Rats

52 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation focale leur est induite par injection stéréotaxique de lysolécithine, modèle de sclérose en plaques, suivie de jusqu'à cinq anesthésies générales par mois, d'amincissements du crâne et de séances d'imagerie par IRM et ultrasons. Une partie des animaux est étudiée éveillés, avec un cadre fixé en permanence au crâne, et le porteur indique que la démyélinisation reste locale sans déficit moteur, les animaux étant tués pour analyse du cerveau. Il affirme que ni les réseaux de neurones ni les organoïdes ne permettent d'évaluer le retentissement d'une démyélinisation focale.

Objectifs

La démyélinisation focale d’un faisceau de matière blanche cérébrale par une injection in situ de lysolecithine est un modèle animal de la sclérose en plaques humaine largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la démyélinisation et remyélinisation. Cependant l’impact fonctionnel (la connectivité entre différentes aires cérébrales) de cette démyélinisation focale a été quasiment ignoré jusqu’à présent. Ce projet permettra de caractériser cet aspect peu étudié, en mobilisant des approches d’imagerie (IRM, ultrasons) et de comportement.

Bénéfices attendus

Les maladies démyélinisantes du système nerveux central et notamment la sclérose en plaque font parties des maladies invalidantes chez le jeune adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact fonctionnel de la démyélinisation focale par l’utilisation de ce modèle animal. Cet aspect inexploré du modèle animal permettra ensuite de définir de marqueurs fonctionnels qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 5 anesthésies générales sur une période d’un mois. La première sera réalisée au moment de l’injection de la substance démyélinisante (1h), la seconde pour l’examen IRM (30 min) et dans le cas où l’induction du modèle est confirmée, de l’amincissement du crâne (30 min). Une troisième anesthésie sera réalisée au cours de la première session d’imagerie ultrasonore (1h). La quatrième anesthésie sera afin de réaliser le deuxième amincissement du crâne et la dernière pour la deuxième session d’imagerie ultrasonore.

Impact sur les animaux

L’injection de la substance démyélinisante (lysophosphatidylcholine) s’effectue via une chirurgie stéréotaxique et produit une démyélinisation focale limitée au niveau du site d’injection. Cette démyélinisation locale n’entraîne pas de déficit moteur. L’amincissement du crâne est réalisé avant chacune des sessions d’imagerie fUS, afin de maximiser le signal ultrasonore. Une partie des animaux sera étudiée en condition d’éveil et dans ce cas un cadre permettant supportant la sonde ultrasonore sera fixé de manière permanente sur le crâne des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélèvement du cerveau et analyse post-mortem.

Remplacement

Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (IRM, ultrasons) permettant d’étudier la connectivité entre aires cérébrales, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Ni les réseaux de neurones, ni les organoïdes cérébraux, ne permettent aujourd’hui d’évaluer le retentissement global (entre aires cérébrales) d’une démyélinisation focale (limitée à un faisceau de matière blanche). De plus, l’utilisation de l’animal vivant permet de relier les données d’imagerie à des performances en tâches comportementales, et ainsi de définir des biomarqueurs fonctionnels qui pourront ensuite être utilisés pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. La sonde ultrasonore est adaptée au rongeur.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelle sans avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique. Un nombre minimum de 8 animaux par groupe seront nécessaire afin de permettre une puissance statistique suffisante avec une variabilité de 5 % et obtenir un résultat fiable en procédure 1. Cette estimation est basée sur les travaux les plus récents utilisant cette technique d’imagerie ultrasonore pour sonder la connectivité cérébrale par groupe. Considérant que 20% d’échecs peuvent survenir au moment de l’injection stéréotaxique (nécrose ou démyélinisation trop faible), et 20% au moment de l’amincissement du crâne, un nombre de 12 animaux par groupe, soit un total de 24 animaux sera requis pour la procédure 1. Les procédures 2 et 3 sont conditionnées à la réussite de la procédure 1 et sont envisagées comme des expérimentations pilotes sur un petit nombre d’animaux. Ainsi, pour la procédure 2, qui vise à établir la faisabilité de l’imagerie fUS chez l’animal éveillé, 10 animaux seront nécessaires au maximum. Pour la procédure 3, qui vise à tester d’autres sites d’injections du corps calleux, 6 animaux sont envisagés par site d’injection soit 18 animaux en tout. L’ensemble du projet nécessite 52 rongeurs.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés après la chirurgie : perte de poids > 15 % depuis le début de la procédure ; poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés, immobilité. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique, amincissement du crâne) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, l’euthanasie serait effectuée. Les scéances d’imagerie fUS seront réalisé avec une sonde de taille adapté aux crânes des rongueurs. Les expériences chez l’animal éveillé seront précédées par une phase d’habituation afin de minimiser le stress.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau du rat est proche de celle de l’homme. Le modèle de démyélinisation focale est très bien caractérisé et maîtrisé chez cette espèce. L'imagerie ultrasonore peut être réalisée en condition optimales grâce à une sonde de taille adaptée, et de poids adapté (20g avec le cable) permettant à l'animal éveillé de rester libre de ses mouvements. Rats adultes (6-8 semaines), Crl:CD(SD) Travail sur des animaux adultes ayant un dévéloppement cérébral achevé.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans deux régions profondes du cerveau, puis une restriction alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pour les motiver à une tâche de labyrinthe en T récompensée par un granulé de sucre. Le porteur décrit précisément cette tâche de conflit de réponse et indique que la chirurgie et la manipulation quotidienne génèrent stress et douleur, atténués par analgésie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer une tâche comportementale et que l'étude ne peut être menée chez l'humain.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet dans le domaine des Neurosciences Cognitives est de comprendre les mécanismes neuronaux sous-tendant le contrôle de l'action dans le cadre de situations ou des actions impulsives et inappropriées peuvent prendre le pas sur le comportement volontaire d’un sujet, ce qu'on appelle dans le milieu un conflit de réponses. Ce travail repose principalement sur des méthodes électrophysiologiques et comportementales pour comprendre la manière dont les rongeurs peuvent résoudre des tâches de conflit de réponses, et comment différentes régions du striatum participent à ce processus. Le striatum étant une structure profonde du cerveau que l'on sait impliqué de manière importante dans le contrôle de l'action et la motricité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement de deux structures cérébrales, le striatum dorso- médian et le striatum dorso-latéral, ainsi que les processus cognitifs sous-tendant le contrôle de l'action.

