Rats
Impact du stress néonatal de séparation maternelle dans les neuropathies induites par constriction chronique du nerf sciatique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est séparée de sa mère trois heures par jour du deuxième au douzième jour après la naissance, puis une partie subit la pose d'un manchon autour du nerf sciatique sous anesthésie, avant huit semaines de tests comportementaux quotidiens non précisés, pour étudier si un stress précoce aggrave une douleur chronique. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur chronique et de possibles comportements anxieux et dépressifs, et tue les animaux en fin d'étude parce que leur état anxieux les rend inutilisables ailleurs. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reconstitue les réseaux neuronaux impliqués et que la séparation maternelle ne peut être reproduite que sur un modèle vivant.
Objectifs
Les données cliniques suggèrent que la prématurité impacte le développement du système nerveux, modifiant plusieurs paramètres neurologiques à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) chez le rongeur est un modèle de stress reflétant la prématurité humaine et induisant des altérations nociceptives, une anxiété accrue, ainsi que des troubles des comportements sociaux. Cependant, l’impact de la SMN sur le développement de douleurs chroniques reste méconnu. Nous faisons en effet l’hypothèse que la SMN constitue un facteur aggravant dans le cas de douleurs chroniques, aussi bien au niveau des symptômes sensoriels qu’émotionnels et cognitifs. Dans ce contexte, nous caractériserons à l’âge adulte les réponses sensorielles, les comportements anxieux et dépressifs et les capacités cognitives des animaux SMN suite à l’établissement d’une neuropathie. Ce modèle n’a encore jamais été étudié chez des animaux ayant subi au préalable une SMN. La mise en place d’une douleur chronique suite à un stress précoce pourrait en effet favoriser l’apparition de comorbidités anxio-dépressives aggravées et d’ordinaire non détectables chez des rats contrôles soumis à ce modèle de neuropathie.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle néonatale a permis de décrypter nombre de mécanismes et d’altérations du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal (i.e. une séparation précoce avec la mère) associé à une neuropathie au niveau des réponses sensorielles, comportements anxieux et dépressifs et des capacités cognitives. Ce modèle n’a encore jamais été étudié chez des animaux ayant subi au préalable une SMN. La mise en place d’une douleur chronique suite à un stress précoce pourrait en effet favoriser l’apparition de comorbidités anxio-dépressives aggravées et d’ordinaire non détectables chez des rats contrôles soumis à ce modèle de neuropathie.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de SMN et seront séparés de leur mère 3 heures par jour du deuxième au douzième jour postnatal. Une partie des animaux subiront une chirurgie de 5 à 10 minutes sous anesthésie générale et analgésie. Afin d’évaluer l'évolution des animaux, ils passeront des tests de comportements dont la durée varie entre 5 et 30 minutes, une fois par jour pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
Le modèle de SMN chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. La SMN induit également au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. La chirurgie du cuff provoque le développement d'une douleur chronique chez l'animal, ainsi que de potentiels comportements anxieux et dépressifs. Les tests de comportements prévus sont courts (de 5 à 30min) et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal.
Devenir
A la fin de l’étude les animaux utilisés seront mis à mort car leur état anxieux n’est compatible ni avec une autre étude ni avec un replacement. Les animaux surnuméraires des portées seront utilisés pour d’autres projets de l’équipe.
Remplacement
Les comportements sociaux, cognitif et la douleur étant des processus intégrés impliquant différentes composantes sensorielles, cognitives et émotionnelles, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature, il est donc actuellement impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans le comportement observé. La séparation maternelle ne peut être mimer qu’en utilisant un modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux prend en compte les risques liés à la chirurgie et les variabilités entre les animaux nécessitant un certain nombre pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous chercherons également à mettre en évidence des différences entre les mâles et les femelles, qui ont été démontrées pour les réponses à la douleur et dans différents modèles de stress précoce.
Raffinement
A leur arrivée, les femelles gestantes sont laissées 1 semaine dans l'animalerie pour acclimatation. Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les animaux sont hébergés encages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien-être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Dans ce cas, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Les chirurgies se feront sous anesthésie avec une analgésie pré- et post-opératoire, et les animaux seront observés quotidiennement en respectant les points limites fixés avant de la chirurgie et en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental des animaux. Les tests nociceptifs sont effectués après une semaine d’habituation afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. La séparation maternelle aura lieu du deuxième au douzième jour postnatal. La procédure commencera quand les animaux seront adultes donc à partir du quarantième jour postnatal.
Travaux Pratiques de pharmacologie : étude des effets de molécules anti-hypertensives chez le rat mâle et femelle
- Enseignement supérieur
392 rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée à l'issue et 180 réutilisés dans d'autres protocoles. Les rats reçoivent des molécules antihypertensives par voie orale, subissent des mesures répétées de pression artérielle par contention en tube et des piqûres à la queue pour la glycémie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des étudiants se destinant aux métiers de l'expérimentation animale. Les rats témoins sont tués en cours de séance pour une étude sur organe isolé, les autres à la fin. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune méthode de remplacement permettant une formation technique équivalente sur l'animal vigile.
Objectifs
Cette séance de travaux pratiques (TP) chez le rat est destinée à des étudiants dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. Cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : mettre en évidence les effets de différents médicaments sur le système cardiovasculaire (Pression artérielle et fréquence cardiaque chez le rat vigile - D’un point de vue éthique (raffinement) : montrer l’intérêt du renforcement positif aux étudiants en mettant en place un système de récompence chez les animaux ; mettre en pratique un système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque non invasif chez le rat - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former à la réalisation d’une administration par voie orale chez le rat ; apprendre à utiliser le système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque au niveau de l’artère caudale chez le rat ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre à nos étudiants à réaliser des expérimentations in vivo de pharmacologie. En effet, les enseignements de ce diplôme sont définis selon un programme pédagogique national. Les étudiants doivent acquérir 5 compétences durant leur formation, et notamment la compétence « mener des études à l’échelle du vivant ». En troisième année, la validation de cette compétence implique de savoir « Participer à l’évaluation de l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ». Il est également précisé que la mise en pratique de l’étude des médicaments des grandes fonctions, dont les médicaments du système cardiovasculaire, se fait in vivo et/ou in vitro. Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants seront les suivants : - consolidation de l’apprentissage de la manipulation des rats vigiles : contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque - mise en oeuvre d’une étude en pharmacologie in vivo : constitution des lots d’animaux après randomisation, identification des animaux, utilisation d’un logiciel dédié, recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence du respect du bien-être des animaux au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect des regles de bien-être animal dans ce TP.
