Rats

442 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques puis gavés quotidiennement pendant cinq semaines, avec une quinzaine de prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. L'objectif est de tester deux plantes de la tradithérapie tunisienne comme antidiabétiques. Le porteur affirme que l'équilibre énergétique et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro et que le rongeur reste un "modèle de référence".

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) touche 90% des personnes diabétiques, principalement au-delà de 40 ans, souvent en surpoids ou obèse, qui ont un régime alimentaire déséquilibré (trop riche en gras et en sucres) et/ou dont l’activité physique est insuffisante. Cette maladie métabolique est caractérisée par un excès chronique de sucre dans le sang Parmi les nouveaux axes de recherche pour traiter le DT2, émergent des alternatives thérapeutiques, préventives et curatives. Parmi ces alternatives thérapeutiques, la tradithérapie offre un panel de substances naturelles méconnues dont les effets n’ont été que très peu caractérisés de façon préclinique et clinique, bien qu’elles soient, localement, couramment utilisées par l’Homme. Ainsi, deux plantes médicinales ont été identifiées comme ayant des caractéristiques phytochimiques intéressantes pour prévenir et traiter le DT2 (ces plantes sont nommées ici MA et AA pour des raisons confidentielles). Spécifiquement, le but du projet sera d’établir chez l’animal diabétique: 1) Si le traitement par MA ou AA présente un effet-dose sur l’amélioration de la glycémie et de comparer ce traitement chronique à des anti-diabétiques déjà sur le marché. 2) Si une unique dose de la plante est suffisante pour améliorer la tolérance au glucose 3) Si les fractionnements successifs des composés de la plante reproduisent les effets anti-diabétiques observés, en vue d’isoler le(s) principe(s) actif(s).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser un nouvel antidiabétique issu de plantes pris par voie orale et d’isoler le (les) principe(s) actif(s)

Procédures

Les animaux seront soumis au traitement antidiabétique par gavage : un par jour pendant 5 semaines, avec un volume de 250 µl/souris ou un volume de 1,5 ml chez le rat. des prélèvements de sang seront effectués : un par semaine afin d'évaluer l'effet du traitement, 5 les jours de test : soit 15 prélèvements au total pour 3 tests.

Impact sur les animaux

Les nuisances dues aux déifférents traitements seront : Au début du traitement par gavage : du stress, Une douleur locale et passagère lors de l'injection intrapéritonéale ainsi que lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car les tissus gluco-sensibles seront prélevés pour divers dosages

Remplacement

L’étude des variations de la glycémie, de l’insulinémie ne peut être réalisée que sur des animaux vivants, ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L’étape de caractérisation des effets sur la sécrétion d’insuline a déjà été faite sur des lignées de cellules pancréatiques mais les effets sur les autres organes insulino-sensibles sont indispensables à caractériser. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. L’étude du métabolisme implique plusieurs organes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ce projet sera réalisé chez la souris mais aussi chez le rat, qui constituent des modèles de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques.

Réduction

Nous utiliserons des tests statistiques permettant de détecter les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour calculer l’échantillon représentant la population, et suffisant pour détecter des différences. Chaque fois que ce nombre pourra être réduit, le nombre d’animaux utilisé sera diminué. Chaque fois que cela est possible, les mêmes animaux seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux : tous les tests métaboliques sont faits chez les mêmes animaux après un temps de repos et de récupération.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton pour les souris ou des bâtonnets de bois et rouleaux de carton pour les rats qui permettent l’expression de comportements innés. Ils seront répartis à quatre par cage pour les souris et à deux pour les rats. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences de manière à diminuer leur stress et inconfort au moment des expériences. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés quotidiennement de manière à s’assurer du bon état de santé des animaux. Douleur et/ou souffrance des animaux sont rendues tolérables lors des prélèvements de sang en effectuant une application d’anesthésique local avant une incision minimale puis désinfection à l’eau oxygénée qui a un fort pouvoir coagulant (en plus d’être un antiseptique). Un animal présentant une perte de poids (

Choix des espèces

Le rongeur est l’animal le plus fréquemment étudié dans les études métaboliques précliniques avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. Les animaux, rats et souris spontanément diabétiques et ceux au régime gras et sucré seront âgés de 14 semaines.

