Rats

1 530 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 050 réutilisés ensuite dans d'autres projets et 480 tués pour prélèvement d'organes. Une partie subit la pose d'une mini-pompe ou d'un cathéter sous anesthésie, puis reçoit le produit à tester avant l'évaluation neurologique par le test d'Irwin, avec un isolement social pouvant durer jusqu'à trois semaines et une mise à jeun jusqu'à seize heures. L'objectif est d'évaluer les effets secondaires de candidats médicaments sur le système nerveux central avant leur passage chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante et que l'animal constitue un "passage obligatoire", le rat étant selon lui l'espèce la plus adaptée.

Objectifs

La développement de nouveaux médicaments s'accompagne d'une évaluation de leurs potentiels effets secondaires chez l'animal avant toute administration chez l'homme. Cette évaluation pré-clinique de la sécurité du candidat médicament au niveau du système nerveux central peut être effectuée par le test d'Irwin chez le rat. Le test consiste à effectuer une batterie d'observations fonctionnelles incluant des paramètres neurologiques après administration d'un candidat médicament afin d'évaluer les effets secondaires de ce dernier sur le système nerveux central du rat.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments avec peu d'effets secondaires pour le patient et de traiter diverses maladies dans de nombreuses indications thérapeutiques (par exemple, les cancers, les maladies du système nerveux central). Ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive.

Procédures

Avant de réaliser le test d'Irwin et afin de permettre une administration chronique ou sous perfusion sanguine du produit à tester, les animaux pourront être sujets à l'implantation d’une minipompe ou d'un cathéter veineux (environ 35 mins) ou également d'un cathéter artériel (35 mins) pour réaliser des prélèvements sanguins. Cela est fait sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique. Ils receveront également un suivi post-opératoire selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux peuvent également recevoir le produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes) à un volume respectant les recommandations éthiques. Les animaux seront ensuite évalués d'un point de vue neurologique par le test d'Irwin, un test durant 6 minutes et qui consiste en l'évaluation de différents paramètres à différents temps de mesure post-administration. Leur activité locomotrice pourra également être évaluée dans un actimètre (environ 60 minutes). Une observation peut être réalisée avant l'administration et la période d'observation post-administration sera de 24h à 72h. Celle-ci pourra être allongée en fonction de la durée de demi-vie du candidat-médicament. Des prélèvements de sang (environ 1 min) pourront également être effectués en cours d'étude en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis a une chirurgie réalisée sous anesthésie qui peut induire un stress à l'endormissement. Les cicatrices de la chirurgie peuvent indurie un inconfort. Les animaux peuvent également être mis en isolement social après la chirurgie et jusqu'à 3 semaines post-chirurgie ce qui peut induire du stress. Le test d'Irwin en lui-même ne provoque pas plus de nuisance pour l'animal qu'un éventuel stress lié à la préhension et au déplacement de ce dernier. L'administration de molécules dont les effets sont connus peuvent induire des effets secondaires modérés et limités par les doses utilisées dans cette procédure. Les animaux peuvent également être mis à jeun pour une période de 16h maximum avec complémentation en glucose ou non ce qui peut induire une sensation de faim chez l'animal.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux pourront être euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Un certain nombre d'animaux pourra également être réutilisé dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes comportementaux ou neurologiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de la toxicité et de la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé (n=10/groupe) afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central car il s'agit de l'espèce la plus pratique et la plus utilisée et donc charactérisée pour évaluer les effets de médicaments en développement sur le système nerveux central. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement afin de s'affranchir de divers effets liés au développement et à l'âge (par exemple les changements hormonaux).

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée des plaies dans le dos pour y implanter sous la peau quatre échantillons d'une matrice d'œsophage d'origine porcine, avant de les tuer à sept ou vingt-huit jours pour analyser la réaction des tissus. Le porteur décrit une chirurgie de quinze à vingt minutes avec traitement antidouleur et des démangeaisons possibles à la plaie. Il teste la tolérance d'un futur substitut d'œsophage et affirme que la réaction immunitaire ne s'apprécie que sur un être vivant.

