Rats

8 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Achetés déjà cathétérisés, ils reçoivent l'Enniatine B, une mycotoxine des céréales, par voies orale et intraveineuse, avec des prélèvements sanguins répétés et un séjour en cage à métabolisme, pour valider un modèle mathématique censé remplacer ensuite l'expérimentation. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour reproduire la cinétique plasmatique, qu'il juge "indispensable" à la validation du modèle. La mise à mort est justifiée par le fait que leur cathétérisation les rend inutilisables ensuite.

Objectifs

Les Enniatines sont des mycotoxines produites par des souches de champignons Fusarium et appartiennent à la classe la plus courante de contaminants des céréales. L’Enniatine B est la molécule la plus prévalent parmi les 28 homologues identifiés dans cette famille de molécules et par conséquent nos concitoyens peuvent être exposés à de faible doses de manière chronique dans leur alimentation quotidienne. Malgré le nombre considérable de propriétés pharmacologiques et toxicologiques et la prévalence de cette mycotoxine dans les aliments à base de céréales il est éthiquement impossible d’étudier in vivo sa toxicologie et donc sa toxicocinétique (et notamment son devenir plasmatique) chez l’humain. Ainsi ce projet de recherche se propose d’utiliser des méthodes alternatives permettant de pallier ce manque de données toxicocinétiques chez l’humain. Ces alternatives reposent sur 3 étapes: a) la génération in vitro (à partir d’essais de laboratoires sur cellules) de données essentiellement de métabolisme qui constituent l’élément principal des différences inter-espèces dans la pharmacocinétique de la molécule étudiée puis b) par l’extrapolation vitro/vivo permettant de prendre en compte le changement d’échelle de la cellule à l’organe et enfin c) par une autre modélisation mathématique dite « pharmacocinétique basée sur la physiologie » permettant d’intégrer ces données cellulaires et tissulaires au fonctionnement de l’organisme (animal ou humain) entier. Les essais in vitro ont déjà été réalisés en incubant l’Enniatine B avec des cultures primaires d’hépatocytes humains et de rats. Il s’agit désormais de valider les extrapolations des cellules a l'organisme faites pour le rat en générant des données in vivo du devenir plasmatique et en les intégrant au modèle mathématique. Le rat a donc été choisi car la comparaison avec l’humain aura été préalablement réalisée à partir d’expérimentations in vitro réalisées sur des hépatocytes primaires de ces deux espèces.

Bénéfices attendus

D’une manière globale, ce projet vise à déterminer les paramètres métaboliques quantitatifs de l’enniatine B: clairances in vivo et in vitro. Ces nouvelles données permettront de développer un modèle mathématique humain de l’enniatine B basé sur l’extrapolation de l’in vitro vers l’in vivo et permettront d’estimer les concentrations plasmatiques en enniatine B en fonction des scénarios d’exposition. Parallèlement, nous déterminerons les réponses moléculaires induites par l’enniatine B après exposition aigüe et répétée sur des hépatocytes primaires de rat et d’humain. Ces réponses permettront de définir les concentrations effectrices de toxicité. Ces concentrations effectrices pourront être comparés aux concentrations plasmatiques déduites du modèle mathématique et ainsi déterminer un risque de toxicité de l’enniatine B pour l’Homme.

Procédures

Le design de prélèvements se fera en deux séquences. Lors de la première séquence 4 rats seront choisis aléatoirement et recevront l’administration par voie iv (en moins de 10 secondes) et seront placés en cage à métabolisme afin de recueillir l’ensemble de leurs urines (recueil continu de l'ensemble des urines grâce à la cage à métabolisme). Deux rats se verront prélevés 0,1ml de sang 0min, 10min, 20min, 45min, 2h et 6h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 5, 15min, 30min, 1h, 4h et 8h après l’administration. Lors de cette même séquence les quatre autres rats recevront l’administration par voie orale (en moins de 10 secondes). Deux rats se verront prélevés 0,1mL de sang 0h, 1h, 4h, 7h, 9h et 11h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 1/4h, 2h, 6h, 8h, 10h et 12h après l’administration. L’ensemble des prélèvements de sang pour chaque rat sur cette première séquence est de 0,6 mL soit si l’on approxime le volume total individuel de sang à 30 mL, un prélèvement de 2% de ce total. Entre chaque administration, un temps suffisant pour permettre l’élimination de la molécule et la reconstitution d’une partie du sang des rats, sera respecté. Ce temps de récupération sera de 1 jour. Lors de la seconde séquence, le principe des séquences veut que les 4 premiers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie orale et à l’inverse les 4 derniers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie iv. Les prélèvements de sang réalisés sur chaque individu ont été limités à 6 prélèvements de chacun 100 μl par rat et par séquence. Ce qui fait pour chaque rat un prélèvement total de 4% du volume de sang individuel.

