Rats
Amélioration d’un inhibiteur de la p38 mitogen-activated protein kinase sur un modèle de douleur inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la capsaïcine pour provoquer une hypersensibilité douloureuse, puis on leur administre des composés par voie intrathécale et sous-cutanée sous anesthésie, avec des tests répétés de mesure de la douleur, pour améliorer un candidat médicament antidouleur. Le porteur indique qu'il lui est impossible de soulager la douleur de ces animaux pendant l'expérience, puisque c'est précisément l'objet de l'étude. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'intégration de la douleur impose des études sur l'animal vivant.
Objectifs
Parmi une série de composés chimiques synthétisés par le laboratoire, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine ?
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer si l'amélioration du composé améliore son effet anti-allodynique, afin d'en faire un candidat médicament pour traiter l'allodynie.
Procédures
Toutes les injections intrathécales (1 par animal d'environ 3min) et sous-cutanées (1 par animal d'environ 2min) seront pratiquées sous anesthésie générale. Les tests de mesure de la douleur en comportement sont réalisés 7 fois en 1h30.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien être des animaux au quotidien suite aux injections intratéchales et sous cutanées. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Les données sont traitées selon les données de la littérature. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire , le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.
Evaluation de l’effet thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles de sclérodermie chez la souris ou le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
Rats : 3120
12 480 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur induit une fibrose de la peau et des poumons, avec pose chirurgicale de pompes, injections intradermiques et administrations intranasales ou oropharyngées, pour cribler l'efficacité de nouvelles molécules contre la sclérodermie. Le porteur indique que la fibrose se développe sans autre effet indésirable attendu et fixe la mise à mort à un score de souffrance déterminé. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "indispensable" d'examiner l'"animal entier" et que ces essais ne peuvent être reproduits sur cellules, pour un total de 15 600 animaux.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc, systemic sclerosis) est une maladie systémique du tissu conjonctif. Elle est caractérisée par des lésions de fibrose cutanée et/ou viscérale, une atteinte microvasculaire et une réponse immunitaire activée et dérégulée. La SSc est une pathologie rare, sa prévalence varie de 30 à 240 cas par million d’habitants. Cette maladie touche essentiellement les femmes (4 femmes pour 1 homme environ), et se déclare généralement entre 45 et 60 ans. La SSc est associée à une surmortalité significative. Le pronostic dépend essentiellement de la survenue d’atteintes viscérales et plus particulièrement d’une pneumopathie infiltrante diffuse (PID) parfois sévère, d’une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) ou d’une atteinte cardiaque primitive, qui représentent les 3 premières causes de mortalité au cours de la SSc. C’est une maladie multifactorielle qui implique des facteurs environnementaux et un fond génétique de susceptibilité. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché mais une prise en charge adaptée permet seulement d’atténuer les symptômes. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet, le but étant d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels contre la sclérodermie. Le projet inclus un screening de nouvelles molécules, une étude si besoin de leur mécanisme d’action et évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement un médicament contre la sclérodermie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’sclérodermie avec la mise en place de différents modèles animaux de fibrose cutanée et pulmonaire chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la fibrose et l’inflammation dans des modèles animaux mimant les symptômes de la sclérodermie diffusée chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans des maladie chronique fibrotiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de la fibrose et l’inflammation.
Procédures
Tous les animaux de la procédure 6 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour incorporer les pompes osmotiques. La chirurgie de 20-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. Tous les animaux de la procédure 1et 2 subiront des injections intradermiques, les animaux de la procédure 3 et 4 subiront des administrations intranasale et oropharyngée (sauf le groupe 1, sérum physiologique) et les animaux de la procédure 5 sauf le groupe 1, avec du véhicule) subiront des injections sous-cutanées et intramusculaires. Les traitements pourront être administrés avant, pendant ou après l'induction du modèle. Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer de la fibrose cutanée et pulmonaire, et l’inflammation sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
Euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur la fibrose et l’inflammation implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de fibrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la fibrose et l’inflammation et structure des organes viscéraux, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (Mann Whitney test) ou une analyse de variance (ANOVA).
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, administrations oropharyngée) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Toutefois, pour les modèles d’induction de fibrose pulmonaire par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces et la réponse respiratoire. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >6 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de fibrose cutanée et pulmonaire en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de souris C57Bl/6 est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de souris comme les BALB/C ou des rats comme la souche de rat Sprague Dawley qui est également un modèle de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour ces études mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-19 semaines au début de l’étude selon le type ou le stade de progression de la maladie sur des patients atteints de sclérodermie (Sclérodermie juvénile ou sclérodermie sur des patients adultes).
Etude de l’influence des maladies parodontales sur les pathologies neurodégénératives dans des modèles expérimentaux de Maladie d’Alzheimer, tauopathies et d’inflammation systémique liée à l’HLA-B27
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 600
1 032 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une parodontite par ligature ou injections répétées dans la gencive, certains subissant une chirurgie stéréotaxique avec injections intracérébrales, un hébergement isolé en cage métabolique et des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, pour tester le lien entre infection buccale et maladies neurodégénératives. Le porteur indique n'attendre qu'un inconfort léger et des saignements gingivaux, sans effet secondaire notable. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" et que ces évaluations ne peuvent se faire sans modèle animal.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de pathologies affectant le système nerveux, dont la plus prévalente est la maladie d’Alzheimer (MA) faisant partie des tauopathies. Dans les tauopathies, la protéine Tau est hyperphosphorylée et présente un repliement anormal, provoquant une perte de sa fonction physiologique et un gain de fonction toxique. La protéine Tau anormale est délocalisée vers le soma puis les dendrites où elle s’accumule, générant une dysfonction synaptique. Ces dernières années, est apparue l’hypothèse qu’une inflammation, progressive et auto-entretenue, du système nerveux central (SNC), peut constituer un terrain favorable à une neurodégénérescence. Les infections périphériques, en agissant sur les processus neuro-inflammatoires, contribueraient au déclenchement et/ou à l’évolution péjorative de ces pathologies. Les parodontites, pathologies buccales infectieuses figurant parmi les affections humaines les plus fréquentes, sont caractérisées par des lésions inflammatoires chroniques des tissus de soutien des dents. Elles sont reconnues comme associées à la progression négatives de diverses pathologies systémiques dont les pathologies neurodégénératives. Cependant le schéma spatio-temporel pouvant lier tauopathies et pathologie infectieuse/inflammatoire périphérique comme la parodontite est encore mal connu. Dans ce contexte général, notre projet vise a investiguer de manière large le schéma spatio-temporel liant infections et inflammation périphériques, neuroinflammation et tauopathie pour mieux définir dans quelle mesure l’immunité innée/adaptative dans le système nerveux central (SNC) mais également les processus immunitaires périphériques sont impliqués dans le développement de la tauopathie. Notre hypothèse est que les infections et/ou inflammations périphériques aggravent voire induisent les signes biologiques et cliniques des tauopathies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l’obtention de données satisfaisantes permettant : - D’identifier les conséquences d’une infection périphérique buccale ou d’une inflammation systémique sur l’initiation ou la progression des tauopathies. - D’élucider des voies mécanistiques liant les tauopathies et les parodontites afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ou des marqueurs diagnostiques. En effet, l’induction d’une parodontite expérimentale sur un terrain avéré de prédisposition à une pathologie neurodégénérative permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’exacerbation, l’entretien voire le déclenchement de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence chez un individu susceptible. Si la parodontite est un facteur aggravant les tauopathies, alors cliniquement les patients atteints de tauopathies devraient bénéficier d’un examen parodontal et d’une prise en charge parodontale en cas de pathologie détectée. Les données que nous obtiendrons avec ce projet sont importantes pour améliorer à moyen terme la prise en charge globale des patients atteints de tauopathies dont la maladie d’Alzheimer et à long terme la santé orale de ces patients. D’autre part, l’induction d’une parodontite expérimentale chez un animal sans prédisposition permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’induction de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Si ce rôle est vérifié, alors cliniquement les patients atteints de parodontite pourrait faire l’objet de dépistage de troubles cognitifs de manière préventive. Il serait alors interessant de pousser la recherche vers des études cliniques en fonction des stades et grades de la parodontite pour déterminer si une catégorie de patient atteint de parodontite serait plus à risque (parodontite sévère de stade III ou IV, à progression rapide grade C par exemple). Compte tenu de la charge mondiale des troubles du déclin cognitif due aux changements démographiques, la recherche et l’identification de facteurs de risque potentiellement modifiables de tauopathies comme proposé dans notre projet fait partie intégrante des efforts de recherche multidisciplinaires. De plus, l’emploi de différents modèles dans notre projet, devrait permettre d’identifier le modèle le plus optimal pour l’analyse des mécanismes et du schéma spatio-temporel des liens entre pathologies neurodégénératives et parodontite et donc raffiner la modélisation pour les études futures.