Objectifs

Les chirurgies pour la reconstruction de l’œsophage suite à l’ablation de l’organe chez des patients atteints de pathologies ou victimes de traumatisme sont reconnues unanimement comme très insatisfaisantes par la communauté médicale. En effet, les complications post-opératoires sont nombreuses. C’est pourquoi, le développement d’une matrice biologique œsophagienne présente de nombreux avantages afin de répondre aux besoins cliniques actuels. La disponibilité des greffons œsophagiens humains étant limitée, le porcin est le modèle animal choisi afin de développer notre matrice. Avant son implantation chez l’homme, cette matrice biologique œsophagienne doit être testée pour vérifier sa capacité à s’intégrer sans être rejetée et sans dégrader son environnement. Ces données doivent être étayées par des données scientifiques qui ne peuvent pas être obtenues in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant. C’est pourquoi, il est nécessaire d’exposer la matrice à un mammifère vivant afin d’évaluer son acceptation dans un environnement physiologique. Il sera possible d’évaluer ces critères selon des méthodes ex-vivo en laboratoires, permettant d’étudier la structure des tissus d’un point de vue microscopique. L’objectif principal de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle une matrice œsophagienne décellularisée engendre une réaction inflammatoire compatible avec son environnement physiologique.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer que l’utilisation d’une matrice biologique en tant que substitut d’œsophage est acceptable en termes de tolérance en regard de la thérapie actuelle, lourde et source de complications post-opératoires, ayant pour conséquence une mauvaise qualité de vie pour les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure chirurgicale suivante : - création des plaies cutanées au niveau de la zone dorsale - implantation des matériaux en sous-cutané. Les animaux recevront un nombre de 4 échantillons, espacés de minimum 1 cm, selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. Cette norme spécifie les méthodes d'essai pour l'évaluation des effets locaux après une implantation de biomatériaux destinés à être utilisés dans des dispositifs médicaux - fermeture des plaies. Le temps de chirurgie est estimé à 15-20mn par animal. A cela, ajouter le temps d’anesthésie et de réveil de l’animal (ce temps est variable selon les individus). Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique, la buprénorphine durant les 48 heures après l’opération. Le groupe 1 sera euthanasié après 7 jours d’implantation, et le groupe 2 sera euthanasié après 28 jours.

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique la réalisation de la plaie , la pose de la matrice dans la poche, refermée avec une suture. La réaction à la chirurgie pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux sont réveillés et suivis cliniquement. Les animaux sont euthanasiés à 7 jours (Groupe 1) et 28 jours (Groupe 2) pour explanter la peau en vue des analyses de la réaction inflammatoire et de la cicatrisation.

Remplacement

Des tests in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant, ont été réalisés préalablement sur les matrices biologiques d’origine porcine, selon la norme ISO 10993-5 concernant l’évaluation biologique des dispositifs médicaux. Néanmoins, en raison des interactions complexes entre l'hôte et la matrice, ces systèmes ne peuvent pas reproduire de façon fidèle les conditions d’intégration ou de rejet de la matrice. La confirmation de la bonne intégration de la matrice étant indispensable avant son implantation chez l’homme, il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux pour évaluer la réaction immunitaire qui ne peut être appréciée que sur l’être vivant, disposant d’un système immunitaire compétent Cette évaluation est faite sur des échantillons biologiques extraits de l’animal, après sa mise à mort.

Réduction

Cette étude comportera 12 rats (dont 2 en cas de mort prématurée lors du déroulé de l’étude) répartis en 2 groupes, G1 (7 jours d’implantation) et G2 (28 jours d’implantation). Chaque rat recevra 4 échantillons, ce qui fera n=12 échantillons/temps pour chaque condition selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. En effet, la norme précise l’utilisation d’au moins trois animaux pour chaque matrice et suffisamment de sites pour obtenir un total de 10 échantillons d'essai et de 10 échantillons de contrôle pour chaque matrice et chaque période d'implantation. Le nombre de rats fixé comprend des animaux supplémentaires dans le but de conserver un nombre d’animaux et d’échantillons suffisant à l’issue du protocole, dans le cas d’éventuelles complications. Cela permettra à l'étude de s'aligner sur l'approche 3R (replace, reduce, refine) de l'expérimentation animale, réduisant ainsi le nombre d'animaux et le nombre de procédures d'expérimentation animale, en tenant compte de la recommandation ISO 10993-6.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Tous les individus seront acclimatés à leur environnement 7 jours avant l’intervention. Cela permet de réduire le stress des animaux le jour de l’implantation. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de la qualité de l’environnement de l’animal, pas de diminution de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. - L’hébergement est réalisé en cages ventilées. Ces cages sont stérilisées. L’environnement de l’animal est adapté. S’il y a nécessité d’isoler les animaux, ce que nous éviterons au maximum, l’environnement des animaux sera enrichi (maison). - Pendant l'opération, les cages seront amenées les unes après les autres dans la salle de chirurgie qui est séparée de la zone d'hébergement des animaux afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. - Des protocoles précis de prémédications permettant la diminution de la douleur, l’anesthésie de l’animal et de sa mise à mort sont mis en place. Un traitement anti-douleur avant, pendant et après l’opération est mise en place à l’aide d’une injection de buprénorphine sous la peau de l’animal. - Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique en sous cutané, durant les 48 heures après l’opération.