Procédures
Les animaux pour l'entrainement à la voie orale suivront cette administration par voie orale 2 fois au maximum par animal (2 fois, car 2 séances d'entrainement par session). Les animaux du protocole expérimental seront soumis à trois interventions: 1. Injection par voie orale du véhicule ou molécules antihypertensives. L'administration par voie orale sera réalisée 2 fois maximum par animal (2 traitements car 2 séances d'étude par session). Chaque administration dure quelques secondes. 2. Mesure non invasive de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque au niveau de la veine caudale. Cette mesure sera réalisée 4 à 8 fois par animal (réparties sur 2 jours consécutifs puis 2 jours après sur 2 jours consécutifs, 1 à 2 mesures par jours). En effet il arrive que les résultast obtenus ne soient pas exploitables, si l'animal bouge par exemple lors de la prise de mesure, dans ce cas une nouvelle prise de pression artéreille est réalisée à distance de la précédente dans la même demi-journée. Chaque mesure de pression artérielle/fréquence cardiaque dure environ 2 minutes et nécessite 7 minutes d'habituation pour sytabiliser la température de mesure. 3. Mesure de la glycémie après piqure au niveau de la veine caudale. Cette intervention sera réalisée 4 fois en 4 jours par animal et durera quelques secondes à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les manipulations (contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque) génèrent du stress chez les animaux. Le prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale entraîne une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux ayant servi pour l'entraînement à la voie orale seront gardés en vie jusqu'à leur utilisation dans des protocoles hors champ, car cette procédure est légère. Pour la procédure expérimentale, les animaux du lot témoin seront mis à mort au cours des sessions de TP afin de réaliser une étude sur organe isolé. Les autres animaux seront mis à morts à la fin de chaque session. En effet, nous considérons que, bien que les gestes techniques effectués soient faiblement invasifs, le fait qu'ils soient effectués par des étudiants peut augmenter le stress des animaux. C'est pourquoi nous proposons que cette procédure soit considérée de gravité modérée. Dans ces conditions la mise à mort des animaux à la fin des séances est adaptée à la procédure. Les animaux surnumraires n'ayant pas été inclus dans l'étude pourront être utilisés pour des procédures hors champ.
Remplacement
Dans la formation de nos étudiants le programme pédagogique national prévoit, en pharmacologie, l’évaluation in vivo des effets de molécules de référence par la mise en œuvre de protocoles expérimentaux. Ce TP doit permettre d’illustrer les effets de traitements des pathologies cardiovasculaires et notamment la classe des médicaments ciblant le système adrénergique . Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile, mesure de l'activité cardiovasculaire…). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et de limiter le nombre d'animaux d'entraînement ainsi que la durée de manipulation de ceux-ci, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, administration VO) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/sondes dédiées sur un support inerte.
Réduction
Ce TP aura lieu sur 2 sessions comportant chacune deux séances d'étude sur 3 jours de protocole, pour 12-15 étudiants par séance (annexes 2 et 3). Deux groupes de 15 étudiants maximum participeront à chaque session d'étude, pour un total de 52 étudiants par an. Pour chaque séance, chaque étudiant sera en charge du traitement et du suivi d’un animal. Pour chaque session, les 4 animaux témoins seront utilisés pour une séance d'étude d'organe isolé et ne seront donc pas réutilisés à la seconde séance d'étude. Les 8 à 11 animaux restant seront utilisés pour la séance d'étude suivante, avec 4 nouveaux animaux témoins (annexe 3). Le même nombre d'animaux sera utilisé pour la session suivante. Soit un total de 34 animaux + 3 animaux surnuméraires par session soit 34+3+3=40 animaux par an pour 52 étudiants et 200 animaux pour 5 ans pour 260 étudiants. A ces animaux s’ajoutent la première année les 12 animaux nécessaires à l’étude préliminaire soit 212 animaux au total. Une semaine avant la séance d'étude, les étudiants s'entraineront à la réalisation de la VO sur des rats issus du surplus d'élevage, à raison d’1 rat par étudiant. Ces rats serviront aussi pour l'apprentissage des étudiants de la seconde séance d'étude d'une même session. Ainsi pour une session de 26 étudiants en moyenne, il sera prévu 13 animaux+ 5 animaux surnuméraires, c'est-à-dire pour un an et deux sessions, un total de 26+10=36 rats par an et pour 52 étudiants. Ainsi au total sur 5 ans, 212 + (36 x 5)= 392 rats pour 260 étudiants.Ce chiffre sera bien évidemment indexé chaque année sur le nombre réel d’étudiants inscrits à notre formation. Afin de garantir une formation de qualité aux étudiants, il n’est pas possible de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant au moins 2 éléments (tunnel en plastique noir, bâtonnet en bois et noix à ronger). Afin de limiter le stress des animaux lors de la manipulation, mais également lors de la mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque, qui s’effectue à l’aide de tubes à contention, les animaux seront habitués à la préhension/contention et à ces mesures quotidiennement pendant la semaine précédant le début des travaux pratiques. Cette habituation se fera via un système de récompense (pop corn, gâteau sec, vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt séché, billes de céréales…). Tout animal présentant des signes de stress ou de maladie tels que: poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids tel qu'attendu à l'âge de ces animaux ne sera pas inclus dans le TP. Enfin, le site de piqure pour le prélèvement de la goutte de sang (nécessaire à l'analyse de la glycémie) sera noté pour chaque rat et modifié à chaque mesure pour limiter la sensibililté.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très souvent utilisée pour les études de pharmacologie. C'est notamment une espèce de choix pour l’étude de la fonction cardiaque, notamment en pharmacologie de sécurité. C'est donc un modèle de choix pour l'étude des effets de médicaments agissant sur la fonction cardiovasculaire. Pour voir l'effet des médicaments utilisés des animaux jeunes adultes sont couramment utilisés dans les essais de pharmacologie. Les animaux seront utilisés à deux stades différents en fonction du sexe: - 8 à 12 semaines pour les mâles - 14 à 18 semaines pour les femelles Ces stades sont choisis d'une part pour que les animaux aient un poids permettant l'utilisation des tubes de contention fournis dans le système de mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque et d'autre part afin que les mâles et femelles utilisés puissent provenir des mêmes portées de notre élevage. Quant aux animaux utilisés pour l'apprentissage de la voie orale, ils seront de tout âge (> 7 semaines) selon les disponibilités du surplus d'élevage.
Développements méthodologiques et formations sur la plateforme imagerie par résonance magnétique (IRM) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 100
300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt séances d'IRM sous anesthésie, d'une durée maximale de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste, non pour répondre à une question précise mais pour mettre au point des protocoles d'imagerie et former de nouveaux utilisateurs de la plateforme. Le porteur signale les risques de l'anesthésie répétée, hypothermie, troubles cardio-respiratoires et non-réveil, ainsi qu'une douleur au point d'injection. Il indique développer d'abord les méthodes sur échantillons in vitro ou ex vivo et ne recourir à l'animal vivant que pour valider les protocoles.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment la caractérisation d'une cohorte d'animaux (phénotypage), le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d’imagerie. Un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants est possible avec l'IRM petit animal. L’objectif de ce projet est large et consiste à : (i) Développer des méthodes spécifiques innovantes aux besoins des équipes de recherches (ii) Adapter des méthodes standards existantes aux besoins des équipes de recherches (iii) Pratiquer des sessions de formation aux nouveaux utilisateurs de la plateforme Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices à long terme. Du point de vue scientifique, ce projet permet à la plateforme de rester à la pointe de la technologie et d’appliquer de nouvelles méthodes pour répondre à des questions scientifiques diverses (phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie). D’autre part, ce projet permet de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie déjà existants. A la fin de chaque étude, nous pouvons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permet de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes peuvent être utilisées pour appuyer une demande de financement. Du point de vue humain, ce projet permettra au personnel d’acquérir de nouvelles compétences : la préparation de l’animal (si la formation initiale d’expérimentation animale est validée), connaissances techniques de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et des séquences, prise en main de la console IRM, traitement des données IRM.
