Rats

600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.

Impact sur les animaux

Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.

Devenir

Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.

Raffinement

L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.

Choix des espèces

Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.

170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue de l'imagerie. Rendus diabétiques par la streptozotocine ou soumis à l'isoprotérénol pour induire une hypertrophie cardiaque, ils reçoivent chaque semaine, sous anesthésie, des prélèvements de sang et d'urine et l'injection d'un produit de contraste testé. Le porteur reconnaît qu'un surdosage d'isoprotérénol pourrait provoquer un infarctus mortel chez près d'un tiers des animaux. Il indique avoir mené des tests cellulaires préalables mais juge le recours à l'animal "primordial" pour valider la nanoparticule sur un organisme complet.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester un composé stable, efficace et biocompatible pour l'imagerie par particules magnétiques (MPI). Le composé sera absorbé/retenu au niveau du cœur selon la préférence de substrat énergétique. Dans ce projet, il sera ciblé l’utilisation préférentielle des acides gras. En effet, nous souhaitons optimiser une technique d'imagerie multimodale (IRM et tomodensitométrie) non invasive qui discrimine des pathologies métaboliques.

Bénéfices attendus

Le projet fournira un nouvel outil d'imagerie pour discriminer les préférences de substrat énergétique du cœur. Le choix du substrat énergétique (principalement le glucose et les acides gras) est influencée par l'homéostasie et les pathologies cardiaques. Or, il n'existe actuellement aucune modalité d'imagerie qui combine les avantages d'une sensibilité et d'une résolution métabolique élevées. Le produit de contraste mis au point nous permettra de tester et de valider une nouvelle méthode d'imagerie multimodale afin de discriminer le substrat préférentiel et ouvrir ainsi de nouvelles stratégies diagnostiques et de la caractérisation des maladies cardiaques. La méthode à tester sera présentée lors de conférences et publier dans des journaux à comité de lecture.

Procédures

Les animaux seront soumis, selon le groupe d'enrôlement, à une injection intrapéritonéale unique ou quotidienne de streptozotocine (injection unique, 44 animaux) ou d'isoprotérénol (7 à 30 injections, 44 animaux). Du sang (de la veine caudale) et de l'urine (du massage abdominal) seront prélevés chaque semaine sous anesthésie pendant la procédure d'imagerie. Ils expérimenteront, lors de l'imagerie, une injection du nouveau ou du produit de contraste biocompatible testé pour le MPI.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress pendant les injections intrapéritonéales, les périodes de jeûne et les prélèvements de sang/urine. Celles-ci seront effectuées sur des courtes durées et uniquement par du personnel formé afin de réduire au maximum l'inconfort des animaux. Le modèle pharmacologique de l'hypertrophie cardiaque n'est pas signalé comme créant de détresse à long court chez les animaux. Néanmoins, un surdosage d’isoprotérénol pourrait provoquer un infarctus du myocarde mortel chez 30% des animaux. Cela sera évité par une injection à une dose optimale, un monitoring quotidien incluant une surveillance les changements de poids corporel. Concernant le modèle de diabète STZ, la durée de vie des animaux traités est raccourcie. Néanmoins, la fenêtre de mortalité est indiquée de 8 à 18 semaines. Or, cela dépasse la durée d’application de notre protocole expérimental appliqué aux animaux. Les procédures d'imagerie seront toutes réalisées sous anesthésie générale, sous thermorégulation et réveil assisté, pour surveiller et limiter l'inconfort des animaux.

Devenir

Selon le stade de suivi, les animaux pourront être euthanasiés à la fin des protocoles d'imagerie (procédures 3 ou 4). Les procédures 1 et 2 ne prévoient pas la mort de l'animal si ce n'est en cas d'événements indésirables incontrôlables ou d'atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation d’animaux est limitée à l'étude de la biodisponibilité systémique du produit de contraste et à la caractérisation du statut métabolique dans le tissu cardiaque. Avant la phase d'étude in vivo, plusieurs tests sur lignées cellulaires immortalisées seront menés pour estimer les effets potentiels des agents de contraste à court et moyen terme, dont la cytotoxicité et les événements indésirables cardiaques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est primordial afin d'avoir une validitié du concept sur les intéractions complexes du corps, et qui pourra être extrapoler aux réactions du corps de patients.

