Rats

15 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau sous anesthésie, puis ils reçoivent des traitements pouvant aller jusqu'à deux administrations par jour pendant plusieurs semaines, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine jusqu'à un diamètre de 20 mm chez la souris et 40 mm chez le rat. Ce dispositif sert au criblage in vivo de molécules anticancéreuses candidates, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit ces procédures et qualifie le recours à un "organisme entier" d'"indispensable".

Objectifs

Le cancer affecte des millions de personnes chaque année. Cette pathologie a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter le cancer ont une efficacité limitée pour certaines indications comme le cancer du pancréas ou le cancer du poumon et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. Il y a donc un besoin urgent de trouver des molécules efficaces nouvelles ou en repositionnement ayant un effet anti-cancéreux démontré. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du cancer avec la mise en place de modèles avec greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement de nouveaux médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes. Ce projet a déjà été déposé en 2018.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments anticancer sur différents types de tumeurs dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pendant 3 minutes afin d’injecter, en sous-cutanée, les cellules cancéreuses (excepté le groupe 1 qui reçoit du PBS) au niveau du flan. Au cours de l’expérience, les animaux recevront des traitements (véhicule, molécule à tester ou molécule de référence). La voie d’administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, par voie orale ou par voie sous-cutanée, sur animaux vigile. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée Cela pourra être une à sept fois par semaine, jusqu’à 2 fois par jour pendant plusieurs semaines. Sur animal vigile pris en contention, la taille des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse jusqu’à la fin de l’étude. La technique non invasive du laser doppler pourra être utilisée une fois par semaine pour une vingtaine de minutes par animal, après une anesthésie par isoflurane. Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’implantation de cellules cancéreuses, l’animal va développer une tumeur solide en sous-cutanée qui va grossir au cours du temps. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer les tumeurs et différents organes pour analyses

Remplacement

Ce projet se focalise sur un modèle intégré d’étude du développement tumoral et/ou de l’angiogenèse (mesure du flux sanguin intra-tumoral) nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier permettant la formation de la tumeur. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant ces procédures expérimentales. Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour pouvoir tester l’effet du traitement sur la croissance tumorale dans un contexte physiologique.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des lignées cancéreuses qui auront répondu au traitement lors d’études in vitro préliminaires afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

La procédure d’implantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et que la tumeur soit placée à un endroit qui ne gêne pas l’animal. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Ainsi, les animaux seront surveillés au moins une fois par semaine puis au moins deux fois par semaine une fois que les tumeurs seront palpables. Une surveillance plus fréquente peut être nécessaire lorsqu'une croissance tumorale rapide est attendue, lorsque les tumeurs approchent du point final ou si l'état de l'animal commence à se détériorer. De nombreux paramètres seront enregistrés, au niveau physique et comportemental. Les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse (dyspnée, convulsions, plégie…) seront mis à mort immédiatement. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. De plus, la taille de la tumeur sera mesurée 2 fois par semaine et est limitée un diamètre maximal de 20 mm pour la souris adulte et de 40 mm pour le rat adulte, sous réserve d’euthanasier pour raison éthique. L’état et l’emplacement de la tumeur seront également inspectés régulièrement pour déceler par exemple la présence de nécrose ou ulcération importante au sein de celle-ci ou si la tumeur est mal placée pouvant gêner les mouvements de l’animal. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés (voir annexe 2). Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques. Lors des prélèvement de sang terminaux, une analgésie de l’animal sera effectuée (buprénorphine ou lidocaïne respectivement pour un prélèvement intra-cardiaque ou rétro-orbital).

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, du fait de leurs tailles et leurs spécificités, ils permettent l’étude et le suivi du développement tumoral d’un point de vue morphologique, histologique et moléculaire. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en cancérologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces (voir tableau récapitulatif en annexe 1). Un animal immunodéficient (comme la souris ou le rat Nude ou la souris SCID) sont classiquement utilisés pour ce type d’étude, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Il s’agit d’un modèle non dommageable à l’état basal. Si les cellules greffées sont d’origine murine, des animaux immunocompétents seront utilisés. Ce sont des modèles de laboratoire bien connus avec suffisamment de données historiques. Ces projets permettront le suivi de l’impact de traitement sur le développement tumoral de cellules greffées. Les animaux seront âgés de 5 à 8 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales, à un stade de jeune adulte où le pouvoir prolifératif des cellules reste important sans avoir à toucher au développement normal de l’animal.

