Rats
Effet du stress chronique sur la douleur post-chirurgicale chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 480
840 animaux non-humains, 480 rats et 360 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont soumis à un stress chronique destiné à provoquer anxiété et dépression, puis à une incision chirurgicale de la patte, et subissent des dizaines de tests de douleur et de tests anxio-dépressifs, avec un jeûne de 24 heures pour l'un d'eux. Le porteur indique que la douleur ne peut pas être soulagée parce que c'est l'objet même de l'étude, et que les animaux présenteront les signes attendus d'anxiété et de dépression. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale d'un animal vivant.
Objectifs
La douleur chronique post-chirurgicale (DCPC) est une douleur qui perdure au moins 3 mois après une intervention chirurgicale. Elle n’a pas d'autre étiologie et n’est pas du a un problème préopératoire. Son incidence varie de 20 à 85 % et représente un fardeau clinique et économique. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent le développement de la DCPC. Parmi les facteurs de risques potentiels, les facteurs psychosociaux préopératoires, notamment l'anxiété et la dépression, joueraient un rôle clé dans le développement de celle-ci. Les modèles animaux ont fourni des informations essentielles sur l'interrelation et la neurobiologie qui sous-tendent l'association entre dépression et douleur chronique, mettant en évidence le cercle vicieux qui relie ces pathologies. Il a récemment été montré que la douleur post-chirurgicale est prolongée lorsque les animaux sont soumis à un stress conduisant à un état dépressif, ce qui confirme que cette observation clinique peut être reproduite dans des modèles animaux précliniques. L’objectif de ce projet sera d’étudier (1) les effets d’un stress répété et la réponse émotionnelle associée (anxiété, dépression) sur la DCPC puis nous déterminerons (2) les mécanismes neuro-immunitaires impliqués dans le développement, l'expression et le maintien de cette DCPC et des phénotypes anxio-dépressifs induits par le RRS. Ce projet s'efforcera d'examiner et de comparer les effets du stress sur la DCPC chez les mâles et les femelles et de déterminer si des dimorphismes sexuels existent en termes de comportement et de mécanismes neurobiologiques.
Bénéfices attendus
La douleur chronique post-chirurgicale est un résultat potentiellement dévastateur d'une intervention chirurgicale par ailleurs réussie, qui entraîne une augmentation des coûts médicaux directs par l'utilisation de ressources supplémentaires et des coûts indirects par l'absentéisme au travail et la perte de productivité. Elle a également un impact significatif sur les individus et leurs familles, affectant leur fonctionnement physique, leur état psychologique et leur qualité de vie. Ainsi, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement de la douleur chronique post-chirurgicale et l'identification de nouvelles stratégies de traitement contribueront grandement à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de cette affection et permettront d’éviter le développement à long terme de cette douleur post-chirurgicale. Cette recherche fournira un nouvel aperçu mécanistique de la façon dont le stress chronique est impliqué dans l'établissement et le maintien de la douleur chronique post-chirurgicale.
Procédures
Les animaux seront soumis à un stress chronique (temps à déterminer pour le rat via une étude pilote durée maximale envisagée de 6 heures et 1h par jour pendant 3 jour pour la souris) qui entraine le développement de troubles anxio-dépressifs ainsi qu’à une douleur de type post-chirurgicale qui perdure 15 jours environ. Ils subiront une chirurgie sous anesthésie gazeuse au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 minutes environ, 48h après la fin du stress chronique. Les animaux subiront 6 tests nociceptifs d’une durée de 20min environ avant la chirurgie, puis 4 tests pendant le stress chronique puis 30 tests après la chirurgie. Ils subiront également 5 tests anxio-dépressifs d’une durée de 5 à 20 min (avec 24h minimum entre chaque test). Pour un de ces tests les animaux seront mis à jeûn 24h avant la réalisation de ce test mais garde accès à la boisson.
Impact sur les animaux
Nous travaillons sur l’effet de l’anxiété chronique sur la douleur post-chirurgicale. Il y a une douleur qui ne peut donc être soulagée car c’est l’objectif de l’étude. De même les animaux présenteront des signes d’anxiété et de dépression car c’est ce qui est attendu. Pour les procédures de stress chronique d'une durée maximale de 6h pour certains groupes d'animaux, il peut y avoir des risques d’irritation de la peau entrainées par une production excessive d'urine. Concernant l’incision de la patte, l'infection de la plaie après l'opération (dans 2% des cas) peut être observée. Chez les rats, une difficulté dans les déplacements peut être présente les heures suivants l’incision mais cette dernière disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Pour l’un des tests comportementaux, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvements à la fin de l'étude.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet d’un stress chronique dans un modèle de douleur post-chirurgicale nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 15 souris/rats mâles et 15 souris/rats femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque de ces réseaux cérébraux étant minime. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides. Cela permet de calculer le nombre de sujets nécessaires pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables de notre étude. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus (souris) ou 2 ou 3 individus (rats) pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Les espèces et les souches utilisées sont représentatives de celles les plus couramment utilisées dans la recherche sur les neurosciences intégratives des systèmes entiers et correspondent à ce qui a été utilisé précédemment pour développer ce nouveau modèle. Les rats Sprague-Dawley sont utilisés couramment dans la recherche sur la douleur. Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font également de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g pour les souris et poids supérieur à 200g à la chirurgie pour les rats).
Travaux pratiques de physiologie : « Suivi d’une anesthésie générale chez le rat mâle et femelle »
- Enseignement supérieur
325 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés la semaine suivante dans une autre séance de travaux pratiques. Chaque étudiant reçoit un rat, lui administre une injection intrapéritonéale d'anesthésique et évalue la profondeur de l'anesthésie, le risque décrit étant une surdose provoquant un arrêt cardio-respiratoire. Le projet sert la formation d'étudiants au suivi d'une anesthésie, dans le cadre d'un programme pédagogique national. Le porteur indique que la réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux et de l'avis du vétérinaire.
Objectifs
Dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP a lieu. Lors de ce TP, les étudiants réalisent une anesthésie chimique chez le rat et doivent évaluer la profondeur de l’anesthésie de leur animal à intervalles réguliers. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont donc de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : apprendre à reconnaître les signes cliniques permettant d’évaluer le temps d’induction d’une anesthésie, sa profondeur et sa durée d’action chez le rat. - D’un point de vue éthique : sensibiliser les étudiants à l’importance de la surveillance d’un animal anesthésié, à la détection et à la prise en compte des signes cliniques de l’anesthésie (fréquence respiratoire, réflexes cutanés) chez l’animal. De plus, une réflexion est menée par les étudiants en amont du TP sur le respect des 3 R dans ce protocole - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former les étudiants à la préhension / contention du rat vigile et à la réalisation d’une injection intrapéritonéale (IP) chez le rat ; apprendre à observer les animaux anesthésiés ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de 1ère année du BUT Génie Biologique option Biologie Médicale et Biotechnologie à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, ce diplôme est réglementé au niveau national et le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : - apprentissage de la manipulation du rat vigile : pesée, identification, préhension, contention et injection IP - apprentissage du déroulé d’une étude en pharmacologie in vivo : recueil de données et traçabilité, choix des paramètres à étudier afin de réaliser un suivi exhaustif des animaux, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence des règles de bien-être animal au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect du bien-être animal dans ce protocole. Enfin, ce TP permettra de sensibiliser les étudiants à la différence de réponse des mâles et des femelles face à ce mélange anesthésique / analgésique et donc de la nécessité d'adapter les doses des molécules.