Choix des espèces

Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais permet d’évaluer la capacité de l’étude à être transposable à une implantation chez l’homme car elle est réalisée chez le mammifère. L’utilisation du rat permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique ainsi que la réponse biologique. Les réactions immunitaires et inflammatoires du rat sont similaires et transposables à l’homme. Ces données sont validées dans la littérature faisant du rat l’espèce de choix pour cette étude. Les rats seront âgés de 10 semaines et pèseront environ 250gr. Tous les rats auront le même âge pour une meilleure comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille des rats. Des rats âgés de 10 semaines sont choisis afin qu'ils aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques à la suite de l’anesthésie et pour faciliter l'intervention chirurgicale. De plus, le stade de développement devra permettre une cicatrisation optimale grâce à la qualité des tissus.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont immobilisés par contention lors de neuf séances de deux heures pour provoquer un stress censé reproduire le syndrome du côlon irritable, avec deux prises de sang, avant d'être tués pour analyse des tissus. Le porteur attend un transit accéléré, des selles molles et une inflammation intestinale légère. Il cherche à valider ce modèle pour évaluer ensuite des compléments alimentaires à base d'extraits végétaux et de probiotiques destinés aux patients.

Objectifs

Le syndrome de l'intestin irritable (IBS) est une maladie complexe qui affecte le système nerveux et le microbiote intestinal. Ses mécanismes ne sont pas encore complètement compris. Les patients souffrent de douleurs abdominales et de troubles digestifs tels que la diarrhée et/ou la constipation, souvent associés à des problèmes psychologiques tels que l'anxiété et la dépression. Le stress et certains aliments peuvent déclencher l'IBS, c'est pourquoi les premières recommandations médicales pour le traitement incluent une gestion améliorée du stress, de l'exercice physique et des changements alimentaires. Dans cette perspective, l'utilisation de compléments alimentaires contenant des extraits végétaux et des probiotiques peut aider à maintenir une santé intestinale équilibrée et prévenir les symptômes de l'IBS chez les patients. Pour tester l'efficacité de ces produits, il est nécessaire d'utiliser des modèles animaux, tels que le rat. Cependant, il n'existe pas actuellement de modèle animal reconnu par la communauté scientifique comme référence pour évaluer le syndrome du côlon irritable, et les modèles utilisés dans la littérature sont très variés. L'objectif de ce projet est de développer et de valider un modèle de syndrome du côlon irritable chez le rat en induisant un stress modéré par une restriction physique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier et à valider un modèle de syndrome du côlon irritable chez le rat, afin d'évaluer l'efficacité des produits de santé destinés aux patients. Si les résultats démontrent l'efficacité de l'une ou plusieurs des combinaisons d'extraits végétaux et de probiotiques, des études précliniques (chez l’animal) pourront être suivies par des études cliniques (chez l’homme), offrant ainsi aux patients des solutions complémentaires pour lutter contre l'IBS. Ce projet revêt donc une importance pour répondre aux besoins non satisfaits des patients souffrant du syndrome du côlon irritable et améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Restriction physique : 9 sessions 2h maximum Contention pour évaluation de la composition corporelle par EchoMRI : 2 sessions de 30 secondes (début et fin d'étude). Prélèvement de sang à la pointe de la queue (200µl) : un prélèvement en début et un en fin d'étude

Impact sur les animaux

Les animaux devraient ressentir un stress modéré se traduisant par une accélération du transit intestinal, des fécès molles ainsi qu’une inflammation intestinale légère visible en histologie. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu avec ce modèle. Les points limites établis dans la procédure n’ont aucune raison d’être atteints.

Devenir

A la fin la procédure les animaux seront mis à mort et différents tissus seront prélevés pour permettre de compléteter les analyses et d’identifier des macanismes d’action.