Procédures
Les animaux, 300 au total incluant 200 souris et 100 rats, réaliseront des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés jusqu’à 20 fois sur le même animal avec un délai de 24h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : Risques liés à l’anesthésie : stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose Risque liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement
Devenir
Tous les animaux (300 au total, rats et souris confondus) peuvent être utilisés plusieurs fois dans le même projet : plusieurs examens par imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ou sans injection de produit de contraste peuvent être réalisés sur le même animal. En fin de période de maintien (15 mois ou 20 examens IRM) ou en cas de points limites atteints les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles IRM (imagerie par résonance magnétique) existants seront dans un premier temps réalisés sur des échantillons in vitro ou ex vivo (organe prélevé). Seules les méthodes nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées in vivo. Pour les autres méthodes, des tests in vivo seront réalisés en fin de processus afin de valider la méthode précédemment testée et développée sur des échantillons in vitro ou ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Selon les études, entre 1 et 3 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Un animal est le minimun nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode et 3 animaux est le minimum pour calculer la moyenne et l’écart-type sur les mesures réalisées. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant afin d’obtenir un échantillon plus représentatif. L’imagerie est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi longitudinal, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps de références d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous favorisons la réutilisation d’animaux ayant déjà été utilisés dans d’autres études avec des procédures classées légères. Un total maximum de 300 animaux est prévu sur les 5 années de ce projet, dont 200 souris et 100 rats. La réalisation d’un examen IRM (imagerie par résonance magnétique) sur un animal permettra également de former une équipe directement sur son étude pilote et d’éviter d’utiliser des animaux seulement pour de la formation. Le but de ce projet étant plutôt de réaliser des études de faisabilité, nous n’envisageons pas de réaliser systématiquement des tests statistiques. La moyenne et écart type seront calculés (pour les groupes supérieurs à 3 animaux) pour avoir une référence et pourront être utilisés à posteriori pour des calculs de puissance pour les études ultérieures.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température/hygrométrie/éclairage. Les cages sont enrichies (nids, congénères, bâtonnets à ronger). Le transport des animaux entre la zone d’hébergement et la salle d’IRM (imagerie par résonance magnétique) se fait à l’aide d’un chariot dans une cage d’hébergement avec un enrichissement identique à celui de la cage d’origine. Les animaux sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle de préparation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Une seule cage à la fois est amenée dans la pièce de préparation. Pendant qu’un animal est utilisé, les autres animaux de la cage sont laissés dans leur cage avec nourriture, eau ad libitum et enrichissement. Avant l’installation de l’animal sur le berceau IRM, du gel oculaire est appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire, de la lidocaïne est appliquée sur les zones en contact avec les barres d’oreilles et de la vaseline est appliquée avant d’insérer la sonde rectale. La chambre de réveil est thermostatée, l’animal n’est remis dans sa cage d’origine que lorsqu'il est parfaitement réveillé. Il sera à nouveau examiné sous 24 heures pour vérifier sa récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration supérieure à 120 respiration par minute (RPM) ou inférieure à 20 RPM malgré l'ajustement d'anesthésique ; une température supérieure à 40 degrés pendant plus de 5 min, une chute de température (perte de 1 degré en moins de 5 min) non liée à la baisse de température de consigne du bain marie ou de modification de l’anesthésie, une température trop basse (inférieure à 34 degrés pendant plus de 5 min et sans augmentation de cette dernière). Un animal inclus dans un lot test fera au plus 20 IRM dans sa vie (entre 3 semaines et 15 mois) avec un délai de récupération de 24h minimum et en ayant vérifié son état de récupération. Les animaux engagés seront surveillés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe. En cas de signes de mal être : poils piqués, amaigrissement, posture voutée, un avis sera demandé à la structure en charge du bien être animal et au vétérinaire.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles rongeurs sont développés pour mimer des pathologies humaines. Les animaux peuvent être imagés entre 3 semaines et 15 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation longitudinale des animaux. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles.
Evaluation des effets anti-allodyniques/hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur neuropathiques associés à différents tests chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
12 490 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 10 990 en gravité sévère. Une douleur neuropathique leur est provoquée par chirurgie ou injection, puis ils subissent des stimulations mécaniques ou thermiques répétées jusqu'à six fois par jour et l'administration de composés par de multiples voies avec prélèvements sanguins, pour tester des candidats analgésiques. Le porteur décrit des atteintes possibles, paralysie, automutilation dans de rares cas, amaigrissement, anémie et perte de tonus, et indique que la plupart des modèles restent douloureux dans le temps, ce qui exclut selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage à l'humain, l'in vitro ne portant que sur la nociception.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur neuropathique et pour différent type de douleur (mécanique, thermique). Ces modèles et tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années. La douleur neuropathique est liée à une atteinte des nerfs. Elle a différentes origines. La première origine est un traumatisme ou une compression. Elle peut aussi être due à un agent chimique tel que l’oxaliplatine (anticancéreux), Les maladies telles que le diabète, le cancer, les infections au VIH et le zona peuvent aussi entrainer une neuropathie. Ces douleurs se traduisent majoritairement par une allodynie (douleur induite par un stimulus normalement non douloureux) ou une hyperalgésie (sensation de douleur ressentie plus intensément) induite par le toucher, la pression, le froid ou chaud. En France, c’est 7 à 10% de la population qui est atteint de douleurs chroniques. Cette hypersensibilité a un impact sur la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépressions). Ceci engendre donc une augmentation des visites chez les professionnels de santé (médecins généralistes, psychiatres…) ainsi qu’une augmentation des prescriptions de médicaments L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Induction du modèle : chirurgie ou injection en intrapéritonéale afin d’induire le modèle. Ils seront ensuite testés avec un des tests suivants. Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les 6 modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur neuropathique chronique ou aigue. Les autres nuisances liées au développement de ces modèles sont des paralysies ou automutilations (dans de rares cas, nuisances sévères), une patte qui se recroqueville plus ou moins (nuisance modérée), une hyperglycémie, un amaigrissement (nuisance modérée), une perte de poids, parfois une anémie et une perte de tonus. Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité réduite mais possible (nuisance légère). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisance légère
Devenir
Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Seul le modèle d’administration aigue à l’oxaliplatine pourrait être replacé. Bien que les animaux ne présentent plus d’allodynie après une semaine nous ne connaissons pas les impacts potentiels que l’administration en systémique a pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the Study of Pain) , la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces modèles sont couramment utilisés au sein de la structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre d’immersion de la patte ou de mVF, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l'assoication internationnal de l'étude de la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés dans l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents lors de l’induction de la pathologie (21 à 49 jours ; 80-280g pour des mâles). Ces stades ont été choisis car ils sont adaptés au développement des modèles, ils permettent un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ces stades de développement permettent aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Etude de la stimulation des neurones impliqués dans la mémoire spatiale chez le rat mâle vieillissant
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections intracérébrales sous anesthésie, douze autres injections, une contention de trente minutes destinée à provoquer un stress avec prélèvements sanguins répétés, et un test de mémoire spatiale en piscine, pour étudier le rôle de nouveaux neurones dans la mémoire au cours du vieillissement. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut entraîner douleur, perte de poids ou infection de la plaie. Il affirme qu'une approche intégrée impose l'animal vivant et écarte tout modèle in vitro ou in silico.