500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'établissement produisant des rats privés de thyroïde et de parathyroïdes pour d'autres laboratoires. Chaque rat subit l'ablation chirurgicale de ces glandes sous anesthésie, avec des risques de saignement, de mauvaise cicatrisation et de chute de calcémie pouvant provoquer une tétanie. Le résumé indique que la majorité des rats jugés aptes sont expédiés vivants vers des laboratoires clients, les autres étant tués. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'évaluer les réactions du "corps vivant entier" et ne fournit aucune justification statistique du nombre d'animaux.

Objectifs

Les rats font partie des animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent un modèle animal de choix dans les domaines tels que les maladies endocriniennes. Ce projet a pour but de fournir des rats sans thyroïde, ni parathyroïde, cela va agir sur le poid, la masse musculaire, la solidité des os, le cholestérole, la glycémie, la température corporelle, le rythme cardiaque, en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année : 100 rats par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu et une mauvaise cicatrisation. Et également les problématiques liées à l'absence de thyroïde et parathyroïdes (perte de poids, diminution du rythme cardiaque, risque d'une chute importante de la calcémie avec risque de tétanie...).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.Les animaux sont supplémentés en lactate de calcium 2% dans l’eau de boisson pendant au moins 5 jours préopératoires et au moins 10 postopératoires, pour pallier a l'hypocalcémie.

Choix des espèces

Les rats sont une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 5 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 10-15 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.

140 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La seule intervention sur l'animal vivant décrite est un frottis vaginal quotidien pendant deux semaines, les rattes étant ensuite tuées pour prélever l'hypophyse et étudier la régulation de la fertilité femelle. Le porteur affirme que ce geste, bien réalisé, "n'induit pas de nuisance au-delà de l'acte de contention". Il indique retenir la ratte pour la régularité de ses cycles et la richesse de la littérature, aucun modèle in vitro ne recomposant selon lui ce cycle biologique complexe.

Objectifs

Chez le mammifères dont l’espèce humaine, la fonction de reproduction est contrôlée par l'axe gonadotrope, constitué par l'hypothalamus, l'hypophyse et des gonades. Dans l'hypophyse, les cellules gonadotropes jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ces cellules intègrent différents signaux venus de l'organisme et secrètent en réponse deux hormones, la LH (hormone luteinisante) et la FSH (hormone folliculo stimulante) qui régulent les fonctions gonadiques et donc la fertilité. L'un des régulateurs majeurs de la fonction des cellules gonadotropes est le neuropeptide hypothalamique GnRH, mais il est maintenant bien décrit que les cellules gonadotropes sont sensibles à de très nombreux signaux comme les hormones sexuelles secrétées par les gonades, faisant de ces cellules de véritables plateformes d'intégration de signaux. De plus, le cocktail de stimulation que reçoit les cellules gonadotropes varie fortement au cours de la vie des mammifères, entraînant des modifications de secrétions des hormones gonadotropes. Cela permet la mise en place des étapes clefs de la vie reproductive comme la puberté ou le déroulement des cycles sexuelles chez les femelles. Cette stimulation complexe, associée à la complexité structurelle de l'hypophyse, composée de 6 types cellulaires endocrines chez les rongeurs, a cependant longtemps représenté un frein à l'étude des mécanismes moléculaires de l’intégration par les cellules gonadotropes. Etudier ces phénomenes complexes et dynamiques dans des modèles de cellules en culture est cependant difficile : Les modèles de cellule en culture, par nature réductionniste, peinent en effet à cette complexité physiologique, et les résultats obtenus à partir de ceux-ci traduisent donc mal les processus se déroulant dans l'animal vivant. L’avènement récent des techniques en cellules uniques représente une opportunité extra-ordinaire pour étudier les mécanismes régulant la fonction gonadotrope dans toutes leurs complexités physiologiques, dans l’animal vivant. Ces nouvelles techniques de pointe permettent, en effet, de dissequer les méchanismes moléculaires au sein même des tissus, dans toute leur complexité biologique. Ce projet permettera donc de comprendre comment les cellules gonadotropes régulent la fertilité alors que celle-ci décline dans l’espèce humaine et chez de nombreux animaux d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait, à cours terme, permettre de mieux comprendre comment les cellules gonadotropes intègrent une signalisation complexe et changeante afin de réaliser sa fonction de régulation hormonale de la fertilité femelle. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la fonction gonadotrope et donc dans la régulation de la fertilité chez les mammifères. A plus long terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier de nouvelles causes génétiques des infertilités humaines, un sujet de préoccupation émergent dans nos sociétés modernes.