Remplacement

L'inflammation chronique de l'intestin est une maladie complexe et multifactorielle qui reste encore largement mal comprise. Les modèles murins sont utilisés pour étudier cette maladie car ils permettent de comprendre son contexte global à l'échelle de l'organisme, ce qui n'est pas possible avec d'autres modèles in vitro ou ex vivo

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.

Raffinement

Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation avant de commencer l’étude, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.

Choix des espèces

Le rat wistar est classiquement utilisé dans la litérature pour la mise en place de ce modèle IBS. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (8 semaines). C’est un âge classiquement utilisé dans nos différents projets et sur lesquels nous avons des points de comparaisons.

1 080 rongeurs, 864 souris et 216 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète de type 1 est induit par injection de streptozocine, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments, parfois par pompe osmotique implantée, et subissent des tests de glycémie avec prises de sang répétées. Le porteur indique que les administrations et la contention peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces molécules comme sélectionnées après des tests in vitro et destinées à d'éventuels essais cliniques, et prévoit la mort de tous les animaux en fin de procédure.

Objectifs

Le glucose est décrit comme étant le principal carburant de l’organisme, et son taux plasmatique est régulé par l’insuline, une hormone secrétée par les cellules bêta du pancréas. Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose, appelé aussi hyperglycémie, dans le sang. On distingue principalement 2 types de diabète : le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). Le DT1 est due à la détérioration des cellules bêta du pancréas entraînant une carence en insuline, tandis que le DT 2 est causé par une baisse de la production d’insuline ou l’apparition d’une résistance à l’insuline produite. Le DT 1 est une maladie auto-immune, en effet, il fait suite au dysfonctionnement des cellules immunitaires (lymphocytes T), qui se mettent à identifier les cellules bêta du pancréas comme des cellules étrangères et à les éliminer. Le DT1 représente environ 10 pour cent des cas de diabètes, dont la moitié se déclare avant l’âge de 20 ans. Il a une incidence d’environ 15 cas pour 100 000 enfants de moins de 15 ans. L’insulinothérapie est le traitement de référence du DT1, qui consiste à des injections sous-cutanées d’insuline plusieurs fois par jour. Un traitement bien suivi permet le plus souvent de réguler la glycémie, néanmoins, c’est un traitement lourd et chronique, nécessitant en même temps une mesure de la glycémie par le patient plusieurs fois par jour. A noter que c’est un traitement qui permet une prise en charge, et non une guérison, et donc à prendre à vie. Par ailleurs, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter au rythme de 3 à 4 % par an. Ainsi, la recherche continue, soit à décrypter les mécanismes de la maladie pour mieux la prévenir, soit en améliorant les traitements. Ce projet a donc pour objectif de tester des nouveaux candidats médicaments pour le traitement du DT1 chez le rat ou chez la souris.

Bénéfices attendus

Depuis une vingtaine d’année, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter tous les ans, tandis que le traitement de référence reste l’insulinothérapie, un traitement lourd et à vie. Ce projet vise à rechercher et sélectionner les candidats médicaments efficaces pour traiter le DT1 chez l’animal, afin d’obtenir une preuve d’efficacité pour d’éventuels essais cliniques chez l’homme par la suite.

Procédures

Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à tester, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. Tout type d’administration sur animal vigil, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute. L’administration à l’aide d’une pompe osmotique dure moins d’un quart d’heure. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour, pendant 1 à 48 semaines). - Une administration intrapéritonéale de streptozocine si le modèle animal requiert l’induction du diabète de type 1. Ce traitement durera 5 jours au maximum avec une administration par jour, réalisé par des personnels tutorés, et dure moins d’une minute. - Un test de supplémentation au glucose ou en insuline (comme réalisé chez l’homme). Ce test consiste à une administration de glucose ou d’insuline, puis à des prélèvements sanguins permettant le dosage de glucose et ou d’insuline dans le sang. Le test est réalisé une seule fois pour chaque animal, et les prélèvements sont réalisés au maximum 5 fois chez la souris et 7 fois chez le rat, dans les 2 heures qui suivent la supplémentation. Chaque prélèvement sanguin par des personnels tutorés dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, et l’implantation de pompe osmotique si besoin - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.

Devenir

Tous les animaux vont avoir un diabète de type 1 et ou vont recevoir un traitement contre cette maladie. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Les composés testés dans ce projet sont ceux ayant montré au préalable des effets positifs dans des tests in vitro (screening).