Procédures
Ce projet comporte 2 procédures chirurgicales (induction de la parodontite, injection par stéréotaxie). L’induction de la parodontite se fera par 2 techniques différentes, l’une nécessitant une seule intervention et un suivi pendant 4 semaines, l’autre nécessitant des injections répétées trois fois par semaine pendant 24 jours. L’emploi de ces deux techniques permet de reproduire des aspects différents de la parodontite (évolution lente ou évolution rapide) pour des groupes d’animaux différents. Pendant cette période, 540 rongeurs bénéficieront d’un suivi à l’aide de cages métaboliques où les animaux seront hébergés seuls afin de déterminer leur balance énergétique. Pour ces deux techniques il sera attendu 10 jours avant de placer les animaux dans les cages métaboliques et une période d’acclimatation d’au moins 48 heures avec de la litière identique à leur cage d’hébergement et dans un espace suffisant au regard de leur poids. La stéréotaxie sera effectuée une seule fois avec pose de canule permettant des injections intracérébrales une fois par jour pendant 6 jours. L’intégralité des animaux seront suivis d’un point de vue comportemental ayant pour objectif de tester les capacités cognitives des animaux. Au cours des deux procédures, des prélèvements sanguins seront effectués une fois par semaine et juste avant la mise à mort sur animaux vigiles pour lesquels la douleur sera prévenue par application d’un anesthésique local. Au cours de la procédure faisant appel à la stéréotaxie, du liquide céphalo-rachidien sera prélevé une fois sur les animaux anesthésiés, avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les procédures chirugicales (induction de parodontite, perfusion ou stéréotaxie) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Le suivi post-opératoire sera réalisé par du personnel formé au bien-être animal. Les procédures comme la stéréotaxie ou la pose de perfusion sont des procédures courantes dans le laboratoire. Les conséquences attendues sont minimes sur le bien-être animal. Aucun effet secondaire n'est attendu sur les animaux du fait de l’induction de la parodontite. Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger (pose d'une ligature à la base d'une dent, et injections dans la gencive). Une absence de perte de poids consécutive à la pose de ligature est attendue comme dans une étude précédente. Les injections au niveau gingival peuvent entrainer des saignements au point d’injection sans nuisance sur le comportement de l’animal. Les injections seront effectuées de manière lente pour éviter l’apparition de grosseurs/nodules au niveau de la gencive. Dans le cas où certains animaux rencontreraient tout de même des difficultés à l’alimentation, de la nourriture en gel sera mise en place.
Devenir
A l'issue des procédures (P1) et (P2), tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre des analyses des tissus parodontaux et cérébraux.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie des tauopathies en lien avec les performances cognitives et des pathologies induites au niveau périphérique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité. En effet, nos travaux visent à mettre en lien les atteintes périphériques infectieuses et inflammatoires avec des altérations comportementales, histologiques, biochimiques et moléculaires neuronaux et d’en étudier les facteurs modulateurs au cours du vieillissement. Cela nécessite donc le développement d’approches neurobiologiques intégrées. De plus les modèles expérimentaux sont largement utilisés pour vérifier les hypothèses biologiques de la relation entre la parodontite et d’autres maladies systémiques pour permettre le contrôle de facteurs étiologiques supposés. Ces évaluations particulières ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de notre protocole sur les 5 ans à venir est donc estimé à 1632 (1032 souris et 600 rats). Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera effectuée pour la mise au point des modèles de parodontite. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R. De plus les animaux seront utilisés pour plusieurs interventions au sein des procédures expérimentales afin de réduire leur nombre. Pour l’étude statistique, une comparaison des groupes d’animaux deux à deux entre les animaux contrôles et les animaux tests sera effectuée.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au moins 1 fois par semaine, par du personnel spécialement formé. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition: blocs à ronger pour les rats, coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées, après une prémédication analgésique, sous anesthésie générale par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique complémentaire sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Ces espèces sont utilisées parce que rats et souris peuvent être évalués par des méthodes comportementales et être génétiquement modifiés par injections de vecteurs viraux ou transgénèse. Les souris transgéniques utilisées dans notre protocole reproduisent un certain nombre d’altérations retrouvées dans la Maladie d’Alzheimer et les tauopathies (lésions amyloïdes : APP/PS1dE9, APPP KI, hyperphosphorylation/troncation, agrégation/altération d’épissage/perte de fonction de la protéine Tau : THY-Tau22, THY-Tau30, TauKO, Tau-KI, MiniTau. Le parodonte des rongeurs et notamment du rat est assez similaire à celui de l'homme notamment d’un point de vue anatomique dans la région molaire. L’avantage de ce modèle animal est aussi de pouvoir mener une étude sur des groupes homogènes et alors minimiser les effets de la variabilité biologique. Dans la plupart des expérimentations, les souris et les rats seront utilisées à l’âge adulte : entre 2 mois à 12 mois.