Procédures
Les animaux recevront une injection intrapéritonéale unique d'un mélange anesthésique / analgésique. La profondeur de l'anesthésie sera évaluée pendant toute la durée de celle-ci. A ces doses, une anesthésie d'environ 40 minutes est attendue chez les mâles et 60-70 min chez les femelles. Aucune autre intervention ne sera réalisée sur les animaux lors de cette séance de TP.
Impact sur les animaux
Tout d'abord, la contention et la manipulation des rats entrainent du stress chez les animaux, les injections par voie intrapéritonéale engendre une légère douleur au site d’injection. Un effet indésirable possible pour le rat est la surdose d'anesthésique, qui peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire de l'animal dans les 5 minutes suivant l’administration des molécules.
Devenir
Tous les animaux seront réutilisés la semaine suivante dans un TP de pharmacologie (procédure légère). Les responsables du projet ont soumis cette possibilité préalablement auprès de la Structure en charge du Bien-Etre Animal, dont leur établissement dépend. Cette dernière leur a envoyé un avis de principe favorable au regard des procédures prévues dans les 2 protocoles, mais la réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux au moment de la réutilisation et donc de l'avis du vétérinaire référent.
Remplacement
Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit, dans la compétence « mener des études à l’échelle du vivant » que les étudiants apprennent à « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP aura lieu. Ce TP doit permettre d’une part d’évaluer in vivo les effets des molécules étudiées (anesthésiques) et d’autre part l’apprentissage par nos étudiants de la technique d’administration IP chez l’animal vigile. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile…) que sur le plan pharmacologique (observation des effets induits par les substances étudiées, pratique des méthodes d'évaluation des effets). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et d'éviter d'intégrer des animaux d'entraînement, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, injection IP) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge).
Réduction
Les étudiants seront répartis par binôme, mais chaque étudiant aura la responsabilité du traitement et du suivi de son propre animal. Chaque promotion comporte au maximum 56 étudiants, avec 1 rat par étudiant. La promotion est répartie en groupes de 14 étudiants et les TP ont donc lieu sur 4 séances (1 séance par groupe d’étudiants). Chaque séance est encadrée par un enseignant et un rat de démonstration sera nécessaire pour chaque séance. Cinq rats supplémentaires seront également prévus chaque année en cas de soucis lors des TP (rat dont l’état de santé ne permet pas l’intégration au protocole expérimental par exemple). Ainsi 56+4+5=65 rats seront nécessaires pour un an pour 56 étudiants et 65*5= 325 rats sur 5 ans pour 280 étudiants. Ces chiffres seront évidemment revus à la baisse si le nombre d’étudiants est inférieur à 56 par promotion. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans notre établissement, ces rats seront également réutilisés la semaine suivante dans le cadre d'un autre TP, réalisé par les étudiants de 2ème année: cette réutilisation a été validée prélablement par la Structure chargée du Bien-Être Animal. Enfin, les animaux proviendront de notre propre élevage et afin d’éviter au maximum les animaux surnuméraires, des mâles et des femelles seront indifféremment utilisés pour ces TP, tout en respectant l’attribution d’animaux d’un même sexe par séance de TP. Afin de garantir un apprentissage de qualité à nos étudiants, il n’est pas possible de diminuer plus le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant 2 éléments (tunnel en plastique noir et bâtonnet en bois ou noix à ronger), dont une rotation sera réalisée au cours de l'hébergement. Tout animal stressé ou malade (poils hérissés, prostration…) ou qui n'aura pas pris de poids par rapport à la semaine précédente (comme attendu aux vues de l'âge des animaux) sera exclu du protocole. Les animaux anesthésiés seront réchauffés grâce à une lampe et leurs yeux seront protégés grâce à l’application d'un collyre lubrifiant et hydratant. Préalablement aux séances de TP, les animaux seront habitués à la préhension et à la contention dans le but de limiter leur stress lors de leur utilisation par les étudiants et seront récompensés après chaque acte en amont et pendant le protocole. De plus afin de limiter le stress des animaux, les étudiants seront sensibilisés au fait de rester calmes et de ne pas être bruyants lors des séances de TP impliquant l’utilisation des animaux. Pendant le protocole, les animaux seront soumis à une anesthésie/analgésie, la composante analgésique étant apportée par l'une des molécules présentes dans le mélange anesthésique. Pour limiter tout risque de surréaction chez les femelles, plus sensibles aux molécules anesthésiques/analgésiques que les mâles, celles-ci recevront une dose adaptée à leur sexe et seront utilisées lors des séances de TP ayant lieu l'après-midi, car les rats sont plus sensibles le matin à ces molécules. En cas de signes de détresse cardio-respiratoire, les enseignants effectueront un massage cardiaque et procéderont à la mise à mort de l'animal par injection de produit dédié si ce massage s'avère insuffisant. Cependant ceci ne devrait pas se produire aux doses utilisées de produits anesthésiques/analgésiques. Enfin, toujours pour diminuer le stress des rats après le protocole, la répartition des animaux dans leur cage d’hébergement initial sera conservée jusqu'au protocole suivant.
Choix des espèces
Le rat est une des principales espèces utilisées en recherche et notamment en physiologie et pharmacologie. Il est donc nécessaire que nos étudiants soient formés à la manipulation et à l’observation des rats. De plus, sa taille permet une surveillance aisée de l’animal lors de l’anesthésie, notamment pour différencier les respirations thoraciques et abdominales, ce qui fait du rat, un animal de choix d'autant plus pour une première formation à des étudiants. Les animaux utilisés auront entre 5 et 7 semaines. Etant donné qu’il s’agit du premier TP avec des rats in vivo réalisé par nos étudiants, utiliser des animaux relativement jeunes, de petite taille, permettra de diminuer leur appréhension et donc le stress ressenti par les animaux.
Prélèvements biologiques chez le rongeur et le lapin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 800
Lapins : 350
1 950 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie ou impliquant un niveau de souffrance léger, une partie euthanasiée pour prélever organes et tissus, d'autres réutilisés, gardés en élevage ou adoptés. Ils subissent des prélèvements de sang par différentes voies, dont la ponction du sinus rétro-orbital sous anesthésie et la ponction intracardiaque terminale, pour fournir sang, sérum, urine et organes à la communauté scientifique. Le porteur affirme que ces produits biologiques ne peuvent pas être obtenus par des méthodes de remplacement. Le projet a pour objet de prélever sur ces animaux la matière biologique utilisée dans d'autres recherches.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de fournir à la communauté scientifique des produits biologiques provenant de l’espèce lapin ou de différentes espèces de rongeurs génétiquement altérés ou non génétiquement altérés (rat, souris,). Ces produits biologiques, essentiels pour l’avancement de la recherche biomedicale, le développement des therapies innovantes et la conduite des tests in vitro ou ex-vivo, sont du sang, plasma, sérum, des fèces, de l’urine, du liquide cérébrospinal et divers tissus (moelle osseuse, organes, … ) Les prélèvements biologiques provenant du lapin ou de rongeurs sont utilisés par exemple comme : -outil de diagnostic/ réactif pour des tests biologiques -matrice pour des essais ex vivo et/ ou la mise au point/ validation de méthodes analytiques indispensables pour des futures études in vivo dans le cadre de l’évaluation de la sécurité de futurs médicaments ou produits biologiques -pour obtenir des contrôles analytiques ou des données références sur une souche animale qui seront ensuite utilisés dans le cadre de l’évaluation de la sécurité de futurs médicaments ou produits biologiques.