Procédures

Les animaux seront soumis à un acte chirurgicale pour implanter des électrodes d'enregistrement intracérébrales. Ils seront également soumis à une tâche comportementale sur un labyrinthe en T, dans laquelle ils apprendront à se diriger vers un des deux bras du T sur la base d'un stimulus instructeur (une lumière indiquant le chemin à suivre), afin d'obtenir une récompense alimentaire (un granulé de sucre). Au total, 20 rats participeront à cette expérience qui devrait durée environ 5 mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de - la restriction alimentaire tout le long du protocole comportementale: l'évolution du poids des animaux sera maintenue à une progression mensuelle de 10% tout au long du protocole à partir d'un poids initial correspondant à 90% du poids de l'animal avant le début de la restriction (pour garantir la motivation des animaux à effectuer la tâche comportementale) - la chirurgie: les animaux subiront une chirurgie pour implanter des électrodes au sein des deux structures visées (le striatum dorso- médian et le striatum dorso-latéral) - La manipulation par l'expérimentateur et la tâche comportementale: Les animaux seront manipulés quotidiennement par l'expérimentateur; le stress que cela pourrait générer sera toutefois minimisé par une habituation longue et adaptée aux besoins de chaque animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés pour des analyses histologiques. Ces analyses sont en effet indispensables pour confirmer le bon positionnement des électrodes d'enregistrement dans les structures ciblées. Sans cela, il est impossible de s'assurer que l'activité neuronale enregistrée provient bien des deux structures qui nous intéressent.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur une tâche comportementale que les animaux effectuent et ne peuvent pas être réalisées à partir de modèles in vitro ou in silico. Ce projet ne peut pas non plus être réalisé chez l’humain car les résolutions spatiale et temporelle étudiées nécessite l’implantation d’électrodes dans des structures cérébrales profondes.

Réduction

Le matériel d’enregistrement électrophysiologique que nous utiliserons (microdescendeurs à haute densité) permettra de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet en maximisant le nombre de neurones enregistrés par animal. En effet, ce système permettant de bouger verticalement la position des éléctrodes prévient la formation d'une cicatrice gliale autour de celles-ci qui pourrait empêcher l'enregistrement de l'activiter neuronale assez rapidement après implantation si le système été fixe. On peut ainsi enregistrer plus de neurones, plus longtemps, entraînant le besoin de moins d'animaux. La méthode d’implantation que nous utiliseront (électrodes placées simultanément dans les deux structures visées chez un même rat, au lieu d'utiliser deux groupes différents, un pour chaque structure) permettra également de réduire ce nombre de 50%.

Raffinement

Avant la chirurgie les rats seront hébergés dans des conditions standards avec de la litière foisonnante et un tube en plastique ou une barrette de bois comme enrichissement. L'hébergement standard prévoie également de garder les animaux en binômes permettant ainsi un enrichissement social de leur environnement. Après la chirurgie les rats implantés seront hébergés individuellement dans des cages rehaussées de 13cm pour qu'ils puissent se redresser sans que l'implant ne gêne leurs mouvements. L'enrichissement matériel de l'environnement sera toujours présent. Durant la procédure chirurgicale, l'anesthésie générale profonde sera assurée par l'association d'un agent volatil (isoflurane) et d'un dérivé morphinique (buprénorphine). La buprénorphine agira également comme un analésique puissant pendant 6h après l'injection, couvrant donc la totalité de la durée de la chirugie et sera également associé à un anti-douleur longue durée (carprophène, 24h d'action) et un analgésique local (lidocaïne) assurant ainsi une couverture analgésique optimale pendant la chirurgie. Durant la phase post-chirurgicale, l'animal aura accés à un complément alimentaire riche en eau et en nutriments (hydrogèle) en plus de sa nourriture standard ad libitum pour faciliter sa rémission. Le suivi de l'état de l'animal dans la phase post-chirurgicale sera fait deux fois par jour durant toutes la période de rémission (7 à 10 jours) et visera à évaluer le niveau de douleur et de détresse du rat. Une prise en charge analgésique sera mise en place si nécessaire. Le dégré sera adapté à l'état de l'animal pour faire disparaître toute manifestation de douleur ou de détresse. Egalement, la procédure comportementale sera précédée d'une période d'habituation à l'expérimentateur et au matériel expérimental (labyrinthe en T) visant à faire disparaître tout stress ou détresse de quelque nature que ce soit liés à la manipulation. Cette période d'habituation pourra être de durée variable en fonction des besoins des animaux. Le niveau de stress étant évalué par l'expérimentateur à chaque manipulation. Finalement, afin de maximiser le confort des animaux durant la tâche comportementale, les tests seront fait dans la pénombre.