Evaluation de traitements dans le cadre du sepsis
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 970
1 990 souris et 970 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un sepsis, une infection généralisée entraînant une défaillance des organes, par administration d'un réactif ou par chirurgie, après pose d'un implant de suivi de la température, puis on teste des candidats médicaments. Le porteur indique que les animaux développent une chute de température, un affaiblissement et une perte de poids sur quelques jours, et qu'ils sont tués parce que leur état rend impossible un maintien en vie dans de bonnes conditions. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la défaillance multiviscérale d'un "corps entier" et conclut au recours à la souris et au rat.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome de dysfonctionnement des organes provoqué par un dérèglement de la réponse aux infections, conséquence d’une infection grave qui débute généralement localement (péritonite, infection urinaire, infection nosocomiale...). Il comprend une phase précoce d'inflammation marquée qui induit des effets néfastes sur les organes vitaux, puis une phase immunosuppressive où le système immunitaire ne peut plus combattre les infections. Le choc septique (ou septicémie) est un sous-ensemble de ce syndrome, au cours duquel on observe une défaillance multiviscérale (incluant poumons, reins, foie) aiguë entrainant, faute de prise en charge suffisante, le décès du patient. Le sepsis touche souvent des patients dont le système immunitaire est affaibli ; aujourd'hui, il affecte principalement des patients nouveaux-nés ou âgés. Toutes les bactéries (dont celles présentes naturellement à la surface de la peau ou des muqueuses) peuvent être responsables de sepsis. Des infections fongiques ainsi que certains virus peuvent également induire une réponse semblable. Afin de lutter efficacement contre l'infection, une reconnaissance et un traitement précoce (très agressif notamment dans le cas du choc septique) sont essentiels. Le traitement consiste notamment en actes chirurgicaux et en la prescription d'antibiotiques en sus des soins permettant d'assurer le maintien des fonctions vitales. Cependant, il n'existe pas de traitement spécifique du sepsis (notamment, permettant de réduire la phase d'hyper-inflammation sans affaiblir le système immunitaire du patient, lui permettant de lutter contre l'infection), et même si la mortalité entraînée par ce syndrome a régressé, elle avoisine malgré tout toujours 30 à 40% des cas. De plus à l'heure actuelle, les patients survivant à un sepsis sont plus à risque de développer différents troubles tels que des maladies cardio-vasculaires, de l'insuffisance rénale ou des cancers. Aussi, afin de réduire la mortalité due au sepsis (ou à la septicémie) ou encore d'améliorer la qualité de vie des patients survivants, l'objectif de ce projet est de continuer la recherche et l'évaluation de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Le sepsis peut causer le décès ainsi que de nombreuses complications chez les survivants. Il n'existe à ce jour pas de traitement spécifique et satisfaisant de ce syndrome ; il apparait donc nécessaire de développer de nouveaux traitements qui permettraient d'augmenter le taux de survie des patients et d'améliorer leur qualité de vie. Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans des modèles murins de sepsis/septicémie.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). Les animaux seront implantés pour suivi de leur température corporelle (puces RFID ou implants télémétriques). En fonction du type d'implant, il s'agira d'une administration très rapide (de l'ordre de la minute) ou d'une chirurgie légère sous anesthésie (quelques minutes). L'induction sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie) ou par chirurgie (quelques minutes, sous anesthésie). Les animaux seront soumis à des prises de température corporelle (majoritairement par puce RFID, lecture de l'ordre de quelques secondes sans contention) et leur comportement général sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes). Ils seront répétés maximum toutes les 30 minutes pendant les heures suivant l'infection. Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les aniumaux dans ce projet développent un syndrome de type sepsis ou septicémie. Ceci se traduit par une baisse de la température corporelle et un affaiblissement de l'animal avec une perte de poids sur un laps de temps de l'ordre de quelques jours (pour les animaux gardés cette durée). Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. prise de température) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Dans le modèle chirurgical, malgré l'administration d'un analgésique il est possible que la chirurgie entraîne une douleur post-opératoire au site concerné.
Devenir
Euthanasie : les animaux auront été soumis à un sepsis voire à une septicémie, ce qui potentiellement peut affecter la fonction de leurs organes vitaux et rendre impossible leur maintien en vie dans de bonnes conditions.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ce syndrome qui est dû à une infection généralisée et entraîne une défaillance multiviscérale. Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement (plusieurs fois par jour pendant la phase critique d'infection, dans le cadre de ce projet) jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori les méthodes de raffinement, si pertinent. Pendant la phase chirurgicale (certaines procédures uniquement), les animaux sont anesthésiés et analgésiés selon un programme défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Pour le suivi rapproché de la température des animaux, il est prévu de favoriser l'utilisation d'implants de type puces RFID permettant une lecture externe des températures, évitant le risque de lésion par sonde rectale et limitant le stress des animaux.
Choix des espèces
Différents modèles de sepsis et septicémie sont bien décrits et caractérisés dans la littérature chez la souris et le rat, permettant d'étudier l'efficacité de candidats médicaments dans ces espèces. Majoritairement jeunes adultes pour étudier des animaux dont le système immunitaire est mature ; cependant, étant donné que le sepsis touche plutôt des sujets aux âges extrêmes de la vie chez l'être humain, des jeunes animaux (âgés de 3 semaines, au moment du sevrage) ou des animaux âgés pouraient être dans certaines indications utilisés.
Recherche d’un agoniste 5HT permettant de moduler la pression artérielle d’un rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit sous anesthésie l'implantation d'un capteur de télémétrie dans la cuisse, puis reçoit deux fois par semaine des injections de molécules agissant sur la sérotonine, dans un criblage visant à moduler la pression artérielle après une lésion de la moelle épinière. Le porteur indique que les molécules testées disposent d'une autorisation de mise sur le marché et n'attend que des hausses transitoires de pression, et précise que chaque rat est utilisé dans dix à douze expériences avant d'être tué pour récupérer le capteur, opération impossible sans détruire l'artère fémorale. Il justifie le rat par sa taille, qui facilite la chirurgie, et par la continuité avec un projet antérieur.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52,5 cas/million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensori-moteurs bien connus et identifiés, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome. Les symptômes cliniques comprennent des troubles cardiovasculaires, une thermorégulation dysfonctionnelle et la présence de dysréflexie autonome (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive pouvant mettre en jeu le pronostic vital). Ces troubles cardiovasculaires contribuent à 40 % des décès chez les patients blessés. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats avec ces blessures, l'administration quotidienne d'un agoniste (molécule qui reproduit les effets d’un neurotransmetteur) de la sérotonine (5HT, molécule fonctionnant sur certains récepteurs du système nerveux central) favorise la récupération de la locomotion. Outre ce rôle démontré dans le contrôle moteur, la 5HT joue également un rôle dans le système cardiovasculaire puisqu'elle module entre autre, le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. Cela nous a conduit à développer un protocole expérimental basé sur l'utilisation chronique d'agonistes 5HT, comme cela a été fait pour la locomotion. Notre précédente étude est partie de cette hypothèse. Dans ce cadre des animaux présentant une lésion de la moelle épinière dite haute ont été traités de façon pendant 28 jrs avec la quipazine, un agoniste 5HT, et les résultats ont confirmés les précédentes études sur la récupération locomotrice mais ont aussi mis en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires (fréquence cardiaque et pression artérielle). Dans ce cadre et en collaboration avec une équipe de médecins en rééducation fonctionnelle de l’hôpital, nous souhaiterions mettre en place une étude clinique. Si notre molécule est complexe à mettre en œuvre chez l’humain car pas encore utilisée en routine, nous savons que des molécules 5HT sont régulièrement utilisées pour soigner d’autres troubles. Nous voudrions donc faire un criblage des molécules connues, et tester si en injection unique, certains effets seraient similaires à ceux de notre molécule. Cette pré-étude permettrait de réduire de beaucoup les animaux utilisés dans un futur projet avec la nouvelle molécule sélectionnée.