Bénéfices attendus
Les prélèvements biologiques provenant du lapin ou de rongeurs sont utilisés par exemple comme : -outil de diagnostic/ réactif pour des tests biologiques -matrice pour des essais ex vivo et/ ou la mise au point/ validation de méthodes analytiques indispensables pour des futures études in vivo -pour obtenir des contrôles analytiques ou des données références sur une souche animale. Ce projet a pour but de mettre à la disposition de la communauté scientifique ou de l’industrie divers produits biologiques (sang et ses dérivés, urines, fèces, liquide cérébrospinal, …) en provenance du lapin, du rat et de la souris. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques.
Procédures
Les méthodes générant le moins de stress pour l’animal (temps de contention réduit, pas de nécessité de vasodilatation) et les moins traumatisantes pour l’animal seront privilégiées : veine jugulaire ou saphène par exemple. Dans le cas où ces sites ne peuvent pas être utilisés ou les volumes demandés sont trop importants, la veine sublinguale ou en dernier recours le sinus rétro-orbital seront utilisés et l’animal sera préalablement anesthésié par voie gazeuse (ex : Isoflurane). Le prélèvement en intracardiaque (ou aorte ou veine cave caudale) sera réservé aux grands volumes de sang ne pouvant être prélevés par d’autres voies et sera terminal sur animal préalablement anesthésié. Les prélèvements auront une durée de l’ordre de la minute. Fréquence pour les procédures où ce ne sera pas un prélèvement unique : Rat (sublinguale) 2 sur 7 jours Rat (Sinus retro-orbital) alternance site G/D : 2 sur 7 jours Rat (caudale) : 6 sur 24h, et 10 sur 7 jours Rat (jugulaire) : 6 sur 24h, et 10 sur 7 jours Rat (saphène externe) : 4 sur 7 jours: Rat (submentale) : 2 sur 7 jours Rat (submandibulaire) : 2 sur 7 jours Souris (submentale) : 2 sur 7 jours Souris (submandibulaire) : 2 sur 7 jours Souris (caudale) : 3 sur 7 jours Souris (saphène) alternance site G/D : 2 sur 7 jours Lapin (oreille) : 8 sur 24h, et 12 sur 7 jours Pour les prélèvements de diurèse, une mise à jeun éventuelle sera appliquée (maximum de 16h avec mise à jeun).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes de prélèvement de sang ou fluides corporels Des points limites identifiés dans les procédures internes seront apppliqués. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, suspension de la procédure ou euthanasie)
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques); 2) gardés en vie si pas de besoin de prélèvement; 3) adoptés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
L’objectif du projet étant de fournir aux scientifiques des produits biologiques provenant de lapins ou de rongeurs et ceux-ci ne peuvent pas être produits par des méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé en fonction de la quantité de sang ou de tissus ou d’autres prélèvements biologiques nécessaire, de manière à respecter les recommandations éthiques en vigueur sur les volumes prélevés et les temps de récupération. Les animaux pourront être réutilisés pour certains prélèvements biologiques à condition de respecter les procédures de réutilisation des animaux et sur avis du vétérinaire.
Raffinement
Les rongeurs hébergés sur site seront hébergés dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, tunnel, …). Les rats (mâles et femelles) et souris femelles seront hébergés en groupes sociaux. Les lapins seront hébergés en cage sur fond plastique munie d’une plateforme de repos, avec contact visuel et olfactif avec les congénères. De la musique sera diffusée pendant la période 6h-18h. Un enrichissement adapté sera fourni : par exemple mousquetons/rondelles métalliques, rondins végétaux et bâtonnet de bois à ronger. Tous les animaux (rongeurs, lapins) sont observés au moins 1 fois par jour afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques, ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance de l’animal (traitement analgésique, suspension de la procédure ou euthanasie).
Choix des espèces
Les espèces utilisées dépendent des espèces sélectionnées pour les études précliniques in vivo (analogie du récepteur entre l’homme et l’animal, similitude du profil des métabolites, données de pharmacocinétique/ pharmacodynamie, …) et des tests biologiques à faire. De la naissance à adulte mature qui a terminé sa croissance. L’âge de l’animal dépend des besoins du scientifique, de la classe d’âge visée dans l’utilisation clinique du produit (mise au point /validation de méthodes analytiques).
Preuve de concept de l’efficacité de nos produits d’intérêt myorelaxant, après application topique, dans le traitement des maladies de la contraction musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
516 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rasé, reçoit le produit sur la peau ou par injection intramusculaire, puis subit une dizaine de mesures électriques du muscle sous anesthésie et une trentaine de mesures de l'écartement des doigts de la patte. Le projet compare des produits commerciaux, désignés comme "nos produits", aux traitements de référence de la dystonie et de la spasticité. Le porteur indique que la réutilisation des animaux a été tentée sans succès et affirme que les modèles cellulaires restent débattus.
Objectifs
Cette étude a pour objectif de démontrer l’efficacité et les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Dans cette étude, le produit sera administré localement aux rats, sur la peau d’un membre postérieur (application topique au niveau du tibialis cranialis). Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide, et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Rasage : 1 fois : 30 sec/animal Administration composée : 1 fois : 1min / animal et maintient avec un pansement pendant 2h ; Mesure CMAP (avec anesthesie) : environ 10 fois : 15 min / animal = 150 min /animal (1h30) Mesure DAS : environ 30 fois : 10 sec / animal = 300 sec / animal (5 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues ici sont : Partie administration des composés : Stress dû au rasage de la patte des animaux, administration des composés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire, légère gêne suite au pansement occlusif sur la patte. Partie observation : Stress dû aux lectures DAS (Digit Abduction Score = score de l'écartement des doigts de la patte) et au différentes anesthésies pour les mesures de CMAP (Coumpound Measurement Activity Potentiel = mesure de l'activité élétrique du muscle).
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet, malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de co-culture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Les test DAS et CMAP nous permettent au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’administration des composés (ici topique et intra-musculaire.) est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Les administrations de nos composés en topique sous pansement occlusif ne seront réalisées qu’une seule fois sur un temps assez restreint (2h). Pour toutes les mesures de CMAP, les animaux seront anesthésiés environ 10 fois pour chaque animal (aux temps 2h, 4h, 8h, 24h, 48h, J7, 14J, 21J, 28J (et tous les 7 jours jusqu’au retour du signal au signal de départ)
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Les tests DAS et CMAP chez le rongeur, déjà éprouvés lors de notre étude princeps, sont au contraire des tests reconnus pour leurs pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles (Bien que faciles à manipuler, nous avons remarqué au cours de l’étude princeps que la prise de poids des animaux ne facilitait pas la stimulation et la lecture du DAS (animal difficile à stimuler, et peu enclin à exhiber un réflexe). Or il est largement admis que les mâles prennent plus de poids que les femelles. De plus, nos molécules ont été administrés en i.m (pour tester leurs efficacités dans notre étude princeps) et que nous n’avons remarqué aucune différence (entre mâles et femelles) de réponse pharmacologique. De plus, pour les molécules testées ici leur pharmacocinétique est connue (soit dans la littérature, soit testé dans notre laboratoire), et aucune différence significative n’est observée entre les deux sexes. Afin de diminuer notre variabilité de mesure, nous sommes donc contraints de nous limiter aux animaux femelles) âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler
Imagerie des altérations structurales vasculaires et de flux sanguins spinaux dans un modèle animal de lésion médullaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit le retrait chirurgical de vertèbres au-dessus de la moelle épinière puis une séance d'imagerie de moins de deux heures, sans reprise de conscience, dans une étude de biomatériaux censés favoriser la régénération médullaire. Le porteur reconnaît que l'anesthésie prolongée peut affecter les constantes vitales et prévoit une étude histologique sur les tissus prélevés. Il affirme qu'aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico ne permet d'obtenir ces données et que seule l'approche sur l'animal entier est possible.