Procédures

Le projet n'inclu qu'un seul type d'intervention sur l'animal vigil: La réalisation de frottis vaginaux quotidien pendant deux semaines. Chaque frottis est réalisé en moins d'une minute (environ 10 à 30 secondes)

Impact sur les animaux

Ce projet ne fait intervenir qu’une étape, hors mise à mort, pouvant induire un éventuel inconfort : la réalisation des frottis vaginaux. Ceux-ci seront cependant réalisés par un personnel compétent qui veillera à réduire l’inconfort des animaux. Ce geste, quand il est réalisé dans les règles de l’art, n’induit pas de nuisance au-delà de l’acte de contention.

Devenir

La finalité de l'expérience est de prélever l'hypophyse. Ceci ne peut être fait sur animal vivant. L'ensemble des animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prelevement de l'hypophyse.

Remplacement

Les modèles cellulaires in vitro ne peuvent se substituer aux modèles animaux dans ce projet car nous nous interessons à des phénomenes physiologiques qui se déroulent aux cours d'un cycle biologique complexe, impossible à recapituler fidelement in vitro. Le modèle rat est particulierement approprié car c'est le modele animal dans lequel les connaissances en physiologie de l'axe gonadotrope sont les plus pointues d'un part, et d'autre part, les rattes présentent des cycles oestriens extrêmement répétables et réguliers, en comparaison d'autres especes comme la souris. Ceci permet de selectionner des animaux de façon fiable et donc de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Comme indiqué si dessous, la robustesse des événements physiologiques programmant la fertilité femelle chez la ratte permet de limiter le nombre d'animaux necessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, les echantillons seront analysés par des methodes de pointe en cellule unique permettant l'acquisition d'une grand nombre de donnée sur le même echantillon. Cela permettra donc de réduire le nombre d'échantillon necessaire. Un projet pilote montre que trois hypophyses prélévées au même moment du cycle donnent une representation statistiquement fiable des evenements moléculaires qui se déroulent à ce moment précis. Des expériences de confirmation des résultats ainsi acquis seront cependant necessaire et necessiteront des animaux supplementaires. Notre recul expérimental nous permet de penser que, pour les verification de l'expression des genes et des proteines, 3 hypophyses par groupe de ratte seront suffisantes. Pour les expériences necessitants des cultures primaires de cellules hypophysaires, notre experience montre que les résultats sont fiables à partir de 10 rattes par culture primaire.

Raffinement

Le projet ne fait pas intervenir de pratique invasive générant des dommages sur animaux vivants. Les frottis vaginaux necessitant toutefois une contention, les animaux seront accoutumés quotidienement à la contention et par simulation d’un frottis pendant une semaine avant le début des vrais frottis. Conditions d'environement: Les rattes seront hébergées dans les conditions suivantes: deux femelles par cage, cage enrichie de materiel de nidification et de rongeage, nourriture et eau ad libitum, cycle jour nuit 12H-12H. Points limites: L'aspect global des animaux sera évalué quotidiennement (pelage propre, présence de blessure...). En cas de signe de déterioration de l'état de santé (perte de poinds, pélage sale, prostration), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Comme déja indiqué, le rat est une espèce de choix pour l'étude des processus de régulation neuro-hormonale de la fertilité femelle chez les mammifères de part : 1) la régularité des cycles sexuels et 2) par l'existence d'une bibliographie étendue sur le sujet. Nous utiliserons des rattes femelles adultes de 8 semaines puisque nous nous intéressons à la régulation du cycle estrien qui se met en place après la puberté (7-8 semaines chez le rat Wistar)

270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cytokines inflammatoires, dont jusqu'à six injections directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral, pour provoquer une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, puis subissent des tests comportementaux avant d'être tués. Le porteur reconnaît qu'il lui est "impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l'expérience", puisque c'est la douleur elle-même qui est étudiée. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo de l'intégration de la douleur.