Réduction

Tout d’abord, seuls les composés ayant montré des effets positifs lors des sélections in vitro seront étudiés dans ce projet, limitant le nombre d’animaux à utiliser. Ensuite, selon la littérature et notre expérience, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Et en prenant en compte les exclusions ou pertes potentielles tout au long de l’étude (environ 20 pour cent), 12 animaux par groupe seront étudiés. En considérant que pour l’étude d’un composé pharmacologique, 6 groupes seront nécessaires, et que l’analyse des résultats sera réalisée en 4 mois, 3 sélections sont prévues par an sur 5 ans. Ainsi, le nombre estimé d’animaux est de : 6 groupes d'animaux x 12 animaux par groupe x 3 sélections par an x 5 ans. Soit un total de 1080 animaux, rats et souris confondus. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les animaux sont hébergés à au moins 2 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Une anesthésie, anesthésie et un traitement antibiotique prophylactique sont réalisées si la procédure d’implantation de pompes osmotiques est réalisée.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du diabète. Les rats et les souris sont bien décrites sur le plan physiologique et comportemental, et pour lesquels il existe de nombreux modèles répondants à l’approche thérapeutique envisagé (diabète de type 1). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. L’étude du diabète nécessite l’apparition des caractéristiques qui sont stables et établies au-delà du stade juvénile.

4 000 rongeurs, 2 000 souris et 2 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la tête reproduisant un accident vasculaire cérébral, occlusion d'une artère, ischémie-reperfusion ou hémorragie, suivie d'une IRM, de tests comportementaux puis d'une ouverture terminale du thorax pour prélever le cerveau. Ces interventions ne visent pas à produire des connaissances mais à entraîner des chirurgiens aux gestes des modèles d'AVC. Le porteur affirme que les techniques d'apprentissage de substitution ne permettent pas d'acquérir ces gestes et attend de cette formation une meilleure reproductibilité réduisant le nombre d'animaux des projets futurs.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Cette stratégie d'apprentissage a pour but d'améliorer les résultats des projets précliniques sur les AVC. Le nombre d'animaux utilisés dans les projets scientifiques ultérieurs sera réduit du fait de la meilleure reproductibilité des gestes des expérimentateurs. La prise en charge des animaux sera également améliorée (soins pré, per et post-opératoire), ce qui participera à l'amélioration du bien-être des animaux.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin que le personnel puisse s’entraîner sur les différents modèles. Le modèle d’ischémie par injection de murine alpha-thrombine ou par application de FeCl3, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) durera 1.5 heure. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire. Une moyenne de 20 minutes est à prévoir pour l’entraînement à cette pose. Le modèle d’ischémie-reperfusion durera 1 heure. 1 heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire le monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 30 minutes. Les deux modèles d’hémorragie dureront 1 heure. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore, 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 20 minutes minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entraînement. Le stress de l'experimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal dans sa cage) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance strict pallient également aux nuisances attendus sur les animaux.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques d'apprentissage de chirurgies actuelles de substitution ne permettent pas d'acquérir les gestes techniques. Nous avons sélectionné les modèles expérimentaux les plus utilisés dans la thématique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend ces espèces (souris et rat) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure a été calculé par l'expérience de plus de vingt ans de formation aux gestes chirurgicaux des personnels dans l'établissement. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 50 animaux par modèle pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les animaux seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose et bûchettes de bois pour les rats), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, limitant ainsi le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, la concentration d’isoflurane et le débit de N2O sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé à 1 L/min pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 1 heure avant d’être remis en cage par 5 pour les souris, par 2 pour les rats. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Le rat (Rattus norvegicus) reprend les caractéristiques de la pertinence de l'utilisation de la souris citées ci-dessus. Sa morphologie suscite son intérêt pour l'imagerie grâce à plus grande taille et à sa palette comportementale plus grande que la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS, de 25g pour les C57BL6J et d’environ 300g pour les Wistar ou Sprague-Dawley âgés de 8 semaines. Nous effectuerons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de ce projet avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