Choix des espèces

Le rat présente de grandes capacités à la fois d'exploration de l'espace et de contrôle de l'action. Ses performances dans des labyrinthes spatiaux (tels que le labyrinthe en T) et dans des tâches de planification et de contrôle de l'action sont excellentes. De plus, une vaste littérature existe sur ces sujets, ce qui nous permettra de comparer les résultats que nous obtiendrons en utilisant une procédure comportementale innovante avec ceux déjà existants. Egalement, nos travaux antérieurs ont été réalisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre eux. Finalement, il s'agira de rats à l'age adulte (3 mois au début de l'expérience). La question scientifique posée ne porte ni sur le développement ni sur le vieillissement des processus cognitifs étudiés. Des animaux jeunes adultes qui devraient avoir des capacités cognitives inchangées tout au long de l'expérience et jusqu'à sa fin sont donc les modèles les plus appropriés.

361 rongeurs, 280 souris et 81 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs du défaut génétique de la maladie de stockage du glycogène de type III, ils reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique à doses croissantes, quatre anesthésies générales, des prélèvements sanguins répétés et des tests de force musculaire, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de déterminer la dose efficace de cette thérapie génique en développement non clinique, en vue d'une future application chez l'humain. Le porteur affirme que le ciblage simultané de trois tissus n'est pas réalisable in vitro et que les deux espèces sont nécessaires, seul le rat reproduisant l'atteinte cardiaque.

Objectifs

La maladie de stockage du glycogène de type III (ou GSD III pour glycogen storage disease III) est une maladie génétique héréditaire rare causée par des mutations dans le gène AGL (pour amyloglucosidase glucanotransférase) qui fabrique l’enzyme débranchante du glycogène nommée GDE. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la transformation du glycogène, molécule de stockage composée de successions de glucose, en unité élémentaire de glucose dans les muscles et le foie. Dans la pathologie, le glycogène non décomposé s’accumule dans les muscles squelettiques et cardiaque et dans le foie, altérant leurs fonctions. L'apparition de la maladie commence dès la petite enfance et comprend l'hypoglycémie, l'hyperlipidémie (excès de graisses dans le sang) et l’élévation des taux sanguins d'enzymes hépatiques causée par la mort des cellules du foie. Au niveau du foie, les symptômes tardifs peuvent inclure une hépatomégalie (foie anormalement gros), reflétant une affection chronique (cirrhose) et, parfois, des tumeurs hépatiques non cancéreuses. Des maladies du cœur peuvent apparaitre. Les fonctions immunitaires sont altérées. Certaines personnes sont de petite taille. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. Notre étude vise à définir la dose efficace d’un traitement de thérapie génique ayant pour but de réintroduire un gène fonctionnel fabriquant la GDE dans les cellules hépatiques et musculaires. Un vecteur recombinant dérivé d’un virus portant le gène AGL fonctionnel sera injecté à doses croissantes dans des modèles de souris et de rats porteurs du défaut du gène agl et l'effet de la thérapie génique sera évalué au cours du temps au niveau des fonctions musculaires, cardiaques et hépatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris et les rats porteurs du défaut du gène agl devraient permettre de stabiliser ou de diminuer l'accumulation de glycogène au niveau du foie et des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une régénération des tissus, une amélioration de la masse et de la force musculaire et une amélioration de la fonction cardiaque. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace du traitement sur tous les organes cibles afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la GSDIII par thérapie génique.

Procédures

Les souris et les rats recevront tous une injection intraveineuse unique de vecteur thérapeutique en début de protocole : chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Pour réaliser l’ensemble des tests et prélèvements, les souris et les rats recevront 4 anesthésies générales par voie intrapéritonéale. Chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures de test fonctionnels de suspension et de test d'agrippement et trois mesures de l'activité électrique musculaire espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques. Les rats subiront 3 mesures d’électrocardiogramme et d’échocardiogramme. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les rats subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats seront euthanasiés après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des périodes de jeûne contrôlé de 4 heures avant les prélèvements sanguins, ce qui pourraient entrainer une sensation de faim, de stress et une hypoglycémie. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil en cas de surdosage. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un petit morceau de queue ou d’oreille (acte réalisé pour l’identification des animaux), au moment des injections intraveineuses du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la pose d’électrodes transcutanés au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé, notamment si un animal présente des blessures aux griffes ou aux pattes au moment du test. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

P1 et P2: Euthanasie. P3: toutes les souris hétérozygotes seront euthanasiées, toutes les souris homozygotes seront utilisées dans la procédure 1, une partie des souris wild-type sera utilisée dans la procédure 1 (14 souris) et le reste des souris wild-type sera euthanasié (56 souris).