Réduction

Les animaux seront utilisés pour plusieurs procédures expérimentales, incluant compris l'imagerie, les analyses de sang et des prélèvements d'urine pour suivre l'absorption et la clairance du nouveau produit de contraste à tester. Cette approche transversale nous permettra d'utiliser le moins d'animaux possible pour la robustesse statistique et la solidité technique de notre nouvelle approche d'imagerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions de soins en fonction de l'espace de cage individuel spécifique à l'espèce, des besoins sociaux, c'est-à-dire sans isolement (à l’exception des très courtes durées de déroulé des procédures), et de la stimulation avec enrichissement environnemental (igloo, bois à ronger...). De plus, les animaux seront suivis par du personnel formé aux meilleurs soins pour les rongeurs.

Choix des espèces

L'utilisation de rats (Wistar wild type) nous permet d'utiliser des techniques d'imagerie à haute résolution – imagerie par résonance magnétique 9.4T et CT – qui sont fondamentales pour révéler les caractéristiques précises de l'agent de contraste. Pour l'imagerie, les rats le meilleur rapport signal/bruit et ils peuvent être utilisés pour les deux modalités d'imagerie envisagées. De plus, les rats permettent la création des modèles pharmacologiques du diabète et de l'hypertrophie cardiaque, de manière reproductible et rapide. Adulte, à partir de 10 semaines afin d’avoir des animaux dont la croissance est achevée.

2 264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sept jours de privation de sommeil paradoxal pour reproduire une fatigue chronique, passent un test moteur et exploratoire, puis sont tués par prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie ou par décapitation à la guillotine pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à modéliser le syndrome de fatigue chronique et à y tester des molécules candidates. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer la fatigue chronique, rendant selon lui le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La fatigue chronique est l’un des principaux facteurs qui dégradent la santé humaine ; aussi appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), il se définit comme un ensemble de symptômes d’épuisement intense et quasi permanent qui apparaissent sans raison apparente ou pathologie sous-jacente. Afin d'étudier la physiopathologie de la fatigue chronique, ce projet consiste : 1) Dans un premier temps, à mettre en place un modèle animal de fatigue chronique chez le rat. Les animaux seront exposés à une privation continue de sommeil à mouvements oculaires rapides (REM) pendant 7 jours. L’impact de cette privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l’étude, différents prélèvements (sang et cerveau) seront réalisés pour des mesures de paramètres biochimiques; 2) Puis, dans un deuxième temps, l’objectif sera de tester, dans ce modèle, des médicaments candidats pouvant réduire la fatigue généralisée.

Bénéfices attendus

Les origines du syndrome de fatigue chronique (SFC) restent méconnues et à ce jour il n’existe pas de traitement spécifique au SFC dont l’efficacité ait été démontrée. Les traitements proposés visent à soulager les symptômes qui lorsqu’ils se manifestent de façon intense deviennent particulièrement invalidants pour le malade. Ce modèle est utile pour : 1) identifier les voies neurobiologiques impliquées dans ce syndrome; et 2) tester de nouvelles molécules candidats, pour améliorer sa prise en charge.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 1 ml à 4 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 4 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

Durant la période d'induction de la fatigue , les animaux sont pesés et leur état général est évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Par ailleurs, certains effets indésirables des produits tels que des crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après administration.

Devenir

L’impact de la privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l'étude, pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à : 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous isoflurane ou par décapitation (sous anesthésie générale) avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer la fatigue chronique, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier la physiopathologie de la fatigue et évaluer l’efficacité de nouvelles molécules qui pourrait la réduire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Ils seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques, par un personnel dûment formé. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Espèce/lignée utilisée : rat mâles Sprague-Dawley Ce modèle est reconnu et sa validité a été démontrée chez le rat. Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis cinq mois à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un état prédiabétique, ils passent des IRM cardiaques sous anesthésie, un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tués par injection létale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme vouloir tester la vitamine D comme protection du cœur, avec pour objectif déclaré de proposer un jour cette approche chez l'humain. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut aujourd'hui remplacer le rat, qu'il juge proche de la physiologie cardiaque humaine.