Objectifs
Les lésions traumatiques et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière chez l’homme induisent un handicap qui peut être sévère et permanent. Analyser l’évolution des constituants neurobiologiques (cellules neuronales, gliales et vasculaires) de la lésion médullaire et en parallèle, élucider comment les neurones lésés répondent à ces changements constitue un défi important afin de concevoir des stratégies thérapeutiques visant à stimuler la régénération et la réparation du réseau neuronal affecté. Ce projet, qui est une collaboration entre notre laboratoire et ceux de nos collaborateurs) vise à étudier la capacité de biomatériaux développés dans le cadre d’un financement commun à promouvoir la régénération médullaire et la récupération motrice chez le rat seul ou en combinaison avec une stratégie neuroprotectrice. La nature de cette demande (notre part du travail dans ce projet collaboratif) réside en l’anesthésie, la pose d’un cathéter veineux, puis l’imagerie de la moelle épinière de ces animaux, dans une expérience d’imagerie sans réveil qui sera immédiatement suivie de leur euthanasie. Pour ce faire, une semaine avant la séance d’imagerie, les animaux seront transférés dans notre laboratoire (3 ou 7 semaines post-lésion de façon à les étudier à 4 ou 8 semaines, à un moment où ils ont retrouvé spontanément une autonomie vésicale. L’utilisation des rongeurs, et du rat en particulier constitue le modèle animal adapté pour ce projet. La règle des 3R a été considérée tout au long de l'élaboration de ce projet et sera appliquée au quotidien.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est de déterminer quand et comment, après la lésion de la moelle épinière, la combinaison de l'implantation de biomatériaux avec les traitements cités permettrait une efficacité fonctionnelle chez l’animal. Par ailleurs, notre collaboratrice poursuit un processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens qui a pour but de permettre une perspective clinique de ces travaux chez l’Homme. Leur ambition est d’aboutir à des solutions transposables, réalisables et efficaces en clinique humaine. Grâce aux preuves de concept obtenues au préalable, notre projet de recherche préclinique démontre qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
- Au début de la séance d’imagerie, les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale ayant pour but de retirer localement les vertèbres au-dessus de la moelle épinière.. Celle-ci durera environ une demi-heure. - Au cours de ces expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. Les acquisitions en imagerie dureront moins d’une heure. - Malgré ce temps court, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront monitorées grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires. Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux de perfusion de l’anesthésique afin de maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). La séance d’imagerie durera en tout moins de deux heures.
Impact sur les animaux
Cette étude d’imagerie sera réalisée sur animal anesthésié. Ils ne seront imagés qu’une seule fois, dans une procédure sans réveil. Bien qu’il n’y ait aucun effet indésirable attendu, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Non seulement nos séances seront courtes (1h30 à 2h d’anesthésie en tout), mais les constantes seront suivies (fréquences cardiaque et respiratoire). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’anesthésique gazeux pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Une étude histologique étant réalisée ensuite à la fin de ces expériences sur les tissus cérébraux prélevés.
Remplacement
Notre projet porte sur l’étude des remaniements vasculaires dans un modèle de lésion médullaire chez le rat et du potentiel thérapeutique d’un mélange de biomatériaux avec un facteur neurotrophique ou des cellules greffées. Ces mesures seront réalisées sur animal anesthésié. Dans ce contexte, les approches intégratives sur l’animal entier restent incontournables. A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données similaires des mécanismes physiopathologiques et leur réparation. Seule l’approche chez l’animal est possible.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus par groupe expérimental est le plus petit possible, permettant de tenir compte de la variabilité attendue des résultats scientifiques et de la nécessité d’avoir une puissance statistique suffisante pour publier nos résultats. En revanche, nous nous intéressons à l’effet de certains facteurs : - La lésion - L’effet bénéfique d’un agent neuroprotecteur - L’effet bénéfique des cellules greffées - L’effet bénéfique du biomatériau - L’effet bénéfique de la combinaison des trois.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des séances d’imagerie. Un suivi quotidien sera assuré contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture. Les animaux seront hébergés à deux par cage dans le respect des surfaces réglementaires avec enrichissement (tunnel, bois à ronger) et avec des copeaux de bois souples qui préviennent l’émergence d’escarres. Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous avons défini un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, l’oxygénation des tissus et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entreprit avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes.
Choix des espèces
Rat et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du traumatisme est très reproductible et standardisée chez le rat et de nombreux tests sensori-moteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion. Chez le mammifère, l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi l’intégralité de ce projet sera réalisé chez le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit en moyenne de 250g.
Évaluation de la réponse inflammatoire de la pulpe dentaire à un nouvel hydrogel d’acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 dans un modèle de pulpe inflammatoire chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.
Objectifs
La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.
Bénéfices attendus
Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.
Procédures
Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.
Devenir
Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).
Remplacement
Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.
Choix des espèces
Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.
Chirurgie expérimentale : formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales chirurgicales sur des animaux
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 480
930 souris et rats vont être utilisés pour une formation réglementaire à la chirurgie, la plupart tués sous anesthésie sans réveil, certains réveillés puis suivis quatre heures avec une douleur postopératoire possible. Chaque animal sert à une intervention abdominale ou thoracique réalisée par un stagiaire après démonstration, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels. Le porteur indique que les stagiaires s'exercent d'abord sur des supports inertes, cuisses de poulet et rats en plastique, et affirme qu'aucun modèle inerte ne reproduit les signes d'anesthésie profonde et de réveil. Il justifie l'ensemble par le caractère obligatoire de la formation et le "besoin" d'acquérir les bases chirurgicales.
Objectifs
Le projet consiste à réaliser des travaux pratiques sur Rongeurs (rats et souris) au cours des sessions du « module spécialisé en procédures chirurgicales » de la formation spécifique en expérimentation animale, destiné aux concepteurs de projets intégrant des interventions chirurgicales et aux personnels réalisant ces procédures chirurgicales. Cette formation réglementaire est obligatoire pour être autorisé à pratiquer des actes chirurgicaux sur l’animal. L’objectif est d’enseigner aux stagiaires les bases en chirurgie : rappels d’anesthésie, monitoring, gestion de la douleur pré-/per-/post-opératoire, sutures, cicatrisation, asepsie et d’acquérir des bases pour la réalisation de gestes chirurgicaux. Les stagiaires s’entrainent sur des supports inanimés (cuisses de poulets pour les sutures, rat MD-PVC pour les microsutures) avant de passer sur l’animal anesthésié. Plusieurs types d’interventions chirurgicales sont réalisées afin d’avoir une approche pluridisciplinaire (chirurgie abdominale, thoracique). Chaque stagiaire dispose d’un animal pour réaliser chaque intervention après démonstration de la technique par vidéo puis mise en œuvre par un intervenant compétent. Il y a donc une progression dans la compréhension de la technique avant sa mise en œuvre par le stagiaire. Chaque intervenant supervise au maximum 5 stagiaires afin d’assurer un encadrement de qualité. Pour réaliser ces travaux pratiques 15 souris et 16 rats maximum sont utilisés à chaque session soit sur 5 ans et pour 6 sessions de formation par an un total maximal de 480 rats et 450 souris.
Bénéfices attendus
Les formations réglementaires en chirurgie sur l’animal sont obligatoires et ont pour objectif de former les personnels impliqués dans ces procédures afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux. Il leur est nécessaire d’acquérir les bases en chirurgie afin de garantir la mise en oeuvre de bonnes pratiques vétérinaires, tant éthiques que techniques. A l’issue de la formation, les stagiaires connaissent les points-clés indispensables à cette mise en œuvre éthique et responsable des protocoles de chirurgie.