Objectifs
Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire spatiale. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus mnésiques. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients chez qui les capacités mnésiques sont préservées. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences interindividuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. Un des processus permettant d’expliquer ces différences serait la capacité des nouveaux neurones créés à l’âge adulte dans le gyrus dentelé de l’hippocampe, à s’intégrer totalement (individus résilients) ou partiellement (individus vulnérables), dans le réseau de neurones du gyrus dentelé au cours des processus de mémoire. L’objectif de ce projet est de regarder si la stimulation des nouveaux neurones améliore la mémoire spatiale des animaux dit vulnérables.
Bénéfices attendus
Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences interindividuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
6 gestes techniques seront réalisés : *Composition corporelle : Après une acclimatation de 30 minutes dans l’appareil à Résonnance magnétique nucléaire, les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention en plastique durant le temps de l’examen qui dure 3 min. *Prélèvement de sang à la queue : les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention pendant 30 min pour induire un stress. Immédiatement après, le sang est prélevé (2 min). L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard (3x2 = 6min). *Injections intracérébrales : Geste chirurgical réalisé sous anesthésie gazeuse (durée moyenne 50 min). *Injections autres : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 12 injections (durée totale préhension de l’animal + injection =36min) *Test de la mémoire : les rats nagent dans une piscine et apprennent à localiser une plateforme immergée. Lors de l’habituation, ils passent 2x60s (2min) dans la piscine sans la plateforme. Lors de l’apprentissage, ils font chaque jour 4 essais, pendant 8 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans l’eau (temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s = 6 min). Au fil des jours, les animaux apprennent et le temps passé dans l’eau diminue : temps moyen passé dans l’eau au cours de ce test 40s x 4 essais par jour soit 160s = 2min40 (durée totale moyenne passée dans la piscine : 8x160s = 1280s = 21min20s). *Euthanasie : Les animaux sous anesthésie gazeuse sont euthanasiés (induction 5min + maintien 3-4min jusqu’à confirmation euthanasie) par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’euthanasique.
Impact sur les animaux
Comme tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux (stéréotaxie, incision de la queue), il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention lors de la mesure de la composition corporelle, celle-ci sera la plus légère possible et de durée relativement courte (3min) de manière à induire le moins de stress possible. S’agissant de la contention afin d’étudier la réactivité cérébrale en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection ou les plaies chirurgicales s’infectent ou deviennent douloureux. De même dans les 2 jours suivants la chirurgie stéréotaxique, il est possible que les animaux perdent du poids ou présentent des signes de douleur. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses réalisées sur leur cerveau.
Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact d’une stimulation des néo-neurones du Gyrus denté au cours du vieillissement. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in silico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, variations anatomiques interindividuelles entraînant l’injection du virus en dehors de la région cérébrale ciblée, problèmes lors de la dissection), ainsi que des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus). Une analyse préalable de la normalité des données sera réalisée afin de vérifier la possibilité de poursuivre l’analyse sur des statistiques paramétriques. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents.
Raffinement
Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives (grande taille) enrichies afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique et manipulés mensuellement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront hébergés dans une animalerie dont la température et le taux d’humidité seront contrôlés et avec un cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera à volonté et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : En fin de chirurgie, un anti-inflammatoire sera injecté en vue de limiter la douleur post-opératoire. Après la chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire. Si un animal présente des signes de douleur, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée toutes les 6 à 12h. En cas de signes d’infection de la plaie chirurgicale, nous la désinfecterons et administrerons un analgésique à l’animal toutes les 6 à 12 heures. Si le bout de la queue s’infecte, nous désinfecterons la plaie et ce jusqu’à disparition totale de l’infection. Si les sites d’injections intra-péritonéales ou sous-cutanées s’infectent ou s’enflamment, nous nettoierons la zone avec et administrerons un baume cicatrisant jusqu’à disparition complète des symptômes. Nous utilisons des grilles d’évaluation de la douleur permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié par inhalation de gaz carbonique.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la formation des nouveaux neurones au cours de la vie (néo-neurogénèse) est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intracérébrales. Les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après celles-ci. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent d’étudier le rôle des nouveaux neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de troubles de la mémoire au cours du vieillissement.
Mise en place de formations en vue d’une qualification initiale aux prélèvements sanguins et administrations de produits sur les animaux utilisés dans le développement pré-clinique des médicaments
- Formation professionnelle
Rats : 150
Cochons d'Inde : 45
Hamsters dorés : 45
Lapins : 45
Chiens : 45
480 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 tués à l'issue, 310 réutilisés et 20 chiens proposés à l'adoption. Souris, rats, cobayes, hamsters, lapins et chiens subissent des prélèvements sanguins et des administrations répétées par de multiples voies, non pour produire des connaissances mais pour entraîner le personnel aux gestes techniques des études précliniques de médicaments. Le porteur reconnaît que ces gestes peuvent provoquer douleur, stress, perte de poids et mobilité réduite. Il présente la réutilisation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et indique qu'un apprentissage sur mannequins précède le passage à l'animal vivant.
Objectifs
L’acquisition de compétences techniques par le personnel appelé à utiliser des animaux dans un cadre expérimental est nécessaire pour la bonne réalisation des études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de médicaments ainsi qu’au maintien du bien-être animal, notamment l’administration de médicaments sous surveillance vétérinaire. Cette acquisition ne peut se faire que par le suivi d’un programme de formation réalisé dans le cadre d’une qualification initiale du personnel aux actes techniques les plus courants qu’il sera amené à appliquer dans les projets de recherche autorisés par le ministère. Ce projet s’inscrit directement dans le cadre de ce programme de formation et s’adresse au personnel ayant la certification en expérimentation animale (ou en cours d’obtention). Il en constituera la dernière étape. Il sera précédé par l’utilisation de susbtituts aux animaux vivants (manequins, tissus articificiels, etc) lorsqu’ils seront disponibles, et débutera par une période d’observation des gestes effectués par un utilisateur expérimenté, afin qu’aucun geste ne soit pratiqué pour la 1ère fois sur un animal vivant. Le passage à l’utilisation d’animaux vivants ne se fera que lorsque les collaborateurs en formation auront démontré une aptitude suffisante lors du travail sur des systèmes de simulation lorsque ceux-ci sont disponibles. Un encadrement des collaborateurs en formation par des tuteurs expérimentés, le service vétérinaire, le service formation, et la structure en charge du bien-être animal (SBEA) permettra d’évaluer en permanence l’évolution des aptitudes de ces collaborateurs ainsi que le maintien en bonne santé des animaux utilisés dans le cadre de la formation.
Bénéfices attendus
Ce projet conclura la formation du personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir une maitrise parfaite des principaux gestes techniques (prélèvements sanguins et administration par voie orale, veineuse, sous-cutanée, intranasale, intrarectale ou encore intrapéritonéale) nécessaires à la conduite des projets d’études pré-cliniques. Ce projet permettra ainsi au personnel formé de débuter une étude dans le cadre d’une procédure autorisée en garantissant une maîtrise parfaite des gestes techniques réalisés. La qualité des données expérimentales ainsi obtenues sera ainsi optimale, tout en réduisant l’impact négatif sur le bien-être des animaux en conséquence de gestes non maitrisés et mal réalisés. De plus, ce projet permettra, pour des utilisateurs expérimentés, de maintenir leur niveau de compétence technique dans la cadre de gestes effectués à intervalle de temps long.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang vigile et anesthésie dont le nombre et la fréquence suivent les recommandations EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations), ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development.
