Rats

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal boit de l'eau contenant des ions perchlorates pendant quatre mois, avant l'induction d'une colite par instillation intra-colique, provoquant perte de poids et d'appétit sur deux jours. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré car il fausserait les résultats, et que les animaux souffrant trop seront isolés ou tués. Il présente cette étude comme "exploratoire", préalable à un projet "plus complet" sur le lien entre pollution et maladie de Crohn.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. La France est un pays fortement agricole et un des plus utilisateur de pesticides en Europe. Un cluster de sur-prévalence de la MC est notamment situé dans le nord de la France, région très sujette aux épandages massifs de produits phytopharmaceutiques (PP). Depuis quelques années une nouvelle préoccupation autour des effets santé des ions perchlorates est en train de naître. Ces ions sont des contaminants de l'eau de boisson et sont notamment issus de l'ionisation en milieu aqueux des perchlorates d'ammonium et de potassium issus principalement de la dégradation d'anciennes mines et munitions issus de la guerre mais peuvent provenir également de rejets industriels. Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire sur l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive. L’objectif de cette étude exploratoire est de pouvoir répondre à cette demande avant de redéposer un projet plus complet.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment que peu d'information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données essentielles et importantes concernant un potentiel effet pro-oxydant et pro-inflammatoire des ions perchlorates sur le système digestif. D'autre part, le développement d'une colite expérimentale chez des animaux traités ou non par les ions perchlorates apportera des données supplémentaires et capitales sur la capacité de ces ions à modifier le profil inflammatoire colique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des ions perchlorates de sodium dans l'eau de boisson pendant 4 mois consécutilfs. Ce mode d'administration ne génère aucune perturbation dans le bien-être des animaux. Après les 4 mois d'administration des ions perchlorates, nous induirons une colite expérimentale chez certains groupes d'animaux comme décrit dans le protocole expérimental. Ce modèle de colite est un modèle inflammatoire d'intensité modérée d'une durée de 3 jours limitant au maximum les potentiels effets délétères chez les animaux. Ce modèle est parfaitement maîtrisé par l'expérimentateur. Une perte de poids et d'appétit est observée au cours des deux premiers jours de colite. A l'issue des 3 jours de colite, les animaux sont mis à mort pour prélèvements tissulaires comme décrits précédemment.

Impact sur les animaux

Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 16 semaines. La procédure est qualifiée de légère. Le modèle de colite expérimentale est un modèle de colite très modérée. La procédure est qualifiée de modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée. L'administration du TNBS se fait par l'intermédiaire d'un capillaire en plastique inséré dans le colon à 5 cm de l'anus. Cette administration ne dure qu'environ 2 min et se fera sous anesthésie. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage respective et surveillés régulièrement pendant les heures suivant la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale pour les prélèvements de sang et d'organes ainsi que l'analyse ultérieure des marqueurs d'intérêt.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité chez de jeunes animaux soumis ou non à un polluant environnemental administré par voie orale (eau de boisson), impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=96; n=12/groupe expérimental) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles et femelles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure. De ce fait, 12 animaux mâles et femelles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique, cela aurai pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables. Les animaux seront suivi quotidiennement avec une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose induira une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat, excepté une perte d'appétit et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas où nous observerons des signes de douleur trop importants, l'animal sera isolé de ses congénères, voire mis à mort. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années pour cette espèce. Notre hypothèse de travail est que l’exposition aux ions perchlorates pendant des phases critiques du développement (enfance et adolescence) pourrait favoriser la survenue des MICI. Nous avons sélectionné un stade de développement en adéquation. Les animaux mâles et femelles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 16 semaines consécutives. A l'âge d'environ 21 semaines, les animaux subiront une anesthésie pour l'induction de la colite expérimentale. Nous souhaitons travailler pendant la phase aiguë inflammatoire et devront mettre à mort les animaux 3 jours après l'induction de la colite.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un anticancéreux, le bortézomib, pour induire une neuropathie, puis subit des tests hebdomadaires de sensibilité tactile et thermique évaluant l'allodynie, pour en étudier le mécanisme membranaire. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée "indispensable" à l'étude et signale une possible baisse de poids. Il reconnaît que des animaux plus âgés seraient plus proches de la clinique humaine mais les écarte pour leur "coût" financier et éthique.

Objectifs

L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique, le bortézomib et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg) et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à l’euthanasie de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15 (grille en annexe).

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important (financier et éthique) et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

416 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie pour être infectés par des bactéries rendues luminescentes, puis des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, avant d'être tués pour dénombrer les bactéries dans leurs tissus. Le porteur indique une perte de poids et une possible prostration liées à l'infection, et présente ce projet pilote comme un préalable à l'étude de nouveaux antibiotiques. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire ces infections et rend l'étude "indispensable".

Objectifs

La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des rechutes sont observées, associées au développement de résistances. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des schémas thérapeutiques est donc nécessaire afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. L’évaluation de l’efficacité de ces nouveaux schémas thérapeutiques est indispensable in vivo chez l’animal infecté avant d’envisager d’éventuels essais cliniques chez l'Homme. Ce projet pilote va nous permettre la mise en place de deux modèles d’infections bactériennes, une infection intrapéritonéale (péritonite) et une infection intra-rénale (pyélonéphrite) à deux entérobactéries (E. Coli et K. pneumoniae) majeures dans l’apparition de l’antibiorésistance. Pour ce faire, l'infection est provoquée en utilisant des bactéries qui ont été modifiées en laboratoire pour être luminescentes. La quantité de luminescence mesurée par un appareil d'imagerie devrait être proportionnelle à la concentration bactérienne ; c'est ce qui sera vérifiée grâce à cette étude. Cette mise en place permet de définir les paramètres optimaux de chaque infection d’un point de vue scientifique (concentration bactérienne adéquate pour maintenir une infection sur plusieurs jours sans traitement antibiotique) et d’un point de vue éthique concernant le bien-être animal (infection provoquant des signes cliniques légers). L’objectif de ce projet pilote permettra de raffiner les procédures et de réduire le nombre d’animaux dans le projet final qui portera sur l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques d’une nouvelle combinaison d’antibiotiques chez le rat infecté par une infection à entérobactérie. Raffiner à l’aide de l'imagerie (bioluminescence) qui est un outil de suivi non invasif de l’infection.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet pilote permettra de mettre au point 2 modèles d'infection et 1 méthode d'imagerie pour le suivi des infections. A long terme, ces modèles et méthode seront utilisés dans un projet plus vaste visant à étudier de nouvelles stratégies antibiotiques, avec un bénéfice direct pour les malades souffrant d'une infection résistante aux antibiotiques.

Procédures

Tous les animaux recevront 2 fois par jour une injection d'antalgique en condition vigile par voie sous cutanée. Le nombre d'injection sera de 2 à 8 injections ( durée de 30 secondes maximum). Le jour de l'infection, chirurgie sous anesthésie générale et locale avec imagerie (bioluminescence) durée totale de l'anesthésie de 20 minutes pour tous les animaux. Les jours suivants l'infection, imagerie pour mesure de la bioluminescence pour les rats mâles : - 4 anesthésies sur 4 jours consécutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 3 anesthésies sur 3 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 2 anesthésies sur 2 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 1 anesthésie : durée 10 min pour 96 animaux. Pour les 32 animaux femelles, le nombre d'anesthésie pourra varier de 1 à 4 en fonction des résultats obtenus chez le rat mâle.

Impact sur les animaux

Anesthésie : un inconfort léger lors de la phase de réveil de l’anesthésie est attendu. Actes chirurgicaux : une légere douler est attendue post-chirurgie réduit au maximum avec une couverture antalgique adéquate. Infection : une perte légère de poids inférieure 5 pour cent est à prévoir au cours du développement de l’infection, une prostration ou une perte de mobilité transitoire jusqu'à 24 heures post-infection peut survenir.

Devenir

Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne par comptage direct et établir une corrélation avec l'imagerie.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro ou in silico permettant de reproduire ces modèles d’infections et permettant de mimer l’apparition de mutations bactériennes in vivo. Cette étude pré-clinique in vivo est donc indispensable à une éventuelle transposition chez l’homme. Le développement de ces modèles est la première étape de ce projet transversal d’amélioration de l’utilisation des antibiotiques en association dans le traitement des infections sévères.

Réduction

Ce projet correspond à une étude pilote pour un projet futur ainsi, seul le nombre minimum d'animaux nécessaire à l'analyse statistique des résultats sera utilisé. Ce nombre a été déterminé par un test statistique . Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux et d’étudier la variabilité inter-sexe, les études des modèles d’infection seront effectués seulement sur les mâles. Une approche progressive de l'évaluation du choix de l'inoculum sera mise en place : Le 1er inoculum testé sera l'inoculum avec la concentration la plus faible, si l'infection ne se maintient pas pendant 4 jours et/ou n'est pas quantifiable par méthode d'imagerie, un second inoculum sera testé à une concentration bactérienne supérieure. Si ce deuxième inoculum ne permet toujours pas d'avoir une infection stable pendant 4 jours, l'inoculum le plus concentré sera évalué . Le nombre d'animaux indiqué dans ce projet est donc un nombre maximal. Une fois qu’un inoculum bactérien unique et une durée unique d’infection seront définis, une étude de variabilité inter-sexe sera réalisée sur des femelles permettant ainsi de reduire le nombre d'animaux dans ce projet pilote.

Raffinement

Les rats suivent une acclimatation de 10 jours et sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et sur planche thermostatée avec analgésie opératoire et postopératoire : cette couverture antalgique sera maintenue en continue sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre 2 fois par jour les animaux tout au long du projet. Des points limites gradés, suffisamment précoces et bien identifiés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettant d'agir rapidement pour améliorer le bien être .

Choix des espèces

La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. De plus, cette lignée n'est pas une lignée génétiquement modifiée. Dans la littérature , cette souche a été utilisée pour développer des modèles d'infection similaires à ceux presentés dans ce projet. Les animaux seront agés de 8 semaines ce qui leur garantit une maturité physiologique notamment de leur système immunitaire pour résister à l’infection.

300 rongeurs, surtout des rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée et une autre réutilisée. Ils reçoivent un produit chimique par la nourriture ou par gavage quotidien, suivi de prélèvements de sang répétés, pour mesurer la biodisponibilité selon la taille des particules. Le porteur indique que les animaux exposés à des substances non homologuées sont tués, quand cent rats et vingt souris pourront être réutilisés. Il présente ces essais comme un préalable réglementaire au choix des doses des études de toxicologie.

Objectifs

Ce projet permet de vérifier l’impact de la taille des particules sur la biodisponibilité du produit à tester. Cette étude est nécessaire pour le bon choix des doses des études de toxicologie si la taille des particules du produit varie d’un lot à l’autre. La voie de synthèse peut évoluer au cours du développement d’une molécule en fonction des quantités synthétisées et faire varier la taille des particules formées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces études sont de déterminer la biodisponibilité du produit en fonction de la taille des particules. Ainsi les études menées pourront répondre à la question suivante : l’exposition interne déterminée par les concentrations plasmatiques varie-t-elle en fonction de la taille des particules ? Ces études apporteront des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures en fonction de la taille connue des particules du produit à tester.

Procédures

Les animaux seront exposés au composé par la nourriture (durée maximale 15 jours) ou le cas échéant par gavage journalier (procédure inferieure à 1 minute) à l'aide de sonde souple adapté à leur taille. En fin d'exposition: prélevements de sang (microprelevements de 20 ou 50µL exceptionnellement 100µL) sur animal vigile à la veine saphène ou la cas échéant caudale (durée maximale de la contention et du prelvement 2 minutes; au maximum 6 prises de sang le premier jour de l'évaluation, puis une prise de sang par jour jusqu’à la fin de la période de réversibilité (8 jours maximum).

Impact sur les animaux

Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet, la forte dose choisie ne devant pas excéder la dose maximale tolérée chez l’animal (et définie au préalable). Les animaux peuvent être soumis à des gavages journaliers à l'aide de sonde souple qui peuvent induire une gène légère lors de la contention. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d’une période de 24h. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement.

Devenir

Les animaux exposés à des substances chimiques non encore homologuées sont euthanasiés.

Remplacement

Des essais in vitro sont utilisés dans l’unité d'expérimantation pour déterminer le profil toxicocinétique des molécules suivis par des études in vivo de toxicocinétique après administration unique. Ces études permettent de définir la période d’administration et de réversibilité de cette procédure mais ne répondent pas à la question de l’impact de la taille des particules sur la biodisponibilité du produit.

Réduction

Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux par groupe (6) définit par l'experience du laboratoire et permettant une analyse statistique et deux doses testées par produit. Un total estimé d’environ 60 rats pourront être utilisés chaque année pour tester environ 2 molécules différentes, pour un total d’environ 300 rongeurs sur 5 années pour ce projet. Exceptionnellement, des souris pourront être utilisées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés tous les jours (week-ends compris). Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Les échantillons de sang prélevés sont faits par la veine saphène (50 µL/prélèvement pour le rat et 20 µl pour la souris - volume ne dépassant pas le volume de 7.5% du volume circulant sur 24h). Pour les rats, la veine caudale peut également être utilisée avec 100 µl par prélèvement. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés par le laboratoire, qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées : la forte dose sera définie sur la base des résultats observés dans des études de 14 ou 28 jours avec administration quotidienne du produit par voie orale. On retiendra donc des doses inférieures à la dose maximale tolérée chez l’animal utilisé.

Choix des espèces

Les études sur les animaux décrites dans ce document sont réalisées chez le rongeur (mâle ou femelle) pour permettre d’avoir le bon niveau d’information pour le choix de doses des études ultérieures. Le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées sur ces espèces. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes (à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux neurochirurgies du cerveau, des prélèvements de sang et des tests répétés de motricité, d'anxiété et de motivation pendant plusieurs mois, dans des modèles reproduisant la maladie de Parkinson qui peuvent provoquer des déficits moteurs et une perte de poids. À l'issue, ils sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et que l'étude des stades précoces de la maladie ne peut pas être menée chez l'humain.

Objectifs

Notre objectif principal est de mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine de la mort des neurones dans la maladie de Parkinson afin de développer une stratégie de détection précoce de la maladie et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, en explorant particulièrement le rôle des marqueurs métaboliques.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre l'origine de la maladie de Parkinson pour proposer une nouvelle cible thérapeutique plus efficace que celles existantes.

Procédures

Les animaux subissent une à deux neurochirurgies d'une durée maximale de 1h, anesthésie incluse. Ils subissent 2 à 3 prélèvements sanguins, espacés de plus de 5 semaines et n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils sont soumis 2 ou 3 fois à 2 tests moteurs complémentaires (durée maximum 1 heure) et un test d’anxiété (durée maximum 5 minutes), chaque session de tests étant séparée de la suivante d’au moins 6 semaines. Ils sont également soumis quotidiennement à un test pour mesurer la motivation (durée maximal 1 heure) pendant 17 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter uniquement des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ins sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi biquotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.