Procédures
les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales effectuées sous analgésie et anesthésie (1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour la formation subissent une chirurgie qui peut avoir des effets indésirables : mauvaise mise en place de l’analgésie/anesthésie, détresse respiratoire, chute de température centrale. Les souris peuvent subir une lègère douleur au point de piqure lors de l’adminsitration de l’anesthésique par voie intrapéritonéale. La plupart des souris ne sont pas réveillées après le geste chirurgical. Celles dont le réveil est suivi pendant 4 heures peuvent ressentir une douleur post-opératoire. L’anesthésie des rats est induite par de l’isoflurane : ils peuvent subir un stress au moment de les placer dans la cage d’induction. Ils ne sont pas réveillés.
Devenir
Ces procédures sont mises en oeuvre dans le cadre d'un stage de formation aux bonnes pratiques chirurgicales. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la mise en oeuvre du geste technique(1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.
Remplacement
Il s’agit de former aux bons gestes chirurgicaux. Les stagiaires commencent par pratiquer sur des supports inertes (cuisses de poulet, rats plastiques) puis ils mettent en œuvre 2 gestes chirurgicaux (procédures 1 et 2) après démonstration et sous supervision des enseignants. Il n’existe actuellement pas de modèle inerte permettant l’observation des signes d’anesthésie profonde et de réveil et un abord le plus précis et le moins invasif possible d’un organe. Quand cela est possible pour un bon apprentissage des gestes, les modèles plastiques sont utilisés. C’est le cas d’une des procédures qui est réalisée uniquement en démonstration par les enseignants : 1 seul animal est concerné par groupe de TP et par séance, les stagiaires reproduisant les gestes sur des modèles de vaisseaux en silicone.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste : 1 animal par démonstration de procédure et 1 animal par stagiaire pour les 2 premiers gestes (pas d’animal pour les stagiaires pour le 3e geste), auxquels on ajoute 2 rats et 4 souris supplémentaires par stage pour tenir compte des aléas chirurgicaux. Il y a 10 stagiaires par session, 6 sessions par an et la demande est faite pour 5 ans. Au total pour 5 ans, 930 Rongeurs : 450 souris et 480 rats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des locaux conformes à la réglementation. Il s’agit d’animaux surnuméraires issus du pôle élevage de l’animalerie, ou ils sont exceptionnellement achetés chez un éleveur agréé lorsqu’il est nécessaire de compléter les lots. Ils sont habitués aux locaux de stabulation et à la manipulation pendant une semaine minimum avant les expérimentations. Les cages sont enrichies en nid végétal pour les souris et en buchettes à ronger pour les rats. Lors des chirurgies, une analgésie pré-opératoire est mise en place et, pour les rats, une sédation est d’abord induite avant d’installer l’anesthésie. En cas de besoin, une demi-dose du mélange anesthésique est administrée et/ou un relais est fait par de l’anesthésique local. Tout au long de l'hébergement et des procédures, la surveillance quotidienne permet de vérifier l'état de santé des animaux et des points limites précoces et adaptés sont mis en place.
Choix des espèces
Pour apprendre à gérer le stress inhérent à toute chirurgie, il est nécessaire en plus de l’apprentissage des gestes techniques sur des supports inertes de se placer dans les conditions réelles et donc de manipuler l’animal. La formation est essentiellement axée sur les Rongeurs (rat et souris) qui représentent plus de 80 % des animaux utilisés dans le cadre des procédures expérimentales. La formation est effectuée sur des animaux adultes car ils sont de gabarit adapté d'un point de vue pédagogique
Evaluation de l’augmentation de l’efficacité de nouvelle technique de radiothérapie en combinaison avec de l’immunothérapie par blocage de la voie PD-1/PD-L1.
- Recherche appliquée
- Cancers
198 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la gravité la plus élevée du lot. Une tumeur cérébrale de type gliome leur est implantée, puis leur cerveau est irradié à des doses de 15 à 40 Gy avant l'injection d'un anticorps d'immunothérapie. Le porteur décrit une détresse, une perte de poids et des ulcérations du cuir chevelu au site d'irradiation, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il qualifie le projet de "pionnier" à "fort impact sociétal" et affirme que la combinaison radiothérapie-immunothérapie est "indispensable" à évaluer sur l'animal entier.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeur cérébrale), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Pour ce faire, nous explorons de nouvelles approches et proposons de développer des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement afin d’améliorer encore l’indice thérapeutique. Ces techniques de radiothérapie innovantes qui utilisent du fractionnement spatial de la dose seront alors combinées avec un des traitements les plus prometteurs que sont les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire. Ainsi, l’immuno-oncologie a pour objectif d’exploiter et de renforcer les capacités de notre propre système immunitaire à reconnaître et détruire les cellules cancéreuses. Tout d'abord, il faut savoir que les lymphocytes T aident l'organisme à lutter contre les infections et d'autres maladies, y compris le cancer. Toutefois, les cellules tumorales peuvent échapper à cette attaque en exprimant à leur surface une protéine appelée PD-L1 qui inactive les lymphocytes T avant qu’ils n’attaquent. La PD-L1 agit en se liant à des récepteurs appelés PD-1 situés sur les lymphocytes T. La liaison de PD-L1 avec PD-1 conduit à l’inactivation des lymphocytes T, un mécanisme dénommé « épuisement des lymphocytes T » qui est un moyen de résistance tumorale. Cette liaison PD-L1 avec PD-1 constitue donc une cible thérapeutique intéressante pour l’immuno-oncologie. En effet, le blocage de la protéine PD-L1 peut empêcher les cellules cancéreuses d'inactiver les lymphocytes T et inverser leur épuisement. Ils retrouvent donc leur rôle dans la détection et la destruction des cellules cancéreuses. L'immuno-oncologie est certainement l'un des domaines de la recherche médicale les plus enthousiasmants, car cette approche a le potentiel de changer profondément la façon dont sont traités de nombreux types de cancer.
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. Dans ce nouveau projet nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique en combinant des techniques d’irradiation innovantes avec de l’immunothérapie avec des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques pouvant ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. , le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
Dans la procédure visant à déterminer à quel moment précis PD-L1 est bloquée par l’administration de l’anticorps anti-PD-L1, les rats Fischer sous anesthésies (générale gazeuse et locale environ 45 minutes) seront tout d’abord implantés avec la tumeur au niveau du cerveau puis recevront l’anticorps anti-PD-L1 en injection intrapéritonéale à j13, j16 et j19 post implantation de la tumeur. Puis dans une seconde procédure, la combinaison de l’immunothérapie par blocage de la voie PD-1/PD-L1 au temps idéal précédemment déterminé et de la radiothérapie par mini faisceaux à j14 post implantation tumorale sera réalisée. Les rats Fischer sous anesthésies (générale gazeuse et locale environ 45 minutes) seront tout d’abord implantés avec des cellules de gliome de rat au niveau du cerveau ; puis irradiés au niveau du cerveau, sous isoflurane (environ 20 minutes d’anesthésie) avec une dose entre 15 et 40 Gy à j14 post-implantation de la tumeur et, pour finir, les animaux recevront une dose d’anticorps anti-PD-L1 en injection intrapéritonéale (durée du geste inf à 10 sec) au temps idéal déterminé lors de la première procédure.