Impact sur les animaux
La formation à certains gestes techniques, bien que faiblement invasifs, peut constituer un risque pour la santé des animaux utilisés. En fonction du type de geste, des douleurs dans la zone où le geste est pratiqué,une augmentation du stress, une perte de poids, ou encore une réduction de la mobitilité pourront être observés. Cependant, il n’est pas attendu que ces effets persistent dans le temps, ni qu’ils soient systématiques en raison du strict encadrement par des tuteurs expérimentés. Avant chaque réalisation du geste technique, le collaborateur en formation et le tuteur s’assureront du bon état de santé de l’animal. De plus, les animaux identifiés pour la formation feront l'objet d'une surveillance accrue par les vétérinaires du centre.
Devenir
La procédure de ce projet est une procédure légère au cours de laquelle il n’est pas attendu d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Ainsi, si un vétérinaire rend un avis favorable, la plupart des animaux de ce projet pourront être réutilisés dans un autre projet autorisé, y compris le projet présent. Le vétérinaire prendra en compte l’effet cumulatif pour chaque animal (ou lot d’animaux pour les rongeurs) dans sa décision. Pour les animaux naïfs avant de commencer ce projet, il sera possible de les réutiliser dans des procédures légères ou modérées. Pour les animaux non naïfs au début de ce projet (c’est-à-dire ayant déjà été inclus dans au moins une autre procédure expérimentale), il sera privilégié la réutilisation dans des procédures sans réveil, bien qu’une utilisation dans des procédures légères ou modérées soient aussi possible. Enfin, la mise à l’adoption d’une partie des chiens est envisagée, après avis vétérinaire et de la SBEA.
Remplacement
Avant d’être formé aux gestes techniques sur un animal vivant, le personnel en formation effectuera un apprentissage des ces gestes sur des systèmes de substitution (mannequins, tissus artificiels, etc). Ces systèmes de substitutions seront mis en place de manière progressive au cours de la durée de ce projet.
Réduction
L’utilisation de système de substitutions (mannequins, tissus artificiels, etc) d’une part, et l’évaluation des compétences par un personnel qualifié avant passage à l’animal d’autre part permet de réduire le nombre d’animaux. Ces systèmes de substitution seront mis en place progressivement au cours de ce projet afin d’identifier et tester les plus adaptés aux gestes techniques et aux espèces utilisées dans les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de candidat médicament. Ils seront mis à jour régulièrement selon l’avancée des connaissances techniques et scientifiques. De plus, dans la plupart des cas, les animaux utilisés dans le cadre de la formation sont des animaux ayant participé à des procédures expérimentales d’un niveau de gravité réelle légère ou modérée. Ceci permettra d’éviter le plus possible l’utilisation d’animaux naïfs uniquement dans un but démonstratif et éducatif. De même, des animaux ayant participés à la formation à des gestes techniques faiblement invasifs pourront être ensuite inclus dans d’autres projets, après consultation du servicevétérinaire et de la SBEA. Cette ré-utilisation permet de réduire jusqu’à 50% le nombre d’animaux utilisés uniquement pour la formation.
Raffinement
Les animaux utilisés en formation font l’objet d’une surveillance accrue de la part des animaliers, du service vétérinaire et de la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux, faisant a minima un point trimestriel sur le suivi des animaux en formation. Avant chaque pratique d’un geste technique. L’utilisation de grille de score comportemental et de bien-être permet de s’assurer du bon état de santé des animaux, et si besoin d’exclure de la formation ceux présentant des signes cliniques ou un comportement anormal et mettre en place un traitement adpaté si nécessaire. Chaque animal utilisé pour la formation à des gestes techniques possède une fiche individuelle sur laquelle est documentés, à chaque utilisation, le(s) type(s) de gestes techniques pratiqué(s) ( en précisant les volumes d’admistration et de prélèvement, les produits administrés, etc), ainsi que l’identification du collaborateur en formation et du tuteur présent lors de la session. Ces fiches individuelles sont consultables par le service vétériniare et la SBEA dans le cadre du suivi de l'utilisation des animaux en formation. Les volumes prélevés et adminitrés aux animaux de formation respectent les lignes directrices EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations), ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development afin de réduire le stress des animaux. Lorsque cela est possible (c’est-à-dire après un avis vétérinaire et de la SBEA), la ré-utilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales permet d’avoir, pour la formation, des animaux habitués à la contention et à la réalisation des gestes techniques faiblement invasifs. Cela participe à la diminution du stress de l’animal et du collaborateur en formation. Enfin, le passage à la réalisation d’un geste technique sur l’animal vivant pourra se faire d’abord sous anesthésie afin de réduire le stress de la contention tant pour l’animal que le collaborateur en formation, et ce même si le geste est praticable sur un animal vigile.
Choix des espèces
Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires (ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo qui nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces différentes. Les rongeurs, les lapins et les chiens sont trois types d’espèces fréquemment utilisés, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs et Lapins, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois.
Évaluations de l’efficacité des traitements antibiofilms pour les biofilms bactériens pathogènes colonisés dans des cathéters intraveineux chez le rat.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
688 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit la pose chirurgicale d'une chambre implantable et d'un cathéter, une injection sous-cutanée quotidienne jusqu'à vingt jours, une infection bactérienne et jusqu'à quatre prélèvements sanguins, pour évaluer des traitements contre les biofilms qui colonisent les cathéters. Le porteur décrit les nuisances attendues comme la chirurgie et une possible infection avec perte de poids et douleur. Il écarte le remplacement in vitro au motif qu'il ne reproduirait pas la complexité d'un "organisme entier" et sa réponse immunitaire.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le travail de notre laboratoire visant à mieux comprendre la physiologie distincte des bactéries grandissant au sein d’une communauté de biofilm, et ce afin de mettre au point des méthodes efficaces pour contrôler les infections dues aux biofilms. Les communautés bactériennes en biofilms sont particulièrement difficiles à éradiquer car elles sont à la fois protégées de l’action du système immunitaire par la structure physique du biofilm (présence de matrice extracellulaire) ainsi que de l’action des antibiotiques par la présence, au sein du biofilm, de sous-populations de bactéries particulièrement tolérantes aux antibiotiques, les bactéries « persistantes ». Ce projet vise donc à identifier chez certaines bactéries pathogènes les fonctions responsables de la colonisation de cathéters centraux, d’évaluer des traitements de type préventifs ou curatifs pour éviter la formation de biofilms ou éradiquer des biofilms existants, et enfin de déterminer si le traitement de ces biofilms par des antibiotiques peut entraîner la sélection de résistance à ces antibiotiques. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de fournir de nouvelles pistes sur les traitements à utiliser pour lutter contre les infections liées aux biofilms tout en prenant en compte le facteur sélection de résistance aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la formation de biofilms sur des cathéters centraux par certaines bactéries pathogènes et de la réaction de ces bactéries à certains traitements. Nous pourrions mieux appréhender si certaines bactéries peuvent développer des mécanismes de résistance, ou bien si les traitements préventifs ou curatifs appliqués sont efficaces pour éviter la formation de biofilms, ou traiter les biofilms dans le cas où ceux-ci sont déjà formés. Grâce à ces études qu’on peut estimer être pré-cliniques, on peut envisager dans le futur d’adapter certains traitements contre ces infections dues à la colonisation de matériel médical et ainsi réduire le taux de morbidité et mortalité des patients malheureusement infectés.
