Rats

Mesurer par où un candidat médicament quitte l'organisme, foie, reins, intestin ou sang, et sa toxicité sur ces voies figure, selon le porteur, parmi les "étapes obligatoires" de son développement. 750 souris et 850 rats, soit 1 600 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats peuvent subir une chirurgie d'une demi-heure à deux heures pour implanter un cathéter dans le canal biliaire, parfois un ou deux autres dans le duodénum et la veine fémorale, puis, comme les souris, recevoir le produit et passer 24 heures seuls en cage à métabolisme pour le recueil d'urine, de fèces ou de bile, avec une privation d'eau ou de nourriture citée parmi les effets. Leur mise à mort s'explique, selon le porteur, par les prélèvements ou par ces 24 heures d'isolement et "la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite".

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine.

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h ou 2X 24h séparée d’environ 1 semaine) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes. à partir de 7 semaines Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Les 210 rats subissent une chirurgie du cerveau de deux heures sous anesthésie générale pour implanter un dispositif de mesure par fibre optique, et 120 d'entre eux une seconde chirurgie pour poser un cathéter dans une veine, après quoi ils restent seuls dans leur cage jusqu'à la fin du projet. Ces 120 rats s'administrent de la cocaïne pendant 25 sessions quotidiennes de six heures, suivies de deux mois d'abstinence, et tous passent trois séances d'une heure d'enregistrement de leurs neurones, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur cite chez les rats rendus dépendants un poil hérissé, de l'irritabilité et une agressivité envers l'expérimentateur, et annonce des tests comportementaux sans les nommer. Le projet vise d'abord à mettre au point cette technique d'enregistrement, par groupes de trois rats et dix conditions au plus. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour analyser leur cerveau.

Objectifs

Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.

Procédures

Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. Chaque rat aura 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours). Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.

84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau provoquant une lésion du cortex moteur, la pose d'une électrode sur le nerf vague et des séances de stimulation et de tests moteurs. Le porteur indique que la lésion peut réduire la préhension de la patte avant droite et que la pose de l'électrode peut gêner la nuque. L'étude vise à savoir si la stimulation du nerf vague améliore la récupération après une lésion cérébrale, en vue d'une transposition "à plus long terme" chez l'humain.

Objectifs

Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. Un tier d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Comme nous l’avons montré depuis plusieurs années chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisés. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. Elle permet une récupération des fonctions motrices et une modulation bénéfique de molécules de l’inflammation et du stress oxydatif. La question est donc de savoir si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion cérébrale afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’Homme. . Les objectifs de ce projet sont donc (1) de développer les techniques de lésion cérébrale et stimulation du nerf vague et (2) de tester les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion.

Bénéfices attendus

La mise en place de ces techniques de lésion cérébrale et de stimulation du nerf vague chez le rat permettra de conclure sur les effets de la stimulation du nerf vague après une lésion cérébrale qui est une étape cruciale dans la recherche d’optimisation de la thérapie cellulaire pour la lésion cérébrale. En effet, les effets bénéfiques attendus de la stimulation du nerf vague sur la lésion cérébrale pourront être évalués à court terme dans le cadre de la thérapie cellulaire pour optimiser les conditions de greffe et ainsi mieux prendre en charge la réparation cérébrale après une lésion chez l’animal. Le but à plus long terme étant d’appliquer ces deux approches thérapeutiques (transplantation + stimulation) chez l’Homme ayant subi une lésion cérébrale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale en présence d'antalgiques pour tous les animaux, durée de 10 min pour 84 rats ou 40 min pour 24 rats. Pour tous les animaux: 2 ( 84 rats) ou 3 ( 24 rats) sessions de tests du comportementaux moteur en condition vigile, durée 10 min par session. Pour ces 24 rats: stimulations du nerf vague en condition vigile, durée 30 min: 1 session pour 12 animaux et sessions répétées quotidiennes, 5 jours par semaine pendant 4 semaines pour 12 autres animaux. Pesées en condition vigile: 1 fois par jour en suivi post-chirurgie pour tous les animaux, puis 1 fois par semaine pendant 5 semaines pour 24 animaux.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil, et une légère perte de poids ponctuelle pourrait également apparaitre. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. Le placement de l’électrode pourra entrainer une gêne et un inconfort au niveau de la nuque. Lors des pesées individuelles des animaux, ou des tests de motricité, les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant maximum 10 minutes. Pour la stimulation du nerf vague les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sans contention dans laquelle ils pourront se retourner ou se mettre sur les pattes-arrières pendant toute la durée de la stimulation (30min) puis ils seront replacés dans sa cage d’hébergement avec leur congénère. La stimulation est indolore. La stimulation aiguë pourra engendrer un léger stress lors du placement de l’animal dans le dispositif. Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’analyser les effets in vivo d’une stimulation du nerf vague sur une lésion cérébrale du cortex moteur afin d’optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire dans le cadre de la lésion cérébrale chez l’Homme. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.