Bénéfices attendus
Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Une précédente étude de notre équipe a montré l'implication de molécules agissant sur le système sérotoninergique et leur capacité à restaurer en partie l’impact de ces troubles. Afin de pouvoir plus rapidement lancer une étude clinique, nous recherchons ici, une molécule pharmacologiquement similaire mais déjà utilisée en routine chez l'humain dans d'autres domaines. Le bénéfice a court terme, nous l'espérons, est l'amélioration des conditions des patients atteints de lésions de la moelle épinière (diminution du nombre de dysreflexie autonome, augmentation de la pression artérielle et diminution de la fréquence cardiaque).
Procédures
Chaque animal (24 animaux au total) subira une chirurgie d’implantation d’un capteur de télémétrie en fémoral. Ce capteur leur permettra d’être libre de leur mouvement dans la cage. Cette chirurgie durera 1h sous analgésie et anesthésie. Ils seront ensuite injectés 2 fois par semaine en sous-cutanée. Ces moélcules sont des agonistes serotoninergiques (molécule fonctionnant sur certains récepteurs du système nerveux).
Impact sur les animaux
Les molécules testées sont toutes avec une autorisation de mise sur le marché et donc avec des effets secondaires minimes, connus et validés par l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) ou par un comité d'éthique pour les études cliniques. Nous prévoyons d'observer des augmentations transitoires et modérée de pressions artérielle ou de ne rien observer. Les animaux pourront éprouver de la douleur post-opératoire malgré un suivi poussé et un protocole mis au point avec des vétérinaires. La chirurgie est peu invasive et cet état est très transitoire.
Devenir
Il est nécessaire de récupérer les capteurs et cela ne peut se faire sans abimer de façon définitive l'artère fémorale.
Remplacement
Le système serotoninergique est complexe avec une quinzaine de types ou sous-types de récepteurs différents et se retrouve à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modèle de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet.
Réduction
Les animaux seront réutilisés sur 10 à 12 expérimentations soit de leurs 8 semaines d'âge à leur 20 semaines d'âge. Ainsi la réutilisation des animaux sur l'ensemble des molécules ici testées va permettre de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés dans le projet. De plus, les animaux seront des individus excédentaires d'élevage interne (tant que possible). Les analyses statistiques seront des comparaisons non paramétriques de type Kruskall-Wallis suivi de test ad-hoc avec correction de type Bonferroni.
Raffinement
La procédure de chirurgie a été mise au point avec 2 vétérinaire dont un extérieur et raffiné au fur et à mesure de notre expérience. Elle est faite sous anesthésie et analgésie, avec une perfusion pour éviter la déshydratation, sous contrôle de la température et avec des personnes compétences et qui se sont formés au sein d’un centre de chirurgie. Une fois implantés les animaux sont totalement libres de leurs mouvements et n’ont aucune contrainte malgré des enregistrement de pression artérielle en cours. Les animaux seront hébergés par deux dans des cages de taille réglementaire avec un milieu enrichi (tunnel, matériel de nidification).
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat car il est notre modèle sur le précédent projet et le sera sur le prochain lorsqu’une ou des molécules de choix auront été déterminées. Précédemment le rat avait été choisi car le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et SCI). Nous utiliserons les animaux dès leurs 8 semaines d'âge soit à l'âge adulte. Nous ne les garderons pas au-delà de 20-21 semaines pour rester dans le cadre du précédent projet.
Etudes moléculaires chez un nouveau modèle rat du Syndrome de Down et de la Maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent un jeûne de six heures, une pose de bague d'identification et une biopsie de l'oreille, puis un prélèvement de sang sous anesthésie avant d'être tués pour des analyses moléculaires post-mortem. Le projet vise à caractériser une nouvelle lignée de rats reproduisant la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer, le porteur avançant que ce modèle pourrait éclairer les mécanismes des deux pathologies. Sur le remplacement, il affirme qu'"aucune alternative" n'existe et que l'étude du cerveau exige un organisme vivant étudié dans sa globalité.
Objectifs
Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 touche 1 naissance sur 800 et représente la forme la plus fréquente de retard mental. Par ailleurs, les personnes atteintes du SD développent de nombreuses comorbidités parmi lesquelles la maladie d’Alzheimer (MA). Nous venons ainsi de créer un tout nouveau modèle de rats du SD pouvant également être utilisé pour étudier le développement de la MA. Ce dernier pourrait notamment contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique du SD, ainsi qu’à l’identification de mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans ce contexte du SD. L’objectif de ce projet est donc de réaliser une première caractérisation de ce modèle grâce à des analyses moléculaires effectuées sur des échantillons de sang/plasma ainsi que sur le cerveau. Les résultats de ces analyses sont sensibles à la prise alimentaire des animaux. De ce fait, il est nécessaire de réaliser une mise à jeun des animaux afin de contrecarrer les effets de la prise alimentaire, cette dernière étant très aléatoire d’un individu à l’autre. Les animaux seront donc soumis à une privation alimentaire avant d’effectuer un prélèvement sanguin qui sera réalisé sous anesthésie générale.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau modèle de rats du SD. Les bénéfices potentiels de ce projet sont multiples (i) une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques du SD, (ii) une meilleure compréhension du rôle de l’interaction 2 gènes dans le développement de la MA dans le SD, l’un de ces gènes étant connu pour son implication dans le SD et l’autre dans la MA et (iii) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans le SD. Par ailleurs, les mécanismes identifiés pour le développement de la MA dans le SD pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectées par la MA. Par la suite, cela pourrait potentiellement permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le SD et la MA.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à une privation alimentaire en vu d’une mise à jeun. Cette privation alimentaire sera d’une durée de 6h. Elle sera réalisée une seule fois par rat et sur la totalité des animaux du projet, soit 24 rats. Ces animaux seront ensuite anesthésiés pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Pour cela, un mélange anesthésique sera administré par voie intrapéritonéale, cette injection est réalisée en 1 à 2 mins par rat. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé, il se fait en 1-2 mins. A noter que l’injection d’anesthésique et le prélèvement de sang sont réalisés qu’une seule fois par rat. Par ailleurs, les animaux seront soumis à la pose d’une bague à numéro unique permettant de les identifier, ainsi qu’au prélèvement d’une biopsie d’oreille afin de déterminer quels animaux sont porteurs de la modification génétique. Ces deux actes sont réalisés une seule fois par animal et de façon successive en 2-3 mins.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une privation alimentaire afin de réaliser une mise à jeun. Cette privation alimentaire peut induire un stress léger chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement sanguin nécessite d’anesthésier l’animal au préalable via une injection d’anesthésique par voie intrapéritonéale. Cette injection n’induit qu’une douleur minime et très brève au site d’injection liée à l’introduction de l’aiguille. Elle peut également induire un stress de courte durée chez l’animal du fait de la contention nécessaire pour pouvoir effectuer l’injection. Concernant la pose d’une bague à numéro unique et du prélèvement d’une biopsie d’oreille, ces deux actes, réalisés de façon successive, ne génèrent qu’une douleur minime et un stress léger chez l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires en post-mortem.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Cette demande concerne la réalisation de prélèvements sanguins et du cerveau sur des animaux mis à jeun en vu de réaliser des analyses moléculaires. Le recul et les connaissances que nous avons sur la mise en œuvre de ces analyses nous permettent d’estimer que le nombre d’animaux nécessaire est de 6 animaux/génotype/sexe. Cet effectif a été déterminé afin d’avoir un nombre minimal d’animaux tout en ayant des résultats scientifiquement interprétables et ce en prenant en compte une variabilité inter-individu attendue. Par ailleurs, cette étude sera réalisée sur des mâles et des femelles afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de vérifier qu’il n’y a pas de différence en fonction du sexe.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une mise à jeun qui n’est en rien délétère pour l’animal. En effet, elle est réalisée sur une période très courte (6h) et pendant la phase de jour, période pendant laquelle les rats dorment principalement et mangent peu, ils ne seront donc que peu perturbés. Il n’y a donc pas de point limite concernant la mise à jeun. Par ailleurs, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie/analgésie générale profonde. Ainsi, aucune douleur n’est attendue. Le prélèvement de sang ne commencera qu’après la perte totale des réflexes de retrait lors du pincement de la patte et des réflexes de fermeture palpébrale témoignant d’une anesthésie profonde. Les points limites seront donc déterminés en fonction des observations faites pendant l’anesthésie/analgésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l’animal). La procédure d’anesthésie sera arrêtée si ces points limites sont atteints. Par ailleurs, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien permettant de s’assurer de leur bien-être et de leur santé. Si les animaux présentent des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids, altération de la respiration, comportement anormal (perte de réactivité, animal prostré)), ils seront placés sous surveillance accrue et présentés au vétérinaire. Si un traitement est envisageable, il sera mis en place (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas pas cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable et que l’état de l’animal persiste ou se dégrade au cours de la journée, il sera mis à mort. Ainsi, l’atteinte de points limites concernant le bien-être et la santé des animaux sera déterminée sur la base des observations quotidiennes de nos animaux. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. L’étude sera réalisée chez des rats âgés de 3-5 mois, car c’est l’âge auquel ont été faites les analyses moléculaires sur les précédents modèles rat du SD. Le but étant de pouvoir comparer les résultats obtenus.