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, les rats seront achetés cathétérisés au fournisseur. A l’aide du cathéter, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (1 gavage par animal) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus d’une à deux minutes. De plus l’inconfort due au maintien en cage à métabolisme nécessaire au recueil de l’ensemble des urines, sera réduit à son strict minimum vis-à-vis de toute la durée d’hébergement (qui lui se fera en cage individuel), c’est-à-dire la phase de prélèvement de 8 heures après l’administration par voie intraveineuse (sur 4 rats lors de la première séquence et sur les 4 autres rats lors de la seconde séquence).

Devenir

Chaque rat sera mis à mort à l’issue de la seconde séquence de prélèvement de la procédure dans des conditions éthiques, étant donné qu'ils ne seront ni réutilisés, ni replacés ni adoptés du fait de leur cathétérisation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique et urinaire (avec la variabilité interindividuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, indispensable à la validation des modèles mathématiques (qui une fois validés permettent de remplacer des expérimentations animales par simulation d’autres scénarii d’exposition).

Réduction

Dans un effort de réduction, le nombre d’animaux est calculé de manière à obtenir la quantité de prélèvements sanguins suffisante. Nous utiliserons 8 rats au total. La subdivision des groupes de 4 rats en deux sous-groupes permet de couvrir l’ensemble des échéances de cinétique et leur exploitation par une approche de population garantie ainsi une estimation de la variabilité interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques de la population et de chaque individu. En outre, le design en séquences permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un temps de récupération.

Raffinement

Concernant le raffinement, des points limites ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux. La douleur, le stress ou les contraintes seront atténués par des méthodes ou médications appropriées. Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Les prises de sang répétées seront effectuées par le cathéter permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avant fermeture avec un désinfectant à base de Chlorhexidine et une surveillance sera effectuée afin de détecter d’éventuels signes d’infection au niveau de cette ouverture sensible sur le système veineux. La procédure expérimentale est conçue pour limiter autant que possible la souffrance animale, en minimisant les interventions sur les animaux au strict nécessaire. Les animaux seront hébergés sur litières dans des boites en polypropylène, en respectant les normes (dimensions notamment) du bien-être animal et avec, à disposition, des enrichissements appropriés (hamac, igloo, jouets tels que des balles...). Les rats seront seuls par cage afin de limiter les risques d'arrachement du cathéter. L’hébergement en cage à métabolisme plus stressant pour l’animal mais nécessaire à un recueil rigoureux de l’ensemble des urines, sera limité à une période de 8 h par animal.

Choix des espèces

Sur la base de connaissances acquises sur l’Enniatine-B lors d’étude in vitro à partir de matériel biologique relevant des rats Sprague-Dawley, il convient de générer des données in vivo chez cette espèce afin de pouvoir les comparer aux données in vitro pour valider cette extrapolation et pouvoir la poursuivre avec le modèle mathématique. Les rats utilisés seront des rats Sprague-Dawley males d’environ 200-250 g (6-8 semaines). Ce stade a été choisi pour limiter la quantité d’Enniatine-B nécessaire tout en maximisant la possibilité d’obtenir des échantillons sériés de plasma. L’étendue indiquée ici dans leur stade de développement est due aux éventuelles contraintes du fournisseur en charge de la pose chirurgicale de cathéter.