Réduction

Cette étude est une mise au point technique avec une procédure de type go, no go. Elle permet, de fait, la réduction du nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps 3 groupes de 12 animaux seront utilisés et si les résultats sont validés les expériences sur 4 autres groupes de 12 animaux seront menées. Des tests statistiques nous ont permis de déterminer le nombre minimal d'animaux pour avoir des résultats significatifs. De plus, cette étude sera réalisée sur les 2 sexes, les mâles et les femelles car le traumatisme crânien concerne aussi bien les hommes que les femmes, mais nous serons attentifs à l’éventuel impact du sexe sur nos résultats. Les mâles et femelles ne peuvent être hébergés dans la même cage et l’isolement étant un stress pour les rongeurs, nous aurons besoin de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) par groupe, afin que chaque rat ait un congénère dans sa cage. L’ensemble du projet prévoit donc minimum 3 groupes de 12 animaux et maximum 7 groupes de 12 animaux. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. En effet, les animaux seront placés dans leur cage d’hébergement par 2 de même sexe, 10 jours avant les expérimentations. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion et la stimulation afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi en post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.

Choix des espèces

Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague (. De part sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes de souche non-consanguine Sprague-Dawley (âgées de 8 semaines) car l’intérêt scientifique concerne la lésion corticale traumatique chez l’adulte. A 8 semaines la différence de poids entre mâle (320-380g) et femelle (210-260g) est importante mais ne gênera pas l’expérimentation, nous utiliserons donc des rats mâles et femelles agés de minimum 8 semaines (adultes) car le traumatisme crânien est aussi fréquent chez les femmes que les hommes.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections sous-cutanées deux fois par semaine pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire et des tests de force et de respiration, pour évaluer une protéine médicament combinée à une thérapie génique. Le porteur décrit des gestes réalisés sur des rats habitués et une perte de poids limitée, et prévoit une sédation systématique pour l'injection intraveineuse. Il qualifie d'"indispensable" le recours à ce modèle de rat, présenté comme plus fidèle à la maladie humaine que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l'absence d'une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardio-respiratoire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique visant à la restauration de dystrophine sont prometteuses et en cours d’évaluation. Nous posons l'hypothèse qu’une thérapie préalable induisant un maintien de l’intégrité et de la croissance musculaire amplifierait le bénéfice de ces thérapies géniques, limitées lorsque les fibres musculaires dégénèrent et laissent place à du tissu conjonctif et graisseux, tous deux non contractiles. La protéine médicament testée dans ce projet est un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Cette étude a pour objectif d’évaluer le bénéfice de la combinaison protéine médicament / thérapie génique dans un modèle de rat DMD. En cas de validation chez le rat d'un effet synergique des deux approches combinées, la pertinence d’un essai clinique chez les enfants atteints de DMD, encouragée par des résultats précliniques robustes, serait augmentée et le processus sans doute accéléré.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés à base de protéine médicament et de thérapie génique pour optimiser la restauration de la fonction perdue dans les muscles dystrophiques. La protéine médicament joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire par une potentialisation du processus de nécrose-régénération des fibres musculaires. Nous attendons donc à court terme une synergie protéine médicament/thérapie génique qui optimisera l'efficacité chez le rat DMD de la première génération de médicaments de thérapie génique. À plus long terme et en cas de succès, nous soutiendrons le développement clinique de cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique (seconde génération de médicaments).

Procédures

Procédure 1 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous-cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. En fin de procédure, un unique test d’agrippement et une quantification non-invasive du patron ventilatoire seront réalisés (durée totale de 45 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). Procédure 2 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous- cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. Au cours de la procédure, trois séries d'évaluation non-invasive sur animal vigile seront réalisées à 4 semaines d'intervalle : évaluation de la force d’agrippement, du patron ventilatoire et du rythme cardiaque par ECG (durée totale d’une heure). Une semaine avant la fin de la procédure, ils seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et soumis à une échocardiographie (20 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). À l'issue du prélèvement, les animaux toujours anesthésiés sont évalués pour la force musculaire de leur muscle tibial antérieur (30 minutes).

Impact sur les animaux

A 5 mois, les conséquences de la maladie impactent très peu la qualité de vie des animaux. Afin de privilégier une méthode la moins invasive possible pour les animaux, nous avons optimisé notre produit et réussi à obtenir des données fiables de pharmacocinétique et d'efficacité en l'administrant par voie sous-cutanée, réalisée avec une aiguille très fine. Le geste réalisé sur des rats habitués est réalisé sans contention ferme, au cours d'un moment d'interaction positive. Les injections répétées en sous-cutané sur un même site d’injection pouvant entrainer l’apparition de granulomes (jamais observés sur nos précédentes cohortes), nous alternerons néanmoins les sites d’injection. L’unique injection intraveineuse sera effectuée dans la veine de la queue chez les rats âgés de 12 semaines (4 semaines au démarrage plus 8 semaines de prétraitement). Pour prévenir une réponse de stress éventuelle des rats en raison de la nécessité de réaliser cette injection sur des rats maintenus quelques minutes dans un tunel de contention, ils seront de façon systématique préalablement sédatés. Si besoin, les plus agités (anxieux) seront en plus légèrement anesthésiés pendant 5 minutes. Tous ces traitements sont parfaitement tolérés par les animaux et maîtrisés. Nous avons montré qu'ils évitent les conséquences perverses d'une réponse de stress exagérée, en particulier les arythmies cardiaques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et améliorent la croissance et la survie des fibres musculaires. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Nous avons préalablement contrôlé que les protéines médicaments étaient bien actives dans des cellules musculaires, et avons réalisé les premières expériences chez la souris modèle (peu sévère) de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui tester l’efficacité de ce traitement combiné dans un modèle dystrophique plus sévère et plus proche de la physiopathologie humaine, le modèle du rat DMD. L’utilisation de ce modèle nous parait indispensable pour évaluer le bénéfice du traitement sur des processus tels que le maintien précoce de la masse musculaire mais aussi la régénération du muscle déjà atteint.