Procédures
Toutes les interventions en dehors de la contention seront faites sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse. Chaque rat subira une injection sous-cutanée quotidienne rapide (quelques secondes) sur l’ensemble de la durée des procédures employée (au maximum sur 20 jours). Chaque rat subira une pose de chambre implantable dans le dos et une cathéterisation. L’intervention chirurgicale durera 45 min. Chaque animal subira au maximum 4 prélèvements de sang au niveau caudal chacun à plus de deux jours d’intervalle. Ceux-ci dureront moins de 3 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances causées aux animaux seront liées à la chirurgie nécessaire pour la pose du cathéter central et au possible développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront tous subis une intervention chirurgicale avec pose d’un implant et été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, tous ces animaux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
Ce projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). La complexité des facteurs de l’hôte qui peuvent influencer le processus de colonisation des matériels médicaux est notamment trop importante pour être reproduite à ce jour in vitro.
Réduction
D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Pour ce qui est des traitements innovateurs qui seront testés, aucun d’entre eux ne sera évalué in vivo si celui-ci n’a pas d’abord démontré son efficacité in vitro. Les protocoles in vivo sont rédigés en amont pour éliminer le risque de réaliser une expérience non indispensable (rejet d’investigations discutables). Un maximum de 4 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 2 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ au niveau du cathéter central et en dehors de celui-ci, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les Rats hébergés à 4 maximum par cage. Le fait d'avoir un hébergement de 4 animaux par cage au lieu d'un seul conduit à un meilleur confort pour les rats, moins d’anxiété et moins d’agitation lors des manipulations. Cette cohabitation n’est pas associée à un plus grand risque de difficultés de cicatrisation ni d’ablation intempestive des chambres implantables. Nous ferons une visite quotidienne durant la phase d’acclimatation, même en l’absence de manipulation, puis au moins une fois par 24h durant les jours suivant. Une attention particulière sera donnée après la phase de chirurgie et d’inoculation des cathéters par les bactéries.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce s’est naturellement faite par le type de matériel implantable à utiliser dans nos expériences. Le cathéter intraveineux à chambre implantable de type pédiatrique est directement pertinent pour le traitement d’infections chez les patients dû au diamètre interne du cathéter ainsi qu’au type de matériau qui ont un impact majeur sur la formation du biofilm. Les dimensions d’un cathéter de type pédiatrique ne permettent pas une adaptation à des animaux plus petits comme la souris. Tous les animaux fournis seront des rats mâles de 8 semaines et d’environ 275-300 g. À ce stade, les veines ont atteint une taille suffisante pour faciliter la pose du cathéter, et le système immunitaire pleinement développé pour participer au contrôle des contaminations du matériel implanté.
Formation du personnel à des gestes techniques
- Formation professionnelle
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Gerbilles de Mongolie : 100
Lapins : 25
1 675 animaux non-humains de six espèces, souris, rats, cobayes, hamsters, gerbilles et lapins, vont être utilisés pour entraîner le personnel à des gestes techniques, une partie étant réutilisée ou adoptée et le reste tué. Selon le geste appris, ils subissent contentions, administrations et prélèvements, certains terminaux comme la ponction de liquide céphalo-rachidien ou la biopsie de peau sous anesthésie, jusqu'à l'euthanasie par dislocation cervicale ou décapitation. Le porteur décrit un stress lié à la contention et une douleur aux points d'injection, et indique privilégier d'abord la formation sans animaux, sur mannequins ou cadavres. Le projet ne produit pas de connaissances, les animaux étant utilisés pour l'entraînement à des gestes prévus dans d'autres protocoles.
Objectifs
Ce projet est un support à la formation du personnel de l’établissement utilisateur à la mise en œuvre des procédures expérimentales des projets de recherche autorisés.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de consolider et valider la formation du personnel afin que les personnes impliquées dans la réalisation des procédures expérimentales des projets de recherche répondent au mieux aux exigences règlementaires en terme de respect du bien-être de l’animal.
Procédures
Les gestes techniques considérés dans cette procédure peuvent être : Préhension, contention Administration : per os, sous cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, intradermique sur animal vigil ou anesthésié Prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié Prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien Biopsie de peau sur animal anesthésié(exsanguination) Prélèvements terminaux de sang et tissus sur animal anesthésié.Préparation à la chirurgie : intubation, dispositif supra-glottique sur animal anesthésié. Euthanasie : dislocation cervicale, décapitation selon l’espèce Le nombre et la durée seront définis en fonction du niveau de formation des personnes aux gestes techniques. La durée des interventions par animal n’excèdera pas une heure.
Impact sur les animaux
Stress et inconfort lié à la contention. Douleur au point d’administration ou de prélèvement. Risque lié à l’anesthésie.
Devenir
Préhension, contention : Réutilisation ou adoption possible selon espèce Administration : Réutilisation ou adoption possible selon espèce Prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié : Réutilisation ou adoption possible selon espèce, euthanasie en cas de réaction exagérée Prélèvement de liquide céphalo-rachidien : Euthanasie Biopsie de peau sur animal anesthésié : Euthanasie Prélèvements terminaux de sang et tissus sur animal anesthésié : Euthanasie Préparation à la chirurgie : intubation, dispositif supra-glottique sur animal anesthésié : Réutilisation ou adoption possible selon espèce Euthanasie : Pas de réutilisation ou autre
Remplacement
Chaque fois que cela est possible, les formations sont réalisées dans un premier temps sans avoir recours à l’animal (e-learning, animaux morts, mannequins ou matériaux synthétiques).
Réduction
Lorsque le type de technique apprise le permet, les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque session de formation, observés attentivement puis feront l’objet d’un examen vétérinaire afin de pouvoir à nouveau être utilisés.
Raffinement
En fonction du geste technique considéré (ex : administration, prélèvement, mise à mort, préparation à la chirurgie), la formation se fera dans un premier temps sur animal anesthésié. Un protocole analgésique sera également mis en place chaque fois que cela est nécessaire.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est fonction des besoins de formation en prévision d’études réalisées dans le cadre d’autres projets autorisés. Pour le personnel amené à réaliser des procédures expérimentales sur animaux, il est indispensable d’acquérir et de maîtriser les gestes spécifiquement pour les espèces concernées afin de garantir la meilleure technicité au moment de leur réalisation. Animaux adultes ou animaux juvéniles sevrés (rongeurs, lagomorphes). Les stades de développement des animaux utilisés sont fonction des besoins des chercheurs.
Défaut alvéolaire dans la mandibule de rat : un modèle de chirurgie maxillo-faciale pour l’étude de biomatériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur mâchoire inférieure est opérée pour y créer un défaut osseux, puis la régénération est suivie au microscanner cinq fois sur deux mois avant la mise à mort pour analyses histologiques, afin de tester des biomatériaux de comblement destinés à la chirurgie dentaire. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur et une difficulté à mastiquer les premiers jours, compensées par une nourriture ramollie et des analgésiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue ces matériaux et que le test sur petit animal est un préalable obligé avant l'humain.