28 rats vont être utilisés, tous tués à cinquante-six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une section chirurgicale du ligament croisé du genou provoque une arthrose, puis huit injections de cannabidiol sont faites dans l'articulation, la douleur ne pouvant être soulagée par anti-inflammatoires sous peine de fausser le modèle. L'objet est de tester si le cannabidiol freine les lésions arthrosiques, dans le contexte d'une consommation croissante par les patients. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ne reproduit ces lésions et juge le modèle rat "indispensable".

Objectifs

L'arthrose est la maladie articulaire la plus répandue. Actuellement en France, 10 millions de personnes souffrent de cette pathologie. L'arthrose est une maladie complexe et sevère qui altère fortement la qualité de vie des patients. Elle se caractérise par une destruction du cartilage qui s'étend à toutes les structures de l'articulation, notamment à l'os et au tissu synovial. À ce jour, il n'existe que des traitements qui visent à soulager la douleur. Face aux douleurs liées à l'arthrose, de plus en plus de patients consomment ou sont tentés de consommer soit du cannabis ou des cannabinoïdes. Plusieurs études cliniques sont en cours concernant la consommation des cannabinoïdes dans les douleurs liées à l'arthrose notamment au Canada et aux États-Unis. En revanche, malgré le nombre important de produits qui apparaissent sur le marché avec différents modes d'administration, leur potentielle efficacité sur les lésions du cartilage n'est pas encore évaluée. Seules des études in vitro ont montré que le système endocannabinoïde est capable de jouer un rôle dans l'arthrose et que les récepteurs aux endocannabinoïdes sont exprimés au sein de l'articulation (cartilage et membrane synoviale). Dans une nécessité d'améliorer les données in vivo sur le rôle des cannabinoïdes dans l'arthrose et leur potentielle utilisation dans le traitement des lésions arthrosiques, nous souhaitons donc étudier l'impact du cannabidiol sur le cartilage sain et sur les lésions du cartilage observées au cours de l'arthrose chez le rat mais également sur le degré d'inflammation de la membrane synoviale. Pour l'exploration de cette nouvelle piste thérapeutique, nous souhaitons injecter directement du cannabidiol dans l'articulation afin de cibler les lésions articulaires et de limiter par ailleurs la diffusion dans l'organisme, chez des rats ayant subi une section du ligament croisé antérieur. La section du ligament croisé antérieur chez le rat est un modèle d'arthrose très utilisé puisqu'il présente les mêmes signes cliniques que ceux observés dans l'arthrose humaine.

Bénéfices attendus

L'arthrose du genou (OA) est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30% de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. En ciblant le système endocannabinoïde dans la pathologie arthrosique, l'injection intra-articulaire de cannabidiol pourrait donc permettre de soulager les patients mais également de retarder l'évolution des lésions arthrosiques, évitant ou retardant la mise en place d'une prothèse (seule technique thérapeutique efficace pour le moment).

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale à J0 d'une durée d'environ 20 minutes qui sera réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Pour minimiser la douleur post-opératoire, les rats seront traités par un antidouleur une heure avant l'intervention chirugicale. Durant cette procédure chirurgicale, la section du ligament croisé le ligament croisé antérieur sera sectionné afin d'induire une arhrose expérimentale par instabilité. La section sera vérifiée par un mouvement sépcifique de genou (présence d'un tiroir). Le plan musculaire et le plan cutané seront ensuite suturés. Les rats seront ensuite placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils seront ensuite replacés dans leur cage par groupe de 3 ou 4. Ils seront également surveillés de façon assidue pendant les 48 heures qui suivent l'opération. Tous les animaux subiront ensuite 8 injections intra-articulaires à J3, J7, J14, J21, J28, J35, J42 et J49 de CBD après l'opération chirurgicale d'une durée de moins d'une minute chacune. Les injections intra-articulaires réalisées sous anesthésie générale d'excipient ou de CBD dont la compositon et la dose ont été choisies sur la base de la littérature (dose antalgique chez le rat), n'induisent pas de douleur "post-injection".

Impact sur les animaux

Ce modèle d'arthrose expérimentale par section du ligament croisé est un modèle très connu et parfaitement maïtrisé par les personnes en charge de la réalisation des procédures expérimentales et tout particulièrement en termes de douleur. La douleur engendrée ne peut cependant pas être prise en charge par des anti-inflammatoires car ces molécules auraient une influence sur l'inflammation et l'apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont donc une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale suite à la chirurgie puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Enfin la dernière nuisance considérée comme légère concerne les anesthésies gazeuses à l’isoflurane hebdomadaires pour la réalisation des 8 injections intra- articulaires. La dose de CDB utilisée est la dose antalgique décrite dans la littérature et n'engendre donc aucune douleur.