400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre proposée à l'adoption. Ils sont placés en cage individuelle pendant 48 heures pour recueillir urines et fèces, subissent des prélèvements sanguins à la queue et une injection d'un traceur avant la mise à mort, pour mesurer la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à la demande de la FAO. Le porteur indique que l'isolement en cage peut provoquer un stress car les rats vivent habituellement en groupe. Sur le remplacement, il affirme que les données in vitro ne sont pas comparables et que le recours à l'animal reste "nécessaire" pour obtenir des données fiables.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à destination de l’alimentation humaine. Il répond notamment à une demande de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) de produire une base de données sur la digestibilité et la qualité de l’ensemble des sources protéiques. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Bénéfices attendus

De très nombreuses études montrent que le niveau de consommation des protéines animales des pays les plus riches ne pourra pas se généraliser à l’échelle planétaire en l’état actuel des ressources. Dans ce contexte, le maintien de la part des protéines dans l’alimentation nécessite de développer de nouveaux régimes et pratiques alimentaires qui viseront à augmenter la part relative des produits végétaux et inclure de nouvelles sources de protéines plus durables. L’évaluation de la qualité des protéines durables issues de ressources alternatives est une étape essentielle lors du développement d’ingrédients protéiques à haute valeur ajoutée. Ce projet permettra d’obtenir ces données. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Procédures

Afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés durant une durée limitée (48h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Lors de la procédure 3, Des prélèvements sanguins de 0,5mL de sang sont collectés à la veine de la queue des rats vigiles. Trois prélèvements sont réalisés par animal (avant, 1h après et 3h après l’ingestion du repas contenant la protéine à tester). Du matériel spécifique est utilisé pour limiter le temps et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. Un anesthésique local est également appliqué sur la queue avant la prise de sang afin de minimiser la douleur. Des pesées quotidiennes sont réalisées pour lesquelles les rats sont emmaillotés dans une lingette afin de les habituer à être emmailloté. Ce même emmaillotage est également réalisé lors de la prise de sang pour contenir le rat. 30 minutes avant la mise à mort des animaux, l’injection d’un marqueur permettant d’évaluer la formation des protéines dans différents organes et tissus est réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

La qualité nutritionnelle des protéines est évaluée en déterminant la consommation alimentaire individuelle des rats et en collectant les urines et fèces ponctuellement. Ceci permet de calculer plusieurs indices de qualité connus pour être transposables à l’homme. Il est donc nécessaire de les héberger en cage individuelles. Le placement en cage individuelle peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Selon les critères de qualité des protéines évalués, la mise à mort des animaux n’est pas nécessaire. Ainsi, les animaux pourront soit être placés pour l’adoption, soit être mis à mort à la fin de l’étude en fonction des critères de qualité à mesurer.

Remplacement

Un protocole de digestion des protéines in vitro a été harmonisé via un réseau international ces dernières années. Cependant les données obtenues in vitro ne sont pas complétement comparables avec les données obtenues chez l’animal. Le recours à des modèles animaux est donc aujourd’hui encore nécessaire pour obtenir des données fiables de digestibilité des acides aminés et donc des données sur la qualité des sources protéiques. Aussi, il n’y a pas de modèle n’utilisant pas d’animaux actuellement sur les effets des sources de protéines sur les concentrations d’acides aminés dans le sang ainsi que sur la formation de protéines dans les différents organes.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 8 rats/groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Afin de limiter le nombre d’animaux, les rats pourront être ré-utilisés pour évaluer un ou plusieurs critères de qualité des protéines. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même lot), deux fois par semaine durant 2 heures dans des espaces spécialement conçus, appelés parcs. Les parcs sont des espaces de 1 m² environ, avec des tunnels suspendus, des zones où se cacher et des zones à escalader. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Lors des prises de sang, un anesthésique local est appliqué sur la queue. L’animal est également habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors des injections du traceur permettant la mesure de la formation des protéines, les rats sont anesthésiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

LLe régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) recommande l’utilisation de l’être humain, ou des modèles animaux que sont le porc et le rat pour l’évaluation de la qualité des protéines. Le critère de qualité des protéines se basant sur la capacité de la protéine à soutenir la croissance se mesure chez de très jeunes rats mâles et femelles, après le sevrage (3 semaines, ~50 g) . Le critère de qualité des protéines évaluant l’utilisation et la digestibilité de la protéine en collectant les fèces et les urines se mesure chez de jeunes rats mâles et femelles encore en phase de croissance (8 semaines, ~250 g). Le critère de qualité des protéines évaluant la digestibilité des acides aminés au niveau de l’intestin se mesure chez des rats mâles et femelles encore en phase de croissance (10 semaines, ~300 g).