Objectifs

La douleur est un processus physiologique nécessaire à la survie : elle prévient l’organisme d’un danger imminent et permet la mise en œuvre de réponses adaptées qui visent à en limiter les effets délétères. Cependant, lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui aparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Les traitements disponibles ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux traitements, et pour ce faire, de déchiffrer les mécanismes responsables de l’apparition de ces douleurs chroniques. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. En condition physiologique, les informations non douloureuses et douloureuses ne sont pas intégrées au même niveau du tronc cérébral, permettant ainsi de dissocier distinctement les deux modalités sensorielles (tact et douleur). Cependant, en condition pathologique, comme dans le cas de l’allodynie, le tact va être capable de devenir douloureux. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans l'apparition de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation de canaux astrocytaires, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Diverses études démontrent que certaines molécules libérées, dont les cytokines, sont capables d’activer les astrocytes. C'est pourquoi nous nous intéresserons à savoir quelle cytokine induit un dysfonctionnement et de déterminer si son blocage a des effets bénéfiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation d'un canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Injections intra-péritonéales : ces injections(

Impact sur les animaux

Injectant des cytokines pro-inflammatoires chez l’animal, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (lésion de notre région d’intérêt lors des injections intracisternales, problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections médullaire et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et immunohistochimiques seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g.Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à J+7 après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg). Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 5 et de 5 à 8 semaines (de 3 à 8 semaines), pour comparer avec les données du laboratoire.

213 rats immunodéficients vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée sous anesthésie, puis ils reçoivent pendant quatre semaines des injections d'un anticorps testé contre les lymphomes T, avec suivi de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut nécroser ou s'ulcérer et devenir douloureuse, l'animal étant tué si elle dépasse 10 % de sa masse corporelle. Il affirme avoir déjà validé l'anticorps in vitro mais juge "nécessaire" de le confirmer dans un environnement "plus physiologique" pour préparer un essai clinique.

Objectifs

Les lymphomes T périphériques appartiennent au groupe des lymphomes non hodgkiniens. Diiférents sous-types de lymphomes T existent mais ils se caractérisent tous par un pronostic sombre. Le pronostic des lymphomes T périphériques traités par polychimiothérapie conventionnelle reste médiocre. L’association Cyclophosphamide, Doxorubicine, Vincristine, Prednisone (CHOP) en reste l’un des traitements de référence mais le taux de lymphomes réfractaires primaires avoisine les 30%. Lors d’un contrôle de la maladie à 5 ans tout type confondu, ce taux n’est d’environ que 20% chez les patients. Il semble primordial de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques, qui pourraient être fondées sur l’administration de thérapies ciblées. Nous avons développé un nouvel anticorps polyclonal dirigé contre un large spectre de cibles antigéniques exprimées à la surface de différents sous-types de lymphomes T.

Bénéfices attendus

Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre anticorps polyclonal et ainsi d’offrir une vraie alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sous anesthésie également. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements avec les anticorps polyclonaux(2 fois par semaine pendant 4 semaines) ou une fois par intraveineuse pour l'admnistration de la chimiothérapie sous anesthésie. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par rat. Les injections intraveineuse ou intra-péritonéale seront également < à 5 min par rat. Les manipulations des rats pour les mesures des tumeurs avec le pied à coulisse se feront aussi sous anesthésie et n'excèderont pas 5 min. Elle seront couplées 2 fois par semaine à l'admnistration des traitements , de manière à ne pas multiplier les manipulations et anesthésies sur les rats

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur devient trop importante (pas plus de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles PTCL peuvent induire une augmentation de la taille de la rate, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des rats seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts (rates, ganlions) ainsi que des prélèvements sanguins pourront être récupérés pour compléter les analyses

Remplacement

L’efficacité de notre anticorps polyclonal a d’abord été validé in vitro par la reconnaissance de biopsies de patients puis la cytotoxicité tumorale a été confirmée par des expérimentations in vitro sur des lignées cellulaires. Cependant Il est nécessaire de confirmer cet effet dans un environnement plus physiologique. Cela nous permettra d’évaluer la biodistribution de notre produit dans les tissus et en intra tumoral, de déterminer la dose nécessaire et la fréquence d’administration chez l’homme dans un essai clinique basée sur les calculs de demi-vie et de pharmacocinétiques obtenus chez le rat.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 8-10 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d'animaux a été déterminé en utilisant un logiciel statitisque permettant de définir le nombre d'animal optimal permettant de répondre à la question biologique posée de manière statistique.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si il n'est pas possible de la supprimer par des traitements médicamenteux. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 3 pour limiter le stress de la surpopulation. Les animaux disposeront d'un igloo en PVC.