Devenir

À la fin de l'étude, les rats seront mis à mort selon la méthode réglementaire, 56 jours après l'induction du modèle d'arthrose expérimentale. Chaque genou (droit et gauche) sera prélevé afin de réaliser les études macroscopiques, histologiques et immunohistologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuse à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlateral. La membrane synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation en histologie, en immunohistochimie.

Remplacement

Face à la consommation absolument non cadrée de cannabidiol par les personnes souffrant d'arthrose et afin d'étudier l'impact de la prise de molécules sur les tissus abarticulaires et de tester également leur efficacité dans le traitement de l'arthrose (atteintes des tissus cartilagineux et degré d'inflammation de la membrane synoviale), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer l'impact de cette substance sur les tissus et sur l'évolution des lésions. Il n'existe pas de méthode "in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l'impact de la prise de ce produit dans un modèle d'arthrose expérimentale chez le rat.

Réduction

Dans un souci d'éthique, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera opéré de façon à préserver le genou gauche comme témoin. Tous les scores histologiques seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 3 ou 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce, en accord avec la législation envigueur, au sein de notre animalerie conventionnelle. De plus, plusieurs éléments plaident en faveur d'une expérimentation en milieu conventionnel en plus de l'expérience historique que nous avons sur ce modèle depuis plus d'une vingtaine d'années, puisque l'envirionnement microbien (microbiote) est particulièrement susceptible d'être impliqué dans le developpement de maladies inflammatoires et/ou dégénératives de l'articulation. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales sucrées. Cet enrichissement ne modifie en rien notre étude et apporte une distraction non négligeable à l'animal et renforce également positivement la relation expérimentateur-animal. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par section du ligament croisé antérieur est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. par ailleurs, une antalgie peropératoire par buprénorphine (0,05 mg/kg) sera réalisée. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure a 20% sur 3 jours étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.

Choix des espèces

Le rat est couramment utilisé dans l'arthrose et ce modèle dit mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux seront livrés à l'animalerie à l'âge de 6 semaines et auront une semaine d'acclimatation. Ils seront opérés à l'âge de 7 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 56 jours après l'intervention chirurgicale pour réaliser des explorations macroscopiques, histologiques et immunohistochimiques des lésions arthrosiques et déterminer le degré d'inflammation de la membrane synoviale.

3 020 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une ou plusieurs chirurgies cérébrales et l'implantation de cathéters, puis s'auto-administrent de la cocaïne ou de l'alcool pendant plusieurs mois, certains selon des protocoles conçus pour induire une consommation de type addiction. Le porteur veut cartographier les circuits reliant contexte social et prise de drogue, et annonce des retombées thérapeutiques et pour les politiques de réduction des risques, formulées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'un comportement volontaire exige un "organisme vivant entier" et conclut que le rat est un "modèle de choix, ne pouvant être remplacé".

Objectifs

La consommation d'alcool ou la cocaïne se fait souvent en soirées, en contexte social. Cependant le rôle de ce contexte social n'est pas bien déterminé. Chez le rat comme l'humain, la présence d'un congénère diminue la consommation de cocaïne. Cette réduction est plus importante si le congénère est inconnu ou naïf à la cocaïne. A l'inverse, la présence d'un congénère augmente la consommation d'alcool. Le contexte social a donc un effet opposé selon la drogue consommée et le type de congénère présent. Au niveau neurobiologique, lorsque l'activité des neurones du noyau subthalamique (NST) est modulée, l'effet de la présence d'un congénère est diminué. Dans ce projet nous étudierons le substrat neurobiologique de ces effets étendu aux réseaux impliquant le NST. Notre hypothèse est que les structures limbiques (Cortex préfrontal, l'insula et l'amygdale) connectées au NST sont impliquées dans la modulation de la consommation de drogue induite par le contexte social. L'objectif est de caractériser les substrats cérébraux responsables de l'influence du contexte social lors de prise de drogues et de comprendre les différences potentielles en fonction du sexe et de la drogue. Nous étudierons, chez le mâle et la femelle, la contribution des voies cortico-NST, insula-NST ou amygdalo-NST quand les animaux ont pour récompense : 1) la cocaïne, 2) l'alcool ou 3) l'accès à un congénère. Pour cela, les rats consommeront volontairement de la cocaïne ou de l'alcool. Le rat, libre de ses mouvements, devra appuyer sur un levier afin d'obtenir de la drogue. Le rat consommera soit seul, soit en contexte social: - en présence d'un congénère dont l'identité variera - avec la diffusion de vocalises ultrasoniques de différents types, modalité principale de communication des rats. Tout d'abord l'activité neuronale des voies étudiées sera mesurée pour confirmer leur implication dans le comportement de consommation de drogue en contexte social. Puis l'activité de ces voies sera manipulée afin de déterminer leur rôle. Ce travail conduira a une meilleure compréhension des susbtrats neurobiologiques de l'influence du contexte social sur la consommation de drogue. En déterminant les substrats biologiques pertinents, il sera possible d'élaborer des thérapies chirurgicales voire pharmacologiques. De plus, l'étude du contexte social permettra de déterminer son rôle dans la consommation de drogue et d'améliorer l'accompagnement des consommateurs voire réduire les risques de consommation.

