Rats

162 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélever les fœtus in utero et une trentaine réutilisées. Les femelles sont accouplées, soumises à des frottis vaginaux puis à trois injections de bleu trypan, un colorant connu pour ses effets sur le développement embryonnaire. Le porteur indique que la substance colore les téguments en bleu sans effet manifeste sur la mère et que la manipulation par des étudiants inexpérimentés peut stresser les animaux. Il présente ce test réglementaire comme un exercice de formation d'agronomes et affirme qu'il ne peut être remplacé par une méthode sans animaux.

Objectifs

Pour initier les étudiants (formation professionalisante en agronomie bac+3) aux procédures expérimentales permettant de tester les effets toxiques et écotoxiques des molécules chimiques, nous avons décidé de réaliser un test de toxicité embryo-foetale tel que décrit dans les directives de l’OCDE (essai n° 414 : « Test de tératogénicité d’une substance ») et repris dans le règlement 2023/464 du 3 mars 2023 de la commission européenne sous la dénomination « test B.31 ». Ce test a été choisi car il reste peu invasif et ne présente pas d’effet délétère sur la femelle à la dose testée. D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques et enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement. De plus, les données générées lors de ce travail pratique seront utilisées pour évaluer les connaissances en analyse de données acquises par les étudiants au cours de leur formation. Enfin, ces tests réglementaires de toxicité embryo-fœtale sont contextualisés dans la nécessité de s’assurer, avant obtention de mise sur le marché de produits phytopharmaceutiques, de leur innocuité vis-à-vis de la santé des populations humaines et de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les étudiants que nous formons.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus en terme de formation, pour nos futurs techniciens, sont principalement une amélioration de leur compétences techniques par la réalisation de gestes variés en milieu contrôlé (travail en animalerie conventionnel avec le respect des procédures et règles sanitaires ; mise en œuvre de Bonnes Pratiques de Laboratoire ; mise en œuvre des enseignements du suivi du bien-être des animaux; apprentissage de nouveaux gestes techniques). Toutefois, ce travail sera aussi l’occasion d’introduire certains concepts et de faire le lien avec de nombreux autres enseignements : importance mais aussi limites des tests sur animaux dans la cadre de tests de toxicité, notamment dans le contexte de mise au point de nouveaux produits phytopharmaceutiques ; analyses statistiques de données complexes à l’aide d’outils informatiques dédiés ; rappel de biologie de la reproduction et du développement.

Procédures

Les animaux seront mis en accouplement jusqu’à 5 jours successifs et seront soumis à la réalisation d’un frotti vaginal (entre 1 et 5 pour une durée maximale de réalisation d’une minute). Les animaux retenus subiront ensuite 3 injections successives (voie intrapéritonéale, sous-cutanée, per os ou intra rectale) de la mocécule testée. Chaque administration devrait durée moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. La seule manifestation évidente est une coloration bleue des téguments. La douleur anticipée de l'injection est modérée et de courte durée.Il est cependant à noter, que les animaux pourraient être soumi à du stress lié à la manipulation par des étudiants qualifiés mais encore inexpérimentés.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans la procédure seront mis à mort car il est nécessaire de prélever les foetus in utéro afin de ne pas sous-estimer le nombre de foetus atteints d'anomalie congénétale. Néanmoins, il est toujours possible que certains femelles ne se soient pas accouplées (estimation de 5 à 6 femelles par année) et n’aient pas été intégrées dans la procédure. Le cas échéant, elles seront mises à disposition d’autres procédures autorisées au sein de notre structure d’enseignement ou permettront de tester une voie d’administration moins invasive que l’intrapéritonéale.

Remplacement

Les tests de toxicité sur le développement sont destinés à livrer des informations générales concernant les effets de l'exposition prénatale d'une femelle gravide à une substance chimique, sur elle-même et sur l'organisme en développement qu'elle porte en elle. Par conséquent, ils ne peuvent être remplacés par d’autres méthodes ne faisant pas appel à des modèles animaux.D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement mais aussi de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les futurs agronomes que nous formons.