2 000 souris, 1 500 rats et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé à tester puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures et des séjours en cage à métabolisme en isolement, certains portant un dispositif chirurgical pour recueillir la bile, pour mesurer le devenir de molécules candidates. Le porteur reconnaît un stress lié à la contention et à l'isolement ainsi que des douleurs et des lésions internes possibles aux sites de prélèvement. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion d'un produit dans l'organisme entier, ce qui rendrait le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essai seront testés (classe thérapeutique anti inflammatoire, anti cancéreux, antibiotique, neurologie principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront pas la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de PK simple: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/serum principalement. Il peut s'agir de conduire des études PK/PD: suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/serum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments test en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments test peuvent être suivis dans les urines, fécès, bile ...

Bénéfices attendus

L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essai sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humain ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK, études PK/PD, études ADME) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés pour pouvoir déterminer les relations dose/effet.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'intervention - Premièrement l'administration de l'élément test. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal -Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats et les cobayes, 9 prélèvements maximum sur 24h, volume prélevé environ 60 μL Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h , volume prélevé environ 30 μL. La durée d'un prélèvement est inférieur à la minute. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme pour des recueils d'excrétas si demandés. La durée de l'hébergement dans ces cages à métabolisme sera réduite au maximum. Jusqu'à 7 jours maximum pour le recueil d'urine ou de fecès et jusqu'a 72h maximum pour le recueil de bile. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Impact sur les animaux

Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, mais il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Lors des recueils de bile, de fécès ou d'urine, les animaux seront hébergés en cage à métabolisme. Cela signifie un hébergement individuel. Cela peut également occasionner du stress pour l'animal. Si l'animal a subit une chirurgie pour un recueil de bile, ou une administration duodénale cela necessite que l'animal porte un dispositif particulier qui peut influer sur sa liberté de mouvements. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté pour éviter au maximum toutes ces nuisances

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux ni d'évaluer les effets d'une molécule sur un ou plusieurs paramètres pharmacodynamiques au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 1500 rats, 2000 souris, 100 cobayes sur 5 ans. Ce sont des chiffres approximatifs pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple en utilisant la technique du micro sampling ( prélèvement de 30 µL de sang par animal) ou en utilisant des animaux cathétérisés cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de pK pourront être réalisés sur le même animal.

Raffinement

Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Animaux hébergés en groupe autant que possible avec présence d'enrichissement au maximum au niveau des hébergements ( présence de buchettes, cachettes, tunnels ...) Les animaux seront observés quotidiennement pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvement au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites seront alterner autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques. Le cobaye est minoritairement utilisé mais peut permettre d'identifier des métabolites absents chez les deux précédentes espèces, par exemple. Nouveau nés, jeunes, adultes. Le stade de développement sera justifié pour chaque étude. Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.

12 750 animaux non-humains, soit 5 100 souris, 5 100 rats et 2 550 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'œil leur est provoquée par injection oculaire ou systémique, suivie d'examens ophtalmologiques parfois sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur attend des modèles servant à évaluer de futurs traitements et décrit une inflammation, un gonflement au point d'injection et de possibles diarrhées. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".

Objectifs

Les uvéites sont des inflammations, réactions de défense de l'organisme à une agression, de la partie de l'oeil appelée uvée qui est composée de plusieurs structures internes de l’oeil. Elles entrainent une rougeur de l'oeil, altèrent la vision, occasionnant des troubles ou l'apparition de taches, et peuvent conduire à la cécité en l'absence de soins. Dans les pays occidentaux, elles seraient à l’origine de 5 à 20% des cas de cécité. Les causes des uvéites sont variées: d’origine infectieuse, associées à une autre pathologie ou auto-immunes. L’objectif du projet est la mise en place de modèles expérimentaux d'uvéite chez le rongeur et le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux pour diminuer les symptômes. Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif, nous devrons avoir recours à des animaux pour établir notre modèle. Les informations bibliographiques recueillies, les analyses statistiques ainsi que notre expérience, nous permettrons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les signes et les origines des uvéites est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Selon la procédure, l'induction de la pathologie peut se faire soit par une injection directement au niveau de l'oeil soit par une injection systémique, intraveineuse pour le lapin, sous cutanée pour le rat, sous-cutanée ou intrapéritoneale pour la souris. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations par une lampe à fente d'phtalmologie). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur des recommandations et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont une inflammation de tissus de l'oeil, conjonctive, iris, humeur aqueuse, rétine, vitré et photophobie. De même un gonflement au niveau du site d'injection de l'inducteur est attendu (patte, dos, et base de la queue). Des diarrhées peuvent se produire, les animaux seront pesés juste avant l’induction le lendemain et chaque semaine qu’à la fin de la procédure.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Des évaluations non invasives des structures internes de l'oeil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum pour les rongeurs, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie légère pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8-12 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.