Bénéfices attendus

La consommation de drogue a généralement lieu en contexte social, lors de soirée ou de fête comme pour l'alcool. Ainsi la présence d’autres individus, consommateurs ou non, amis ou étrangers, influence notre consommation. Actuellement chez l’animal, l’addiction est étudiée avec le protocole d’auto-administration de drogue. Le rat notamment, s’auto-administre l’ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain dans ce protocole. Dans celui-ci, le rat est vigil et libre de ses mouvements, et a accès à un levier. Ce n’est que lors de l’appui volontaire du rat sur ce levier, qu’une dose de drogue lui est délivrée. Néanmoins peu d’études scientifiques s’intéressent à l’influence contexte social et la présence de congénère sur la consommation de drogue. Il a été montré que chez l’humain comme chez le rat, la consommation de cocaïne diminuait en présence d’un congénère, tandis que celle d’alcool augmente dans ces mêmes conditions. Les rats ont ainsi des comportements proches de celui des humains lors de consommations de drogue en présence d’un congénère. Ainsi la présence d’un congénère rat permet une approche plus écologique et plus réaliste de la consommation de drogue chez l'humain. De plus, il est nécessaire de déterminer les substrats neurobiologiques responsables de ces effets. Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cérébraux pour mieux comprendre les processus émotionnels en lien avec la prise de drogue, notamment l’effet du contexte social, qui peut être protecteur ou non en fonction de la drogue consommée. En plus d’améliorer les modèles animaux d’addiction en implémentant le contexte de consommation, ce projet génèrera des résultats à fort impact translationnel. En effet, les résultats peuvent soutenir ou pas les politiques de réduction des risques de consommation qui suggèrent le développement de salles de consommation par exemple. Ce projet apportera également de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction et devrait confirmer le potentiel thérapeutique de la manipulation du NST dans cette pathologie et ses effets secondaires potentiels. De plus, il permettra aussi de mettre en évidence le rôle du NST dans les comportements sociaux, ce qui pourrait lui donner un autre intérêt dans le contexte de recherche des bases neurales de certains troubles de la cognition sociale tels que celui du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale. Afin d’enregistrer ou de moduler l’activité cérébrale, nous réalisons des chirurgies cérébrales. Les animaux sont sous anthésie générale. Chirurgies : -1670 animaux seront soumis à un seul acte (1670 chirugie cérébrales (durée:1h30), -1350 animaux seront soumis à deux actes (30 qui auront 2 chirurgies cérébrales (durée:1h et 10h), espacés d'au moins 3 semaines), 1320 chirurgie cérébrales (durée: 2h30)et implantation cathéter pour l’auto-administration de cocaïne (durée:1h) ). Dans les approches comportementales: -1320 animaux s’auto-administreront la cocaïne quotidiennement durant 2-3 mois (sessions de 2h (consommation récréative) ou sessions de 6h durant 20 jours (protocole permettant d’induire une consommation de type « addiction »). -1320 animaux s’auto-administreront l’alcool quotidiennement durant 3 à 5 mois (sessions de 1h (consommation récréative) ou sessions de 14h durant 1 mois et demi tous les 48h (protocole d’accès intermittent à l’alcool pour induire une consommation de type « addiction »)). -330 animaux travailleront pour obtenir une récompense sociale (une interaction avec un autre rat à travers un grillage) quotidiennement durant 1 à 2 mois (sessions de 2h ou sessions de 6h (Protocole de ratio progressif, l’animal doit fournir de plus en plus d’appui pour une même récompense)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les conséquences ‘classiques’ à court terme des interventions chirurgicales. Dans les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas en accès libre), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. Enfin, les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters, ou fibres optiques, peuvent parfois provoquer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu. Enfin, suivant les sessions d’auto-administration les animaux présentent une hyperactivité marquée, qui s’estompe en moins d’une heure (la dose i.v. de cocaïne est faible, tout comme la quantité d’alcool). Les symptômes de manque (perte de poids, agressivité…) sont rares, car les animaux ont accès tous les jours à la drogue.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort après les études comportementales afin de vérifier que les injections des virus et implantations de fibres optiques aient été réalisées correctement. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier les substrats cérébraux dans une pathologie précise : la consommation de drogue. Or, en France, il est interdit de fournir des drogues d’abus dans le cadre d’expérimentation humaine. De plus, le recours à des méthodes invasives exclut de fait les études chez le sujet humain. Pour l’étude d’un comportement, il est nécessaire d’utiliser un organisme vivant entier. La consommation de drogue, pathologique ou non, repose sur la consommation volontaire de l’individu. Ainsi l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l’individu soit vigil et libre de ses mouvements. Les modèles animaux de consommation de drogue reposent sur les protocoles d’auto-administration. Dans celui-ci le rongeur a accès à un levier. Lorsqu’il appuie dessus, une dose de drogue lui est délivrée. Ainsi c’est le rongeur lui-même qui décide du nombre de doses qu’il reçoit, il s’autorégule. Il est alors possible d’étudier son comportement volontaire de consommation de drogue. Le rat est un animal curieux ce qui facilite significativement l’apprentissage de l’association appuie sur le levier égale une récompense/drogue et il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain . De plus, dans ce projet, nous étudions le rôle du contexte social. Or, le rat est un animal sociable, vivant en communauté dans un système hiérarchisé. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Ainsi, le rat est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

Dans l’optique de ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous réaliserons les vérifications des techniques de modulations de l'activité cérébrale avant les tests comportementaux. De plus le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statisique. Ensuite nous analyserons régulièrement les données expérimentales issues des approches comportementales. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale. Nos conditions expérimentales étant nombreuses (6 conditions différentes possibles, voir annexe1), chaque animal en réalisera 2 afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. Il y a donc 3 contextes sociaux à réalisés. Afin de diminuer le nombre de congénères nécessaire, des rats d’autres projets seront réutilisés après l’approbation de la Structure du bien-être Animal (SBEA) de notre établissement. Les rats n’ayant jamais été exposés une drogue pourront être réutilisés dans d’autres projets n’impliquant pas l’étude du contexte social, avec l’accord de la SBEA de notre établissement.

Raffinement

Lors des chirurgies, les animaux seront sous anesthésie générale et sous antidouleur. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si l’animal présente des signes de souffrance de l’animal (grimace faciale, prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé…) par l'administration d’antidouleurs spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir chaque jour et de manière appropriée en cas de besoin. En addition, une fiche de score du bien-être complété au moins une fois semaine permettra l’évaluation du bien-être de l’animal. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé…) et/ou de perte importante de poids (15%), l’animal sera isolé et aura accès illimité à une nourriture enrichie en glucose. Un traitement antidouleur pourra être administré si besoin. L’animal sera replacé avec son partenaire de cage dès reprise de poids et comportement normal afin de limiter l’isolement au maximum. En ce qui concerne l’habitat, les animaux sont hébergés par pair. Les cages sont enrichies grâce à la présence d’objets divers et variés (bâtonnets en bois, petits tunnels...) avec un roulement toutes les semaines pour diversifier au maximum l’environnements des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain. De plus le rat est un animal social dont le comportement présente des similitudes avec celui de l’humain, avec mise en place d’un système hiérarchique et organisé, communication visuelle, olfactive, auditive et tactile. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rast adultes (>7-8 semaines) (environ 380g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

Âgés d'un jour, des ratons éveillés reçoivent une injection d'un vecteur viral dans la veine jugulaire, qui peut provoquer une insuffisance cardiaque dans les semaines suivantes, et leur manipulation peut conduire la mère à les rejeter ou à les mutiler. 206 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec deux à quatre mois de régime riche en graisse, des gavages de glucose, des injections d'insuline et sept prises de sang par test de tolérance, à 20 et 60 jours. Le porteur écrit que certains rats ne supportent pas l'anesthésie des échocardiographies et "ne peuvent être réanimés", puis que les rats "se réveillent dès l'arrêt" de cette anesthésie. Tous sont mis à mort à la fin de l'étude pour des prélèvements post-mortem.

Objectifs

La fibrillation atriale (FA) est l'arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement et la sédentarisation accrue de la population, faisant craindre une véritable épidémie dans les 50 prochaines années. Un remodelage atrial et électrique est observé, favorisant l'apparition d'arythmies cardiaques. Par ailleurs, des études ont montré une association entre abondance du tissu adipeux épicardique et le risque de FA. Les maladies métaboliques comme l'obésité sont donc des facteurs de risque de la FA. Lors de la FA, le remodelage observé au niveau macroscopique (dilatation des cavités ventriculaires et atriales) se répercute au niveau cellulaire avec une désorganisation de la structure des cardiomyocytes. Ce remodelage cellulaire aura pour conséquence la perturbation des domaines membranaires caractéristiques du cardiomyocyte, lesquels sont nécessaires à une conduction optimale du potentiel d'action cardiaque (anisotropie cardiaque). La protéine CASK (Calcium Calmodulin Serine threonine kinase) est une protéine essentielle au développement et à la mise en place de la polarité cellulaire dans le système nerveux. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de CASK dans la différenciation du cardiomyocyte, cellule qui acquiert sa polarité après la naissance.

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhesion du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines partenaire du canal sodique comme CASK dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 types d'interventions différentes. Ceux-ci sont d'abord mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les rates servant à la reproduction (2 mois anté et post-natal des ratons), et 2 mois pour les rats issus des portés. Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront nécessaires. Celles-ci commencent par le gavage de glucose, qui est une procédure très rapide (quelques secondes). Un gavage sera réalisé à deux stades : 20 jours et 60 jours de développement pour tester la tolérance au glucose. Par la suite, le test de tolérance à l'insuline sera réalisé à partir d'une injection d'insuline : l'injection se fera à 2 stades de développement (20 jours et 60 jours) et dure quelques secondes. Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue est effectué sur les animaux vigiles afin de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte qui ne dure que quelques secondes est répété 7 fois pour un test de tolérance au glucose et à l'insuline. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de tolérance au glucose et 2 fois à un test de tolérance à l'insuline, à 20 jours et 60 jours. Afin de valider l'implication de notre protéine d'intérêt CASK, son expression est modifiée par injection d'un vecteur viral dans la veine jugulaire des animaux vigiles. Les rats reçoivent une injection unique 1 jour après la naissance, qui est très rapide (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation.

Devenir

A l'issu de cette étude, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (n=206) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 10 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablements frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont aggrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, baton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anésthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anéthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anésthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont indolores. Une anésthésie locale est utilisée pour les injections et prélèvements de sang. Un analgésique est également administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, deshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: Perte de poids de plus de 20%, deshydratation, poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du CM, qui se fait en post-natale (d'où les stades J1, J5, J20 et J60). - Afin d'étudier le rôle de la protéine CASK sur le développement myocardique (d'où l'injection à J1).

20 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transférés vers l'établissement voisin où ils seront tués à la fin du protocole. Ces rats rendus diabétiques reçoivent une injection quotidienne pendant douze semaines, des prises de sang hebdomadaires, des tests de tolérance au glucose et un test de mémoire en piscine de Morris, cette partie du projet se limitant à une séance d'imagerie par rayons X sous anesthésie. Le porteur indique attendre perte de poids, hyperglycémie et lésions de la queue liées aux prélèvements répétés dans l'établissement principal. Il présente sa myokine comme une biothérapie innovante et curative du diabète, et affirme que l'étude in vivo est indispensable car la maladie implique plusieurs organes.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. L'objectif de l'étude réalisée dans l'EU 2/2 est de mesurer l'absorption des rayons X par les différents tissus du rat afin de quantifier la masse maigre et grasse. Ceci sera réalisé lors d'une séance d'imagerie non invasive à rayons X chez le rat anesthésié en fin de protocole.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. Contrairement au Liraglutide, largement utilisé chez le patient diabétique qui peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux pouvant amener le patient à vouloir arrêter son traitement, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2. L'impact de la Myokine X sur le muscle squelettique (masse maigre) qui joue un rôle central dans la régulation de la glycémie sera évaluée avec l'utilisation de l'imagerie par rayons X chez l'animal anesthésié en fin de protocole.

Procédures

Dans l’établissement 1/2, les animaux recevront une injection quotidienne en intrapéritonéale durant 12 semaines. De plus, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie et ainsi évaluer l’évolution du diabète. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans l’établissement 1/2 sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X. – Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. Les nuisances attendues sur les animaux sont une anesthésié à l'isoflurane et une séance d'imagerie par rayons X d'une durée de 2 minutes. Il n’y a pas d’effets indésirables attendus dans le protocole réalisé dans l’EU 2/2 ; la dose de rayons X reçue lors de la séance unique d’imagerie TDM-X est largement inférieure au seuil d’apparition d’effets délétères cellulaires.

Devenir

A la fin de la procédure réalisée dans l'EU 2/2, les animaux retournent dans l'EU 1/2 pour terminer le protocole (saisine 40266). La mise à mort à lieu dans l’établissement 1/2

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, comme décrit précédemment, l’impact de la Myokine X ayant déjà été évalué in vitro, il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

La tomodensitométrie est une technique d’imagerie qui nous permettra de déterminer l’impact de la Myokine X sur l’ensemble de la composition corporelle, en complément des pesée d’organes réalisées sur l’ensemble des animaux au moment du sacrifice. Cette méthode de quantification étant très précise, nous utiliserons 5 rats par groupe. En effet, ce nombre d’animaux est suffisant pour nous permettre de réaliser des analyses statistiques sur les données de masse grasse et masse maigre des animaux.. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie en tenant compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Pour cela, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer cette procédure sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne réaliseront pas la procédure de tomodensitométrie car ils sont déjà impliqués dans des procédures réalisées précédemment..

Raffinement

Les rats seront transportés entre les 2 établissements dans des boites de transport adaptées avec des croquettes, de l’eau en gel et de l’enrichissement. Ils ne resteront dans l’établissement 2 que le temps nécessaire à la réalisation de l’imagerie. Avant et après la séance d’imagerie, ils seront placés au calme dans la zone de quarantaine de l’animalerie avec un contrôle régulier afin de vérifier leur bien-être.

Choix des espèces

Le rat ZDSD (Zucker Diabetic Sprague Dawley) est celui qui mime le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons le modèle de rat ZDSD. L’utilisation en parallèle de rats SD (Sprague Dawley) servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats SD et ZDSD âgés de 16 semaines au commencement du protocole. En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats ZDSD. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.

800 animaux non-humains, 400 souris et 400 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des immunisations par pistolet à gènes deux fois par semaine pendant jusqu'à 25 semaines, avec des prélèvements sanguins réguliers, les souris prélevées vigiles à la veine maxillaire et les rats sous anesthésie. Le porteur indique que le pistolet à gènes provoque une rétraction de la peau, une irritation et une douleur locale, et qu'aucun animal ne sera gardé en vie. Il affirme qu'un modèle in vitro ne reproduirait pas la complexité de la réponse immunitaire.

Objectifs

La préparation aux pandémies est un bien public mondial. Les menaces de maladies infectieuses ne connaissent pas de frontières. De même, des maladies telles que le cancer, les maladies auto-immunes et la résistance aux antibiotiques constituent un risque mondial. Des efforts sont donc en cours pour développer des vaccins plus efficaces et plus spécifiques. L'enjeu est de taille car les progrès scientifiques et la maîtrise des procédés de génie génétique ont permis de concevoir des molécules de plus en plus efficaces à des coûts avantageux. Les anticorps monoclonaux produits in vitro étaient coûteux et échouaient lors des essais cliniques. Ainsi, le développement des vaccins plus efficaces et plus spécifiques, tels que les vaccins à ADN sont donc mis en avant. Ces vaccins produisent, in vivo, une immunité spécifique à l'antigène et font l'objet d'intenses recherches. Alors que les vaccins traditionnels reposent sur la production d'anticorps par l'injection de virus atténués, de particules virales mortes ou de protéines recombinantes, les vaccins à ADN peuvent être construits pour fonctionner de manière fiable tout en conservant la spécificité du vaccin. Les vaccins à ADN sont non vivants, non réplicatifs et présentent un faible risque de réversion pour provoquer une forme de la maladie en question ou une infection secondaire. En outre, les vaccins à ADN sont très flexibles et peuvent coder de multiples gènes (virus, bactéries et protéines). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de différentes méthodologies d'immunisation chez le rat et la souris par la production d'anticorps neutralisants.

Bénéfices attendus

Le principal avantage de ce projet est le développement de vaccins plus efficaces et plus sûrs grâce à la validation de la méthode d'immunisation par le "gene gun".