Objectifs

Le but de ce projet de recherche est de proposer une approche thérapeutique simple et innovante afin de protéger le coeur prédiabétique mâle et femelle dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique à l'Homme. Plus précisément,, nous chercherons à mettre en évidence l’effet d’une supplémentation en vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre. Le prédiabète est un véritable enjeu de santé publique car au regard de sa durée longue et réversible, il offre une fenêtre thérapeutique très pertinente. Par ailleurs, la vitamine D a des effets importants sur le système cardiovasculaire en régulant le métabolisme du calcium, l’immunité et l’inflammation et pourrait exercer un effet protecteur sur les altérations cardiovasculaires précoces associées au prédiabète. Au laboratoire, nous avons acquis une solide expérience dans la caractérisation des atteintes cardiovasculaires induites lors du prédiabète et du diabète de type deux selon le sexe sur l’animal in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’étudier l’effet de la supplémentation en Vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique chez l’Homme.

Procédures

Nous utiliserons une approche multiparamétrique in vivo combinant les techniques d’imagerie (IRM) de résonance magnétique à une étude de l'homéostasie glucidique et à des analyses biochimiques sur différents tissus. Le modèle animal utilisé sera le rat soumis à un régime riche en graisse et en sucre (HFS) pendant 5 mois, qui mime une alimentation déséquilibrée retrouvée fréquemment dans les pays développés. Nous définirons 3 groupes mâles et femelles de 12 animaux : un groupe contrôle avec une alimentation normale, un groupe sous régime HFS et un groupe sous régime HFS supplémenté par la vitamine D pendant les deux derniers mois de régime. Pour l’ensemble du projet, le nombre maximum d’animaux sera de 36 mâles et 36 femelles, soit un total de 72 rats. Une pesée hebdomadaire et une mesure de la prise alimentaire seront faites toutes les semaines pendant les 5 mois de régime. Les altérations cardiovasculaires seront suivies de manière non invasive in vivo par IRM après 3, 4 et 5 mois de régime. Après 5 mois de régime, un test de tolérance au glucose et une mesure de l’insuline seront faits afin de vérifier l’état prédiabétique et le métabolisme glucidique des animaux. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection léthale d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.

Impact sur les animaux

Lors de l'IRM, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (2%) et d’oxygène (1 L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sert assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée,une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la bétadine jaune. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.Tout le long du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet de la supplémentation en vitamine D sur les complications cardiovasculaires précoces associées au prédiabète selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, les mêmes animaux seront utilisés pour les analyses décrites (examen par IRM, test de tolérance au glucose et mesure de l'insuline). A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimun nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes et a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique utilisant le logiciel Statistica.

Raffinement

L'étude par IRM se fera sous anesthésie inhalée afin de réduire l'angoisse et la douleur. La température corporelle sera maintenue à 37°C pendant l'examen à l'aide d'une couverture chauffante et vérifiée avec une sonde rectale. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés. L'impact environnemental sera pris en compte par une phase d'acclimatation des animaux de quelques jours. Le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Les animaux seront pesés une fois par semaine par les expérimentateurs pendant les 5 mois de régime. Les animaux seront aussi régulièrement manipulés par les expérimentateurs pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Les points limites seront déterminés en fonction des observations définies par Morton et Griffiths (1985). Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.

Choix des espèces

Le modèle de rat nourri avec un régime HFS permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le cœur. Le modèle HFS a été décrit pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale. Les animaux seront âges de 6 semaines à l’achat et de 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement des animaux.

1314 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une insuffisance rénale leur est induite par injection d'acide folique à forte dose, suivie d'administrations de molécules à tester, de séjours en cage à métabolisme et de prélèvements sanguins. Le porteur indique ignorer "ni la nature ni les effets secondaires" des molécules de clients qu'il évalue, et reconnaît une perte de poids et une baisse du volume urinaire. Il présente le recours aux rongeurs comme "incontournable", aucun modèle ne mimant selon lui la fibrose rénale.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur la transition de l’insuffisance rénale aiguë vers l’insuffisance rénale chronique et sur le développement de la fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients présentant une insuffisance rénale.