Réduction

Un test de toxicité embryo-fœtal nécessite le recours à deux espèces de mammifères (une espèce de rongeur et une espèce non-rongeur) et 4 à 5 lots (3 doses différentes et 1 ou deux témoins -conditions zootechniques et le cas échéant, véhicule de la substance testée-) d’un minimum de 20 femelles gravides chacun. Compte tenu de la visée pédagogique de ce travail, le nombre d’animaux sera réduit au strict minimum. Seul le lot correspondant à la dose d’intérêt chez une espèce, le rat, sera réalisé. Aussi, metterons nous 30 femelles en reproduction pour avoir au moins 25 femelles gravides par année (soit 30*5=150 femelles) ce qui correspond, d'une part aux exigences du test réglementaire et d'autres part aux effectifs de nos promotions (50 étudiants, 1 rat par binôme). Les résultats obtenus seront comparés à des données simulés informatiquement à partir de données de la littérature (les fréquences spontanées des principales anomalies congénitales et des résorptions sont en effet connues chez le rat). Dans un souci de raffinement, 12 rats supplémentaires seront utilisée pour tester une voie d’administration moins invasive. Soit 162 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Le test de toxicité sera simplifié par rapport aux directives réglementaires pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Les étudiants participants ont au préalable obtenu la qualification à l’expérimentation animale pour Applicateur et ont acquis un certain nombre de gestes techniques. La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. Le suivi est réalisé conjointement par les étudiants, le personnel de l’animalerie et le personnel enseignant à l’aide d’une grille d’évaluation mise en place par la Structure en charge du Bien-Etre Animal de notre structure. Chaque manipulation conduit à l’attribution d’une amande donnée par l’étudiant ayant réalisé l’intervention à titre de renforcement positif. Nous proposons de mettre en place une étude pilote permettant de définir une voie d’administration la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 dans des conditions conforment à la réglementation avec un enrichissement varié et adapté ainsi qu'un contrôle quotidien.

Choix des espèces

Le rat est le modèle le plus utilisé après le lapin dans les études de toxicité embryo-fœtale. La forte prolificité de cette souche permet avec un nombre réduit de femelles d’obtenir une grande quantité d’information sur les fœtus. En outre la biologie de la reproduction de cette souche est parfaitement caractérisée facilitant la mise en place de la procédure mais aussi la simulation informatique du lot témoin (les fréquences spontanées des résorptions et des principales anomalies congénitales sont en effet connues). Seules des femelles primipares seront utilisées afin de ne pas confondre les résorptions précoces imputables au traitement avec des traces d’implantation d’évènements de reproduction ultérieurs. Les femelles devront atteindre un poids d’environ 300g pour augmenter les chances de fécondation lors des accouplements.

2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les cellules tumorales sont injectées par voie carotidienne pour provoquer des métastases cérébrales, suivies de traitements par diverses voies, de rayons ionisants, parfois d'un implant hormonal et de prélèvements répétés. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte de poids, faiblesse musculaire et troubles de la coordination, la perte de poids servant de point limite. Cette société de recherche préclinique décrit une "demande de plus en plus importante" pour ces modèles et affirme que les méthodes 3D restent marginales et difficilement transposables.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie (Centre international de recherche contre le cancer). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, les cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. D’énormes progrès ont été réalisés en clinique sur les tumeurs dites primaires. En revanche, le pronostic vital des patients peut être énormément dégradé en cas de métastases. On parle de métastases cérébrales lorsqu’un cancer d’un autre organe (cancer primitif) s’est propagé au cerveau. Des métastases s’y développent fréquemment en cas de cancer du sein, de la peau ou du poumon. Parmi les cancers chez les femmes, celui au sein est le plus répandu dans les pays développés. Environ 20 % des cancers du sein développent des métastases cérébrales. Malheureusement, les traitements actuels, par radiothérapie, chimiothérapie et chirurgie, sont majoritairement vains. La présence de métastases au cerveau entraîne un mauvais pronostic de survie (6 mois en moyenne), même si le cancer primitif répond bien aux traitements. En effet, le diagnostic est généralement tardif. Pour répondre à ce besoin de nouvelles approches thérapeutiques l’objectif de ce projet est d’induire directement des métastases dans le cerveau en mimant le cheminement des cellules tumorales jusqu’au cerveau par la voie carotidienne. Ces modèles, permettront de refléter la pathologie humaine et d’évaluer des nouveaux médicaments destinés à traiter les métastases cérébrales chez l’homme. Nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison chez l’animal avant de les tester chez l’homme. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale. Nous estimons le nombre de projet à 5 par an soit 25 projets sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Notre société, spécialisée en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Une demande de plus en plus importante se fait pour le traitement des métastases. Plus particulièrement ces demandes sont accès sur les métastases cérébrales qui reste à ce jour sans traitement. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grace à ces modèles, il sera possible d’étudier les mécanismes d’expansion ou de nidification des métastases avec des traitements prophylactiques ou de croissance des métastases avec des traitement de deuxième ligne dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Il sera possible aussi, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre la progression des métastases.