Impact sur les animaux
Suite à l’implantation tumorale et à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Le blocage de la voie PD-1/PD-L1 n'a montré aucun signe de toxicité chez les souris traitées dans la littérature.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ces mécanismes sont les clés pour une combinaison efficace avec l’immunothérapie. Dans une première étude in vivo (Bertho et al 2022), nous avons démontré que la MBRT induit un recrutement efficace des lymphocytes T et cela justifie l’évaluation de la combinaison avec des immunothérapies. De plus, l’évaluation des combinassions radio-immunothérapies requièrent l’expérimentation in vivo où l’interaction entre la réaction à la radiation et le système immunitaire peuvent être activées. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons régulièrement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être, puis nous utiliserons un enrichissement adapté avec des objets placés dans les cages d'accueil (des tunnels en carton). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Le système immunitaire des rats est adapté pour nos études (même types cellulaires que l’humain, même mode d’action) et déjà dévelopé au moment de l’étude. Les animaux utilisés seront des adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant y compris du système immunitaire et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Evaluation de candidats médicaments dans un modèle de dysfonction érectile chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
750 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à trois anesthésies, deux laparotomies dont l'une pour léser le nerf des corps caverneux et poser des électrodes, ainsi que la pose de cathéters dans l'aorte et le pénis pour mesurer des pressions. La dernière anesthésie, irréversible, est menée sans réveil et dure jusqu'à trois heures, avant la mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la dysfonction érectile dans sa complexité et conclut au caractère incontournable de l'expérimentation animale.
Objectifs
Après 40 ans, un homme sur trois a des troubles de l’érection, pouvant avoir une incidence sur la qualité de vie des patients. La dysfonction érectile (DE) est un symptôme sentinelle des maladies cardio-vasculaires mais peut être également due à des traumatismes (chirurgicaux ou accident). Les traitements actuels présentent soit des contre-indications importantes soit des contraintes d’utilisation et/ou de prescription, d’où l’importance de développer de nouveaux candidats médicaments sur différents types de modèles. L’érection est une fonction complexe faisant intervenir des mécanismes vasculaires, musculaires et nerveux. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments dans un modèle de dysfonction érectile chez le rat mâle anesthésié.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysfonction érectile.
Procédures
Les animaux subiront : - 3 anesthésies au maximum (2 gazeuses qui vont durer 15-20 min et 1 fixe sans réveil qui va durer jusqu’à 3 heures), - 2 chirurgies (1 laparotomie pour la lésion du nerf des corps caverneux qui va durer 20-30 min selon les expérimentateurs, 1 laparotomie pour installation d’électrodes au niveau des nerf du corps caverneux qui va durer 1 heure). - L’administration des composés à tester pourra se faire sous anesthésie gazeuse pour l’administration dans les corps caverneux (directement via le pénis, anesthésie de 20 min) ou via des voies plus classiques (i.p., s.c….). Les gestes étant réalisés par du personnel qualifié, les administrations de composés, d’antalgiques ne dureront que quelques secondes. De plus des cathéters seront implantés dans l’aorte carotide et dans le pénis au niveau du corps caverneux afin de mesurer des pressions. Le dernier acte fait sur l’animal est sans réveil pour l’animal.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés, ce qui d’une part peut engendrer un stress, une nuisance, une douleur. Les animaux vont également subir 1 laparotomie sous anesthésie gazeuse pouvant induire une gêne post-opératoire. L’administration du produit à tester pouvant se faire sous anesthésie gazeuse (pour l’administration dans les corps caverneux par exemple), cette succession d’anesthésie pour induire une nuisance à l’animal. De plus, une troisième anesthésie sans réveil sera réalisée pour l’évaluation de l’effet des candidats médicaments avant l’euthanasie de l’animal (ceci ne devant pas conduire à des nuisances particulières) à part la douleur de l’aiguille pour l’administration intrapéritonéale de l’anesthésiant).
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure car l’anesthésique utilisé est irréversible et les animaux ne pourront pas se réveiller. De plus, des organes pourront être collectés à la fin de la procédure.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la dysfonction érectile. Tous les traitements existants ont d’importants effets secondaires. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Le modèle de dysfonction érectile se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. Dans une étude classique, il y aura 5 groupes expérimentaux. Un nombre minimum de 15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et interprétables.
Raffinement
Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux (tunnel, aspen brick…). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Ce modèle est très bien décrit dans la littérature chez le rat. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Travaux pratiques de pharmacologie « Etude de la catalepsie induite par un neuroleptique chez le rat avec le test du croisement des pattes homolatérales »
- Enseignement supérieur
305 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués à l'issue et une partie réutilisée. Lors de travaux pratiques, des étudiants leur injectent un neuroleptique par voie intrapéritonéale puis mesurent la catalepsie induite par le test du croisement des pattes homolatérales. Ces rats ont déjà servi une semaine plus tôt à un TP d'anesthésie, et après l'étude de la catalepsie ils sont tués puis congelés pour des TP de dissection en première année. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet une formation appropriée à la manipulation du rat vigile et à la pharmacologie in vivo.
Objectifs
Ces travaux pratiques (TP) chez le rat sont destinés à des étudiants dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux, afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche. D’autre part, cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont les suivants : - Mettre en pratique l’enseignement théorique à la fois d’un point vue pharmacologique concernant les effets des neuroleptiques classiques (médicaments psychotropes) et d’un point de vue éthique vis-à-vis de l’utilisation de l’animal en expérimentation. - Savoir mettre en application un protocole expérimental de pharmacologie in vivo comme demandé dans le programme pédagogique et réaliser un tableau de recueil de données approprié au déroulement de ce protocole pour garantir la traçabilité des données brutes expérimentales. - Utiliser un test de comportement chez l’animal pour mettre en évidence la propriété caractéristique des neuroleptiques classiques à induire une catalepsie. Quantifier l’activité pharmacologique d'un neuroleptique classique de référence selon une relation dose/effet dans le cas d’un test répondant à loi du tout ou rien (absence ou présence de catalepsie). - Consolider la manipulation du rat vigile (contention, administration par voie intrapéritonéale) avant de réaliser un TP comportemental chez le rat au semestre suivant.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre à nos étudiants à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, les enseignements de ce diplôme sont définis selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En deuxième année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Explorer les dysfonctionnements cellulaires, mesurer les effets de molécules toxiques et l'efficacité de thérapies ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP a lieu. En effet, mesurer l'efficacité de thérapies nécessite de savoir établir notamment la dose efficace 50 d'une molécule, ce qui est l'objet de cet enseignement. Ainsi ce projet en formant de futurs techniciens à l'expérimentation animale, notamment à la réalisation de gestes techniques respectant au mieux le bien-être animal, et au respect de l'éthique lors de leur exercice, amènera sur le marché du travail un personnel qualifié et bien formé au respect du bien-être animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types d'intervention: 1. Injection intrapéritonéale d'un neuroleptique de référence à l'une des trois doses choisies. Cette injection reprend la voie classiquement utilisée pour l'étude des effets des neuroleptiques chez le rat. 2. Réalisation du test de croisement des pattes homolatérales, 20, 40, 60, 80 et 100 minutes après administration du produit. Ce test consiste à imposer une position à l'animal et à observer s'il la conserve pendant une durée de 30 secondes. A la fin du protocole, les animaux ayant participé aux travaux pratiques seront mis à mort par surdosage de CO2. Les animaux surnuméraires s’ils n’ont pas suivi la procédure pourront être inclus dans des procédures hors champs.
Impact sur les animaux
Tout d'abord, la contention et la manipulation des rats entrainent du stress chez les animaux, les injections par voie intrapéritonéale engendrent une légère douleur au site d’injection. Par ailleurs, le neuroleptique testé peut provoquer chez l’homme un dépôt brunâtre au niveau de l’oeil dû à l’accumulation du produit mais indépendamment de la dose administrée, car une partie du médicament est éliminée par voie lacrymale.