Remplacement

Le projet consiste à mesurer l'effet thérapeutique du transfert génétique du gène agl au niveau du foie, du cœur et des différents muscles squelettiques: ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler trois tissus simultanément in vitro et d’étudier la biodistribution relative de notre molécule thérapeutique entre les différents organes cibles. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une amélioration de la fonction musculaire dans les 2 modèles murins utilisés (souris et rats). Ces calculs permettent de prévoir un effectif de 7 souris et de 8 rats par groupe et par sexe, les deux sexes devant être inclus dans les études de recherche de dose thérapeutique afin de prendre en compte une éventuelle variabilité des effets liée au sexe (soit 14 et 16 individus par groupe pour les souris et les rats, respectivement). Pour les études réalisées sur les souris, 4 doses seront testées en parallèles d’un témoin non traité et d’un groupe de référence d’animaux en bonne santé, et 3 doses seront utilisées pour les études réalisées sur les rats avec les mêmes groupes témoins, soit un total de 84 souris et de 80 rats pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris et les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux recevront une injection unique du traitement par veine caudale, et subiront 3 prélèvements de sang au cours des 4 mois du protocole (un avant le traitement et un tous les deux mois). Ces prélèvements seront réalisés au niveau d'une veine du museau sur animaux vigiles maintenus en contention (souris) ou sous anesthésie gazeuse (rats). Les animaux subiront également un prélèvement de sang d’un volume plus important au moment de l’euthanasie, par prélèvement au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie générale. Au cours du protocole, tous les animaux seront soumis à différents tests fonctionnels permettant de mesurer l’effet du traitement au niveau des muscles squelettiques (souris et rat) et du cœur (rats seulement). Les tests douloureux seront réalisés soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie générale et un antalgique fort sera administré par voie sous cutanée avant de le réaliser. Le même antalgique sera également administré pendant les 48 heures qui suivront la fin de certains tests. Tous les tests fonctionnels seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur les pathologies génétiques. Le modèle de souris de la GSDIII permet une évaluation fonctionnelle très complète de différents groupes musculaires, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque des individus affectés par la GSDIII. Le rat est le seul modèle reproduisant cet aspect de la pathologie. L'utilisation des deux modèles de GSDIII permettra de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les souris et les rats seront de jeunes adultes âgés de 4 mois au moment du traitement et de 8 mois à la fin du protocole. La caractérisation préalable des deux modèles a permis de déterminer que la pathologie sera déjà présente au moment du traitement, ce qui permettra de tester l’effet de réversion de la pathologie, et non pas sa simple prévention. Ce choix permet de se rapprocher au plus juste de la pathologie humaine, qui sera traitée majoritairement après l’apparition des symptômes.

3 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats spontanément hypertendus servent de modèle du trouble de l'attention avec hyperactivité, testés jeunes entre trois et six semaines pour se rapprocher de l'enfant, placés seuls dans une enceinte pendant 150 minutes après administration d'un composé, puis tués pour prélever sang et cerveau. L'effectif est important et les procédures sont décrites brièvement. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer le TDAH et que le recours à l'animal de laboratoire est "nécessaire".

Objectifs

Le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention (TDAH) est un trouble complexe du développement cérébral caractérisé par l'hyperactivité/l'impulsivité et l'inattention. Cette affection touche principalement les enfants et les adolescents, mais elle peut également perdurer à l'âge adulte. Les rats SHR sont des rats spontanément hypertendus présentant une hyperactivité locomotrice et qui sont considérés comme un modèle animal validé du TDAH. Les rats WIstar Kyoto (WKY) servent de souche témoin. L’objectif de la présente étude est d’examiner l’effet d’un composé sur l’hyperactivité des rats SHR dans un test d’activité locomotrice spontanée. Ce modèle animal est un outil précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux ainsi que le développement neuronal mis en jeu dans le TDAH.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, seul des médicaments modulant les transmissions aminergiques tels ques les psychostimulants (ex :Méthylphénidate) et non psychostimulants (ex : Atomoxétine) sont utilisés actuellement comme pharmacothérapies. Ces médicaments augmentent les transmissions dopaminergiques et noradrénergiques; ces systèmes de neurotransmission sont les cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux traitements. De nombreuses recherches sur ce trouble, utilisant des approches génétiques, pharmacologiques et de neuro-imagerie, ont été réalisées. Plusieurs modèles animaux de TDAH tels que : le rat spontanément hypertendu (SHR) ou les souris knock-out DAT, ont également été utilisés. Ces modèles animaux sont donc des outils précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux du TDAH.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