Procédures

Les animaux subiront une injection intrapéritonéale d’acide folique et une administration de molécules à tester en total respect de la législation (voies, fréquence et durée dépendantes de chaque protocole expérimentale). Ils pourront également être mis dans des cages à métabolisme pour récolter de l’urine pendant 24 heures maximum. De plus, les animaux pourront être anesthésiés à l’isoflurane, afin d’attacher un capteur permettant la mesure du débit de filtration glomérulaire. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang. Enfin, différents prélèvements pourront être réalisés sur l’animal post-mortem.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. De plus, toute manipulation de l’animal pour les traitements ou expérimentations peut provoquer un certain stress, désagrément, douleur qui seront minimiser par le fait que les expérimentateurs auront les formations et les compétences nécessaires pour réaliser tous les gestes expérimentaux. De plus, le modèle pathologique induisant une insuffisance rénale, les animaux pourront ressentir tous les effets indésirables de cette pathologie (perte de poids possible, volume urinaire diminué…).

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation car des prélèvements d’organes et des examens post-mortem pourront être réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la fibrose rénale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité (développement d’une fibrose rénale). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur l’insuffisance rénale se fera au cours du temps par des techniques non-invasives : mesure du poids, récolte urinaire par cage à métabolisme avec phase d’habituation à la cage pour limiter le stress, mesure du débit de filtration glomérulaire. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettent pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutefois, il est nécessaire de garder un groupe contrôle (sans la pathologie) afin de pouvoir le comparer avec un groupe pathologique afin de valider le modèle de l’étude. Une étude pilote préalable sur quelques animaux sera réalisée afin de mettre au point ce modèle. Aucun test statistique pour calculer le nombre d’animaux par groupe n’a été réalisé mais de par notre expérience et en tenant compte des études déjà publiées sur ce modèle, un nombre d’animaux par groupe de 15 pour la souris et 12 pour le rat est le minimum nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité inter-individuelle des réponses étudiées. Tout geste expérimental sera réalisé par du personnel compétent et expérimenté, limitant ainsi le stress et la douleur possible lors de chaque manipulation des animaux.

Raffinement

L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié permettant d’appliquer les points limites décrits dans les procédures (prostration, perte de poids importante, difficulté à se nourrir, se mouvoir…) et des critères d’arrêt des souffrances de l’animal. Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo/tunnel en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Certaines expérimentations (récolte urinaire ou mesure de la filtration glomérulaire) nécessitent un isolement temporaire des animaux dans des cages individuelles. Toutefois, les animaux pourront voir leurs congénères du fait que toutes les cages sont transparentes. Si un animal présentait des symptômes de mal-être tels que perte de poids, poils hérissés, plaies, déshydratation, il serait soigné, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière et isolé si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h et que un des points limites était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle de pathologie rénale induite par une injection d’acide folique à forte dose est largement décrit dans la littérature chez le rongeur (souris et rat) Classiquement nous utiliserons des animaux matures sexuellement d’au moins 8 semaines car la fibrose rénale apparaît principalement chez l’adulte. Néanmoins cet âge pourra être amené à être modifié à la demande du client.

Des rats et des souris reçoivent, pour le compte de clients, des candidats médicaments dont le laboratoire dit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles". 2 076 rongeurs, 1 038 souris et 1 038 rats, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements de tissus. Le létrozole sert à induire un syndrome des ovaires polykystiques, et le protocole peut comporter jusqu'à dix semaines d'administrations, jusqu'à deux fois par jour, un régime gras, une ovariectomie ou l'implantation de pellets, des frottis vaginaux et des prises de sang. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a fixé la taille des groupes, huit rongeurs chacun, et estime trois études par an raisonnables au regard de ses autres protocoles et des demandes de ses clients.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien pendant une semaine ou un frottis par semaine pendant dix semaines. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.

Choix des espèces

Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix sera ainsi dépendant des demandes clients car le modèle SOPK induit par le létrozole est bien décrit dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des rats et des souris adultes ou prépubères (3 semaines). De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé).