Rats

338 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de quatre heures, une privation de sommeil de dix-huit heures et une épreuve d'endurance respiratoire sous contention, pour étudier le lien entre manque de sommeil et fatigue des muscles respiratoires. Le porteur relie ce travail au sevrage de la ventilation en réanimation, une retombée située dans le futur. Il affirme qu'aucune méthode substitutive comme la culture cellulaire ne peut remplacer l'étude du comportement veille-sommeil chez l'animal.

Objectifs

L’un des enjeux majeurs pour les patients en service de réanimation est le sevrage de l’aide artificielle à la respiration (ventilation mécanique). En effet, les patients en échec de sevrage chez qui il est nécessaire de maintenir la ventilation mécanique ont plus de risques de décéder au cours de leur hospitalisation en réanimation. L’endurance des muscles respiratoires joue un rôle essentiel lors du sevrage de la ventilation mécanique, puisqu’elle doit être suffisante pour permettre une respiration spontanée non assistée. Il a été proposé que le manque de sommeil puisse diminuer cette endurance inspiratoire, les patients en réanimation ayant un sommeil diminué et fragmenté. Des études ont effectivement montré chez l’être humain une diminution de l’endurance inspiratoire après une privation d’une nuit de sommeil. Une étude précédemment menée au laboratoire a démontré qu’il existe un lien entre la privation de sommeil et l’endurance inspiratoire chez le rat. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre les mécanismes cérébraux à l'origine de la fatigue des muscles respiratoires suite à une privation de sommeil et 2) de tenter de limiter la fatigue musculaire en administrant des médicaments qui sont connus pour avoir un effet "éveillant"

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre une meilleure compréhension du fonctionnement du lien entre endurance inspiratoire et sommeil. Le projet devrait aussi permettre dans le futur de proposer de nouveaux médicaments pour faciliter le sevrage à la ventilation assistée pour les patients en réanimation. D'un point de plus large, ce projet ouvre la voie à des pistes thérapeutiques pour soulager les patients atteints de maladies respiratoires chroniques très souvent associées à des troubles du sommeil.

Procédures

chirurgie (4h), injection intrapéritonéale de molécules (moins de 1 min), enregistrement de l'activité de l'animal +/- privation de sommeil (18h), épreuve d'endurance respritoire (1h)

Impact sur les animaux

Stress lié à l'isolement des animaux en post chirurgie, à la privation de sommeil et à la contention lors de l'épreuve d'endurance respiratoire

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leur cerveau pour les analyses post-mortem.

Remplacement

Ces approches nécessitant des expériences comportementales avec interaction entre différents organes (système respiratoire et système nerveux) et ce en fonction de deux états très différents de l’organisme (la veille et le sommeil), il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes substitutives à l’expérimentation animale telles que la culture cellulaire ou les analyses informatiques.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Un calcul de puissance statistique a été utilisé pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Pour satisfaire à ces critères, ceci implique d'utiliser des groupes expérimentaux composés de 13 rats. De plus, le nombre d'animaux contrôles sera réduit en utilisant un même lot contrôle pour plusieurs molécules médicaments ayant le même solvant, il a été possible de réduire le nombre d’animaux pour ces groupes contrôles. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en termes de "mal être" animal. L’évaluation et la prise en charge de la douleur, la souffrance et l’angoisse seront effectuées lors du suivi quotidien des animaux. Des critères de points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal…). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée 2 fois par semaine, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les animaux sont hébergés en groupe de deux avec accès à la nourriture et à l’eau à volonté et à un enrichissement (bâton de peuplier et baguette de papier compressé) pour assouvir leur besoin naturel de ronger. Le stress lié à la nouveauté sera diminué par l’habituation de l’animal aux différents appareils (non fonctionnels). Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude combinée du sommeil et de la fonction respiratoire. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison d’une variabilité inter-individuelle faible et des données déjà disponibles. Âge adulte (8 semaines à 12 semaines) pour s’approcher au mieux des données de la littérature et des résultats obtenus par le laboratoire

646 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention forcée de deux heures, une chirurgie d'implantation d'une fibre optique dans le cerveau, des enregistrements électrophysiologiques de trois heures et, pour les femelles, des frottis vaginaux répétés, afin d'observer l'activité de circuits neuronaux après un stress aigu. Les retombées annoncées pour les troubles psychiatriques humains restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que ce type d'étude ne peut être mené que sur un animal vivant et conclut qu'il n'est pas envisageable de recourir à des méthodes de substitution à l'"animal entier".

