Rats
Evaluation chez le rat, en imagerie par résonance magnétique, d’une nouvelle stratégie de neuroprotection non-pharmacologique pour l’accident vasculaire cérébral
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une occlusion de l'artère cérébrale moyenne puis une ischémie de 90 minutes, suivie d'examens IRM, pour tester un traitement de l'AVC consistant à incliner le corps tête en bas. Le porteur indique que la lésion induit des déficits sensorimoteurs, dont une hémiplégie partielle et des difficultés à se nourrir, sans récupération attendue puisque le suivi s'arrête à 24 heures. Il présente le projet comme une réplication d'un effet neuroprotecteur déjà observé, avancée comme condition d'une future évaluation "chez l'homme".
Objectifs
L’objectif est d’évaluer un nouveau traitement pour l’accident vasculaire cérébral (AVC), ayant l’avantage d’être non pharmacologique et facile à mettre en place dès le transport du patient vers l’hôpital. Il s’agit d’une inclinaison prolongée du corps (tête en bas, angle de 15°), effectuée pendant l’AVC, avant l'arrivée à l'hôpital. Un effet protecteur a déjà été mis en évidence sur un modèle d’ischémie/reperfusion chez le rat. Dans ce projet réalisé sur le même modèle animal, un suivi par IRM permettra de montrer que des changements de perfusion cérébrale sont induits pendant l’inclinaison, et qu’ils sont associés à l’effet neuroprotecteur observé. Par rapport aux données existantes, le projet a donc une double valeur, réplicative d’une part, et mécanistique d’autre part.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de répliquer de manière indépendante l’observation d’un effet neuroprotecteur : c’est une condition pour qu’il soit ensuite évalué chez l’homme. De plus, il apportera des données d’imagerie éclairant le mécanisme d’action et guidant la future évaluation clinique de ce traitement potentiel.
Procédures
Pour induire l'accident vasculaire cérébral, une chirurgie de 30 à 45 minutes est réalisée sous anesthésie générale. L’anesthésie est prolongée pendant la durée de l’ischémie (90 min), soit une durée totale entre 2h et 2h15. Un examen IRM est réalisé pendant l'ischémie. Un autre examen IRM (20 minutes) est réalisé le lendemain.
Impact sur les animaux
La lésion cérébrale (striatum et cortex sensori-moteur) induit des déficits sensorimoteurs (hémiplégie partielle, locomotion altérée, possible difficulté à se nourrir) dont la gravité est mesurée grâce à diverses échelles ou neuroscores. Il n’y a pas de récupération sensorimotrice notable attendue dans ce projet car le suivi post-AVC est volontairement limité à 24h.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure, après mesure du déficit neurofonctionnel et de la taille finale d’infarct final. Les cerveaux sont prélèvés post-mortem pour analyses immunohistochimiques.
Remplacement
L’inclinaison du corps comme stratégie de protection cérébrovasculaire nécessite une expérimentation animale. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie dédiés aux petits animaux.
Réduction
L’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sans avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans ce projet, l’imagerie permet également de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. La chirurgie est réalisée sous traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), avec thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. D’autre part, le suivi est volontairement limité à 24h post-AVC, car l’infarct est alors constitué, et la mesure d’un éventuel effet neuroprotecteur peut être réalisée. Une grille de score dédiée permet de juger objectivement les déficits sensori-moteurs, et le codage des expressions faciales permet de quantifier la souffrance post-opératoire afin de la traiter.
Choix des espèces
Le rat (souches Sprague-Dawley ou Wistar) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation et de la reperfuion par simple rétraction manuelle du filament. Le modèle a ensuite été adapté à la souris, mais les déficits sensori-moteurs sont plus difficilement mis en évidence et la taille du cerveau est plus petite, ce qui est pénalisant pour les techniques avancées d’imagerie (mesure de la perfusion notamment). Rats : jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre.
Étude du potentiel d’hydrogels innovants pour la régénération du muscle squelettique dans un modèle de perte volumétrique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections intrapéritonéales, subit une incision de 2,5 cm dans le muscle de la patte et un prélèvement de 100 mg créant une perte musculaire d'environ 20%, avant qu'un hydrogel expérimental ne soit déposé dans la plaie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut se substituer aux animaux et qu'un modèle physiologique est "nécessaire" pour valider la preuve de concept. Les retombées annoncées pour des personnes blessées, militaires et accidentés, restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de caractériser les hydrogels sur la cicatrisation.
Objectifs
L’ingénierie tissulaire se base sur l’utilisation de biomatériaux reproduisant la matrice extracellulaire native en fournissant un support aux cellules et à la formation de nouveaux tissus. Les biomatériaux peuvent orienter les phénotypes cellulaires et guider la régénération de tissus fonctionnels à travers des propriétés mécaniques modulables. Ils sont donc de plus en plus étudiés comme nouvelle stratégie de régénération des tissus et organes lésés. Parmi ces biomatériaux, les hydrogels, sont des réseaux tridimensionnels de polymères hydrophiles. Leurs capacités d’hydratation et leurs propriétés mécaniques ajustables en font des biomatériaux attractifs. Si l’utilisation potentielle d’hydrogels comme supports de la régénération musculaire est étudiée de façon croissante, des difficultés persistent en regard de la qualité et fonctionnalité du tissu formé. De fait, peu d’études montrent l’obtention d’un muscle fonctionnel – permettant la contraction – suite à une plaie volumétrique. La régénération du muscle est basée sur la prolifération et la différentiation de cellules souches musculaire qui une fois activées par l’inflammation liée à la création de la plaie, peuvent coloniser la plaie et reconstruire les fibres musculaires endommagées. La bonne cicatrisation repose sur une coordination efficace de tous les acteurs cellulaires impliqués afin de retrouver l’homéostasie du tissu. Les plaies profondes graves entraînant une perte musculaire volumétrique significative provoque donc une altération fonctionnelle permanente et handicapante. Les conséquences pour les personnes affectées (militaires, accidentés, victimes) sont très importantes et il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. C’est dans ce contexte que ce projet s’intéresse à la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en cas de lésion en utilisant des hydrogels injectable et poreux innovants.
Bénéfices attendus
Cette approche permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales. Une fois implantés au niveau du tissu musculaire lésé, nous déterminerons si ces hydrogels sont capables de mimer l’environnement cellulaire, améliorant ainsi la réparation fonctionnelle des tissus et organes, en particulier le tissu musculaire.
Procédures
5 injections intrapéritonéales (traitement anti-douleur et anesthésie), sous anesthésie; incision de 2.5 cm dans le muscle qui loge le tibia et prelevement de 100mg de muscle et enfin traiter cette plaie à l'aide des hydrogels à tester.
Impact sur les animaux
La chirurgie d’implantation réalisée pourra entraîner des douleurs localisées au niveau de la zone d’implantation et une plaie volumétrique d’environ 20% pourra potentiellement créer dans un 1er temps (la 1ere semaine) une gêne pour marcher/se déplacer. Les dommages de types lésions musculaires sont souvent accompagnés d’une inflammation passagère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser la zone d'implantation de l’hydrogel.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre d’en définir une première approche qualitative et cinétique.
Réduction
Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 7 rats par groupe et par temps est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Elle constitue en soi une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée. La présence dans les 2 premiers bras de la procédure d'étapes d'évaluations décisionnelles engageant la poursuite de la procédure, nous permettra aussi de réduire le plus possible le nombre d’animaux.
Raffinement
Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement pendant 1 semaine suivant la procédure expérimentale. La mise en place d’une grille de score (incluant la mobilité de l’animal, sa prostration ainsi que son niveau d’interaction sociale) et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée au moins 4 fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal et du poids corporel deux fois par semaine Une attention particulière sera portée au comportement moteur, l’activité, l’accès à la nourriture et à l’eau et à l’intégrité du pansement. Suite à la procédure de chirurgie, les animaux seront surveillés régulièrement (4 fois par semaine) afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou un stress néfaste. Les fils de suture non résorbables seront retirés au bout de trois semaines tandis que l’intégrité du pansement sera monitorée à chaque observation. Si un animal a retiré son pansement, la plaie sera désinfectée et un nouveau pansement mis en place. Les cages seront enrichies avec de la nourriture humide au cours de la première semaine post-opératoire, pour prendre en compte les difficultés éventuelles de mobilité. Leur ajout sera constamment ré-évalué au cours de la surveillance dans les semaines suivantes. De même, des analgésiques locaux seront appliqués aux abords de la plaie chirurgicale juste avant la suture et en cas de signe de douleur et/ou si le pansement a été retiré (lidocaïne 5mg/kg, 1-2 ml).
Choix des espèces
Etude basée sur un modèle de perte volumétrique musculaire standardisée chez le rat [1]. De plus, pour cette étude, il est nécessaire d’avoir un muscle permettant la mise en place d’un défaut pouvant accueillir un volume d’au moins 100µL pour que le système d’injection soit opérant (tests déjà réalisés sur rats mis à mort pour la standardisation de la procédure). [1]X. Wu, B. T. Corona, X. Chen, and T. J. Walters, “A Standardized Rat Model of Volumetric Muscle Loss Injury for the Development of Tissue Engineering Therapies,” Biores. Open Access, vol. 1, no. 6, pp. 280–290, 2012. L’objectif du travail étant d’observer l’effet de biomatériaux dans les processus de cicatrisation, les rats utilisés dans le cadre de ce protocole seront âgés de 2 mois (Jeunes adultes) en début de protocole. Sexuellement mature pour les males (65-110jours) Sprague Dawley or Wistar (ceux qui sont préconisés pour aspect chirurgicaux). Les temps d’implantations ont été choisis pour caractérisation du tissu à 3 moments clés de la cicatrisation : - 3 semaines : fin de l’inflammation aigue et différentiation des cellules satellites en cours - 6 semaines : possibilité de quantification du nombre de fibres musculaires au sein de l’hydrogel - 3 mois : Validation du bon remodelage de la plaie.
Effet d’une neurectomie vestibulaire unilatérale sur l’activité des cellules directionnelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
15 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent deux chirurgies, l'implantation d'électrodes dans le thalamus puis une neurectomie vestibulaire unilatérale qui détruit un côté de l'oreille interne et provoque un syndrome vestibulaire, avec enregistrement de l'activité neuronale pendant deux mois, pour étudier l'effet de cette perte sur les cellules directionnelles de l'orientation spatiale. Le porteur maintient les rats à leur poids initial par contrôle alimentaire et les héberge individuellement, et intègre à ses effectifs un risque de mortalité chirurgicale d'environ 20 %. Les bénéfices annoncés se limitent à mieux caractériser les déficits fonctionnels de la perte vestibulaire.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet dans le domaine des Neurosciences Intégratives et Cognitives est de comprendre comment une perte vestibulaire unilatérale affecte l'activité des neurones nécessaires à l'orientation spatiale, et plus particulièrement des cellules directionnelles du thalamus antérodorsal. Le système vestibulaire est un système sensorimoteur dont les fonctions sont assurées grâce à la présence de récepteurs vestibulaires (canaux semi-circulaires et organes otolithiques) dans l’oreille interne, sensibles aux accélérations angulaires et linéaires. Ces informations sont véhiculées jusqu’aux noyaux vestibulaires du tronc cérébral avant de transiter par des relais thalamiques et d’être projetées dans un ensemble très varié d’aires corticales. Les signaux vestibulaires sont impliqués dans de nombreuses fonctions, en particulier dans le contrôle de la posture et de la locomotion, dans la stabilisation du regard, mais également dans des fonctions cognitives comme l’orientation spatiale. Alors qu’un grand nombre de travaux ont été conduits sur les modèles de perte totale des signaux vestibulaires, peu d’études se sont intéressées à la perte unilatérale de l’information vestibulaire. Dans ce cas, on observe l’apparition d’un syndrome vestibulaire caractéristique, composé d’une multitude de symptômes différentes affectant l’ensemble des fonctions vestibulaires. Au cours du temps, il est cependant possible d’observer la disparition progressive et spontanée des troubles fonctionnels grâce au phénomène de compensation vestibulaire. Nos premiers résultats indiquent que, bien que les déficits posturo-locomoteurs disparaissent progressivement, les déficits mnésiques ne semblent pas s’atténuer lors de la phase de compensation. En parallèle, nous avons montré que plusieurs marqueurs de plasticité post-lésionnelle réactionnelle sont exprimés dans différents structures cérébrales du réseau spatial. Toutefois, il est impossible de comprendre si et comment cette lésion affecte les propriétés fonctionnelles des neurones qui appartiennent au réseau cérébral dévolu au traitement de l’espace. Ce projet vise donc à apporter des réponses aux déficits observés précédemment au niveau comportemental après perte vestibulaire unilatérale, en s'intéressant aux cellules directionnelles qui sont un corrélat neuronal de la mémoire spatiale.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux caracteriser les effets induits par une perte vestibulaire unilatérale affecte l'activité cérebrale, et de mieux comprendre les propriétes fonctionelles des neurones directionels, impliqués dans la navigation spatiale.
Procédures
Les animaux (N=15) seront d'abord soumis à une procédure chirurgicale d'implants d'électrodes. Ils seront ensuite soumis à une procédure comportementale et d'enregistrement de l'activité neuronale pendant 1 mois, le temps de recueillir un nombre minimum de cellules directionnelles de n=30. Une fois ce nombre atteint, ils subiront une neurectomie vestibulaire unilatérale. Après une semaine de récupération, ils repasseront dans la procédure comportementale et d'enregistrement de l'activité neuronale pendant 2 mois. Enfin au bout de ces 2 mois post NVU, ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront deux chirurgies : une première chirurgie pour implanter des électrodes au sein de la structure visée (le thalamus antérodorsal), et l'autre pour induire une perte vestibulaire unilatérale. Ces points seront discutés davantage dans les sections des procédures expérimentales. Lleur alimentation sera contrôlée pendant la tâche comportementale et d’enregistrement puisqu’ils seront maintenus à leur poids initial et ne disposeront pas de nourriture illimitée. Enfin, les animaux seront hébergés individuellement pour des raisons de sécurité.
Devenir
A l'issue de la procédure n°1 qui consiste à implanter des électrodes dans le thalamus antérodorsal, les rats subiront la procédure n°3 qui consiste en une tâche comportementale durant laquelle l'activité neuronale est enregistrée. Après 1 mois, les animaux subiront la procédure n°2 qui consiste à réaliser une neurectomie vestibulaire unilatérale. Après 1 semaine de récupération post-opératoire ils retourneront dans la procédure n°3 pendant 2 mois. Enfin, ils seront mis à mort.
Remplacement
La nature même des expériences ne permets pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur une tâche comportementale que les animaux effectuent et ne peuvent pas être réalisées à partir de modèles in vitro ou in silico. Du fait du caractère invasif des procédures (implantation d'électrodes intra-cérebrales) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été réduit au maximum (n=10) en se basant sur les études précédentes de l’équipe et sur un test de puissance statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. A ce nombre minimum s’ajoute 5 animaux afin de prendre en compte les risques de mortalité liés aux deux chirurgies (risque d’échec de la neurectomie de l’ordre de 20% et risque de perte de l’implant d’électrodes de 10%). De plus, l'utilisation de microdescendeurs à haute densité d'enregistrement permet de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Enfin, la possibilité de comparer l'activité neuronale avant et après perte vestibulaire chez les mêmes animaux permet de réduire le nombre d'animaux tout en augmentant la robustesse des résultats.
Raffinement
La souffrance des animaux est limitée au maximum. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole expérimental afin de diminuer leur stress puis pendant l’ensemble du projet expérimental. Pendant la chirurgie, l’utilisation de buprénorphine permettra de diminuer la douleur de l’animal (Buprécare, 0.03mg/kg SC). Pendant la période post-opératoire à la première chirurgie d’implantation, une grille de score adaptée sera utilisée pour évaluer le bien-être de l’animal et une analgésie sera utilisée en cas de soupçon de douleur (score sur la grille d’évaluation de la SEBA situé entre 10 et 14). Pendant la période post-opératoire à la suite de NVU, une analgésie appropriée sera assurée durant la phase aigüe de 3 jours (Buprénorphine, Buprécare® 0.05mg/kg, SC). L’hébergement des animaux sera adapté durant les 3 premiers jours après la NVU afin de garantir la sécurité et le bien-être animal. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet), en chirurgie sur rongeurs et sensibilisés au bien-être animal
Choix des espèces
Le projet porte sur l’enregistrement de l’activité de neurones in vivo lors d’une tâche comportementale. La nature même de ce projet ne permet pas d’envisager de remplacement in vitro ou in silico. De plus, au regard du caractère invasif des procédures, elles ne peuvent pas être conduites chez l’humain. L’utilisation du modèle rat présente de nombreux avantages, notamment dans l’étude des déficits engendrés par une perte vestibulaire unilatérale. En effet, ce modèle permet une bonne reproduction du syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces tout en présentant la particularité de présenter une courte phase de déficits fonctionnels post-lésionnels. Ce gain temporel est avantageux pour la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les déficits fonctionnels. De plus, le modèle rat est classiquement utilisé dans l’étude des cellules directionnelles. Nous pourrons donc comparer nos résultats aux résultats préexistants dans la littérature mais également aux résultats antérieurs de l’équipe, réalisés également sur modèle rat. La présente étude s’intéresse aux signaux directionnels chez l'adulte, après neurectomie vestibulaire unilatérale. L’étude de ces mécanismes sera donc réalisée sur des rats adultes afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Par ailleurs, pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à + de 8 semaines (Semple et al., 2013). Il est donc nécessaire de travailler sur des rats adultes d'au moins 10 semaines pour qu'une maturation complète du système nerveux central soit présente. Nous avons fait le choix de travailler sur des rats adultes, âgés de 3 mois au début du protocole expérimental pour ces raisons.
Etude des récupérations sensorimotrices chez le rat après lésion de la moelle épinière et injection de graisse mécaniquement activée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
85 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une contusion de la moelle épinière suivie d'une greffe de tissu graisseux, provoquant des déficits sensorimoteurs, des troubles de la miction et des douleurs pouvant durer environ deux semaines, avec vidange manuelle de la vessie deux fois par jour, pour tester une stratégie de réparation médullaire. Le porteur mobilise une grille de douleur (le "Rat grimace scale") et une analgésie à la buprénorphine, et réserve la mise à mort finale à une électrophysiologie sans réveil. Le bénéfice annoncé, une application chez des blessés médullaires, reste renvoyé à un hypothétique cas de succès.
Objectifs
Si la prise en charge immédiate des sujets ayant subi un traumatisme médullaire n’est pas capable de réduire les dégâts occasionnés par la blessure primaire imprévisible, la décompression médullaire et la mise en œuvre de mesures médicales visant à limiter les modifications vasculaires, biochimiques ou électrolytiques permettent aujourd’hui de limiter l’extension longitudinale et radiale de la lésion secondaire. Toutefois, ces interventions immédiates ne permettent pas aux patients de recouvrer l’intégralité de leurs fonctions sensori-motrices et végétatives après le traumatisme et des déficits fonctionnels persistent avec des conséquences humaines et sociales désastreuses. Face à ce constat, il est impératif d’orienter la recherche fondamentale et clinique sur la mise au point de stratégies visant à limiter les déficits post-lésionnels et à réparer le tissu nerveux endommagé, d’où l’objet de ce projet scientifique.
Bénéfices attendus
En cas de succès, une application clinique pourra être envisagée chez des blessés médullaires.
Procédures
2 procédures : - Procédure 1 (avec réveil) : Prélèvement de la graisse + lésion de la moelle épinière + greffe (durée : 45 min à 1h) et suivi des animaux (3 mois) . - Procédure 2 (sans réveil) : Electrophysiologie (1 h).
Impact sur les animaux
La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles neurovégétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature indique que les troubles végétatifs et les douleurs peuvent persister environ pendant 2 semaines.
Devenir
A l'issue de la procédure 2, les animaux seront sacrifiés afin de prélever les moelles épinières pour des analyses immuno-histologiques. Aucun animal sera maintenu en vie à la fin du projet.
Remplacement
Il s’agit d’une étude pré-clinique non-humaine qui ne peut être substituée (R de Remplacer). Le modèle de contusion spinale chez le mammifère reste à l'heure actuelle une des seules solutions non-humaines pour mettre en évidence le potentiel thérapeutique d’une stratégie de protection/réparation de la moelle épinière post-lésionnelle. Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion spinale et les récupérations sensori-motrices ne peuvent pas être étudiés sur des cultures cellulaires ou avec des modèles numériques.
Réduction
Le nombre d’animaux requis (R de Réduire) a été estimé à la suite d’expérimentations préliminaires réalisées sur 3 animaux et à l’aide d’un test statistique approprié. Une analyse de puissance basée sur les résultats obtenus lors des tests comportementaux a permis d’estimer pour un risque α = 0,05, une puissance de 90%, un écart-type commun de 1,768 et une correction réalisée à l’aide du test Kruskal-Wallis que le nombre d’animaux minimum nécessaires dans chaque groupe était de 17.
Raffinement
Une attention sera particulièrement portée au bien-être et au soin des animaux (R de Raffinement) afin d’éliminer toute potentielle souffrance, stress et effets indésirables. Après la lésion médullaire, l’animal sera traité toutes les 12h pendant 5 jours avec de la buprénorphine (S.C., 0.05 mg/kg, 0,3 mg/ml) associé à un antibiotique (P.O., ciprofloxacine, 10 mg/kg). L’administration de ces deux substances pourra être prolongée en cas de nécessité. La vidange de la vessie sera réalisée 2 fois par jour jusqu’au retour de la fonction. Un suivi attentif sera mis en place afin de s’assurer que l’animal se nourrit et s’hydrate normalement et qu’il ne souffre pas. Le « Rat grimace scale » (NC3Rs) sera réalisé quotidiennement. Les comportements anormaux (tremblements, convulsion, agité ou très immobile, prostration, automutilation) seront considérés comme rédhibitoires ainsi que les signes de déshydratation (persistance du pli de peau et enophtalmie), malnutrition et infections. Une attention sera également portée sur la couleur des muqueuses (ictère, anémie, cyanose, congestion) ainsi que sur la présence de plaie (cf. grille de score). Le rôle des expérimentateurs et du responsable du bien-être des animaux sera de s’assurer que les animaux ne souffrent pas et qu’ils aient accès à de la nourriture et à de l’eau ad libitum.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion médullaire sont proches de celui de l’humain. Ces mécanismes ne peuvent être étudiés sur des cultures cellulaires, in silico ou sur des espèces non-mammifères, chez ces derniers les mécanismes mis en œuvre après une lésion du système nerveux sont sensiblement différents de l’Homme. L’étude pourrait être réalisée chez des primates non-humains comme le reportent de nombreuses publications ou des plus gros mammifères (cochons, chats…) mais compte tenu du coût et de la logistique à mettre en œuvre pour héberger ces animaux (notre animalerie n’étant pas habilitée pour accueillir de telles espèces) nous préférons avoir recours à des petits rongeurs dont notre équipe à l’expérience et est équipée de tous les dispositifs expérimentaux (plateforme d’analyse du mouvement, d’enregistrement électrophysiologique...) permettant de les étudier. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 250-350 g environ au début de l’expérience. Afin d’étudier les récupérations post-traumatiques chez le mammifère adulte, il est nécessaire de s’assurer que les animaux ont terminé leur croissance et leur développement.
Identification des bases neurales de l’intégration des trajets par marquage c-fos chez le rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
35 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont maintenus par restriction alimentaire à 90 % de leur poids pour les inciter à rapporter de la nourriture à leur nid pendant un mois d'apprentissage, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour un marquage du gène c-fos, afin d'identifier les régions cérébrales de l'intégration des trajets. Le porteur héberge individuellement une partie des rats et prévoit un retour à l'alimentation libre au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ce projet fondamental comme une remise en question possible de l'hypothèse de la carte cognitive dans la navigation.
Objectifs
La navigation spatiale chez les mammifères repose sur la perception et le traitement de multiples informations sensorielles dont la source peut être environnementale (informations allothétiques : visuelles, olfactives, auditives) ou interne à l'animal (informations idiothétiques générées par le déplacement: vestibulaires, tactiles, proprioceptives, etc.). La conjonction de ces informations va permettre à l’animal de mettre en œuvre des stratégies spatiales variées lui procurant une flexibilité comportementale. L'importance des informations idiothétiques et le rôle des régions cérébrales dans le traitement de ces informations ont longtemps été sous-estimés et restent méconnus. Des travaux comportementaux ont montré que les mammifères sont capables au cours de leur déplacement de revenir à un lieu de référence, par exemple leur "nid", en n'utilisant que des informations idiothétiques. Cette capacité est appelée intégration des trajets car elle repose sur l'intégration par le système vestibulaire des accélérations linéaires et angulaires lors du mouvement ce qui aboutit au calcul et à la mise à jour d'un vecteur pointant sur le lieu de retour. Dans une série d’études lésionnelles, nous avons montré que l'intégration des trajets implique plusieurs régions du cerveau, comme le cortex pariétal et le cortex entorhinal. Dans le cortex entorhinal, une population neuronale (les "cellules-grilles") pourrait être le centre de l’intégration des trajets du cerveau. Cette hypothèse est séduisante mais le cortex entorhinal n'est certainement pas la seule région du cerveau impliquée. Le traitement des informations idiothétiques dans le cerveau implique un réseau nerveux étendu mais notre connaissance des contours de ce réseau reste très lacunaire. L'objectif du projet est d'identifier l'ensemble des régions impliquées dans ce réseau en faisant un marquage de l'expression du gène d'expression précoce c-fos au cours d'une tâche d'intégration des trajets. Nous faisons l’hypothèse que la tâche implique une activation rapide du gène c-fos et donc une synthèse de proteines c-fos en particulier dans les structures sollicitées par le processus d’intégration des trajets.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront d'identifier les structures cérébrales impliquées spécifiquement dans la mise en œuvre de l'intégration de trajet. Ces résultats nous permettront également de tester l'hypothèse selon laquelle l'intégration de trajet peut se faire à partir d'un autre point de l'environnement que celui à partir duquel l'animal initie son trajet. Ce dernier résultat, s'il est confirmé, nous permettrait de remettre en question le recours quasi-systématique à une hypothèse alternative (existence d'une carte cognitive) pour expliquer les comportements de navigation complexes observés chez les animaux (humains compris).
Procédures
Procédure comportementale : Apprentissage d'une tâche d'integration des trajets. Procédure se déroulant sur un mois environ à raison de 2 essais de durée variable (mais n'excédant pas 5 minutes chacun) par jour et par animal.
Impact sur les animaux
Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux des groupes 1, 2 et 4 seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort (n=35) par injection d'euthanasiant (Pentobarbital sodique, 200 mg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg d'EUTHASOL VET. SOLUTION INJECTABLE) après sédation profonde (Médétomidine, 500 μg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg pour le DOMITOR). La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage de l'expression du gène d'expression c-fos par immunohistochimie. La quantification de ce marquage est l'objectif de l'étude car il permettra d'identifier les structures nerveuses impliquées dans l'intégration des trajets.
Remplacement
La nature même des expériences proposées dans ce projet ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, ces expériences reposent sur l'exploration de l'environnement effectuée par les animaux en réponse à diverses manipulations environnementales et ne peuvent être réalisées à partir de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. Ces expériences, du fait du caractère invasif des procédures de collecte des données (prélèvement du cerveau afin de révéler le marquage de certaines structures nerveuses), ne peuvent pas non plus être conduites chez le sujet humain.
Réduction
Cette étude nécessitera un total de 35 rats. Deux groupes expérimentaux et deux groupes contrôles sont indispensables pour permettre de conclure sur l'implication des structures dans les processus ciblés : Un groupe expérimental (n=8) entraîné dans la tâche d'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=8) entraîné dans une tâche spatiale ne nécessitant pas l'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=6) ne réalisant aucune tâche (explorant librement l'environnement pendant 3 mn) et un deuxième groupe expérimental (n=8) entraîné dans une tâche alternative d'intégration de trajet. Enfin, 5 animaux sont ajoutés au total pour pallier d'éventuels problèmes de marquage immunohistochimique (aux alentours de 15%). Le nombre d'animaux dans ces groupes permet de tenir compte de la variabilité individuelle inhérente aux études comportementales et d'obtenir des résultats fiables. L'analyse des résultats comportementaux reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques de proportion (type Chi 2). En ce qui concerne l'analyse des résultats issus des marquages immunohistochimiques, plusieurs scenari sont envisagés. Si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non-paramétriques tels que le test de Kruskal-Wallis. Si la normalité des distributions est avérée mais pas l'homogénéité des variances, nous utiliserons l'ANOVA à un facteur de Welch (associé au test post-hoc de Games-Howell). Si la normalité et l'homogénéité sont avérées, nous aurons recours à un test ANOVA à un facteur (associé au test post-hoc de Tukey). Ce plan d'analyse statistique nous permettra d'exploiter les données quelque soit l'ampleur de la variabilité inter-individuelle tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.
Raffinement
La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement et à récupérer un morceau de nourriture pour le ramener dans son nid et le consommer. L'animal apprend à faire cette tâche sans contrainte externe ce qui réduit considérablement son état de stress. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.
Choix des espèces
Le rat constitue un modèle animal privilégié pour les études sur la navigation spatiale du fait de ses excellentes capacités d'orientation spatiale. Nous avons montré que ces animaux sont capables de réaliser la tâche d'intégration des trajets dans sa version classique (Groupe 1). L'étude de l'activation des réseaux de structures nerveuses au cours d'un comportement de déplacement dans l'environnement ne peut pas être réalisé en utilisant des procédures in vitro, ex vivo ou in silico. Les animaux seront des rats adultes agés de 4 mois. Les capacités d'apprentissage chez ces animaux de cet âge sont optimales.
Activités neuronales impliquées dans les représentations mentales d’environnements faits de pièces connectées : études électrophysiologiques et comportementales chez le rat jeune adulte.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau avec injection d'un vecteur viral, puis sont soumis à une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les pousser à explorer un dispositif en quête de nourriture, l'objet étant de cartographier l'activité du cortex rétrosplénial pendant la navigation spatiale. Le porteur les héberge individuellement et prévoit un retour à l'alimentation libre si la perte de poids dépasse 15 %. Il présente les retombées pour les maladies neurodégénératives comme une simple piste de réflexion issue de cette recherche fondamentale.
Objectifs
Les capacités d'orientation et de mémoire sont déficitaires chez les sujets vieillissant et les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le cortex rétrosplénial est impliqué dans ces processus mnésiques et de navigation. et semble être une structure fondamentale pour s'orienter dans des environnements complexes. Ce projet permet de comprendre quelles informations de l'espace sont nécessaires aux activités neuronales du cortex rétrosplénial et également d'étudier l'influence de cette structure sur les autres aires cérébrales impliquées dans la navigation, notamment le cortex entorhinal médian. Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.
Procédures
Procédure comportementales : exploration libre à la recherche de nourriture suite à une privation contrôlée de nourriture; et procédures chirurgicales : implantation d'un système d'électrode avec l'injection d'un vecteur viral pour utiliser les outils d'inactivation neuronale pharmacogénétique. Tous les animaux subiront la procédure comportementale. 1 groupe de 20 animaux sera soumis à la procédure chirurgicale d'implantation des électrodes seule, et un 2ème groupe d'animaux sera soumis à la chirurgies d'implantation d'électrode et d'injection du vecteur viral.
Impact sur les animaux
Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.
Devenir
La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage des neurones par cresyl violet ou thionine et d’identifier la position des électrodes d’enregistrement dans les structures d’intérêts. L'identification de la position des électrodes est cruciale car elle permet d'affirmer que les activités neuronales mises en évidence proviennent bien de la structure cérébrale ciblée dans le projet.
Remplacement
Ce projet repose sur les méthodes invasives d'enregistrement des neurones isolés ainsi que de l'inactivation de l'activité cérébrale chez le rat jeune adulte Long Evans, qui ne sont pas compatibles avec une approche chez le sujet humain, ni adaptables aux études in vitro ou de modélisation.
Réduction
Le projet comporte deux expériences qui utiliseront chacune 20 animaux. Ce nombre est indispensable pour deux raisons : 1-éviter statistiquement une variabilité inter-individuelle et 2-enregistrer un nombre suffisant d’activité neuronale pour effectuer des tests statistiques. L'analyse des résultats reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques paramétriques. Cependant, si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques. Ce plan d'analyse statistique permettra d'exploiter les données si une variabilité inter-individuelle est toutefois présente tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.
Raffinement
La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement pour aller manger des granulés de nourriture. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%) ou en dessous de 90% de leur poids initial (points limites), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré. Une grille de score approuvée par la SBEA permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. L’arrêt des souffrances est prévu dans cette grille de score par des mesures d’observation attentive, des méthodes de soulagement, l’arrêt complet de l’expérience ou la mise à mort de l’animal. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.
Choix des espèces
Le rat représente le modèle de choix pour les études du comportement spatial qui est à la base des protocoles comportementaux qui seront utilisés. Il présente d'excellentes performances dans les tâches de navigation spatiale. Enfin, 90% des études portant sur les bases neurales de la navigation réalisées chez le rongeur reposent sur l'utilisation du rat, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Par ailleurs, j'ai réalisé la seule étude qui a mis en évidence les cellules bidirectionnelles du cortex rétrosplénial chez le rat. Utiliser le rat me permet de comparer les résultats issus de ce projet avec ceux précédemment obtenus. Le projet vise à établir le rôle de certaines structures cérébrales chez le rat jeune adulte. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les travaux antérieurs, nous utiliserons des animaux qui auront 3 mois au début de l'expérience.
Défaut diaphysaire fémoral chez le rat : un modèle orthopédique pour l’étude de biomatériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée par chirurgie un défaut osseux dans le fémur, suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester le pouvoir de régénération de biomatériaux. Le porteur reconnaît que la chirurgie provoque une douleur et une gêne à la mobilité les premiers jours. Les rats sont tués au dioxyde de carbone à huit semaines pour l'analyse de l'os.
Objectifs
Pour étudier le potentiel ostéogénique du biomatériau, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle de défaut osseux diaphysaire est réalisé au niveau du fémur du rat afin de tester le pouvoir ostéogénique des biomatériaux implantés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée).
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau du fémur (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisée à des intervalles de temps espacés (toutes les 2 semaines). Lors de cette procédure, les rats seront anesthésiés à l'isoflurane (maintient au masque). Concernant cette procédure, l'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale en site orthopédique (défaut unicorticale) et ne nécessitera pas de fixation interne de l'os. Toutefois, la chirurgie engendra une duleur pour les animaux et leur mobilité sera atteinte lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénients.
Devenir
Suite à la procédure n°1 (chirurgie), les animaux seront maintenus en vie pour la procédure n°2 (scanner). Lors de la dernière acquisition au scanner (8 semaines), les animaux seront euthanasiés au dioxyde de carbone par le personnel de l'animalerie conventionnelle afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, puis, si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils doivent être testés dans modèle chez le gros animal
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, la souris reviendra dans sa cage d’origine. Raffinement des conditions d’hébergement : pour enrichissement de l’environnement d’hébergement, que de la litière en copeaux de peupliers et des jouets.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du fémur. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats Sprague Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Intérêt de l’inhibition de l’activité phosphatase de l’époxyde hydrolase soluble pour la prise en charge des maladies cardiovasculaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 168
360 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 160 d'entre eux. Une partie subit la ligature d'une artère du cœur, une autre l'ablation d'un rein, avant des examens d'IRM, pour tester si l'inhibition d'une enzyme protège des maladies cardiovasculaires. Le porteur indique que les animaux hypertendus risquent l'accident vasculaire cérébral et l'insuffisance cardiaque ou rénale. Il présente le projet comme validé par l'Inserm et financé par l'ANR, les animaux étant tués pour analyser leurs artères et prélever leurs organes.
Objectifs
Il s’agit d’un projet s’inscrivant dans le domaine de la recherche publique préclinique. L'objectif central du projet de recherche expérimentale est de répondre pour la fois à la question : l’inhibition de la sEH phosphatase peut-elle constituer une nouvelle approche thérapeutique pour la prévention et/ou le traitement des maladies cardiovasculaires ? Ce programme de recherche a été validé scientifiquement par l'Inserm (CSS4), ainsi que par des experts internationaux sollicités. Il sera financé par l’ANR.
Bénéfices attendus
Le but ultime de cette recherche est de pouvoir démontrer pour la première fois que la sEH phosphatase constitue une cible thérapeutique d’intérêt pour prévenir et/ou traiter les maladies cardiovasculaires et nous espérons que cette recherche permettra la mise en place d’une nouvelle classe de traitements.
Procédures
le but de cette étude est un modèle d'hypertension artérielle et d'insuffisance rénale. La procédure N°1 chirurgicale , concernant le modèle de ligature coronaire comprends un nombre de 66 souris et 84 rats La procédure N°2 chirurgicale , concernant le modèle de Néphrectomie comprends également un nombre de 66 souris et 84 rats. Les animaux restant ne subissent aucune chirurgie mais un traitement, concernant le diabete. Tous l'ensemble des animaux, c'est à dire 192 souris et 168 rats auront un IRM standart.
Impact sur les animaux
Concernant le groupe de la procédure N°1 sur l'Hypertension Artérielle, ces animaux seront hypertendus; il y a donc des riques d'AVC et les animaux vont développer une insufisance cardiaque, d'ou une surveillance et un contrôle particulier quotidien, cela n'engendre pas de réponse d'un point de vue comportemenatale. Les animaux de la procédure N°2, sur le modèle d'insufisance rénale, auront egalement un facteur risque d'AVC , ils peuvent aussi développer une insufisance cardiaque. cette pathologie n'engendre pas de signe comportementaux, la surveilance quotidienne est absolument indisprensable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l'étude de la fonction vasculaire del'artère mésentérique par artériographie et les prélèvements sanguins, ainsi que les différents organes qui serviront aux analyses anatomiques et moléculaires, seront prélevés.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier les effets cardiovasculaires de l’inhibition d’une enzyme dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des rats et des souris avec une hypertension artérielle, une insuffisance rénale ou un diabète induits expérimentalement. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
réduire le nombre d'animaux par l'utilisation de méthodes non invasives (IRM, échocardiographie) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris et de rats nécessaire afin de détecter une différence de 15% (one way ANOVA et test de Tukey).
Raffinement
raffiner les modèles afin de réduire la variabilité entres animaux permettant de limiter le nombre d'animaux par groupe : utilisation de régimes alimentaires pour potentialiser le développement de l’atteinte rénale ou des complications cardiovasculaires. De plus, les animaux seront hébergés aux normes requises et un enrichissement (plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) est mis en place. Enfin, une anesthésie et une analgésie adéquates seront mises en place pour chaque animal en fonction de chaque type de procédure. Si les animaux arrivent aux points limites, les animaux recevront une injection d’un euthanasiant.
Choix des espèces
Le choix du rat et de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire et sur la possibilité de recourir aux animaux transgéniques (rat KI pour la sEH phosphatase) pour approfondir les résultats de la recherche. Les opérations chirurgicales et les mises sous régime seront effectuées sur les souris entre 6 et 8 semaines de vie et sur les rats entre 10 à 12 semaines de vie. Les animaux seront immédiatement traités avec l’agent thérapeutique inhibiteur de la sEH phosphatase (SWE101 administré dans l’eau de boisson : 40 mg/L pour les modèles d’hypertension artérielle et de diabète ou anticorps administré par voie intrapéritonéale pour le modèle d’insuffisance rénale, la dose d’anticorps sera ajustée en fonction des données d’inhibition obtenues in vitro sur la sEH recombinante murine) . Concernant le modèle d’hypertension artérielle et le modèle d’insuffisance rénale, le recueil des urines puis les mesures invasives de la pression artérielle seront réalisées 10 semaines après l’opération, l’imagerie fonctionnelle in vivo 10 à 12 semaines après l’opération et la mise à mort 12 semaines après l’opération. Concernant le modèle de diabète, le recueil des urines puis les mesures invasives de la pression artérielle seront réalisées 14 semaines après le début du régime riche en graisses saturées, l’imagerie fonctionnelle in vivo 14 à 16 semaines après le début du régime et la mise à mort 16 semaines après le début du régime.
OBOE : Évaluation de la durée de dégradation et de l’inflammation de BM2 chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose quatre biomatériaux sous la peau par chirurgie, avec un suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester un nouveau support destiné à la régénération osseuse. Le porteur n'attend comme seul effet indésirable qu'une réaction inflammatoire qu'il juge "peu probable". Le résumé décrit le réveil des rats après l'opération sans indiquer leur sort final, que le tableau du RNT classe pourtant comme une mise à mort, cohérente avec l'analyse des implants.
Objectifs
La consolidation des pertes de substance osseuses lors des reconstructions osseuses représente un problème majeur dans les domaines de la chirurgie orthopédique, de la traumatologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Ces troubles peuvent nécessiter l’utilisation d’une greffe osseuse afin d'obtenir une consolidation osseuse. Bien que la greffe osseuse soit toujours considérée comme la référence pour les reconstructions osseuses, elle est associée à un taux important de complication au niveau du site de prelevement de la greffe. En outre, les quantités d'os disponibles pour un seul patient sont limitées. Par conséquent, les substituts osseux ayant une composition aussi proche que possible de celle de l'os natif offrent des alternatives intéressantes. Parmi eux, l'allogreffe ainsi que les céramiques représentent les substituts osseux les plus utilisés. Outre la greffe osseuse ou les substituts osseux, l'un des moyens les plus efficaces pour améliorer la formation et la reconstruction osseuses est la thérapie protéique, qui consiste en l'application locale de facteurs de croissance favorisant la production osseuse, tels que les protéines morphogéniques osseuses (BMP). Actuellement, la BMP-2 et la BMP-7 sont utilisées en pratique clinique et ont donné des résultats prometteurs. Ces BMP ont besoin d’un support afin d’être déposé sur le site chirurgical. Les supports utilisés aujourd’hui sont des éponges ou des pâtes de collagène. Néanmoins, la BMP a une faible faible affinité pour le collagène, ce qui nécessite des doses très importantes de BMP entrainant un risque de complication plus important et un coût beaucoup plus élevés. Dès lors, afin d'augmenter les applications cliniques de la BMP, il est indispensable de disposer de différents types de supports présentant une forte affinité pour le BMP. Le but de cette étude, est l’étude d’un nouveau support pour la BMP.
Bénéfices attendus
Cette étude va permettre de montrer que le film réticulé avec et sans BMP2 est biocompatible et n'est pas à l'origine de phénomènes locaux ou systémiques néfastes pour la santé du receveur et d'autre part que les tissus du receveur ne sont pas susceptibles d'altérer le matériau au détriment de ses qualités intrinsèques ou au risque de générer des produits de dégradation toxiques. Cette étude servira donc à prouver l'absence vraisemblable d'effet délétère du film et de la BMP2, et d'autre part, accumuler des données prédictives du comportement in vivo du matériau.
Procédures
1 seule procédure sera réalisée sur les 64 rats : - Mise en place de 4 implants en sous cutanés (4 incisions). Fermeture de la plaie à l’aide d’un surjet intradermique avec un monofilament 4-0 (polyglecaprone 25). L’intervention durera 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les seules nuisances ou effets indésirables de cette étude sur les animaux seraient une réaction inflammatoire anormale ce qui semble peu probable au vu des tests préalables.
Devenir
A l’issue de l’intervention chirurgicale d’implantation, les rats seront reveillés dans une cage à induction chauffée et seront ensuite remis avec ses congénères une fois réveillé.
Remplacement
De nombreux modèles in vitro ont été mis en place pour étudier la dégradation d’un matériel. Cependant, les interactions matériel-hôtes sont importantes et nécessitent une étude in vivo. Les données manquantes sur les propriétés anti-inflammatoires, sur la biocompatibilité et la dégradation de matériel ne peuvent être menées que sur l’animal entier vivant : la réaction inflammatoire et hémodynamique sont des processus vivants et dynamiques, mettant en jeu des mécanismes complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro. Lorsque les mécanismes biologiques entrent en jeu dans le processus inflammatoire de dégradation, on ne peut vérifier la biocompatibilité que dans un organisme vivant.
Réduction
Des études in vitro ont été menée au préalable afin de sélectionner les formulations d’implants les plus intéressantes à tester in vivo pour réduire au maximum le nombre de tests et le nombre d’animaux. De plus des études bibliographiques ont été menées afin de choisir au mieux le modèle animal et le matériaux contrôles. Afin de réduire le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisés pour l’étude de biocompatibilité et l’étude de biodégradation du film.
Raffinement
64 rats seront inclus dans l’étude. Tout le projet sera conduit dans des locaux agrées, avec du personnel dédié et expérimenté. Un protocole précis de prémédication, d’analgésie, d’anesthésie est mis en place. Les rats auront une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant l’implantation. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. L’injection d’hydrogel sera réalisé sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire et post-opératoire par un vétérinaire. Les animaux seront observés quotidiennement : état général, alimentation, abreuvement, nettoyage, respiration, morbidité et mortalité. En cas d’animal considéré comme anormal, la personne en charge des observations : -manipulera l’animal pour confirmer ou infirmer cet état -Toutes anomalies cliniques seront signalées au vétérinaire pour un examen clinique complet si nécessaire. La douleur et le bien-être sont évalués selon des paramètres précis. En cas de signe de douleur importante, des antalgiques seront administrés jusqu’à disparition des signes. Si une souffrance et/ou une détresse de l’animal est mise en évidence, des mesures seront directement mise en place : fin de la procédure, traitement afin de soulager la souffrance. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté.
Choix des espèces
Le rat est un modèle couramment utilisé pour évaluer l'inflammation et pour étudier le délai de dégradation et l'effet de différentes modalités de traitement. L’évaluation de la dégradation au contact du tissu hôte est primordial dans l’étude des biomatériaux. Cette évaluation a été traditionnellement réalisée dans des modèles d'implantations sous-cutanées, intrapéritonéales et intramusculaires chez les rongeurs (souris et rats). Les modèles murins sous-cutanés, intramusculaires et intrapéritonéaux sont des outils utiles pour évaluer l'effet des médiateurs anti-inflammatoires et inflammatoires. Quelle que soit l'application finale prévue des biomatériaux, les modèles d'implantation sous-cutanée et intramusculaire offrent des informations sur l'effet direct du biomatériau au niveau du site d'implantation. L'application clinique finale étant une implantation osseuse, l'implantation sous cutanée est choisie. Les implants seront insérés dans le tissu sous cutané de rats adultes, conformément aux dispositions de la norme ISO 10993-2. Pour plusieurs de ces raisons, nous avons choisi d'utiliser des rats comme modèle pour réaliser l'étude de dégradation et de biocompatibilité du film enrichi en BMP-2.
Evaluation de la fonction respiratoire sur le modèle du rat DMDmdx
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
40 rats porteurs de la myopathie de Duchenne vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis cinq fois, entre l'âge de quelques semaines et un an, à des séances de pléthysmographie de 45 minutes dans une chambre hermétique, pour mesurer leur fonction respiratoire. Le porteur reconnaît que le protocole peut conduire à un "manque vital d'oxygène" et que l'isolement dans une chambre sans litière ni enrichissement est une source de stress. À l'issue, ces rats sont réutilisés dans une autre étude déjà autorisée portant sur leur fonction musculaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser les atteintes respiratoires chez le modèle de rat DMDmdx, modèle animal de la myopathie de Duchenne (DMD). Ces atteintes seront caractérisées et quantifiées de manière longitudinale à différents stades de développement à l’aide de la technique non invasive de pléthysmographie.
Bénéfices attendus
La lignée de rats DMDmdx a été créé en 2014 par un consortium de laboratoire dans le but de pallier aux inconvénients rencontrés avec les autres modèles DMD, la souris mdx et le chien GRMD, pourtant largement utilisés pour étudier l’efficacité de traitement. La souris mdx est facile d’utilisation, peu couteuse mais ne reproduit que partiellement les lésions musculaires retrouvées chez les patients DMD. Le chien GRMD présente un phénotype sévère, mais il reste un modèle de gros animal couteux et lourd à manipuler. Les premières études de caractérisation du rat DMDmdx ont démontré que ces animaux présentent un phénotype sévère, avec une atteinte des muscles squelettiques et cardiaques semblables à celles observées chez les patients DMD. La caractérisation des atteintes respiratoires du rat DMDmdx, encore non explorée, permettra alors de conforter l’utilisation et la validité de ce modèle pour l’évaluation d’approches thérapeutiques avec un intérêt particulier pour la fonction respiratoire, dont les atteintes sont visibles chez les patients dès l’âge de 12 ans
Procédures
Analyse de la fonction respiratoire par pléthysmographie non invasive, sur animaux vigiles Durée d’une séance de pléthysmographie par rat : 45 minutes Nombre de séance de pléthysmographie par rat : 5, de 4-6 semaines à 12 mois d’âge, espacés d’au minimum d’1 mois.
Impact sur les animaux
Le protocole retenu pour étudier la fonction respiratoire par pléthysmographie pourrait conduire à un manque vital d’oxygène. L’observation en continue des animaux pendant le test permettra d’identifier rapidement cet effet indésirable et conduira à l’arrêt de l’étude pour le ou les rats concernés, qui seront par conséquent sortis des chambres de pléthysmographie et remis dans leur cage respective. L’isolement des animaux dans une chambre hermétique de petite taille, sans litière ni enrichissement, peut également être une source de stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie pendant le temps du protocole après la pléthysmographie non invasive puisque celle-ci est utilisée pour suivre au cours du temps l’évolution des atteintes respiratoires. Suite au dernier stade d'exploration (12 mois), les animaux seront réutilisés pour l'analyse de la fonction contractile et intégrés dans une autre demande d'autorisation de projet déjà validée (DAP #10792).