Développement d’applications thérapeutiques pour améliorer le transfert de thérapies au cerveau par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 136
368 souris et 136 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir la barrière protégeant le cerveau, avec injection de microbulles et d'agent de contraste, certains subissant en plus une chirurgie et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière peut provoquer une inflammation cérébrale transitoire et que les animaux présentant des effets visibles en imagerie sont tués sans réveil. Les retombées annoncées, un meilleur passage des médicaments contre les cancers du cerveau et une thérapie génique du syndrome de l'X fragile, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments. Récemment, les ultrasons guidés par imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre temporairement ce passage. Pour améliorer les traitements, il faudrait pouvoir faire passer ceux-ci plusieurs fois d'affilée au travers de cette barrière. Dans cette étude nous étudierons donc les effets de cette méthode au niveau des vaisseaux sanguins mais aussi l’intérêt de plusieurs ouvertures en faisant des analyses sur le tissu cérébral sain. Dans un second temps nous évaluerons le potentiel thérapeutique de cette méthode chez des rats et des souris présentant le syndrome de l'X fragile, une maladie neuro développementale due à la déficience d'un gène menant à des problèmes de développement du cerveau. Notre but sera donc de déterminer les meilleures conditions d’ouverture de la barrière dans le cerveau (temps d’ouverture, taux d’augmentation du passage des molécules) afin d’améliorer le passage de molécules thérapeutiques de manière non invasive. En plus des données que nous obtiendrons par imagerie par résonance magnétique et l'acquisition des signaux reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons le passage des molécules d’intérêt et étudierons les changements morphologiques des vaisseaux ayant reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer leur intégrité après traitement. La caractérisation de ces effets permettra d’optimiser les conditions pour déposer localement des médicaments dans un cadre thérapeutique. Pour la partie applicative, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de l'injection de thérapie génique chez des souris mimant le syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales. Dans le cas des cancers cérébraux, la moyenne de survie chez l'homme est de 15 mois environ. Chez l'animal, plusieurs études ont montré que l'on pouvait guérir des cancers cérébraux, ce qu'aucun essai préclinique n'avait montré jusqu'ici. Les essais cliniques chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient être rapidement bénéfiques chez l'humain. Dans le cas du syndrome X fragile, une maladie génétique, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour réaliser de la thérapie génique. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies localisées dans le cerveau.
Procédures
Suivant les procédures, une partie des animaux subiront des chirurgies sous anesthésie et n'excedant pas 30 minutes. Tous les animaux seront exposés à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Les animaux peuvent être amenés à participer à plusieurs séances d'imagerie (8 au maximum), dans ce cas celles-ci seront espacées d'au moins 24h. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection d'agent de contraste. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse d'une solution de microbulles. Les injections de produits à visée thérapeutiques sera aussi effectuée sur une partie des animaux.
Impact sur les animaux
L'utilisation des ultrasons focalisés guidés par imagerie de résonance magnétique peuvent provoquer une inflammation transitoire du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation est un effet normal dû à cette procédure qui ne provoque pas de dommages apparents pour l'animal. Si des effets néfastes sont visibles en imagerie, les animaux seront mis à mort sans réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), et plus particulièrement la frontière à l'interface entre le système vasculaire et le système nerveux central, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude de l'effet sur le cerveau du passage de particules virales à travers la barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses biologiques afin d'évaluer l’impact des ultrasons qui ne sauraient être remplacés par un modèle informatique ou cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences). Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront herbergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux fixés par le ministère, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement antalgique adapté sera mis en place.
Choix des espèces
L’ensemble des animaux sera utilisé à l'âge adulte (6 à 9 semaines pour la souris et 6 à 8 semaines pour le rat).
ETUDE HISTOLOGIQUE SUR L’ORGANISATION TISSULAIRE D’UN HYDROGEL DE REVITALISATION PULPAIRE INJECTE DANS DES RACINES DES DENTS HUMAINES
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
102 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau du dos des racines de dents humaines remplies d'un hydrogel ou de sang, pour quatre à douze semaines, avant de les tuer et de prélever les échantillons pour analyse. Le porteur décrit une douleur post-chirurgicale, un stress lié aux points de suture et une anxiété qu'il présente comme "attendue dans toute expérimentation animale". L'objectif est de valider un gel de revitalisation des dents nécrosées comme alternative à la dévitalisation chez de jeunes patients.