Devenir
Tous les animaux recevant la molécule de référence testée auront déjà été utilisé lors d'une précédente séance de TP, pendant laquelle ils auront reçu une anesthésie générale par injection de molécules par voie intrapéritonéale. Après l'étude de la catalepsie, ils auront donc été inclus dans deux procédures. De plus, le Programme Pédagogique National de notre formation prévoit, en première année, la réalisation de dissection afin d'étudier les grandes fonctions de mammifères. A cette fin, des rats sont classiquement utilisés. Pour ces TP de dissection, nous utilisons exclusivement des animaux ayant été inclus dans un ou deux protocoles in vivo, afin de ne pas produire d'animaux uniquement dédiés à la réalisation de dissections. Ainsi les animaux mis à mort suite à ce TP seront réutilisés pour les dissections par des étudiants de 1ère année. Les animaux n'ayant pas reçu la molécule testée (animaux de démonstration et surnuméraires issus de la première séance de TP) seront conservés afin d'être utilisés dans des protocoles hors champ tels que des études sur organe isolé. De la même manière que pour les TP de dissection, nous cherchons à ne pas produire d'animaux pour nos protocoles hors champ mais uniquement à réutiliser des animaux ayant été impliqués dans des procédures in vivo.
Remplacement
Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme national prévoit, en pharmacologie, l’évaluation in vivo des effets et du mode d’action de molécules de référence par la mise en oeuvre de protocoles expérimentaux. Ce TP doit permettre d’une part d’illustrer les effets de la classe des neuroleptiques classiques et d’évaluer in vivo la relation effet/dose de la molécule étudiée et d’autre part de renforcer l’apprentissage par nos étudiants de la manipulation du rat vigile (contention, administration par voie intrapéritonéale, test comportemental). Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan pharmacologique (observation et quantification des effets de la substance étudiée) que sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration de substances chez l’animal vigile…).
Réduction
Chaque promotion, de 52 étudiants au maximum, est divisée en 4 groupes de 13 étudiants en moyenne. Par conséquent, ce TP aura lieu sur 4 séances (1 séance par groupe d’étudiants, encadrés par 1 enseignant). Les étudiants seront répartis par binôme et un seul animal sera utilisé par étudiant. A chaque séance, 3 lots expérimentaux seront constitués (1 lot pour chaque dose testée du neuroleptique). Les étudiants exploiteront les résultats obtenus par plusieurs groupes d’étudiants afin d'établir correctement la dose efficace 50 de la molécule testée tout en utilisant un seul animal par étudiant. Au besoin nous complèterons les données annuelles avec des résultats antérieurs. Comme un animal non traité par la molécule test ne peut être cataleptique, aucun lot de rats contrôles ne sera constitué. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre établissement, les rats inclus dans ce TP proviendront d'un 1er protocole réalisé une semaine auparavant concernant le suivi d’une anesthésie générale. Cette réutilisation des animaux dans les présentes conditions a été validée par la Structure chargée du Bien-Être Animal, dont nous dépendons, au regard des procédures prévues dans les 2 protocoles et de la demi-vie des molécules utilisées dans le 1er TP. De même les rats supplémentaires du 1er TP (maximum 5 rats) ainsi que les 4 rats affectés à la démonstration des gestes techniques par les enseignants pourront être réutilisés au cours du présent protocole en cas de problème particulier (exemple : rat dont l’état de santé ne permettrait pas son intégration à ce nouveau protocole expérimental). Ainsi tous les animaux utilisés dans ce TP (61 par an pour 52 étudiants soit 305 pour 5 ans) seront issus du 1er TP concernant l’anesthésie générale. Ces chiffres seront évidemment revus à la baisse si le nombre d’étudiants est inférieur à 52 par promotion. Ces animaux proviendront de notre propre élevage et afin de limiter au maximum la naissance d’animaux surnuméraires, des rats et des femelles seront utilisés indifféremment dans ce protocole tout en respectant l’attribution d’un sexe par séance de TP. Enfin, après euthanasie des animaux ayant reçu la molécule, ils seront congelés et utilisés pour les TP de dissection réalisés en 1ère année. Les animaux de démonstration (issus de la première séance de TP) ou surnuméraires pourront être conservés et utilisés dans des protocoles hors champs (euthanasie et prélèvement d’organes).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant 2 éléments (tunnel en plastique noir et bâtonnet en bois ou noix à ronger). Préalablement aux séances de TP, les animaux seront habitués à la préhension et à la contention afin de limiter leur stress lors de leur utilisation par les étudiants et seront récompensés après chaque acte en amont, pendant et après le protocole. Afin de limiter le stress des animaux, les étudiants seront sensibilisés au fait de rester calmes et de ne pas être bruyants lors des séances de TP impliquant l’utilisation des animaux. Ces animaux ayant été utilisés dans un précédent protocole, une semaine de récupération sera laissée aux animaux avant de les introduire dans le présent TP, comme cela été validée par la Structure chargée du Bien-Être Animal. Si un dépôt brunâtre apparaît au niveau de l’oeil des rats, (dû à l’accumulation de la molécule testée et à son élimniation en partie par voie lacrymale), un nettoyage des yeux des rats concernés sera réalisé avec du sérum physiologique afin d'éviter tout inconfort. Enfin, toujours pour diminuer le stress des rats après le protocole, la répartition des animaux dans leur cage d’hébergement initial sera conservée jusqu'à leur euthanasie.
Choix des espèces
Le rat est une des principales espèces utilisées en recherche, notamment en pharmacologie par exemple pour la réalisation des tests de catalepsie tel celui du croisement des pattes homolatérales. Il est donc important que nos étudiants soient formés à la manipulation de celui-ci. Stade adulte (6 à 8 semaines) correspondant au stade d’utilisation classique de ces animaux lors des essais de pharmacologie précliniques.
Ischémie reperfusion en condition hyperglycémique: cardioprotection par l’exercice et rôle du NO
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie court quarante-cinq minutes de tapis roulant cinq jours sur sept pendant cinq semaines, avant une ischémie-reperfusion cardiaque menée in vivo sous anesthésie avec pose d'une sonde de pression dans le ventricule. Le porteur reconnaît que l'exercice "peut être stressant" et prévoit des points limites et une euthanasie décidée avec le responsable de l'animalerie. Il affirme qu'il "n'existe aucun modèle de substitution in vitro" pour évaluer l'effet cardioprotecteur de l'exercice en contexte hyperglycémique.