Procédures

L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (

Impact sur les animaux

La greffe des cellules nécessitera une chirurgie qui pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une perte de poids, des difficultés à se mouvoir, une faiblesse musculaire et des soucis de coordination. La perte de poids sera le premier symptôme observé et constituera un point limite. Pour les expériences d’activités antitumorales, les animaux recevront des traitements et/ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1 jour. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress pendant 1-2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme pour étudier les modèles de métastases.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie (risque inférieur de 5% de mortalité chirurgie par des personnels entrainés) et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. En fonction du succès des études pilotes et une fois le modèle totalement acquis, ce nombre d’animaux surnuméraire sera réduit. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 6 à 15 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement relevant. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).

Raffinement

Au cours de l’expérimentation, les animaux seront maintenus dans leurs cage avec un enrichissement adapté et dans les conditions standard d’hébergement en terme de surface de cage et de nombre. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et un suivi adapté (observations, pesées, signes cliniques) sera mise en place post chirurgie avec évaluation des lésions neurologiques 1h post chirurgie et soins post opératoire et antalgie pendant 48h post chirurgie. Cette fréquence sera augmentée pour tous les animaux dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès qu'une perte de poids de plus de 10% sera observée sur certains animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, la pose d’implants hormonaux seront réalisés sous anesthésie avec incision cutanée et Injection locale d'antalgique. Pour la greffe, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau de l’incision de la peau sera réalisée et les animaux recevront un opiacé et un anti inflammatoire non stéroïdien. Le lendemain, les animaux seront traités avec un antiinflammatoire). En fonction du suivi clinique et sous avis vétérinaire, le traitement à l’antiinflammatoire pourra être prolongé. La greffe sera réalisée en conditions d’asepsie. Les points limites définit par la SBEA seront appliqués.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur sectionne le nerf sciatique droit sous anesthésie, avant de le réparer par colle biologique ou manchonnage veineux, puis ils subissent des tests fonctionnels à 15, 30 et 90 jours et une évaluation électrophysiologique finale sans réveil. Le porteur indique que la section du nerf provoque une perte des fonctions motrices et sensitives du membre, des douleurs postopératoires et un risque d'automutilation. Il affirme que ce mécanisme nerveux intégré ne peut pas être reproduit de façon satisfaisante in vitro ou in silico et écarte les modèles sur invertébrés.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse. Actuellement, la technique de suture associée au manchonnage veineux est considérée comme la technique de référence en termes de réparation nerveuse. La technique de suture associée à l’enveloppement par colle biologique se veut plus simple, puisque moins de points de suture sont à réaliser (seulement deux versus quatre pour la technique de référence). De nombreuses colles biologiques sont utilisées neanmoins, meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prévenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Le névrome correspond à une prolifération anarchique des neurones qui interfère avec la récupération fonctionnelle et peut engendrer des douleurs. Cette étude pré-clinique a pour objectif de déterminer si la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux pour prévenir l’apparition de névrome, tout en permettant une bonne repousse nerveuse sur le nerf sciatique droit chez le rat. Il s’agira d’évaluer de façon clinique, électrophysiologique, et histologique la repousse axonale selon les deux groupes : suture/manchonnage veineux et suture/enveloppement par colle biologique.