Objectifs
L’acte de dévitaliser les dents sur de jeunes patients peut-être éviter en préférant une thérapie régénérative (Traitement Endodontique Régénératif (TER) ou revitalisation pulpaire). Ce traitement se base sur l’obtention d’un tissu vascularisé à partir d’un caillot sanguin formé à l’intérieur de la racine de la dent nécrosée. Pour favoriser le développement d’un tissu de type pulpe dentaire à partir d’un caillot sanguin, au sein de notre laboratoire , a été développé un gel injectable dans la racine de la dent. Les études in vitro ont démontré la capacité de ces matrices sous forme de gel à former un tissu similaire à la pulpe dentaire, vascularisé et organisé. L’étape suivante vise à évaluer et à étudier le tissu formé dans des conditions in vivo chez le rat. Le modèle in vivo consiste en l’implantation sous-cutanée dans le dos du rat, de racines des dents humaines remplies avec les matériaux de revitalisation pulpaire. Pour notre étude, 10 racines remplies avec du gel (groupe test) et 10 racines remplies avec du sang (groupe contrôle) seront implantés sur 10 animaux par groupe. Chaque animal sera implanté avec 2 échantillons selon un modèle en split mouth : un échantillon « contrôle » et un échantillon « test ». Après la fin de la période d’implantation une étude histologique des tissus néoformés dans les racines sera réalisée. L’ensemble de ces résultats seront comparés avec les résultats des études in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude des effets des biomatériaux pour la revitalisation pulpaire. Les bénéfices attendus de ce projet sont l’obtention d’un tissu en condition proche de la clinique dont les caractéristiques en termes de cellules, de fibres et de formation de vaisseaux sanguins et nerveux seraient proches de celles de la pulpe dentaire. L’étude de la formation du tissu par l’hydrogel en condition in vivo nous permettrait de valider la capacité de l’hydrogel à recréer un tissu proche de la pulpe qui pourrait ensuite être appliqué en condition réelle à l’intérieur de la dent d’un patient, afin de remplacer le processus de dévitalisation.
Procédures
Implantation sous cutanée des échanitillons dans la loge dorsale de l'animal pour une période de 4 et 12 semaines. Dans chaque animal nous allons implanter 2 échantillons - un échantillon "test" et un échantillon "contrôle". Après les deux périodes d'implantation les animaux seront autanasiés et les échantillons prélévés pour une étude histologique et immunohistochimique.
Impact sur les animaux
- Douleur post chirurgicale au niveau du site opératoire (gonflement, inflammation) due à la cicatrisation - Stress physique provoqué par les points de suture au niveau des incisions (excitation, comportement anormal des animaux qui peuvent essayer de se retirer les points) - L’anxiété est un effet indésirable attendu comme dans toute expérimentation animale.-
Devenir
A la fin des deux périodes d'implantation, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération et analyse des échantillons
Remplacement
Ce projet de recherche s’inscrit dans la suite d’études expérimentales in vitro concluantes qui peuvent donner lieu à l’application chez l’homme des biomatériaux proposés. C’est pourquoi, des études sur le petit animal doivent être entreprises pour confirmer le bénéfice in vivo et informer d’éventuels biais non révélés in vitro. Il n’existe pas d’alternatives non animales pour réaliser ce test in vivo. L’implantation de l’hydrogel à base de fibrinogène et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. En effet, cliniquement, l’hydrogel sera en contact avec le sang de l’hôte pour permettre la formation d’un tissu similaire à la pulpe dentaire humaine. L’implantation de nos échantillons dans le dos du rat offre un environnement avec des conditions de vascularisation similaire à la réalité clinique, ce qui augmente la significativité des résultats.
Réduction
La taille d’échantillon utilisé (racine dentaire humaine 10mm) nous permet d’implanter maximum 2 échantillons dans la loge sous-cutanée thoracique dorsale de deux côtés de la colonne vertébrale par animal. Ansi dans un animal nous allons implanter un échantillon "test" et un échantillon "controle". Cela va diviser par deux le nombre d' animaux necessaires pour tous les tests. Le résultat du nombre de sujets nécessaires est de 10 par groupe (soit 20 échantillons implantés) et par la période d’implantation pour l’étude principale et de deux animaux pour l’étude préliminaire au total 102 animaux. Cela détermine un nombre d' animaux implantés pour l’étude principale égal à 100. Les résultats seront groupés dans des fiches individuelles pour chaque animal.
Raffinement
les animaux seront isolés en post-opératoire afin d'éviter tout risque de blessure.Les rats disposeront dans leurs cages individuelles de modules de cœur de bois de peuplier qui permettent de développer l’activité d’exploration de l’animal et de participer à son bien être. L'environnement du rongeur est également enrichi avec frisottis de papier qui stimule les instincts de nidification et d'exploration de jeu. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté. Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement.Visites quotidiennes par le personnel qualifié de l’animalerie. Utilisation d'un anesthésique local en début de toute chirurgie .Mise en place d’un protocole antalgique adapté . En cas de signes clinique d'infection du site opératoire, nous lui administrerons un antibiotique.Mise en place d’une grille de score ,utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance .
Choix des espèces
Le rat est un animal dont la taille et les proportions permettent la mise en place d’un protocole chirurgical pour l’implantation des racines dentaires humaines avec ces dimensions déterminées dans le dos du rat. L’implantation des biomateriaux pour la revitalisation de la pulpe dentaire et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. De plus le rat est un animal connu pour la rapidité de cicatrisation, sa résistance à la douleur et aux infections ainsi que sa bonne tolérance à l’anesthésie. Le rat dispose d'une qualité tissulaire proche de celle de l’homme ce qui nous permettra d’obtenir des conditions expérimentales proches des situations cliniques, augmentant ainsi la significativité des résultats. Animaux adultes : la taille suffisante pour l’implantation de deux échantillons par animal.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies d’origine auto-immune et diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 365
2 043 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une partie subit une chirurgie d'induction de neuropathie, une électrophysiologie du nerf sciatique sous anesthésie et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, avec trois tests comportementaux répétés, pour évaluer des candidats médicaments contre des neuropathies auto-immunes et diabétiques. Le porteur décrit des douleurs neuropathiques, une baisse sévère de la mobilité au pic de la maladie et les effets du diabète induit, obésité, hyperglycémie et retard de cicatrisation. Parmi les bénéfices avancés figurent une banque de tissus, des publications et une mise sur le marché "prévue d'ici 2035".
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé au niveau des pattes arrière permettant à la fois leur motricité mais aussi de ressentir des sensations perçues à leur niveau (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une enveloppe autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire) ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie d’origine auto-immune lors de laquelle le système immunitaire s’attaque à la myéline. Dans ce projet nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques acquises qui touchent 4% de la population mondiale et pour lesquelles les traitements actuels ne ciblent pas spécifiquement la démyélinisation pathologique dans ces maladies. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements agissant directement sur la démyélinisation pathologique dans les modèles rongeurs transgéniques de ces maladies. Ils seront donc complémentaires de ceux déjà employés en clinique. Les résultats seront publiés auprès de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - Démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - Sélectionner les produits efficaces pour un futur passage en clinique. - Créer une banque de tissus. - Publier des résultats. Avantages à long terme : -Thérapies complémentaires de celles sur le marché pour les patients. -Une autorisation de mise sur le marché prévue d’ici 2035.