Objectifs
Les pertes de substances osseuses en chirurgie orale représentent un réel défi. Les moyens de reconstruction actuels font souvent appel à des greffes autologues qui sont disponibles en quantité limitée et peuvent être source de complications post-opératoires pour les patients. L’ingénierie tissulaire osseuse cherche à développer de nouveaux substituts osseux d'origine naturel pour pallier aux inconvénients de l'autogreffe. A titre d'exemple, dans le cadre de la pose d’un implant dentaire, il est souvent nécessaire de régénérer l’os manquant pour stabiliser l'implant. Cette régénérations peut employer différents dispositifs médicaux tels que : (i) des matériaux de comblement qui remplacent l'os ou favorisent la régénération osseuse et/ou (ii) des membranes qui jouent un rôle barrière pour prévenir l’infiltration cellulaire des tissus mous et préserver les cellules osseuses pour régénérer l’os.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux implantables (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire inférieure (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendra une douleur pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénients (administration dans les premiers temps de nourriture ramollie pour faciliter la mastication). Les animaux seront aussi imagés à intervalle de temps régulier. L'évolution du défaut ossuex pourra ainsi être suivi et si des complications venaient à être observées, des mesures seront prises pour éviter toute souffrance.
Devenir
Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après les temps pré-définis (2, 4 et 8 semaines après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique et angiogénique du biomatériau étudié.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent au préalable être testés dans un modèle de petit animal (ici le rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Ce nombre a également été choisi pour s'affranchir des variabilités inter- et intra-individu concernant la régénération de l'os.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par groupe. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement pour éviter toute source de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'analgésique pour prévenir toute douleur liée à l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés lors de la chirurgie. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage individuelle chauffée à l'aide d'un tapis chauffant afin d'éviter tout contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. De la nourriture préalablement humidifiée sera mise à sa disposition directement dans la cage afin de faciliter sa mastication après la chirurgie. Pour pallier à la douleur de l'intervention, un traitement quotidien pendant 3 jours sera administré à l'animal. Son bon rétablissement sera observé sur une période de 5 jours. Concernant les compétences des expérimentateurs, ceux-ci possèdent les qualifications nécessaires, la formation réglementaire et des formations continues (formation à l'expérimentation animale de niveau expérimentateur et/ou concepteur). La maîtrise de la contention et des différents types d'injections à appliquer sont également maîtrisés par les expérimentateurs. Le personnel de l'animalerie possède toutes les compètences pour s'assurer du bien être et du suivi des animaux au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses alvéolaires. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mandibule. L'utilisation du modèle Rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre. Des rats Sprague Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 300-350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’état d’anxiété et/ou l’activité compulsive chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 4800
12 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie des animaux témoins étant réutilisée dans d'autres projets et le reste tué. Ils reçoivent des composés par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée, puis sont soumis à l'un de cinq tests comportementaux mesurant l'anxiété, avec parfois une mise à jeun jusqu'à vingt heures et un isolement sans eau ni nourriture jusqu'à quarante minutes, pour évaluer de nouvelles molécules anxiolytiques. Le porteur estime les atteintes limitées à un stress et une brève douleur d'injection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et juge le rat et la souris "les espèces les plus adaptées" avant tout passage chez l'humain.
Objectifs
Les troubles anxieux constituent une maladie psychique chronique fréquente et souvent invalidante qui s’exprime sous plusieurs formes chez l’homme (anxiété généralisée, phobies, trouble panique, troubles obsessionnels compulsifs…). Ils touchent environ 21% de la population générale sur la vie entière et peuvent être associés à de nombreux facteurs de comorbidité (prise d’alcool, troubles dépressifs…). Si les antidépresseurs et les anxiolytiques sont généralement employés dans les traitements des troubles anxieux, ces derniers présentent cependant de nombreuses limites (efficacité limitée, effets secondaires…). Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouveaux produit synthétisés ou acquis au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le trouble anxieux et le comportement compulsif chez l’homme. Il s’agira de mesurer la capacité de composés à agir sur l’activité anxieuse et/ou compulsive chez le rat ou la souris pour poursuivre de développement de ces nouvelles molécules en phase clinique chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l’animal l’efficacité potentielle de nouveaux produits pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules vis-à-vis du comportement anxieux de rongeurs, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique ciblée. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l’Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée) ainsi que la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas 2 administrations/jour max) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les animaux seront soumis à un seul des 5 tests de la procédure de ce projet. Chacun des tests a pour objectif de mesurer l'anxiété des animaux et d'évaluer le potentiel de candidats médicaments à moduler cette anxiété. La durée de chaque test sera de 5 minutes à 30 minutes. Les délais d'administration avant les phases de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le comportement anxieux dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, rat et souris étant ici les espèces les plus adaptées.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux (rats, souris) sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…). Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi SBEA (Structure Bien-être Animal) par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur l’anxiété et/ou l’activité compulsive. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests d’anxiété/activité compulsive décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.
Etude des caractéristiques pharmacocinétiques des composés d’intérêts administrés par voie intra-veineuse, voie intrapéritonéale ou voie orale en dose unique chez le rat ou chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 780
1 560 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit une administration unique d'un composé par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, subit jusqu'à deux prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, puis est tué et exsanguiné par perfusion intracardiaque, pour mesurer le devenir des molécules dans l'organisme avant leur passage vers des programmes ciblés. Le porteur décrit un projet "généraliste" en amont, servant de filtre de sélection des molécules, et estime les nuisances faibles hormis une éventuelle toxicité aiguë. Sur le remplacement, il concède que des tests in vitro miment la métabolisation hépatique mais conclut que le modèle animal est "incontournable" pour la pharmacocinétique.
Objectifs
Les propriétés physico-chimiques des composés étudiés leur confèrent des propriétés pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo. Pour étudier l’efficacité pharmacologique des molécules dans un modèle donné ou dans une pathologie précise, il est nécessaire de savoir comment la molécule se comporte une fois administrée à un organisme vivant. C'est-à-dire quelle sera son impact et son devenir dans un organisme dans lequel elle est administrée. Le projet décrit ici a donc pour objectif de détailler des procédures de pharmacocinétiques expérimentales préalables au développement des molécules innovantes dans diverses pathologies. Pour être efficaces, les molécules doivent pouvoir atteindre leur cible, une fois administrées, car les molécules subissent une métabolisation ou une dégradation puis une élimination, la voie d’administration sera donc aussi un facteur essentiel sur la biodisponibilité de la molécule dans l’organisme. Ce projet « généraliste » se place donc en amont de nos programmes de recherches spécifiquement dédiés à une pathologie, il est composé de procédures expérimentales standardisée (voies IP, IV ou PO chez rats et souris) pour les études des caractéristiques PK (pharmaco kinetic en anglais) des molécules qui viendront alimenter les programmes de recherches avals. Ces procédures préalables nécessitent peu d’animaux au regard de l’ambition des programmes menés, ils permettent d’ajouter un filtre supplémentaire dans notre arbre de sélection des nouvelles molécules qui seront destinées aux études d’efficacité chez l’animal. L’ensemble des procédures décrites dans ce projet appliquées à des souris et des rats nécessitera l’emploi de 1560 animaux pour la durée de 5 années que couvre ce projet.
Bénéfices attendus
Ces études préalables aux études d’évaluation de l’efficacité des composés dans les modèles développés dans une pathologie données, permettent de déterminer les conditions optimales d’administration des principes actifs étudiés. Cela peut donc contribuer à obtenir des modèles plus qualitatifs (conditions optimales) et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés (moins de répétitions d’étude).