4 576 rongeurs, 2 288 souris et 2 288 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour induire une infertilité, une partie des animaux subit une hyperthermie du scrotum par immersion de l'arrière-train dans une eau à 43 °C pendant vingt minutes, jusqu'à quinze fois, sous anesthésies répétées, tandis que d'autres reçoivent de l'acyline, puis tous des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur reconnaît tester des molécules de clients dont il ignore la nature et les effets secondaires, et signale des bagarres entre mâles pouvant les blesser. Il conclut que ces modèles d'infertilité rendent le recours à l'animal "incontournable", aucune méthode in vitro ne reproduisant la production de sperme et son contrôle hormonal.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles d’infertilité masculine chez le rongeur. L’infertilité masculine joue un rôle très important dans le couple infertile, car environ 30% des problèmes liés à la grossesse correspondent à un facteur masculin. La plupart du temps, l'homme infertile présente une faible qualité séminale, ce qui signifie que son sperme n'a pas la capacité suffisante pour féconder l'ovule. L’azoospermie, caractérisée par une absence totale de spermatozoïdes dans l’éjaculat ou l’oligospermie, caractérisée, quant à elle, par une concentration en spermatozoïdes insuffisante dans le sperme conduisent à une infertilité masculine. Pour mimer une infertilité masculine en jouant sur la spermatogénèse, le modèle d’hyperthermie scrotale est décrit dans la littérature chez la souris. Ce modèle consiste à tremper dans le l’eau chaude la partie basse de l’animal (pattes arrières, queue, scrotum) pour créer une hyperthermie scrotale et ainsi altérer la spermatogénèse. Une administration hormonale sera réalisée afin de réverser l’infertilité et induire une réactivation de la spermatogénèse. L'hypogonadisme, autre pathologie provoquant une infertilité masculine, est défini par une synthèse insuffisante des hormones sexuelles (d'origine testiculaire telle que la testostérone). Pour mimer cette pathologie, l’administration d’acyline est décrite dans la littérature chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’infertilité.

Procédures

Les animaux du modèle hyperthermie seront anesthésiés et la partie basse de leur corps (pattes arrière, queue et scrotum) sera trempée dans le l’eau chaude à 43°C pendant 20 min, et ce plusieurs fois par semaine (15 fois au maximum en tout). Ils recevront également des traitements de candidats médicaments et d’hormones pour restimuler la spermatogénèse (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Les animaux du modèle acyline recevront uniquement des traitements de candidats médicaments et d’hormones (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Tous ces animaux pourront également avoir des prélèvements sanguins (en terminal ou prélèvements intermédiaires). De plus, des animaux utilisés uniquement pour des études de pharmacocinétique recevront des administrations de candidats médicament, d’hormones et auront des prélèvements sanguins à des temps précis dépendants du protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possible, il nous ait, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux liées à ces produits. Toutefois, des manipulations, administrations répétées sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille), un hématome possible selon la voie d’administration. De plus, les animaux vont subir plusieurs anesthésies répétitives pour le modèle d’hyperthermie scrotale (procédure 1) et être en partie immergés dans de l’eau à 43°C. Toutes ces séries successives peuvent provoquer un stress à l’animal, une nuisance physiologique respiratoire ou cardiaque dues aux successions d’anesthésies. De ce fait, une attention particulière des animaux sera observée lors des sessions d’hyperthermie scrotale et pendant les phases d’endormissement et de réveil. Les animaux étant des mâles, des bagarres peuvent facilement intervenir selon la hiérarchie dans les cages, pouvant stresser, voire blesser certains d’entre eux. Les plaies possibles seront désinfectées avec de la vétédine et les animaux seront séparés si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’infertilité masculine. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer la fertilité masculine (production de sperme, viabilité des spermatozoïdes) en tenant compte des différents organes intervenants et des différentes hormones pouvant intervenir sur les différents paramètres observés, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle d’infertilité par hyperthermie scrotale se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. D’après notre expérience sur les modèles in vivo, un nombre minimum de 8 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement différents. Un premier test sur quelques animaux (8 maximum) pourra être réalisé comme « étude pilote » afin d’évaluer la faisabilité technique du modèle (surtout pour l’hyperthermie scrotale et le prélèvement de sperme). De plus, ce premier test pourrait être fait sur des animaux issus d’autres projets et non euthanasiés à la fin, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Après chaque anesthésie, une attention particulière sera apportée lors du réveil de l’animal. Un contrôle de la température de l’eau (utilisation de matériel type bain-marie thermostaté) sera effectué lors de chaque expérimentation. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris ou du rat dans les modèles d’infertilité sont très bien décrits dans la littérature. Chaque modèle peut être extrapolé aux deux espèces. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.