Bénéfices attendus

Les lesions nerveuses representent une part importante de la traumatologie de la main, environ un million de cas par an dans le monde. Il est decrit de nombreuses techniques pour les reparer. Il existe des risques non negligeables de complications malgre la reparation realisee, et plus particulierement de nevrome. Les nevromes correspondent a une proliferation de tissu nerveux avec une repousse axonale desorganisee, engendrant des douleurs pas exces de nociception, pouvant s’associer a des dysesthesies. Ces nevromes, lorsqu’ils sont constitues, necessitent un second geste chirurgical pour en faire l’exerese, avec risque de perte de sensibilite definitive en aval. Il est admis que l’ajout d’un manchon veineux autour de la suture nerveuse permet l’absence de nevrome dans les suites post-operatoire. Une etude pre-clinique sur le manchon veineux sur le nerf sciatique de chien, ainsi qu’une etude clinique sur le manchonnage veineux sur les nerfs collateraux des doigts, etaient toutes deux en faveur de l’absence de nevrome dans les suites operatoires. A ce jour, certains chirurgiens pratiquent la technique : suture + colle biologique. Cette technique se veut plus simple, avec moins de points de suture et d’apprentissage plus rapide. De nombreuses colles biologiques sont utilisees, neanmoins meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique,. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prevenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Ainsi, nous espérons que notre étude permettra de prouver que la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux dans la prévention des névromes. Si l'étude tend vers une preuve d'efficacité, nous souhaiterions réaliser dans les suites une étude clinique chez l'Homme, afin de développer davantage cette technique et obtenir si cela est possible une autorisation de mise sur le marché (AMM) dans cette indication.

Procédures

Il y a 3 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique droit (J0). Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale sous ventilation durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (J15, J30 et J90), chaque test durera environ 20 minutes. - La troisième intervention est l’évaluation électrophysiologique du nerf sciatique droit avec abord chirurgical, réalisée sous anesthésie générale sous ventilation et qui ne devra pas excéder 15 minutes ; suivi du prélèvement du nerf sciatique afin de réaliser l’analyse histologique sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux lorsque les animaux ne seront pas lésés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

mécanisme physiopathologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammofères (i.e. invertébrés) ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (e.g. chirurgie de la main).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Les protocoles ont été déterminés de manière à réaliser une étude longitudinale afin que chaque animal réalise un maximum d’analyses, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Les statistiques ont été réalisées via un logiciel. Le calcul du nombre de sujets nécessaires a été réalisé en comparant deux proportions binomiales, selon une proportion théorique de 0,30 (soit 30% de névrome observé chez l’homme), et une proportion observée supposée de 0,50, avec un test unilatéral. On considère un risque de première espèce alpha de 5% et une puissance de 90%. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrières.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chezl'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

3069 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neurotoxine leur est injectée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique pour reproduire un comportement de type narcoleptique, puis leur activité est enregistrée en isolement individuel pendant 48 heures avant la chirurgie et 21 jours après, avant l'administration quotidienne d'un candidat médicament pendant 23 jours. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, perte de poids et posture voûtée, et que les rats sont tués pour prélever leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer le cycle circadien dans la narcolepsie et que le recours à l'animal est 'nécessaire'.

Objectifs

La narcolepsie est une maladie chronique rare et non curable survenant le plus souvent dans l’enfance et l’adolescence. Ce trouble du sommeil est caractérisé par un sommeil nocturne de qualité médiocre, une somnolence diurne excessive et des endormissements irrépressibles pouvant survenir à tout moment de la journée, même en pleine activité, généralement avec des épisodes soudains et passagers de faiblesse musculaire. Des études ont montré qu’une injection d’une neurotoxine dans le cerveau, chez le rat, induisait un comportement de sommeil de type narcoleptique. Le rat est un animal nocturne présentant une activité locomotrice qui est 4 à 5 fois plus élevée pendant la phase nocturne que pendant la phase diurne. L’activité circadienne est donc un indice fiable du cycle de sommeil/éveil. De ce fait, une diminution de l’activité durant la phase nocturne est un indicateur d’une augmentation du sommeil c’est-à-dire d’un comportement de sommeil de type narcoleptique. L’objectif de ce projet est (1) d’examiner si une injection bilatérale d’une neurotoxine dans le cerveau induit un comportement de sommeil de type narcoleptique chez le rat et (2) dans le cas où l’injection de la neurotoxine entraîne une perturbation de l’activité circadienne pendant la phase nocturne, d’examiner l’efficacité de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées. Actuellement, aucun traitement curatif n’existe. Il subsiste cependant la possibilité de traitements médicamenteux pour traiter par exemple la somnolence diurne excessive. Cependant, ces traitements ne traitent pas la cause mais seulement les symptômes et ils sont de plus inconstamment efficaces et parfois associés à des effets secondaires. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de cibles thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie des patients atteints de narcolepsie.

Bénéfices attendus

La narcolepsie est une maladie neurologique chronique rare, débutant le plus souvent dans l’enfance et l’adolescence et provoqué par une perte des neurones synthétisant la protéine hypocrétine. Elle se caractérise par un sommeil nocturne de qualité médiocre, d’une somnolence diurne excessive et des endormissements irrépressibles pouvant survenir à tout moment de la journée, même en pleine activité, généralement avec des épisodes soudains et passagers de faiblesse musculaire (cataplexie). Il existe actuellement peu de médicaments pour améliorer les symptômes de la narcolepsie. De plus, les traitements ne traitent pas la cause mais seulement les symptômes et ils sont de plus inconstamment efficaces et parfois associés à des effets secondaires. Ainsi ce modèle est pertinent pour le développement de cibles thérapeutiques pouvant améliorer la qualité de vie des patients atteints de narcolepsie.

Procédures

1- Avant l’injection bilatérale dans le cerveau, le rythme circadien des animaux est étudié de façon individuelle, dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 48 heures. 2- Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d’une neurotoxine dans le cerveau) qui dure dans sa totalité environ une heure (de l'anesthésie jusqu'au réveil). 3- Après l’injection bilatérale de la neurotoxine dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuelle dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 21 jours consécutifs. 4- L’effet d'un candidat médicament sur la perturbation de l'activité circadienne induite par l’injection bilatérale de la neurotoxine dans le cerveau est étudié. Selon le groupe, les animaux reçoivent une administration par jour soit d'une solution saline soit du candidat médicament (durée totale du traitement 23 jours - durée du geste moins d’une minute). 5- A la fin de l’expérience, les animaux sont mis à mort. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale profonde (soit anesthésie gazeuse soit anesthésie par injection).Puis le cerveau de l’animal est prélevé post-mortem et des coupes histologiques sont réalisées sur le cerveau pour des analyses immunohistochimiques. Dans sa totalité, l'intervention dure en moyenne 40 minutes.

Impact sur les animaux

(1) Chirurgie : l’injection bilatérale stéréotaxique d’une neurotoxine dans le cerveau. Le type de douleur attendue est uniquement de la douleur lié à la chirurgie stéréotaxique. En cas de douleurs, on remarquera chez l’animal : la présence de porphyrine (pigment rouge autour des yeux et du nez), une diminution des mouvements, une perte de poids et une posture voutée ; (2) Administration de candidats médicaments. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont avec des doses croissantes de la molécule ; et (3) L’isolement des animaux. Avant l’injection bilatéral, dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuelle (un animal par enceinte) dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 48h. Après l’injection bilatérale de la neurotoxine, dans le cerveau, le rythme circadien est étudié sur chaque animal de façon individuel (un animal par enceinte) dans un test de comportement moteur/exploratoire, pendant 21 jours consécutifs.