Procédures
- La chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum. - Le modèle de rat Guillain Barré sera induit par une réaction immunitaire. -Les prélèvements de sang via le sinus rétro-orbital et celui du liquide dans lequel baigne le cerveau (liquide céphalo-rachidien) seront effectués au maximum sur 914 animaux, une fois par animal et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances -Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. -Douleurs post-opératoires (4 jours) -Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (durée 5 semaines) entre-coupée d’une diminution sévère de la mobilité lors du pic de la pathologie (durée de 5 jours entre le 15ème et 19ème jour) puis réversibilité progressive des symptômes. -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) -Nuisances associées au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures car des prélèvements terminaux sont nécessaires à l'étude des effets des traitements.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Des méthodes existent pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénérescence et régénérescence du nerf périphérique ne sont pas reproduits in vitro. L'expérimentation animale reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
Un calcul de taille d’échantillon a été réalisé, basé sur la variabilité attendue, la différence biologiquement significative à mettre en évidence avec une puissance suffisante et un risque alpha déterminé. Ces calculs ont été réalisés sur les données d’électrophysiologie et de comportement moteur afin de connaitre le nombre minimum d’animaux à avoir par lot pour chaque test. Dans tous les modèles sauf ceux des souris développant une démyélinisation d’origine auto-immune, les deux sexes seront utilisés car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Pour les modèles de souris de neuropathies d’origine auto-immune uniquement les femelles seront utilisées car 100% présenteront la pathologie, contre 16 à 30% des mâles. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation aux expérimentateurs sera effectuée ; - Pour éviter les douleurs neuropathiques, nous utiliserons de la litière de cellulose. Cette litière présente également l’avantage d’avoir une bonne capacité d’absorption et sera donc particulièrement adaptée à la polyurie des souris diabétiques. De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons en fonction de l’évolution du diabète. - Des fiches individuelles de suivi pré- et post-opératoire seront utilisées ; - Deux fois par semaine, l’évaluation de l’état clinique des animaux sera faite, avec des scores corrélés à l’intensité de la souffrance, à l’aide de plusieurs fiches dont chacune est adaptée aux besoins spécifiques des lignées et au suivi post-opératoire. Selon la souffrance évaluée, il y aura une discussion avec le vétérinaire pour décider des soins à apporter ou de la nécessité d’une euthanasie. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple, en cas de déshydratation, apport d’eau gélifiée ou injections sous-cutanées d’une solution isotonique d’électrolytes. En cas de perte de poids ou d’état affaibli, mise à disposition de nourriture humide et d’eau gélifiée sur le sol de la cage. -Nous sédaterons les rats avant leur euthanasie par dislocation cervicale ; -Une fois par semaine (modèles de souris de neuropathie auto-immune) ou une fois par jour (rat SGB) nous évaluerons l’évolution de la paralysie par une fiche de scoring. -Pour éviter la perte d’identification des animaux et le stress de contention : les animaux seront marqués de manière permanente soit par des poinçons d’oreille, soit par des micro-puces sous-cutanées, soit à la queue par un stylo marqueur non toxique.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez des souris C57Bl6 sauvages ou db/db et sur des rats, ceci nécessitant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Rat/souris : juvéniles et adultes Les animaux seront reçus entre 3 et 6 semaines d’âge. Une partie d’entre eux commenceront à être traités entre 4 et 8 semaines d’âge (procédure 1, 2, 3, 4 et 5). L’autre partie des animaux sera traitée à partir de 20 à 30 semaines d’âge (une partie de la procédure 4). Il s’agit de souris modèles de neuropathie périphérique d’origine auto-immune chez qui les symptômes moteurs s’expriment tardivement. Ces femelles seront générées par FIV, aucun mâle ne sera commandé pour ces modèles.
Identifier les déterminants physiologiques de maladie (obésité, diabète…) par l’analyse non-invasive des paramètres métaboliques chez le petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 48
252 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré du "sans réveil" au léger, une partie réutilisée pour d'autres études et le reste tué pour prélèvement d'organes. Les animaux passent par une plateforme de mesure métabolique non invasive, avec un isolement individuel d'environ deux semaines présenté comme la seule contrainte. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et estime qu'un quart environ des animaux est tué dans son établissement. Le dispositif sert des collaborations extérieures, le devenir de chaque animal dépendant de l'équipe qui le récupère.
Objectifs
Le but est d'étudier au niveau préclinique le métabolisme énergétique des souris ou rats par un outil non-invasif et complètement automatisé. Pour cela, la plateforme d’Exploration Physiologique Fonctionnelle (EPF) est composée de 12 cages et permet la mesure en temps réel et pour chaque souris ou rats : - la prise alimentaire et hydrique - la mesure de la consommation d’oxygène - la production de dioxyde de carbone - la mesure du quotient respiratoire (indicatif de la nature du métabolisme glycolytique ou oxydatif) - la dépense énergétique globale de l’animal - l’activité spontanée et la mesure fine des déplacements dans les 3 dimensions spatiales (X, Y, Z). La plateforme EPF permet aussi l’analyse non-invasive de la composition corporelle des souris et rats par un scanner à résonance magnétique. Ce système ne requiert pas d’anesthésie et permet de déterminer la masse maigre, la masse grasse, les fluides corporels et la composition totale en eau sur des souris et rats.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre de collaborations qui auront été préalablement validées par des comités éthique locaux aux équipes voulant collaborer avec nous pour connaitre les comportements métaboliques et cela sans douleur et en limitant le stress des animaux.
Procédures
Aucune intervention n'est effectuée, il s'agit d'une procédure non invasive de mesure de calorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Cette lecture métabolique est non-invasive et nécessite un isolement de 2 semaines au total avant d'être regroupé. Nous n'attendons aucun effet indésirable sur les animaux, ceux-ci ont de la nourriture et de l'eau à disposition comme dans une cage d'hébergement classique, la seule contrainte étant l'isolement de l'animal obligatoire pour les prises de mesure. Chaques études collaboratives (21 par an) sont réalisées sur 12 souris ou rats.
Devenir
En fonction des collaborations, les animaux seront récupérés dans le cadre des collaborations et mis directement à mort pour prélèvements d'organes. Nous pouvons estimer que 25% des animaux sont mis à mort dans notre EU.
Remplacement
Dans le cadre des projets de collaborations nous devrons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour nos études nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux (activité, prise alimentaire et hydrique) et de métabolique . De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs / le stress dans la procédure. Cette procédure est non invasive et ne provoquent normalement aucun effet indésirable sur les animaux.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur. Les animaux doivent être âgées au minimum de 10 semaines lorsque toutes les structures cérébrales et le métabolisme soient stabilisés.
Etude de pharmacologie (biodistribution, élimination) de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques chez le rat en vue d’une application en oncologie humaine – Étude 3
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse, sous anesthésie, des molécules radiomarquées destinées au diagnostic ou au traitement du cancer, passent deux imageries, puis sont tués pour prélèvement d'organes et comptage de la radioactivité. Le porteur affirme que l'animal est la "seule alternative", un système in vitro ne reproduisant ni circulation sanguine ni excrétion, et justifie le choix du rat par un métabolisme différent de celui de la souris. Le projet sert un industriel qui cherche à écarter les composés à risque avant la suite de son développement.