Objectifs
L’hyperglycémie aigue semble pouvoir être à l’origine de dysfonctions mitochondriales notamment caractérisées par une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) au niveau cellulaire, conduisant à l’établissement d’une situation de stress oxydant. Cette surproduction de ROS au cours de l’hyperglycémie serait capable d’impacter la dynamique du réseau mitochondrial en favorisant la fission (ou fragmentation) mitochondriale. A l’échelle du muscle cardiaque, ces phénomènes pourraient contribuer à l’établissement d’un phénotype plus sensible au stress et ainsi à une plus grande vulnérabilité du cœur à un syndrome ischémique. Ceci pourrait ainsi permettre d’expliquer que le niveau de glycémie lors de l’admission à l’hôpital de sujets non diabétiques soit un facteur prédictif de la sévérité des lésions d’ischémie-reperfusion. Nos premiers travaux sur le sujet, conduits ex vivo, tendent à confirmer que l’hyperglycémie au moment de l’infarctus du myocarde favorise la production de ROS ainsi que la fragmentation mitochondriale au cours de l’ischémie reperfusion. Parmi les stratégies de cardioprotection efficace à la fois dans les modèles expérimentaux et chez l’homme, l’exercice physique est reconnu comme permettant de diminuer la taille de la zone nécrosée suite à un infarctus du myocarde, notamment via sa capacité à moduler la production de ROS et stimuler le métabolisme du monoxyde d'azote (NO). Les effets de l’exercice physique sur la dynamique mitochondriale restent à ce jour mal décrit. Par ailleurs, à ce jour, l’impact de l’hyperglycémie aigue sur la capacité de l’exercice physique à pré-conditionner l’organe cardiaque et à limiter les lésions au cours de l’infarctus reste mal décrit et les mécanismes sous-jacents non investigués. En résumé les objectifs de cette étude sont: (1) Evaluer l'impact de l'hyperglycémie aigue sur la production de ROS ainsi que sur la fission mitochondriale au cours de l’ischémie-reperfusion myocardique. ; (2) d’évaluer si le pré-conditionnement par l’exercice physique est toujours efficace en condition d’hyperglycémie et enfin (3) évaluer le rôle du NO dans ces phénomènes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental devrait permettre de mieux appréhender les mécanismes cellulaires sous-jacents à la vulnérabilité accrue du cœur à l’ischémie-reperfusion lors de situations transitoires d’hyperglycémie. Ceci pourra peut-être permettre, à plus long terme d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Certains animaux (groupe ExTr) seront soumis à un exercice physique de 45 minutes, 5/7j pendant 5 semaines sur tapis roulant. Les rats sont surveillés durant toute la durée de l’entrainement par l’expérimentateur. Certains animaux recevront une injection de L-NAME (50mg/kg, ip) 14h00 avant l'acte expérimental d’ischémie-reperfusion. Ces animaux feront l’objet d’un suivi particulier. Une ischémie-reperfusion sera réalisée in-vivo sur des rats anesthésiés en condition hyperglycémique ou non. Les animaux seront traités ou non au préalable avec un inhibiteur de l’enzyme responsable de la synthèse de NO. La fonction cardiaque sera mesurée au cours de la reperfusion par l’implantation d’une sonde millar de pression dans la cavité ventriculaire (voie artérielle) et par la pose d’électrodes de surface pour l’électrocardiographe (ECG). Au total 120 rats seront nécessaires durant cette étude afin de disposer de l'effectif minimum permettant de mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres étudiés.
Impact sur les animaux
Certains animaux (groupe ExTr) seront soumis à un exercice physique de 45 minutes, 5/7j pendant 5 semaines sur tapis roulant. Cet acte expérimental peut être stressante pour les animaux. Afin de limiter le stress, les animaux sont acclimatés au tapis de course pendant une semaines, 1h00 par jour. Enfin, les rats sont surveillés durant toute la durée de l’entrainement par l’expérimentateur. Certains animaux recevront une injection de L-NAME, un inhibiteur des NOS, 14h00 avant l'acte exéprimental d’ischémie-reperfusion. Ces animaux feront l’objet d’un suivi particulier. Nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle de l'état clinique de ces animaux sera réalisé pour différents critères physiologiques et comportementaux. Si nécessaire, la prise de décision d’euthanasie sera réalisée avec le responsable de l’animalerie. Une ischémie-reperfusion sera réalisée in-vivo sur des rats anesthésiés en condition hyperglycémique ou non. Afin de limiter toute souffrance chez les animaux durant cette procédure sans réveil, une anesthésie chimique sera réalisée (isoflurane 4.5% puis 1.5-2%) associée à une analgésié pré-opératoire (buprénorphine; 0.3mg/kg).
Devenir
A l'issu de l'ischémie reperfusion in vivo" la totalité des animaux sont euthanasiés par injection d'une dose léthale de pentobarbital, afin de permettre le prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l'effet cardioprotecteur de l’exercice physique sur la fonction cardio-vasculaire lors d’un stress hyperglycémique. L'animal permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient soumis à une hyperglycémie aigue. Basé sur l’expérience du laboratoire dans le domaine, les programmes d'entrainement modéré des animaux seront basés sur les mêmes paramètres physiologiques que chez le patient pour se rapprocher aux mieux des conditions cliniques et valider ou non cette stratégie de cardioprotection en condition hyperglycémique.
Réduction
Nos travaux préalables conduits ex vivo ont déjà permis de réduire considérablement le nombre d’animaux nécessaires à cette étude et d’identifier des conditions particulières nécessitant l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont soit non invasives (protocole d'entrainement), ou finalement sans réveil (anesthésie létale suivit d’un prélèvement d’organe). Au cours de l'acte expérimental d’ischémie-reperfusion in vivo, les animaux seront anesthésiés (Isoflurane) puis analgésiées (injection sous cutanée de buprénorphine 0.3mg/kg). Enfin, les rats seront logés dans des cages de 3 individus, avec nourriture ad libitum et accès à de l’eau fraiche. Un enrichissement de l’environnement sera présent et régulièrement renouvelé (tunnels, abris, cube de bois, coton). Un animalier formé contrôlera le bien-être des animaux tous les jours et nettoiera les cages une fois par semaine.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation du même animal in vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade de jeune adulte (rats de 12 semaines)
Le test d’observation d’Irwin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3600
7 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats-médicaments puis passent le test d'observation d'Irwin, une batterie d'évaluations comportementales et neurologiques destinée à repérer la toxicité avant tout essai chez l'humain. Le porteur indique qu'un animal atteignant un point limite est "immédiatement mis à mort", et qu'un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie précède le prélèvement du cerveau. Il affirme qu'il "n'existe pas" de modèle sans animaux ni de méthode moins sévère fournissant des informations équivalentes.
Objectifs
Les directives réglementaires recommandent des évaluations pharmacologiques de sécurité spécialisées pour caractériser les effets induits par les médicaments sur le système nerveux central (SNC) avant leur administration chez l’humain et tout au long du développement clinique. Le test d’observation d’Irwin, couramment utilisé par l'industrie pharmaceutique, est une batterie d'observations contenant plusieurs paramètres pour évaluer l'état global comportemental, neurologique et autonome d'un animal (rat ou souris). Cela implique l'évaluation systématique de plusieurs paramètres à l'aide d'une échelle de notation détaillée. Le but de ce projet est d’évaluer les effets induits par les médicaments sur le SNC avant leur administration chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats du test d'Irwin sont utilisés pour déterminer la toxicité potentielle d’une nouvelle substance (aigüe et chronique) et peuvent aider à déterminer la gamme de doses à tester dans d'autres tests. Par ailleurs, ce test d’observation peut également fournir une première orientation, qui peut être pertinente, vers une indication thérapeutique spécifique, un mécanisme d'action spécifique ou une fonction physiologique spécifique. Il permet également d'éviter toute expérimentation inappropriée, en orientant les études d'efficacité postérieures, voire même d'interrompre celles-ci en cas d'effets secondaires.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre le prélèvement de sang est réalisé en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris pour les rats entre 1 ml à 4 ml maximum et pour les souris entre 0.5 ml à 1ml. A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Lors de l'administration d'un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables peuvent apparaître. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, l'état général des animaux est évalué selon notre grille. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Devenir
A la suite de la procédure "d'administration des produits", tous les animaux passent en test. Puis, à la fin du test d’observation d’Irwin, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale puis à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèle n'utilisant pas d'animaux ou ayant un degré de sévérité inférieur permettant d'obtenir des informations équivalentes à celles obtenues par le présent modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar ou Sprague Dawley Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J et SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2...) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.