Remplacement
Il n’existe actuellement aucun modèle animale d’exploration de la fonction respiratoire remplaçant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux estimé dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèle et des approches expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L’évolution de la maladie en elle-même pouvant entrainer un déclin de l’état de santé (difficultés locomotrices, d’alimentation et respiratoires), l’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne par le personnel animal et le responsable du projet pour estimer une éventuelle gène ou douleur liées à l’expression clinique de la maladie. Le protocole, validé, non invasif et effectué sur animal vigile prend également en compte au mieux le bien-être des animaux. Si nécessaire, une mise à mort la plus éthique possible des animaux sera effectuée.
Choix des espèces
La lignée de rats DMDmdx possède une mutation sur le gène dmd codant pour la protéine dystrophine. Deux modèles animaux DMD sont couramment utilisés en pré-clinique : 1) la souris mdx, facile d’utilisation, peu couteuse mais ne reproduisant que partiellement les lésions musculaires retrouvées chez les patients DMD, et 2) le chien GRMD, qui présente un phénotype sévère, mais qui reste un modèle de gros animal couteux et lourd à manipuler. Les premières études de caractérisation du rat DMDmdx ont démontré que ces animaux présentent un phénotype sévère, avec une atteinte des muscles squelettiques et cardiaques semblables à celles observées chez les patients DMD. La caractérisation des atteintes respiratoires du rat DMDmdx, encore non explorée, permettra alors de conforter l’utilisation et la validité de ce modèle pour l’évaluation d’approches thérapeutiques Rats d’âge compris entre 1 et 12 mois afin d’évaluer la progression des atteintes respiratoires chez le modèle de rat DMDmdx. La fonction respiratoire de ces animaux sera ainsi étudiée à 5 stades de développement : 6 semaines, 3 mois, 5 mois, 7 mois et 12 mois. Les premiers signes d’atteintes musculaires et cardiaques sont visibles dès l’âge de 6 semaines, et à 12 mois les rats présentent un phénotype dystrophique sévère.
Immunothérapies et traitement de carcinomes hépatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 560
1 820 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui atteint le grade sévère pour 1 480 d'entre eux. On leur implante par chirurgie un ou plusieurs nodules tumoraux, sous la peau ou dans le foie, avant de tester des traitements intra-artériels et des immunothérapies, pour reproduire un cancer du foie avancé avec métastase à distance. Le porteur reconnaît que les animaux peuvent développer des métastases, une ascite et des tumeurs assez volumineuses pour gêner leurs mouvements. La plupart sont tués pour l'analyse et 200 réutilisés dans d'autres procédures, la mise à mort intervenant sous anesthésie lorsque les points limites sont atteints.
Objectifs
Aucune solution clinique robuste ne permet de traiter efficacement un nodule hépatique et un autre nodule à distance. L'existence d'un effet abscopal a déjà été démontré pour une combinaison d'immunothérapie et d'ablation par radiofréquence, mais ce n'est pas le cas du traitement par chimioembolisation des nodules hépatiques, procédure très fréquemment effectuée chez les patients porteurs d'un carcinome hépatocellulaire ou de métastases hépatiques non résécables. De plus, les tolérances des immunothérapies et des combinaisons de traitements chez les patients sont aujourd'hui peu connues. Ces informations deviennent de plus en plus nécessaires en clinique pour adapter les traitements aux patients. L’objectif du projet consiste à évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique anti-tumorale en associant un traitement local par radiologie interventionelle à une immunothérapie. Le traitement par radiologie interventionnelle utilisé sera dans un premier temps la chimioembolisation (TACE), reconnue pour son efficacité clinique. L’immunothérapie anti-tumorale retenue consistera d’une part à stimuler le système immunitaire de l’animal par un adjuvant distribué en local, et d'autre part à améliorer l'efficacité anti-tumorale du système immunitaire par l'usage de Checkpoint inhibiteurs en systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les bénéfices immunologiques apportés par un traitement par TACE, et comment ils peuvent être combinés de façon efficace avec des immunothérapies à base de Checkpoint Inhibiteurs et/ou d'adjuvants. De plus, le projet permettra d'apporter des éléments de réponse concernant les chronologies otpimales des traitements combinés, les doses, les éventuelles répétitions des traitements, qui sont des questions clés en clinique aujourd'hui dans toutes les combinaisons thérapeutiques. Enfin, le projet pourrait apporter une solution préclinique optimale pour le traitement d'un nodule principal et d'un nodule non ciblé, qui servirait de base à des potentiels essais chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront implantés d'un ou de plusieurs nodules tumoraux pouvant être sous-cutané ou intra-hépatique par chirurgie, pour mimer un nodule hépatique et une métastase à distance comme en clinique chez des patients avec des cancers avancés. Les traitements pourront se faire par voir intra-artérielle par chirurgie, comme le traitement par TACE administré chez l’Homme, ou par voie intra-tumorale, très utilisée pour les tumeurs cutanées notamment (mélanomes) chez l’Homme. Ces traitements pourront être combinés avec des immunothérapies par voie systémique (voie utilisée pour délivrer des immunothérapies aux patients porteurs d’un cancer avancé). Les tumeurs seront suivies régulièrement par imagerie ou par mesure au pied à coulisse. Des prélèvements de sang de petits volumes réguliers (décrits dans les recommandatations) peuvent être réalisés pour suivre certains marqueurs d’intérêt immunologiques notamment. Les procédures seront effectuées sous anesthésie, également sous analgésie pour les chirurgies.
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de tumeurs pourraient présenter des métastases, comme ce qui est observé en clinique. Le suivi par imagerie permet notamment de contrôler l’apparition de nouvelles tumeurs. Une production d’ascite, comme ce qui est observé en clinique dans certains cancers, peut aussi être observée. Les tumeurs sous-cutanées peuvent, lorsque leur volume devient important, gêner les mouvements, mais de façon très légère. Enfin, des effets secondaires après l’injection intra-tumorale ou à l’injection intra-artérielle peuvent survenir, de la même façon qu’en clinique (réaction inflammatoire locale). Ces procédures de traitement pourraient entrainer un ralentissement de la pousse des tumeurs, voire la diminution ou la disparition des tumeurs, effet souhaité par ces traitements combinés avec un traitement systémique par immunothérapie.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie, sans réveil de l'animal par la suite.
Remplacement
Il s'agit ici d'améliorer des éléments de la pratique clinique, d'évaluer l'efficacité et la tolérance de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux. L’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination des effets thérapeutiques de la réaction immune car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Ces études d’immunologie et d’immunothérapie anti tumorale sont uniquement réalisables chez l’animal immunocompétent.
Réduction
Les animaux qui ne présenteront pas de pousse tumorale pourront être réutilisé une seule fois à la mise au point de nouvelle techniques au sein du même projet. De plus, sous certaines conditions précises, les rats ne présentant pas de pousse tumorale intra-hépatique pourront faire l'objet d'une nouvelle tentative d'induction pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, les animaux donneurs de fragments tumoraux via des tumeurs sous-cutanées pourront, sous certaines conditions précises, être opérés pour une résection de leur tumeur sous-cutanée et être réutilisé au sein du même projet (pour des mises au point ou comme donneur à nouveau). Les animaux donneurs pourront être implantés sur les deux flancs pour optimiser le nombre d'animaux inductibles par donneur, et une tissuthèque sera mise en place pour tenter d'implanter des fragments conservés par congélation et réduire ainsi le nombre d'animaux donneurs.
Raffinement
Les animaux en étude seront suivis quotidiennement, avec une mesure fréquente à minima hebdomadaire de leurs tumeurs, voire plus si cela semble nécessaire, pour évaluer leur état clinique, les volumes tumoraux, surveiller d'éventuels signes de souffrance et pouvoir éventuellement traiter lorsque cela est possible. Le scoring sera fait selon une grille des points limites décidée dans le protocole expérimental avant le début des expériences. Les procédures d'implantation des tumeurs, d'imagerie et de traitement se feront sous anesthésie gazeuse avec,dès que cela est nécessaire, un traitement analgésique (pré-per-et post opératoire). Les animaux sont hébergés en groupes, dans des cages avec des enrichissements et sont habitués à la prise en main par l'expérimentateur.
Choix des espèces
La littérature renseigne l'utilisation du Rat et de la Souris pour l'induction de carcinomes hépatiques ou de métastases hépatiques de carcinomes colorectal. De plus, ce sont des modèles déjà testés pour le traitement des cancers par immunothérapies de carcinomes, et le traitement de tumeurs par radiologie interventionnelle. Le modèle Souris est particulièrement utilisé dans des études impliquant le système immunitaire. Ce sont des modèles qui permettent un screening rapide et suffisant pour tester des combinaisons de traitements. Ces espèces animales sont autorisées pour l'utilisation en laboratoire à des fins scientifiques. Les animaux seront des jeunes adultes sevrés, entre 5 et 16 semaines.