Devenir

A la fin de l’expérience, les animaux sont mis à mort. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale (soit anesthésie gazeuse, soit anesthésie par injection). Le cerveau de l’animal est ensuite prélevé post-mortem et des coupes histologiques sont réalisées sur le cerveau pour des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucune méthode alternative permettant d’évaluer le cycle circadien dans la narcolepsie. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Etant donné la variabilité probable, 11 animaux par groupe au maximum sont prévus dans ce projet pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable – tout en prenant en compte le bien-être animal. Cet effectif correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Pour chacune des étapes, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Les animaux sont hébergés par deux dans des cages transparentes de type III contenant de la litière et des enrichissements (matériel de nidification : sizzle dri kraft et brique de peuplier) afin de réduire le stress. Ils sont quotidiennement observés par des techniciens/ingénieurs formés et attentifs. Les soins pré et post opératoires sont les suivants : (1) Trente minutes avant l’acte chirurgical, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un analgésique puis ils sont anesthésiés (anesthésie gazeuse) ; (2) Durant l’acte chirurgical, les animaux ont un soutien thermique (couverture chauffante) de façon à éviter l’hypothermie et du gel oculaire stérile est également déposé sur les yeux des animaux, formant une couche protectrice, une humidification et une lubrification de la surface cornéenne de l’œil et (3) juste après la chirurgie, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un anti-inflammatoire et une administration sous-cutanée d’une solution saline (1ml). Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. La cage d’hébergement est placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Par ailleurs, lors des soins post- opératoires, les animaux reçoivent une administration sous-cutanée d’un anti-inflammatoire pendant 2 à 5 jours (selon leur état général), comme indiqué dans la formation réglementaire en chirurgie expérimentale, pour garantir le bien-être animal. Ici, le type de douleur attendue est uniquement de la douleur lié à la chirurgie stéréotaxique. Les animaux sont également pesés et leur état général est évalué durant toute la durée de l’expérience, selon notre grille de surveillance, pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. Par ailleurs, le rat est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. 5 semaines au moment de la chirurgie. Dans ce projet, seuls des animaux adultes seront utilisés car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un anticancéreux, pour leur induire une neuropathie douloureuse, puis des injections d'une molécule candidate, et subissent des tests comportementaux d'allodynie tactile et thermique au froid. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une 'nuisance à part entière' mais 'indispensable' à l'étude, et prévoit de tuer tous les rats pour des prélèvements. Il affirme que ce type d'étude sur la douleur n'est pas encore remplaçable par des modèles in vitro.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui touche environ 60% des patients, et altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limitée. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents ont montré l’intérêt d’une molécule, le CARBA1, pour améliorer l'action anticancéreuse du paclitaxel (taxane) et avec des propriétés antioxydantes laissant penser que le CARBA1 pourrait limiter la neurotoxicité du paclitaxel. Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’effet préventif du CARBA1 sur la CIPN associé au paclitaxel sur un modèle animal (rat). Ces effets préventifs seront notamment mesurés par des tests comportementaux (allodynie tactile et thermique).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie thérapeutique de prévention de la CIPN associée au paclitaxel. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). L’objectif ultime sera de proposer un nouvel agent capable de prévenir la CIPN qui devra faire l’objet d’une preuve de concept dans le cadre d’une étude clinique impliquant la personne humaine.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections de paclitaxel ou de son véhicule associées à des injections de CARBA1 ou de son véhicule. Le nombre d’injections pour le paclitaxel sera de 4 (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) et de 6 pour le CARBA1 (J-2, J-1, J0, J2, J4, et J7) par voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à 3 semaines après la fin des injections : 1. Mesure de l'allodynie tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats); 2. Mesure de l'allodynie thermique au froid : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel pourront être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux, mais ce phénomène est très limité voire absent avec les doses de paclitaxel utilisées (nb. Nous ne l’avons jamais observé avec ce modèle animal, mais cet effet est retrouvé plus fréquemment avec les autres anticancéreux neurotoxiques). Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations de paclitaxel, et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux, car l’altération de l’état général des animaux est un biais important à la pertinence des analyses conduites.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 2 expérimentations afin d’effectuer des prélèvements.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur (troubles nociceptifs neuropathiques), l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de douze heures, une diarrhée est provoquée par gavage d'huile de ricin, puis chaque animal est isolé quatre heures dans une cage à métabolisme pour recueillir ses selles, le porteur reconnaissant un inconfort et un stress liés à l'isolement. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le projet teste deux souches de probiotiques et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal, dans la perspective d'un futur essai clinique.