Choix des espèces

Le rat RRGS est un rat immunodéficient qui présente un complément actif, indispensable pour le mode d’action de notre anticorps. De plus, ce modèle a déjà été utilisé pour mettre en place des modèles de tumeurs humaines Animaux : 4-8 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge et le poids des rats est encore faible et permet donc de réduire la quantité d'anticorps polyclonaux qui seront admnistrés

320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.

Bénéfices attendus

L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.

Devenir

Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.

Raffinement

La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.

Choix des espèces

Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

2 400 animaux non-humains, 1 000 rats, 800 cochons d'Inde et 600 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur des animaux sains, on administre par de multiples voies des molécules de clients dont le porteur admet ignorer la nature et les effets, avant la mise à mort pour prélever des organes. L'objet est un service payant d'évaluation pharmacologique dépendant de la demande de partenaires commerciaux. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" faute d'alternative in vitro donnant les propriétés pharmacodynamiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets pharmacodynamiques ou les effets indésirables potentiels de nouvelles molécules. Le type d’étude ex vivo envisagé intervient précocement dans le développement préclinique de candidats médicaments. Réalisées en grande majorité sur des animaux sains, ces études permettent une première sélection de molécules d’intérêt sur un tissu cible avant leur évaluation dans des modèles physiopathologiques in vivo, plus consommateurs d’animaux. Ces études permettent la quantification des effets pharmacologiques ou indésirables de différentes molécules pour les comparer sur différents paramètres. Elles ne s’inscrivent pas dans l’établissement de données de sécurité (toxicologie) avec lesquelles elles ne sont pas redondantes. Les molécules testées par le biais de ce projet le sont majoritairement dans notre champ d’expertise que sont les pathologies de l’appareil génito-urinaire et de l’appareil digestif. Cependant, pour la nécessité de partenaires commerciaux, d’autres champs d’expertise peuvent être explorés occasionnellement.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement sur le marché pour soigner les maladies de l’appareil génito-urinaire ou digestif principalement.

Procédures

Les animaux seront principalement soumis à des administrations de composés (voies et fréquence dépendantes du protocole expérimental). Les voies per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intravésicale et intradermique seront utilisées. Les animaux seront donc peu manipulés.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Il sera attendu d’observer chez l’animal toutes nuisances dues à la manipulation, contention et administration de composés (stress possible, douleur possible de l’aiguille, gêne lors de la contention, réveil difficile suite à une anesthésie…).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car des prélèvements d’organes sont nécessaires.

Remplacement

Les expérimentations in vitro permettent de connaitre les propriétés physicochimiques de la substance étudiée mais en aucun cas ses propriétés pharmacodynamiques. Ainsi le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour une évaluation pharmacologique des effets indésirables ou pharmacodynamiques potentiels des candidats médicaments.

Réduction

Dans le cas d’études fonctionnelles ex vivo et selon la nature du tissu prélevé, plusieurs fragments d’un même tissu peuvent être analysés. Ainsi, selon l’organe cible prélevé, un animal peut fournir plusieurs fragments et limiter ainsi le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront manipulés par du personnel compétent limitant ainsi la douleur et le stress des animaux lors des administrations par exemple. Dans le cas d’études avec analyse statistique, du fait de notre expérience, le nombre de 10 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, principalement dû à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, igloo, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… Les animaux seront manipulés par du personnel compétent limitant ainsi la douleur et le stress des animaux lors des administrations par exemple. Toute procédure nécessitant une anesthésie sera réalisée avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté (accès plus facile à l’eau de boisson si nécessaire, réhydratation par administration de liquide physiologique en sous-cutanée, en gavage…) et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Il est admis qu'il existe des différences entre les espèces en ce qui concerne la sensibilité pharmacodynamique. Le choix de l’espèce sera donc fonction du mécanisme et/ou cible du candidat médicament. Il sera dépendant de la demande des clients. Nous utiliserons principalement des animaux adultes et matures (i.e. âgés d’au moins 6 semaines pour le rat et la souris et pesant au moins 250-300 g pour le cobaye). Très exceptionnellement des souris ou rats non matures (i.e. après sevrage et avant la puberté) pourront être utilisés. En effet, chez ces animaux l’axe hypothalamo-pituito- gonadique n’est pas encore fonctionnel donc les taux d’œstrogènes endogènes sont extrêmement faibles. Une autre méthode aurait été d’utiliser des femelles ovariectomisées mais il nous semble plus souhaitable d’éviter un traitement chirurgical à des animaux.