Objectifs
Lors du développement de nouveaux médicaments et/ou sondes d’imagerie, il est nécessaire d’étudier la façon dont la molécule d’intérêt se distribue et est éliminée de l’organisme. Cette étape permettra de valider qu’un agent diagnostic sera éliminé rapidement de l’organisme sans causer de toxicité ou qu’un composé thérapeutique restera suffisamment longtemps dans l’organisme pour exercer son action. Pour cela, nous avons d’abord vérifié sur culture cellulaire que les composés à étudier n’exercent pas de toxicité. Les composés à étudier ont, d’autre part, déjà été injectés à la souris sans causer d’effets secondaires. Nous allons ensuite procéder au radiomarquage de la molécule (ajout d’un isotope radioactif pour pouvoir la détecter : Indium111 ou lutétium 177) puis au contrôle in vitro sur culture cellulaire de la préservation de l’activité biologique de la molécule suite à ce marquage. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés pharmacocinétiques d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative est l’utilisation d’animaux. L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. L’industriel développant les composés à évaluer dans ce projet a pu remarquer lors de ses développements précédents que certains de ses composés pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris (notamment au niveau des organes excréteurs que sont le foie et les reins). Les métabolismes du rat et de la souris sont très différents, et cette différence de métabolisme induit des différences sur le comportement pharmacocinétique des médicaments. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat (d’autres travaux menés conjointement seront réalisés chez la souris porteuse de tumeur pour identifier des différences de comportement selon les espèces et permettre ainsi une meilleure prédiction du comportement des composés chez l’homme). L’objectif de notre projet vise donc à suivre jusque 5 composés par expérience, chez des rats sains, après administration par voie intraveineuse grâce à l’utilisation de l’imagerie et du comptage de la radioactivité.
Bénéfices attendus
Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de caractériser précisément et simultanément le comportement de 5 composés dans l’organisme afin d’orienter les développements ultérieurs vers le diagnostic ou la thérapie, et d’écarter des composés à risque pour la suite des développements (rétention trop importante dans un organe non ciblé).
Procédures
- Préhension et mise sous anesthésie (3 fois maximum : injection et 2 imageries – quelques secondes) - Injection intrraveineuse d'un agent d’imagerie sous anesthésie (1 fois, quelques minutes) - Imagerie (2 fois, 45 minutes maximum par imagerie)
Impact sur les animaux
La préhension pour induction de l’anesthésie pourrait causer un certain stress aux animaux. Les injections, imageries et euthanasies seront réalisées sous anesthésie par du personnel expérimenté et ne devraient pas provoquer de nuisances supplémentaires. Les composés à tester ont déjà été injectés à l’animal (à une dose supérieure à celle que nous utiliserons) et n’ont pas provoqué d’effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Le prélèvement des organes étant nécessaire pour réaliser des analyses complémentaires et affiner les résultats d’imagerie par comptage précis de la radioactivité, l’euthanasie des animaux est inévitable.
Remplacement
Les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum (n=3 par groupe et par temps). Le nombre d'animaux a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide d'une analyse statistique.
Raffinement
Les gestes de ce projet (injection, imagerie, euthanasie) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux seront observés quotidiennement et le suivi pondéral sera réalisé 2 fois par semaine. Aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de l’euthanasie.
Choix des espèces
L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. L’industriel développant les composés à évaluer dans ce projet a pu remarquer lors de ses développements précédents que certains de ses composés pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus le métabolisme du rat est différent de celui de la souris et plus proche de l'homme pour les molécules étudiées. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge), puisque les études prévues par la suite seront réalisées sur des animaux adultes présentant un cancer.
Développement du cancer colorectal chez le rat : analyse de la contribution du microbiote intestinal dans l’effet du régime alimentaire.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous-cutanée, un gavage de microbiote humain et une injection d'azoxyméthane, un composé cancérigène destiné à déclencher des lésions précoces du côlon, puis subissent trois prélèvements de fèces avant d'être tués pour analyse. Le porteur décrit ces gestes comme générant un stress et une douleur "minimes" et affirme que l'injection du cancérigène n'engendrera pas de douleur. Les retombées annoncées, une piste nutritionnelle contre le cancer colorectal moins coûteuse que le médicament, restent formulées comme une possibilité.
Objectifs
Le risque de cancer colorectal (CCR) est fortement affecté par l’alimentation, avec un risque augmenté par la consommation de viande rouge et un risque réduit par un régime pesco-végétarien (sans viande mais avec des oeufs et des produits laitiers en plus des végétaux, auquel on ajoute des produits de la mer comme les poissons, les crustacés et les mollusques). Le projet porte sur l’étude de la contribution du microbiote intestinal dans ces effets de l’alimentation sur le risque de CCR.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle du microbiote intestinal en lien avec le régime alimentaire dans le développement du cancer colorectal, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour favoriser un microbiote limitant le risque de cancer colorectal. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.
Procédures
- 1 implantation sous-cutanée d’une puce électronique destinée à identifier les rats de manière unique et pérenne (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes. - 1 gavage unique de microbiote humain dilué (1 ml) (rats vigiles, tous les rats), durée : 10 secondes - 1 injection intra péritonéale unique d’un composé cancérigène (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes - 3 prélèvements de fèces (2 semaines après l’inoculation, à 7 semaines, et à 14 semaines après l’inoculation). Pour cela, chaque rat est placé quelques minutes dans un grand pot en plastique transparent ; les rats émettent spontanément et rapidement les 1-2 crottes nécessaires (rats vigiles, tous les rats)
Impact sur les animaux
Le projet porte sur les liens entre alimentation, microbiote intestinal et cancer colorectal. Il est donc attendu que les rats présentent, suite à l’injection d’azoxyméthane, une augmentation des marqueurs de cancérogenèse au niveau du côlon. Toutefois, il s’agit d’une procédure établie pour étudier les stades précoces de la cancérogenèse (foyer de cryptes aberrantes, lésions prénéoplasiques…) qui n’engendreront pas de douleur. Les interventions sur les animaux seront d’une part l’inoculation des microbiotes par gavage et d’autre part l’injection intra-péritonéale d’une solution tamponnée d’azoxyméthane. Ces gestes sont assurés par des personnels expérimentés et généreront un stress et une douleur minimes. LLes prélèvements fécaux n’occasionneront que peu de stress ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques associés au développement du cancer colorectal.
Remplacement
A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote et de l’alimentation sur le cancer colorectal nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique suffisamment sophistiquée pour le remplacer.
Réduction
Nous utiliserons 10 rats par groupe. Notre expérience, et celle d’autres groupes de recherche, dans l’étude de l’effet du régime alimentaire et/ou du microbiote intestinal sur la cancérogenèse colique, indique qu’un effectif de 10 rats par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En particulier, les résultats obtenus lors d’un protocole similaire (mais avec transfert de microbiotes de rats) ont montré que ce nombre d’animaux permettait de mettre en évidence des effets du microbiote sur certains marqueurs de la cancérogenèse.
Raffinement
La solution du composé cancérigène est préparée de façon à ce qu’elle évite une douleur au point d’injection. Il n’y aura pas d’autres manipulations provoquant de la douleur pendant cette procédure, et l’étude est arrêtée au stade de lésions précancéreuses qui ne provoquent pas de douleur. Tous les rats auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l'ajout de feuilles de cellulose (pour faire le nid), d'un bâton de bois à ronger et des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper. Les rats seront 2 par cage pour éviter l'isolement et auront libre accès à la nourriture et à l'eau. Tous les rats recevront de l'eau stérilisée à l'autoclave et un régime alimentaire standard irradié.
Choix des espèces
Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est l’injection unique d’un composé cancérigène qui a l’avantage de provoquer des stades précoces du cancer colorectal comparable à la situation humaine. Nous utiliserons des rats adultes, âgés de 5 semaines au début de l’expérimentation, l’objectif étant d’étudier la relation alimentation-microbiote-cancer colorectal chez l’adulte.