1) L’un des modèles animaux du TDAH les plus utilisés est le rat spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Le rat SHR montre des niveaux élevés d’hyperactivité et d’impulsivité ; ces traits sont présents avant que le rat SHR ne développe une hypertension à l’âge adulte, c’est-à-dire vers l’âge de 7- 8 semaines. Dans ce projet, l’âge des animaux est compris entre 3 à 6 semaines au moment du test ; étant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est plus pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles. Par conséquent, les animaux de ce projet n’ont pas encore développé l’hypertension spontanée. 2) Le test consiste à placer les animaux individuellement dans une enceinte et à les laisser se déplacer librement pendant une période de 150 minutes comprenant une première période d’habituation de 30 minutes et une deuxième période de test de 120 minutes. 3) Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test à un intervalle de 2 semaines. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée ou intraveineuse peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer TDAH. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

►1) Les animaux sont hébergés selon les normes d’hébergement (annexe II de l’arrêté relatif à l’agrément des EU). Les rats seront hébergés collectivement. Les cages comporteront une litière de sciure, des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger... ► 2) Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet sont : les rats spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Les rats SHR présentent des déficits d'attention soutenue, d'impulsivité motrice et d'hyperactivité dans un nouvel environnement. De plus, ils présentent une signalisation DA réduite et une expression accrue du transporteur DA (DAT), similaire aux patients atteints de TDAH. De même, le méthylphénidate (MPH) corrige les déficiences attentionnelles et motrices chez les rats SHR, apportant un soutien supplémentaire aux rats SHR en tant que modèle de TDAH humain. 3-6 semaines au moment du test. Etant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles.

1 088 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neuropathie douloureuse leur est provoquée par quatre injections de paclitaxel, un agent de chimiothérapie, puis leur douleur est mesurée par des tests de von Frey, d'immersion et de pression de la patte. L'objet est de mettre au point un modèle de douleur neuropathique destiné à l'"offre de service" commerciale de la société pour ses clients développant des médicaments. Le porteur reconnaît que le remplacement reste limité dans l'étude de la douleur et décrit des effets attendus comme l'absence de prise de poids, la constipation et l'alopécie.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’un modèle de neuropathie chimioinduite, causé par des administrations répétées de paclitaxel. Le nombre de procédures, ainsi que le nombre d’études au sein de ces procédures et le nombre d’animaux sont basés sur l’expérience de l'entreprise dans le développement de modèles de douleur chez le rongeur. Elle a récemment mis au point un modèle de douleur neuropathique par intoxication à l’oxaliplatine. Fort de cette expérience, la société souhaite mettre en place un nouveau modèle de douleur neuropathie chimioinduite, afin de pouvoir apporter des modèles au plus proche de la clinique. Il est important de tester les molécules avec l’agent chimiothérapeutique testé en clinique. Chaque agent a une application différente due à son mécanisme d’action. Au terme de leur développement, ces modèles seront inclus dans l’offre de service de la société.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre à la société de mettre au point un nouveau modèle au plus près des conditions cliniques. L'entreprise peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causés par l’administration de paclitaxel, actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ceci va ainsi permettre une meilleure prise en charge de neuropathie due l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer

Procédures

Les animaux auront 4 injections intrapéritonéale de paclitaxel (D0-2-4-7) et auront un test comportementale de douleur (monofilament de von frey, von frey électrique, immersion de la patte, pression de patte) Les procédures 1 à 3 feront des cinétiques de test sur du long terme pour voir l'induction (tous les 3 à 4 jours entre J0 et J35 un seul timepoint) et pour les autres précédures un seul jour (selon résultats des premieres procédures) sera testé mais avec une cinétique de cinq point de mesures. Le travail s’orientant vers de l’allodynie, une partie des animaux auront simplement une sensation de gêne/chatouillement. Lors des tests, les animaux peuvent être isolés ou en contention.

Impact sur les animaux

Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Malgré tout, un article nous permet de nous attendre à une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie et de la piloérection. (Cavaletti, 1995, PMID : 7601264) Ces observations seront incluses dans nos points limites.

Devenir

Le modèle de neuropathie chimioinduite par administration de paclitaxel semble être un modèle stable dans le temps. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles . De plus, les processus biologiques causés par l’administration de paclitaxel pourrait interférer avec d’autres modèles. L’âge de ces animaux à la fin des procédures sera bien plus important que pour l’ensemble de nos modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité d’ANS Biotech, par l’utilisation d’une enceinte à CO2 dont l’air est remplacé par du dioxyde de carbone à raison de 27.5% par minute (mort par arrêt respiratoire après perte de conscience) ou par injection d’une dose létale de d’Euthasol® (sous anesthésie gazeuse, 400 mg/kg, i.p. ou i.c.) ou dislocation cervicale par du personnel spécifiquement formé à ce geste.

Remplacement

Les possibilités de remplacement par substitution complète de l’expérimentation animale sont encore limitées dans le domaine de l’étude de la douleur, mais nous les mettons en place dès qu’elles sont scientifiquement validées.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat.

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent pour la majorité des valeurs maximales à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance supplémentaire. Les procédures ont pour but de trouver les critères les moins drastiques permettant de montrer une allodynie/hyperalgésie. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise d’ANS Biotech (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien d’ANS (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II).