Évaluation d’une immunothérapie peptidique ciblant CD38 chez le rat R-DMDdel52, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent jusqu'à 510 injections sous-cutanées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, pour tester une immunothérapie peptidique. Le porteur décrit une maladie évolutive, avec perte de masse musculaire, faiblesse et défaillance cardiorespiratoire conduisant à une "euthanasie compassionnelle" entre six et treize mois. Il annonce, en cas de succès, un passage aux chiens dystrophiques puis aux enfants, et présente le rat comme un modèle "plus fidèle" que la souris.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare, rapidement invalidante, causée par des mutations dans le gène de la dystrophine (porté par le chromosome X). La dystrophine est une proteine clé dans le fonctionement et la survie des cellules musculaires. Le déficit en dystrophine induit donc une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque produit une insuffisance cardiorespiratoire irrémédiablement fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune solution de guérison. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, anti-inflammatoires puissants, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, mais avec le désavantage de provoquer parfois des effets indésirables qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions de solutions therapeutiques (thérapies géniques ou molecules pharmacologiques) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours. Les mutations aboutissent à l'absence de dystrophine dans les cellules musculaires (en particulier cardiaque). Cette absence aboutit à une fragilité de ces cellules, ce qui se traduit tôt ou tard par une rupture de leur membranes, soumises aux forces latérales lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle qui entre alors en sénescence (arrêt des cycles cellulaires qui aboutit à la mort). Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une immunothérapie innovante. Nous posons l'hypothèse que notre immunothérapie ciblant une protéine clé de l'inflammation est capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant pour la première fois contre l'ensemble des mécanismes néfastes induits de sorte que les cellules souches du muscle échapperont à la sénescence précoce et poursuivront ainsi plus durablement leur contribution réparatrice.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice de l'immunothérapie innovante ciblant une proteine clé de l'inflammation sur le modèle original et pertinent du rat DMD développé au laboratoire qui reproduit plus fidèlement la maladie que les modeles classiques de souris. Le traitement testé permet de bénéficier simultanément de propriétés anti-sénescentes et anti-inflammatoires, sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. Le traitement testé devrait de surcroît améliorer la contribution des cellules souches à la réparation musculaire. À moyen terme et en cas de succès de cette immunotherapie sur le rat DMD, un essai sera ultérieurement programmé sur un nombre restreint de chiens DMD. Notre équipe dispose d'une expertise, d'une compétence et d'une base précieuse de données sur ces chiens, acquises antérieurement lors de l'évaluation d'autres stratégies thérapeutiques. Nous pourrons alors établir le potentiel de l'immunothérapie sur ce second modèle translationnel, hautement prédictif du succès d'un essai clinique chez l'humain. En cas de bénéfice évident chez les rats et les chiens, nous aurons contribué à produire des données précliniques robustes qui seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. À long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. Notre immunothérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant voire en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux reçoivent le candidat médicament par une injection quotidienne sous cutanée. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 21 (procédures 1, 2 et 3) et 510 (procédures 4 et 5). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbitaire, 4 fois en un mois ou 7 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluaton fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. Seule la mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois pour les animaux des procédures 1 à 3 et 3 fois en 6 mois pour les procédures 4 et 5. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide NC-P7, y compris pour les doses élevées. L'immunothérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. En revanche, les rats R-DMDdel52 développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Combinées, ces défaillances conduisent à la nécessité d'une euthanasie compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. Les procédures 1, 2 et 3 de ce projet incluent des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. Les procédures 4 et 5 de ce projet incluent des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux.
Devenir
À l'issue des cinq procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Il est également essentiel de prélever les organes sentinelles d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La méthode précise de mise à mort des animaux est décrite dans le chapitre 3.3.3. Il est attendu que l'immunothérapie testée améliorera grandement l'état de santé des animaux et retardera la survenue des signes cliniques les plus sévères. Mais administrée seule dans un premier temps, l'immunothérapie n'empêchera pas totalement la nécrose des fibres musculaires. Les animaux vieillissants nécessiteront donc toujours une surveillance rapprochée et des compétences médicales pour décider du niveau de l'atteinte générale de l'animal et du recours à une euthanasie compassionnelle, par exemple en cas de décompensation cardiorespiratoire. Dans ce cas, l'euthanasie interviendra en anticipation de la mise à mort programmée des rats de l'étude. Les organes seront néanmoins récupérés sur les animaux euthanasiés, de sorte que tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus dans les analyses histologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
L'expression de la cible CD38 dans le système immunitaire (monocytes, macrophages, lymphocytes T et B), le muscle, le système nerveux central, le tissu conjonctif a déjà été confirmée par de nombreuses expériences réalisées sur cellules, in vitro. Le ciblage de CD38 dans les maladies inflammatoires, cardiovasculaires, neurodégénératives, immunitaires ainsi que dans la lutte contre les effets indésirables du vieillissement a également été largement documenté. Les effets bénéfiques de la modulation spécifique de CD38 par l'immunothérapie brevetée par ENCEFA via le NAD, le cADPR et le NAADP boosting sur la réduction de l'inflammation (NAD), l'accroissement de la contractilité du cœur et des muscles et de leur métabolisme (cADPR) et la stimulation du flux autophagique (NAADP) ont également été mis en évidence sur de nombreux modèles cellulaires, puis sur des modèles de souris. Sur ces bases mécanistiques très robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à deux questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : quelle dose de NC-P7 faut-il injecter pour obtenir un engagement optimal de la cible CD38 dans le muscle (PK-PD) et quels effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce ou tardif, court ou long sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.
Réduction
Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats R-DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), on puisse traiter les données de 5 animaux arrivés au terme de la procédure. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et R-DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Nous avons pu réduire ce nombre à 4 pour la procédure 1 car l’intensité de la variation d'un biomarqueur tel que la créatine kinase qui présage de l’efficacité du traitement (et qui sera privilégié dans le cas de la procédure 1) est beaucoup plus forte.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Depuis janvier 2021, la température dans nos nouveaux locaux a été très bien maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C, sauf lors de périodes courtes de réglages ou de pannes corrigées dans un délai court. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se lever. Les cages XL ont une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Nous sommes le premier laboratoire académique à utiliser ces cages. L'observation des animaux nous conforte dans la pertinence de ce choix : les animaux profitent pleinement de la hauteur pour se lever fréquemment sur leurs pattes arrière. Sur le plan fonctionnel, cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12 h par jour (5 h-17 h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100 g ; nous préférons rester sous le seuil réglementaire de 10 pour des raisons de confort des animaux). Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux WT au-delà de 5 mois, les R-DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. À tour de rôle, les groupes font également des séjours de quelques heures dans une grande cage de type "cage à furet" (Savic suite royale 95 double®). Cette cage de 6000 cm2 (le triple de leur cage habituelle) mesure 159 cm de hauteur. Elle est organisée en 3 niveaux, les deux plus haut accessibles via des échelles. Nous avons constaté que les rats s'y plaisent beaucoup et pratiquent une intense exploration du volume selon leurs capacités. Nous les filmons et mettons actuellement au point une méthode de quantification de ces mouvements spontanés, réduisant ainsi à terme la nécessité de les contraindre à des exercices imposés. Une fois validée, cette méthode permettra de réduire le nombre de tests fonctionnels, réservés aux mesures de force ou d'endurance par exemple.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat R-DMDdel52 mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris Mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Comme indiqué ci-dessus nous utiliserons : 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines et après la semaine d'acclimatation, inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines pour les Procédures 1, 2 et 4 et à partir de 5 mois d'âge pour les Procédures 3 et 5. Les animaux âgés de 4 semaines sont choisis parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement précoce dans la phase asymptomatique de la maladie. Les animaux âgés de 5 mois expriment déjà les signes cliniques de la maladie et sans traitement, devront être euthanasiés dans les 2 à 8 mois suivants. En cas d'efficacité du traitement durable chez ces animaux, il est attendu qu'ils récupèrent en partie de la maladie et le cas échéant, qu'ils survivent au-delà de l'âge de l'euthanasie habituel pour le groupe des rats DMD non traités (6 à 13 mois). Une réussite de ce traitement durable augurera d'une possibilité de proposer des essais cliniques avec cette immunothérapie.