Réduction

Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur le modèle de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons de plus optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. Nous utilisons 8 rats par groupe, ce qui permet d'obtenir des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Additionnellement, les analyses prévues ont toutes été optimisées afin de minimiser le nombre d’anesthésie/injection/stress et dérangement subis par les animaux. Tous les tests pouvant être réalisés lors de la même anesthésie ont été regroupés et les tests réalisés sur animaux réveillés sont également rassemblés afin de limiter le stress et la fatigue induite par le dérangement des animaux pendant leur période de repos.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

320 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l'adolescence, ils subissent un stress chronique imprévisible pendant 21 jours, cinq tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée et quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, pour modéliser des troubles psychotiques. Le porteur indique que ce stress ralentit la prise de poids, puis les rats sont mis à mort pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'une approche comportementale n'est possible qu'à l'échelle de "l'organisme entier" et que le rat offre une meilleure "performance translationnelle".

Objectifs

Les troubles psychotiques sont fréquents. Ils apparaissent généralement à l’adolescence, une période de grands changements, tant sur le plan physiologique, psychologique, que social. Ces troubles ont des conséquences majeures sur la vie personnelle, sociale, et professionnelle des patients et de leur entourage en font un véritable enjeu médical et socioéconomique. Malheureusement l’étiologie de la maladie reste mal connue car plurifactorielle. Son développement résulterait d’une interaction entre gènes et environnement, suggérant qu’il existe une vulnérabilité génétique précipitée par des facteurs environnementaux comme le stress psychosocial. Des adolescents ou jeunes adultes présentant des symptômes atténués ou très transitoires de psychose ont été identifiés comme des individus à ultra-haut risque de psychose. Deux tiers des sujets à ultra-haut risque ne développeront pas de trouble psychotique et les thérapies cognitivo-comportementales pourraient favoriser cette résilience au stress. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sensibilité ou la résilience au stress notamment pendant la période cruciale qu’est l’adolescence pourrait permettre de faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet, chez le Rat, vise à étudier les consequences comportementales pouvant s’apparenter aux les troubles psychotiques suite à stress chronique à l’adolescence afin d'identifier les mécanismes biologiques et moléculaires impliqués dans cette dernière et la résilience au stress et dans les effets bénéfiques de l’environnement enrichi (modèle de thérapies cognitivo-comportementales chez l’animal).

Bénéfices attendus

A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant la vulnérabilité au stress et l’effet des thérapies cognitivo-comportementales pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les stades précoces des troubles psychotiques.

Procédures

Les animaux pendant l'adolescence subiront sur une période de 21 jours un stress chronique un stress chronique imprédictible. Ils seront également évalués à 2 périodes de temps dans 5 comportementaux espacés de 24h au minimum et durant entre 5 minutes et 1h. Chez ses mêmes animaux 4 prélèvements sanguins seront effectués avec au minimum 3 semaines entre chaque prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sur une période de 5 minutes sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le stress réalisé pendant l'adolescence va induire un ralentissement de la prise de poids. Les testscomportementaux utilisés peuvent engendrer un stress chez l'animal mais sont de courte durée. . Les prélèvements sanguins peuvent entrainner un stress et une douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau pour des analyses moléculaires

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est une nécessité pour cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes et une analyse de puissance statistique. De plus, certaines expériences présenteront un aspect longitudinal afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Les rats sont hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur sera soulagé avec des analgésiques. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur pour limiter le stress et la douleur associés à ce geste.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rongeur et plus particulièrement le Rat car il présente l’avantage, d’être proche physiologiquement de l’Homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure performance translationnelle. D'ailleurs, le Rat, contrairement aux souris, est plus réceptif aux interactions sociales et présente dans le temps des performances cognitives plus stables. De plus, des résultats préliminaires issus de notre laboratoire ont pu montrer que certains stress pendant l'adolescence pouvaient avoir des répercutions à long terme qui pouvaient varier d'un individu à l'autre, comme chez l'Homme. Les animaux issus de femelles gestantes commandées seront utilisés à partir de 28 jours de vie (adolescence) jusqu'à l'âge adulte.