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente (Sneddon 2019 PMID : 31544617) et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente (Flatters 2004, PMID : 15082137) suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Des rats pesants entre 200-250g le jour de l’induction vont être utilisés. Cette gamme de poids correspond à un âge de cinq à six semaines. Ceci a été choisi en accord avec les données bibliographiques sur lesquels nous nous sommes basées pour choisir nos critères d’induction . (Favre et al. PMID : 19576881 ; Flatters et al. 2004 and 2006)

3 912 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dystonie cervicale, l'équivalent d'un torticolis spasmodique, leur est provoquée par micro-injection intracérébrale de DTG dans le noyau rouge après pose d'un guide-canule sous chirurgie stéréotaxique, puis des molécules d'un donneur d'ordre sont testées avant une perfusion au paraformaldéhyde. L'effectif est important pour une étude comportementale, et le projet relève d'une prestation pour un client industriel. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif de dystonie cervicale n'existe et que la démonstration se fait sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, souvent douloureux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Des études comportementales et biochimiques ont montré que les récepteurs σ sont impliqués dans la régulation du mouvement et de la posture. Ces récepteurs σ sont concentrés dans des structures cérébrales, telles que le noyau rouge et la substantia nigra. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et par la suite de tester les molécules du donneur d’ordre pour étudier leur potentiel effet sur les récepteurs σ : soit en induisant, par eux-mêmes, des dystonies cervicales (effet agoniste sur les récepteurs σ2) soit en inhibant les dystonies cervicales induites par l’administration de DTG, un agoniste σ2, (effet antagoniste sur les récepteurs σ2).

Bénéfices attendus

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Ce modèle est utile pour tester le potentiel agoniste ou antagoniste des récepteurs σ2 de molécules induisant des dystonies cervicales.

Procédures

Le but de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et ainsi permettre le développement de différentes molécules. Une micro-injection intracérébrale dans le noyau rouge de 1,3-di- (2-tolyl) guanidine (DTG), qui est un agoniste des récepteurs σ 1 et σ 2, est réalisée pour induire une dystonie du cou chez le rat. A la fin de l’étude, pour vérifier le site d’injection, les animaux sont perfusés au paraformaldehyde (PFA) et des coupes histologiques sont réalisées par la suite.

Impact sur les animaux

•1- Chirurgie -Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Un guide canule (tubes en acier inoxydable de calibre 24) est implantée verticalement à 1.00 mm au-dessus du noyau rouge •2- Administration -Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour vérifier le site d’injection au niveau du cerveau, les animaux seront perfusés au paraformaldehyde (PFA) à la fin de l’étude.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle de dystonie cervicale alternatif à l’animal.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables. • Justification du nombre de groupes: 1) Le groupe témoin est nécessaire à chaque expérience 2) Le groupe DTG est nécessaire pour valider l’expérience et pour comparer l’efficacité du produit testé 3) Il est généralement nécessaire de tester le produit à trois doses pour mesurer la relation dose-effet mais un nombre de doses inférieur ou supérieur peut être justifié en fonction de l’état de connaissance du produit. L’effet attendu du produit testé est une diminution de déviation de torsion de la tête par rapport au plan horizontal. Le DTG est administré en intracérébrale. Selon les études, le produit testé et son placebo sont administrés en intracérébrale ou par voies orale (gavage), intrapéritonéale, sous-cutané, intraveineuse ou intranasale. • Justification du nombre d’animaux par groupe. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 12 animaux par groupe. L’utilisation d’un nombre inférieur d’animaux a une probabilité importante d’entraîner la non-validité de l’étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d’animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée et ils sont placés individuellement. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. La lignée de rat utilisée est : Wistar 7 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont nourris avec des protéines issues de levure et de bactérie, soumis à des prélèvements sanguins caudaux puis à une ponction intracardiaque sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs contenus intestinaux et de leurs organes, pour évaluer l'intérêt nutritionnel de ces protéines pour l'alimentation humaine. Le porteur signale que ces aliments peuvent contenir des acides nucléiques potentiellement néfastes pour les reins. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative validée in vitro" pour mesurer la digestibilité des acides aminés, mesurable seulement chez l'animal ou chez l'humain.

Objectifs

Face à l’accroissement de plus en plus rapide de la population, aux enjeux liés au changement climatique et à l’urbanisation croissante, sécuriser l’offre alimentaire constitue un défi majeur pour le secteur agricole. Une augmentation considérable des besoins de ressources en protéines est inévitable. Les ressources végétales et animales nécessitent la mobilisation de grandes surfaces agricoles et sont dépendantes des conditions climatiques et de la saisonnalité. La recherche de sources protéiques alternatives est ainsi en plein essor et les Protéines d’Organismes Unicellulaires (POU) représentent actuellement une filière en développement. Les microorganismes sont des ressources intéressantes à exploiter, de par leur vitesse de croissance, leur capacité d’accumulation et la possibilité de moduler leur métabolisme et leur composition en fonction des conditions d’environnement. Dans ce contexte, le projet Nutripou va produire des POU issues de bactérie et de levure à partir de procédés de culture, d’extraction et de purification optimisés afin d’obtenir des POU dont la composition nutritionnelle est adaptée à l’alimentation humaine. Les objectifs de l’étude animale que nous souhaitons mener sont : i- d’évaluer la qualité nutritionnelle de POU issues de levure et de bactérie et présentant des degrés de purification différents (procédures expérimentales 1 et 2) et ii- d’évaluer les effets métaboliques et physiopathologiques de l’ingestion durant 3 mois de ces mêmes POU (procédure expérimentale 3) chez le rat.