Objectifs

La diarrhée est trouble digestif qui touche près de 4,5 milliards de personnes dans le monde chaque année et qui se manifeste notamment par l’émission de selles généralement liquides ou molles, dans une quantité et à une fréquence plus élevée que la normale. Les épisodes de diarrhées aiguës peuvent être la conséquence d’une infection bactérienne, virale ou parasitaire, ou survenir suite à une intolérance alimentaire ou médicamenteuse, notamment suite à la prise d’antibiotiques. Ces épisodes peuvent s’accompagner de déshydratation, de douleur abdominale, de fièvre ... Des médicaments peuvent faire cesser la diarrhée en ralentissant les mouvements intestinaux mais peuvent entrainer par la suite une constipation. D’autres diminuent la secrétion d’eau dans les intestins. Au besoin, des antibiotiques peuvent venir à bout d’une diarhhée causée par une bactérie ou un parasite. Les probiotiques sont des bactéries ou des levures qui modulent la prolifération bactérienne de l’intestin. Ils sont largement utilisés comme compléments alimentaires et comme médicaments dans le traitement et la prévention des diarrhées. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer les effets sur la diarrhée et sur la douleur induite de 2 nouvelles souches de probiotiques chez des rats soumis à l’induction d’une diarrhée. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un médicament de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et les intestins seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 nouvelles souches de probiotiques chez le rat soumis à l’induction d’une diarrhée expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un médicament de référence utilisé pour le traitement de la diarrhée aigüe. Les données des différents paramètres observés au cours de la mise en cage spéciale, temps de latence d’émission des premières selles, nombre et consistance des selles émises, ainsi que les données comportementales concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur les intestins et le colon prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ces 2 nouvelles souches de probiotiques sur leur activité anti-diarrhéique et sur les effets sur la douleur perçue chez le rat. Cela permettra d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une ou l’autre de ces 2 nouvelles souches de probiotiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de diarrhée aigüe.

Procédures

Les rats seront placés à jeun pendant 12 heures avant la réalisation des essais. Après cette mise à jeun, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué, geste effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Une heure après le traitement, la diarrhée sera induite par administration par voie orale d’un composé induisant une diarrhée expérimentale (huile de ricin), geste également effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Après induction de la diarrhée, les rats seront placés individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 4 heures afin de recueillir les selles émises par chacun d’entre eux et d’observer leur comportement, permettant ainsi d’évaluer l’effet des composés administrés.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des animaux la veille au soir de la réalisation des traitements et de l’induction de la diarrhée, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques, va induire une légère perte de poids des animaux. Cette perte de poids sera en effet peu importante car les animaux étant placés en cycle de lumière inversé, la période de jeûne correspondra à la phase lumineuse du cycle au cours de laquelle les animaux sont peu actifs voire inactifs, avec une prise alimentaire très limitée voire nulle. L’induction de la diarrhée va quant à elle induire un inconfort des animaux, se traduisant par l’émission plus ou moins rapide et importante de selles au cours des 4 heures de mise en cage spéciale, et par des modifications du comportement des animaux se traduisant par une baisse de l’activité, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée, et des yeux moins ouverts. Le traitement avec les 2 souches de probiotiques devraient limiter cet inconfort. La mise en cage spéciale, nécessaire pour recueillir individuellement les selles de chaque rat et observer individuellement le comportement de chaque rat pendant 4 heures suivant l’induction de la diarrhée, va induire un stress modéré par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 32 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des intestins pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets anti-diarrhéiques et comportementaux de composés. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de diarrhée, dont certains ont été publiés. Une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée à l’issue des expérimentations.

Raffinement

Au cours de la semaine d'acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux seront placés à 2 par cage avec de l'enrichissement pour assurer leur bien-être, et avec accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après la réalisation des traitements, l’induction de la diarrhée et la mise en cage spéciale, les animaux étant observés en continu pendant les 4 heures de mise en cage spéciale. L’expérimentation étant de très courte durée, sur 5 heures le jour des essais, les seuls points limites identifiés seraient des convulsions, tremblements ou paralysie des animaux suite à l’administration orale des produits à tester. Cela ne serait pas le cas après administration orale du médicament de référence et du composé induisant la diarrhée car nous avons une très bonne expérience de ce modèle et nous n’avons jamais observé de trouble des animaux traités avec ces composés. Ce modèle étant validé et ayant été utilisé de nombreuses fois en plaçant les animaux individuellement en cage spéciale pour une durée de 4 heures sans habituation à ces dispositifs, aucune habituation des animaux aux cages spéciale n’est envisagée. Les rats seront placés dans une salle d’expérimentation attenante à leur pièce d’hébergement, placée en lumière blanche attenuée pour ne pas les perturber et maintenir des conditions proches de celles de leur hébergement.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée et majoritairement utilisée pour la mise en évidence des effets anti-diarrhéiques de candidats médicaments et de compléments alimentaires. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de diarrhée.