Procédures
Chaque animal inclus dans les procédures 1 à 4 subira une seule administration, selon les cas elle pourra être réalisée par voie intraveineuse (IV), Intrapéritonéale (IP) ou per-os (gavage intragastrique PO). Les injections IP et IV durent 10 à 15 secondes et peuvent nécessiter l’emploi d’un dispositif de contention lorsque les IV sont faites dans la veine caudale ou au sinus retro-orbitaire. Les administrations PO durent 5 à 10 seconde et sont pratiquées sur un animal maintenu en contention manuelle. • Les procédures 1 et 2 concernent les PK plasmatiques, chaque animal inclus dans ces procédures subira au maximum 2 prélèvements sanguins, ils sont pratiqués sous anesthésie volatile par une ponction au sinus retro-orbitaire faite par un capillaire en verre. Chaque prélèvement dure environ 20 seconde. •Les procédures 3 et 4 concernent les PK plasmatiques et tissulaire, chaque animal inclus dans ces procédures subira un prélèvement sanguin unique (terminal) réalisé sous anesthésie volatile (durée 20 secondes) par une ponction au sinus retro-orbitaire faite par un capillaire en verre. L’anesthésie volatile sera maintenue afin de procéder à l’euthanasie puis à l’exsanguination rapide par une perfusion intracardiaque (durée 30-40 secondes) d’une solution physiologique héparinée.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont produites par les administrations des composés, et sont estimés faibles ou modérées et uniquement produites lors des administrations par voie intraveineuse (au sinus retro-orbitaire) pour lesquelles le recours à l'analgésie est prévue. Les prélèvements sont effectués sous anesthésie et ne produisent pas d'inconfort autre que celui de l'état de l'animal au sortir de son anesthésie. On ne peut pas occulter l’éventualité d’une toxicité aigue post administration du composé étudié mais comme les produits utilisés ne sont administrés qu’une seule fois et qu’ils sont dosés faiblement, , la probabilité d’observation de signes clinique est très minime, mais permettrait les cas échéant de juger de la sévérité de la souffrance et de l’atteinte de points limites qui déclenchent un arrêt anticipé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédures expérimentale. Dans le cas des procédures 1 et 2, bien que nous n'étudions que l'exposition plasmatique, nous mettrons les animaux à mort car il ne peuvent en aucune mesure être employés dans d'autres études ( ils ne sont plus naifs et ont pu stocker des quantités de composés ou de ses métabolites). Dans les cas des procédures 3 et 4, ils sont mis à mort au temps de cinétiques indiqués pour les mesures d'exposition des composés dans les organes clés du métabolisme (foie, reins, etc )
Remplacement
L'objectif principal est d'évaluer la pharmacocinétique de nos molécules suite à une administration per os qui est la voie la plus utilisée dans la Pharmacopée. Cette voie d’administration impose aux molécules un 1er passage entérohépatique lors duquel se déroulent de nombreuses modifications chimiques, même si des tests de stabilité mimant l’action des cytochromes peuvent être appréhendés in vitro, le modèle animal est incontournable pour la réalisation des études de pharmacocinétiques. D’autres voies d’administration systémique (intraveineuse ou intrapéritonéale par exemple) vont renseigner sur les paramètres ADME, elles pourront aussi être utilisées. Ces études seront menées sur animaux sains ou sur des animaux dans un état pathologique induit expérimentalement, en effet la pharamcocinétique des produits peut être modifée dans ces circonstances.
Réduction
Les méthodes analytiques sont performantes, de faibles quantités sont décelables de minière reproductibles, cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à ces études de pharmacocinétique.
Raffinement
Le point sur lequel l'expérimentateur peut agir concerne le raffinement au moment des administrations et prélèvements au cours desquels on apporte un confort par l'utilisation d'analgésique ou de moyens anesthésiques s'ils est avéré qu'ils n'induisent pas un biais expérimental.
Choix des espèces
Les rats et les souris constituent des modèles reconnus dans la littérature scientifique pour l’étude pharmacocinétique de molécules. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes rats adultes à adultes ( 175-200gr minimum) ou des souris adulte de 25-30 gr , il ne sera pratiqué aucune expérience sur des animaux nouveaux-nés.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et de leur effet vasoconstricteur par imagerie laser doppler dans un modèle murin de rosacée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 80
600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des inducteurs de rosacée sont injectés de façon répétée pour provoquer une inflammation cutanée, puis les animaux reçoivent des traitements quotidiens par voie orale, cutanée ou injectée, avec imagerie, mesures de l'épaisseur des oreilles et du dos et prélèvement sanguin terminal, pour tester de nouvelles molécules contre cette maladie de peau du visage. Le porteur reconnaît que la rosacée est "sans gravité" mais insiste sur son retentissement psychologique, et décrit une inflammation locale "transitoire" ainsi qu'un possible dessèchement de la peau. Il écarte le remplacement au motif qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la peau comme tissu vivant, alors que le bénéfice reste conditionné à ce qu'une molécule "se révèle efficace".
Objectifs
La rosacée touche 2 à 3 % de la population adulte, majoritairement des personnes âgées de 30 à 60 ans et atteint deux fois plus les femmes que les hommes. La rosacée est une maladie cutanée chronique caractérisée par une atteinte des petits vaisseaux sanguins du visage. Cette maladie de la peau touche essentiellement la partie centrale du visage (front, nez, joues, menton). Elle se manifeste par des rougeurs du visage occasionnelles ou persistantes ; de la couperose (dilatation anormale et permanente de petits vaisseaux sanguins de la peau, visibles à l'œil nu) ; et éventuellement, diverses lésions cutanées comme des papules, des pustules...Bien que sans gravité, la rosacée peut avoir un fort retentissement psychologique en raison de la visibilité des lésions du visage. Il est indispensable de tester ces molécules dans un modèle murin pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la rosacée afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.
Bénéfices attendus
La rosacée est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints de rosacée de guérir de la rosacée et de son érythème, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.
Procédures
Des traitements seront administrés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre de la rosacée (durée d'intervention
Impact sur les animaux
L'injection répétée des inducteurs de la rosacée induit de l'inflammation locale, mais très transitoire chez l'animal, du fait de l'injection en elle-même et du produit injecté. Il est possible également que les molécules testées par voie topique puissent assécher localement de façon excessive la peau des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées (dans le cas de traitement de 1 à 2 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures car ils ne pourront pas être réutilisés du fait du prélèvement des tissus chez ces derniers.
Remplacement
Nous n'utiliserons le modèle animal de rosacée qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA ; seuil de significativité alpha de 5 % dont le critère principal sera l'épaisseur des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe (groupe d’animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester et le traitement thérapeutique de référence commercialisé). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15 %, une puissance de 70 %, et une différence à souligner de 20 % entre groupes témoins et tests. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du meme animal. Cette approche permet donc de réduire le nombre d’animaux de 50 % au moins comparé à une technique telle que l'histologie qui aurait nécessité le sacrifice des animaux à différents temps.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque cage d'hébergement bénéficie d'un enrichissement adapté (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation de points limites adaptés et établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement sera mise en place ainsi que l'utilisation d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris / rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entres ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faible coûts, cycle de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines, nous permettant ainsi d’avoir un point de comparaison par rapport aux résultats issus de la littérature relative à ce modèle.