Bénéfices attendus

Les données de qualité nutritionnelle des POU de levure et de bactérie et les effets de leur ingestion obtenues dans notre étude permettront d’appréhender l’intérêt de cette nouvelle ressource en protéines. La caractérisation nutritionnelle permettra de valoriser ou d’envisager des pistes d’amélioration de la production des POU et elles pourront éventuellement venir compléter le catalogue des ressources alternatives en protéines permettant de faire face à la demande mondiale croissante.

Procédures

Dans les procédures 1 et 2, les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence. Dans la procédure 3, ils seront hébergés à 2 par cages et placés uniquement 3 fois 24h dans des cages individuelles pour la collecte des urines. Lors des procédures 2 et 3, avant l’euthanasie des animaux et pour collecter une quantité suffisante de sang, une ponction intracardiaque sera réalisée après anesthésie gazeuse profonde de l’animal. Lors de la procédure 3, des prélèvements sanguins sur la veine latérale de la queue seront réalisés sur les rats vigiles. Trois prélèvements seront réalisés (au début, à mi-parcours et à la fin de la procédure) et la durée de chaque prélèvement ne dépassera pas 5 minutes

Impact sur les animaux

Lors des procédures 1 et 2, il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devrons suivre précisément la prise alimentaire de chaque rat (procédure 1) et les habituer à l’ingestion d’un repas-test (procédure 1). Lors de la procédure 3, les animaux seront hébergés à 2 par cage. La prise alimentaire n’étant pas le paramètre principal évalué lors de cette procédure, il est envisageable de diminuer la précision de cette mesure pour cette procédure. Les animaux seront placés en cage individuelle uniquement lors du recueil des urines, soit 3 fois une journée sur l’ensemble de la procédure. Les prélèvements sanguins de la procédure 3 sont susceptibles d’induire de la douleur. Les prélèvements se feront au niveau d’une veine latérale de la queue par un expérimentateur entraîné et les volumes prélevés seront modérés et ne dépasseront pas 15% du volume de sang des rats. Bien que la production des POU utilisées dans cette étude sera optimisée pour réduire les quantités d’acides nucléiques, les régimes à base de POU sont susceptibles de contenir des quantités faibles d’acides nucléiques pouvant être potentiellement néfastes pour la santé des rats. Les expérimentateurs seront donc particulièrement vigilant lors du suivi de l’état de santé globale des animaux. L’ingestion d’acides nucléiques pourrait avoir un effet sur le rein et l’excrétion des urines sera particulièrement observée.

Devenir

Procédure 1: Les 40 rats seront réutilisés pour la procédure 2. Procédure 2: les 40 rats seront euthanasiés afin de collecter les digestats des différents compartiments intestinaux et évaluer la digestibilité de POU. Procédure 3: les 40 rats seront euthanasiés afin de prélever les organes et tissus permettant d'évaluer les effets de l'ingestion de POU sur des marqueurs inflammatoires et histologiques.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de méthode alternative validée in vitro pour déterminer la digestibilité de l’azote et des acides aminés des protéines. Les méthodes de digestion in vitro ne permettent pas en l’état actuel des connaissances d’obtenir des données représentatives de la digestibilité in vivo des acides aminés alimentaires. Ces mesures ne peuvent être réalisées que chez l’animal et chez l’homme. Néanmoins, les études de digestibilité des acides aminés nécessitent à l’heure actuelle l’accès aux contenus intestinaux au niveau iléal et sont très invasives chez l’homme. En outre, afin d’étudier l’innocuité de ces nouvelles sources de protéines alimentaires à moyen terme, et en particulier les effets de taux d’acides nucléiques non négligeables, il est nécessaire d’évaluer les effets sur différents marqueurs inflammatoires, métaboliques, du statut osseux, etc. et cela ne peut se faire que chez l’animal en ayant accès à l’ensemble des tissus et organes.