1 155 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés et leurs mères allaitantes sont exposés pendant 14 jours à des concentrations variables d'oxygène pour reproduire la rétinopathie du prématuré, puis les ratons sont anesthésiés pour un examen de la rétine avant d'être tués pour prélever leurs yeux. Le porteur indique que les mères sont elles aussi mises à mort et signale des lésions cérébrales possibles sans surmortalité observée. Sur le remplacement, il affirme que la complexité de la rétine rend les études in vitro insuffisantes et l'animal "nécessaire".

Objectifs

La rétinopathie du prématuré est une des principales causes de cécité infantile. Son incidence est en augmentation en lien avec des changements de pratiques récents visant à administrer l’oxygène à une saturation plus élevée afin de favoriser la survie des grands prématurés. Cependant, l’excès d'oxygène est délétère pour la rétine immature du prématuré et un des principaux facteurs de risques pour le développement de la rétinopathie du prématuré. L’excès d’oxygène induit un stress oxydant qui conduit à un arrêt du développement de vaisseaux et à la mort de neurones de la rétine. De plus, plusieurs facteurs non associés à l’excès d’oxygène favorisent le développement de la maladie par l'intermédiaire d'un stress oxydant. Cependant, le lien entre certains de ces facteurs et la rétinopathie du prématuré n’a pas été clairement établi. Les traitements actuels de la rétinopathie du prématuré reposent sur des interventions invasives et/ou destructrices pour les tissus rétiniens intervenant de façon tardive dans le développement de la maladie et se limitent à diminuer le risque de cécité par décollement de rétine. Il n’existe aucun traitement pharmacologique préventif à l’heure actuelle. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle d'un ion métallique dans la physiopathologie de la rétinopathie du prématuré et l’effet bénéfique des molécules fixatrices de cet ion dans la prévention de la rétinopathie du prématuré et/ou dans la sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont importants pour plusieurs raisons. La rétinopathie du prématuré est l'une des principales causes de déficience visuelle dans la population pédiatrique. Sa prise en charge vise à lutter contre les complications tardives de la maladie, mais il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique préventif. Ce projet ouvrira des perspectives pour des études translationnelles visant à lutter contre le handicap visuel lié à la ROP. Nous espérons montrer 1) un lien entre une concentration élevée d'un ion métallique et la survenue et/ou la sévérité d’une rétinopathie du prématuré en utilisant un modèle animal répandu et connu pour mimer la pathologie du nouveau-né prématuré 2) un effet bénéfique des molécules fixatrices de cet ion dans la prévention de la rétinopathie du prématuré et/ou dans la sévérité de la maladie. • Les avantages à court terme comprennent une meilleure compréhension de la rétinopathie du prématuré ainsi que la détermination des cibles thérapeutiques potentielles dans cette maladie • Les bénéfices à moyen terme comprennent la traduction clinique des cibles thérapeutiques potentielles dans la rétinopathie du prématuré, ainsi que le développement de collaborations internationales dans le domaine. • Les avantages à long terme comprennent la réduction du handicap visuel lié à la rétinopathie du prématuré et les coûts économiques qui en découlent. Le coût estimé aux États-Unis pour un enfant déficient visuel suite à une rétinopathie du prématuré est d'environ 1 260 000 $ incluant les coûts directs et indirects (perte de productivité à l'âge adulte et perte de productivité parentale).