Procédures

Les animaux seront soumis aux protocoles d’immunisation avec l’utilisation du pistoler à gènes sous pression qui envoie des molécules d'ADN à travers la barrière épidermique et/ou muqueuse. Ce type d’immunisation est réalisé sous anesthésie. Lors de ce protocole, les animaux contrôles recevront les injections des éléments d’essais par une des voies dites classique, à savoir : sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou orale. Afin que les résultats puissent être comparables, les animaux contrôles seront également anesthésiés. Les immunisations seront réalisées 2 fois/semaine. La durée maximale du protocole d’immunisation et des injections est 25 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus avant immunisation et toutes les 2 semaines pendant le protocole d’immunisation dont la durée maximale est de 25 semaines. Les rats seront prélevés en veine sublinguale sous l’anesthésie générale. Les souris seront prélevées en veine maxillaire en vigile. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes circulants et à ne pas dépasser 15% du volume circulant. A la fin du protocole les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie pour le prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

L'anesthésie induit une baisse de la température corporelle. Le traitement par pistolet à gènes induit une rétraction temporaire du pis, une irritation temporaire de la peau et une douleur locale (légère et temporaire). Les voies d'immunisation conventionnelles, telles que les voies sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, orale et intraveineuse, peuvent induire une irritation et une douleur cutanées (locales et temporaires). La prise de sang chez la souris par la veine mandibulaire est effectuée avec l'animal éveillé. La contention peut générer un stress momentané, contrôlé par les opérateurs. La douleur locale est minime et temporaire, et les animaux ne montrent généralement pas de signes de souffrance (ils recommencent rapidement à explorer la cage, à manger et à boire). La prise de sang chez le rat est réalisée sous anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude, des organes tels que la rate, la moelle osseuse et les lymphonodes peuvent être prélevés après sacrifice par dislocation cervicale sous anesthésie. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

La vaccination permet de développer une réponse immunitaire de mémoire qui est à ce fin protectrice. La réponse immunitaire est complexe, mettant en jeux plusieurs types cellulaires : les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules T, les cellules B, entre autres avec des activités biologiques différentes. Un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire ces mécanismes complexes, et ne permettrait pas de montrer le potentiel et la puissance du vaccin ainsi que les effets indésirables.

Réduction

Le nombre total d'animaux (800) utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre ses objectifs, c'est à dire avoir une production de anticorps neutralisants et protecteurs après le protocole d'immunisation. Le nombre d'animaux par groupe, un échantillon minimum de 10 animaux/groupe, a été choisi pour cet essai préclinique de vaccin sur la base d'études antérieures, en raison de l'efficacité accrue des vaccins ADN avec le protocole d'immunisation par pistolet à gènes.

Raffinement

Nous réalisons le protocole sur des animaux anesthésiés. Afin d'éviter tout impact négatif de l'anesthésie sur l'animal, la durée de la procédure n'excède pas 10 minutes, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les concentrations anesthésiques sont adaptées à chaque espèce. Le personnel est formé à l'utilisation du pistolet à gènes, afin d'assurer un contrôle adéquat de la technique et de la procédure. Pour les voies d'immunisation conventionnelles, les volumes d'administration et le type d'aiguille ou de canule sont adaptés à l'espèce et au site d'injection ou d'administration. Toutes les voies d'administration conventionnelles chez les rats et les souris seront effectuées sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux et de garantir des conditions égales entre les groupes. Les mesures de raffinement pour les prélèvements répétés concernent le respect du volume circulant total et une période de récupération de 2 semaines. Les prélèvements dans les veines sublinguales des rats sont réalisés sous anesthésie, avec une pression sur le site de prélèvement en fin de procédure pour prévenir le risque de saignement. Chez la souris, la veine maxillaire est choisie et les prélèvements sont effectués tous les quinze jours, de manière à ne pas anesthésier les animaux et à prélever un volume suffisant, en alternant les deux côtés pour permettre un temps de récupération. La surveillance quotidienne des animaux, le contrôle de leur poids et l'observation clinique permettront d'identifier le plus tôt possible tout signe de douleur, de souffrance ou de stress. Les animaux seront hébergés en groupes et des enrichissements spécifiques à l'espèce seront systématiquement fournis et/ou ajoutés si nécessaire (par exemple, en cas de comportement agressif). La nourriture sera placée au fond de la cage pour faciliter l'alimentation.

Choix des espèces

Les rats et les souris peuvent bénéficier d'un protocole de vaccination destiné à stimuler largement le système immunitaire humoral. Une étude a montré que les anticorps naturels issus des sérums de rats immunisés ont produit une grande variété de production et une liaison totale supérieure à celle des anticorps naturels provenant des sérums de rats non immunisés. Cela indique que chez les rats de laboratoire, l'immunisation est associée à un plus grand répertoire d'anticorps naturels et à une liaison plus forte des anticorps. D'autres études plus récentes montrent chez la souris et le hamster et même chez l'humain le grand répertoire d'anticorps neutralisants produits par immunisation. Les animaux arrivent dans nos locaux à partir de 8 semaines d'âge. Après 1 ou 2 semaines d’acclimatation, en fonction de leur origine ils seront donc au stade adulte, et leur système immunitaire aura atteint sa pleine maturité.