Réduction

A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante et garantir l'exploitation des résultats est de 8 rats par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel dans les procédures 1 et 2, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. Des regroupements dans des cages collectives (5 rats/cage) seront effectués une fois par semaine lors de ces 2 procédures. La capacité d’accueil de la cage de regroupement sera adaptée au nombre et au poids des rats et les animaux seront identifiés par un numéro inscrit au marqueur sur leur queue. Pour la procédure 3, les animaux seront hébergés à 2 par cage. Néanmoins, les animaux passeront 3 fois 24h en cage métabolique individuelle afin de collecter les urines. Ces cages seront également en plexiglas et enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. Afin de réduire la douleur lors des prises de sang au niveau d’une veine latérale caudale réalisées en procédure 3, les prélèvements se feront par un expérimentateur entraîné. Les volumes prélevés seront modérés (2mL/prélèvement, 3 prélèvements à J0, J45 et J90) et ne dépasseront pas 15% du volume de sang des rats. Les animaux seront habitués à la contention dans un tissu lors des pesées afin de réduire le stress généré lors de la contention pour réaliser la prise de sang et un analgésique sera appliqué sur la queue quelques minutes avant le prélèvement pour réduire les douleurs. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Si une perte de poids de plus de 20% sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’Homme pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles. Procédure 1 : Rats âgés de 3 semaines. L’évaluation du CEP est une procédure standardisée qui se réalise chez de jeunes rats pour rendre compte de la capacité de la protéine à soutenir la croissance. Procédure 2 : Rats issus de la procédure 1. Ils seront alors âgés de 8 semaines. Les études de digestibilité sont habituellement réalisées sur des rats de cet âge. C’est une fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études quand il s’agit de normaliser les conditions d’expérimentations dans lesquelles l’âge de l’individu n’est pas l’objet de la recherche. Procédure 3 : Rats adultes âgés de 8 semaines. C’est une fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études quand il s’agit de normaliser les conditions d’expérimentations dans lesquelles l’âge de l’individu n’est pas l’objet de la recherche.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse d'un conjugué anticorps-médicament puis huit prélèvements de sang sur vingt-et-un jours sous anesthésie, pour mesurer la durée de présence de la molécule anticancéreuse dans le sang. Le porteur indique que les organes seront prélevés après la mise à mort afin d'éviter une seconde expérience de biodistribution. Il justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la "nécessité" de prélèvements répétés et par son statut de modèle "obligatoire" pour les études réglementaires.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à determiner la durée de présence dans le sang de l'animal (pharmacocinétique) qui est étroitement corrélé avec son activité anti-cancéreuse. L'étude proposée vise à évaluer la pharmacocinétique de conjugués anticorps-médicaments innovant développés pour le traitement de cancers solides ne possédant à ce jour aucun traitement de thérapie ciblée. Connaître ce paramètre pour un composé permet de déterminer sa fenêtre d'efficacité et donc de déterminer la dose à utiliser. L'étude proposée porte sur différents variants d'un conjugué anticorps-médicament dont l'anticorps est validé par la FDA (Food and Drug Administration) et dont le médicament est un dérivé de molécule approuvé par la FDA. Ces conjugués anticorps-médicament sont en développement pre-clinique et l'étude vise à séléctionner le composé possédant le meilleur profile pharmacocinétique afin de le qualifier pour un développement pré-clinique plus poussé dans l'objectif de l'évaluer en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’influence de l’agent masquant sur le profil pharmacocinétique du conjugué anticorps-médicament formulé en fonction de sa taille et de la molécule cytotoxique attachée. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (antibody-drug conjugate, conjugué anticorps-médicament) ayant la meilleure fenêtre thérapeutique, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- une seule injection de molécule thérapeutique dans la veine caudale. -prélèvement de sang dans la veine saphène. 8 prélèvements au total sur une durée de 21 jours. Les prélèvements sont effectués sur des animaux anesthésiés avec un anesthésie/analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

- La dose administrée dans cette étude étant significativement plus faible que la dose maximum tolérée et les traitement étant stables en circulation, pas de nuisance concernant la perte de poids n'est attendue. - Injection unique d’un composé thérapeutique dans la veine caudale (degré de gravité modérée). - Prélèvement sanguins dans la veine saphène (degré de gravité modérée). Les prélèvements se font dans la veine saphène, superficielle, et n’entraîneront pas de difficultés locomotrices. - Douleur caudale si inflammation du point de prélèvement, 2h maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. L'ensemble des organes seront prélevés et conservés pour des études de biodistribution. En effet, l'étude ci-présente vise à déterminer le profile pharmacocinétique des composés, cependant un même schéma d'étude peut être effectué pour réaliser une étude de biodistribution. Le prélèvement des organes évitera donc de devoir réaliser une expérience similaire.

Remplacement

Cette étude vise à déterminer la durée de présence de nouvelles molécules dans le sang d’un organisme vivant, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro ont été faites en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour les études in vivo.

Réduction

Le choix du rat versus la souris permet d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux pour pouvoir réaliser des prélèvements sanguins répétés. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 10 rats par groupes. Dans une démarche de réduction, l'ensemble des organes seront prélevés et congelés pour d'éventuelles analyses de biodistribution.

Raffinement

Avant le début des procédures, les rats seront habitués aux expérimentateurs des études, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières, un traitement antalgique, ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.

Choix des espèces

Le choix du rat pour l'étude pharmacocinétique (PK) s’explique par plusieurs raisons, la nécessité de prélèvements sanguins répétés justifie le choix du Rat par la règle des 3R. Une étude chez la souris nécessiterait de multiplier le nombre d’animaux pour réaliser les prélèvements dans des conditions éthiques. De plus, les prélèvements répétés en 48h peuvent être faits avec une seule piqure initiale, les autres se faisant par prélèvement de la goutte de sang qui se forme lorsque l’on gratte le sang séché. Par ailleurs, le Rat est un des modèles obligatoires pour les études de PK règlementaires, il est donc justifié de réaliser ces études chez le Rat plutôt que la Souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des rats de 6 semaines pour avoir un poids idéal de 200g des rats au moment du traitement.