Procédures

Les expériences seront menées chez des ratons nouveau-nés, dont le développement rétinien postnatal est superposable à celui d’un bébé prématuré, grâce à un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène qui mime la rétinopathie de l’enfant prématuré. Des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante seront soumis à des concentrations oscillantes d’oxygène, pendant 14 jours, avant de les ramener à l'air ambiant. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale une seule fois pour des examens de la rétine et de la fonction visuelle pendant 20 minutes, puisimmédiatement après ils seront euthanasiés pour l’analyse ex vivo des tissus rétiniens. Afin d'analyser les différentes phases physiopathologiques de la maladie trois temps seront étudiés: à 14 jours (1er phase), à 18 jours (2ème phase) et à 28 jours (phase de régression) après la naissance. L’administration des traitements étudiés sera faite par voie orale (gavage, 3-5 minutes), en injection intrapéritonéal (1-3 secondes) ou en injection périoculaire (1-3 secondes). En cas d'inefficacité de la voie péri-oculaire, des injections intraoculaires seront effectuées sous anesthésie générale (1-3 secondes), dans ce cas les animaux aurons 2 anesthésies générales. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vivants. Aucune procédure chirurgicale n'est prévue.

Impact sur les animaux

Le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène, consiste à exposer des rongeurs nouveau-nés et leur mère allaitante à des concentrations variables d'oxygène pendant 14 jours. Le retentissement sur l’état général des animaux est habituellement faible. Le modèle néonatal de supplémentation ionique n’a pas de retentissement sur l’état général des animaux. Il a été observé des lésions cérébrales mais ces lésions n’ont pas été associées à une incidence augmenté de mort, convulsions ou apnées. Les nuisances associées aux explorations in vivo et aux traitements administrés sont liées à la nécessité d’effectuer une anesthésie générale (douleur légère de courte durée due à a réalisation d’une injection intra-péritonéale). L’injection intraoculaire d’un agent thérapeutique est utilisé en pratique clinique courant chez les nouveau-née prématurés. Les effets indésirables sont rares : infection, cataracte, hémorragies.

Devenir

Les analyses seront effectuées sur les rétines ce qui nécessite de prélever les yeux en post-mortem. Cela implique que tous les animaux devront être euthanasiés par une méthode réglementaire afin d'effectuer ces prélèvements tissulaires. Les mères seront euthanasiées par une méthode réglementaire.

Remplacement

La rétine est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires qui fonctionnent en réseau, et interagissent en permanence avec les autres tissus oculaires et la circulation (vaisseaux rétiniens et choroïdiens). Des études in vivo dans des modèles animaux mimant la rétinopathie du prématuré humaine sont nécessaires afin d’établir une preuve de concept thérapeutique, car les études in vitro ne permettent pas de prendre en compte la multiplicité de ces interactions, ni la physiopathologie complexe de cette maladie. Le recours à l'expérimentation animale pour la recherche de traitements efficaces est justifié par les conséquences visuelles graves de la rétinopathie du prématuré. Nous avons prévu des analyses immunohistochimiques des rétines des fœtus humains après interruption de grossesse et chez des enfants prématurés afin de vérifier que nos observations chez l’animal sont concordantes avec les données chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux impliqués est de 989 ratons et 166 mères, soit un total de 1155 animaux. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum, sans toutefois grever la possibilité d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Nous avons ainsi calculé un minimum de n=5/ groupe pour des analyses comparatives. Pour minimiser le nombre d'animaux, les deux yeux d'un même animal seront utilisés pour les expériences ex vivo, ce qui divise par 2 le nombre d’animaux nécessaires. Afin d'éviter les doublons un seul œil/animal sera analysé par chaque technique en en immunohistochimie et en biologie moléculaire. Aussi, nous avons choisi de réaliser des coupes rétiniennes (à la place des montages à plat) permettant l'utilisation de plus d'anticorps par rétine pour explorer plusieurs marqueurs tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Le même groupe d’animaux témoins sera utilisé pour l’analyse de l’efficacité des différentes posologies ou voies d’administration des molécules chélatrices.

Raffinement

Les femelles gestantes seront reçues à l’animalerie au moins 8 jours avant la date présumée de mise bas pour leur permettre de s’acclimater, et hébergées en conditions stables et adaptées à l'espèce, en stabulation conventionnelle, avec un régime alimentaire spécial femelles gestantes/allaitantes. Les cages seront enrichies de nids végétaux. Afin de limiter stress, angoisse et douleur, les nouveau-nés seront manipulés lentement et doucement sous lampe chauffante. Les injections intrapéritonéale d’anesthésiantes seront effectuées en les contenant doucement dans la paume de la main. Ces anesthésies générales seront effectués lors des explorations in vivo et en cas d’effectuer des injections intraoculaires. Une anesthésie locale sera également effectuée en cas d’injection intraoculaire. Le comportement des ratons et de leur mère sera observé tous les jours. Dans le cas où les traitements ou explorations effectués seraient à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit/absence de réplétion gastrique, perte de poids, changement d’aspect physique, hypothermie, isolement) le traitement sera interrompu et le raton sera euthanasié.

Choix des espèces

Le développement rétinien de rongeurs à la naissance correspond à celui d’un enfant prématuré né vers 6 mois 1/2 de grossesse : la rétine est largement avasculaire et très susceptible à la rétinopathie du prématuré. Chez les rongeurs, l'angiogenèse rétinienne commence peu après la naissance, les capillaires superficiels atteignent les bords de la rétine 9 jours après, et la vascularisation rétinienne est terminée à 15 jours. Les différentes caractéristiques de la rétinopathie du prématuré peuvent être reproduites en exposant des rats ou des souriceaux nouveau-nés à une hyperoxie. Les rats et les souris sont donc particulièrement adaptés pour étudier l'angiogenèse rétinienne dans des conditions tant normales que pathologiques; la très grande majorité des modèles animaux de rétinopathie du prématuré utilisent ces espèces. Nous avons préféré d’utiliser les rats aux souris car grâce à la taille des yeux plus importante les injections des molécules est plus facilement effectué avec moins de complications pour l’animal. Les expériences utiliseront de ratons nouveau-nés de J1 à J28 postnatal. La fenêtre pour étudier le développement rétinien, dont l’angiogenèse rétinienne normale et pathologique, est courte chez le rongeur et correspond à la période post-natale immédiate. De plus, le stade de développement rétinien des rongeurs à la naissance correspond à celui d’un prématuré né à environ 6 mois 1⁄2 de grossesse. Il est possible de reproduire chez les rongeurs nouveau-nés des lésions de rétinopathie semblables à celles observées dans la rétinopathie du prématuré par hyperoxie.

281 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction d'une artère au moyen d'un filament inséré au cou, retiré une heure plus tard, suivi d'un traitement puis de tests comportementaux avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire, et héberge les rats isolément pour éviter l'arrachage des sutures. Il présente le rat comme un "modèle préférentiel" pour l'AVC et affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients est réalisée par l’injection de tPA. Toutefois, seule une faible proportion des patients peut être traitée du fait des effets secondaires de l’injection de tPA. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l’AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans une artère pour l'obstruer et induire l'accident vascualire cérébral. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. Une heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre à nouveau une circulation sanguine. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. Le traitement sera administré 10 minutes après le rétablissement de la circulation sanguine. A J+1 un prélèvement sanguin sera réalisé. A J-1 et J+2, ces mêmes animaux suivront une série de test comportementaux. Un total de 20 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’utilisation d’une analgésie lors de la chirurgie va permettre de limiter au maximum la souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des animaux, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voire au moins un de ses congénères et également par l’utilisation d’enrichissements. Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après la chirurgie. Pour pallier à ces problèmes, les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel améliore la prise en charge des rats après la chrirugie, et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement après la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin du protocole expérimental.

Remplacement

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux au cours de l'AVC chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos traitements. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 18 rats par groupe + 60% liée à la variabilité du modèle. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec plusieurs enrichissements, auront un accès non restreint à de la nourriture et à de l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie, anesthésie générale, maintient de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale) ainsi qu’après. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Les animaux resteront en cage individuelle pendant le restant de la durée du projet. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les fonctions motrices peuvent être altérées durant les premières heures après la chirurgie. Pour pallier à ces problèmes, les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, nous constatons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l'AVC sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC chez l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par l'AVC. Les animaux utilisés seront âgés de 7-8 semaines soit un poids d’environ 250-300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.