Objectifs

Ce projet a comme but principal de mettre en évidence, après un stress, des changements de l’activité des neurones dans un réseau de structures cérébrales qui participe au fonctionnement de la perception corporelle, émotionnelle et motivationnelle. En particulier, nous étudierons les altérations, induites par un stress, de l’activité des neurones dans le cortex insulaire (ou insula), une structure cérébrale impliquée dans la perception des changements corporels et une de ses cibles, le noyau accumbens, qui joue un rôle important dans l’intégration des informations émotionnelles et motivationnelles. Il est connu que l’insula et le noyau accumbens sont dérégulés dans de nombreuses maladies psychiatriques liées au stress comme l’anxiété et la dépression. Le stress est un facteur de risque important pour le développement de troubles psychiatriques. Afin de développer de nouveaux traitements pour ces troubles liés au stress, il est nécessaire de comprendre les adaptations des neurones induites par un stress. De plus, les hommes et les femmes ont tendance à réagir différemment au stress, à la fois psychologiquement et biologiquement, et des différences entre les sexes sont observées dans de nombreux troubles psychiatriques. C’est pourquoi l’étude chez des rats mâles et femelles est nécessaire à ce projet. Dans ce projet, nous étudierons l’impact d’un stress aigu sur les structures cérébrales d’intérêt immédiatement et un jour après un stress par contention. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’exposition à un stress et pourra avoir un impact sur la prise en charge des maladies psychiatriques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont premièrement une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’exposition à un stress aigu. En effet, le stress étant un facteur important dans le développement de maladies psychiatriques, il est important de comprendre ces mécanismes de dérégulation suite à un stress afin de pouvoir agir sur le développement de ces pathologies. Ce projet nous permettra de mettre en avant des différences inter-sexe, avec un aspect temporel et potentiellement un retour à la normal de l’activité plastique de cette voie 24h après le stress.

Procédures

323 animaux, seront soumis au stress par contention, 1 fois pendant 2 heures. Toutes les femelles (323 animaux) seront soumises à un frottis vaginal avant le début des enregistrements électrophysiologiques (1 seul frottis, 304 femelles) ou après chaque enregistrements en photométrie par fibre optique (3 frottis vaginaux, 19 femelles) (2 secondes par acte). Tous les rats de l’approche éléctrophysiologique (608 animaux) seront enregistrés électrophysiologiquement (3h). Tous les rats de l’approche de photométrie par fibre optique (38 animaux) subiront une chirurgie pour l’injection d’un vecteur viral non pathogène et l’implantation à demeure d’une fibre optique (2h), puis 5 sessions d’apprentissage d’auto-administration d’eau sucrée et enfin 3 sessions de test d’auto-administration d’eau sucrée en enregistrement en photométrie par fibre optique. (1 heure pour chaque session d’auto-administration).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - stress par contention : peut entrainer une augmentation du rythme respiratoire, attendue dans les premières minutes du test. - frottis vaginal chez les femelles en conditions vigiles : gêne occasionnée. - Casque en ciment dentaire maintenant la fibre optique : gêne occasionnée. - isolement des animaux afin que les animaux ne détériorent pas le système de fixation de la fibre optique. - légère restriction de l’accès à l’eau sera effectuée pour les animaux qui seront enregistré en photométrie chez qui les biberons d’eau seront retirés 3h avant leurs sessions d’auto-administration d’eau sucrée et replacés par la suite.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des enregistrements seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires, histologiques et/ou d’expression de protéines.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, Nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans les émotions et les troubles associés à l’exposition à un stress. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques qui permettent de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous estimons un ajout de 2 animaux par lot dus à la complexité du geste chirurgical et aux possibles mauvais placements des électrodes d’enregistrement et/ou de stimulation. Ainsi 19 animaux par lots, seront nécessaires à notre étude. 34 lots seront nécessaires pour le projet, soit 646 animaux maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi de points limites et des critères d’intervention et d’arrêt ; l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick en papier) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux auront une période d’habituation à l’animalerie de 5 jours minimum avant toutes manipulations, ils seront d’abord hébergés à deux par cage puis ils seront hébergés individuellement pour éviter l’amplification du stress (304 rats, pendant 24h) et la détérioration du système de fibre optique (38 rats, pendant 5 semaines maximum). Les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux auront une période d’habituation aux cages d’auto-administration lors des sessions d’auto-administration d’eau sucrée pendant 5 jours avant les tests enregistrés en photométrie par fibre optique.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Dans cette étude, nous utiliserons des rats adultes de 8 semaines ce qui est en conformité avec la majorité des expériences de comportement animal et la littérature, et ce qui limite les risques de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

639 rats bruns et rats noirs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une infection intranasale par le SARS-CoV-2 sous anesthésie, jusqu'à sept lavages nasaux, des prises de sang répétées et un gavage oral, pour évaluer si ces rongeurs peuvent constituer un réservoir sauvage du virus. Le porteur indique que l'infection respiratoire peut provoquer une baisse d'appétit et une perte de poids, les difficultés respiratoires ou une perte de poids au-delà de 20 % déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude du potentiel de réservoir ne peut être menée que par des expériences in vivo.

Objectifs

Dès le début de la pandémie de COVID-19, la question de la contamination des animaux proches de l'homme a été posée. Plusieurs études expérimentales ont été menées pour déterminer le spectre d'hôtes du SRAS-CoV-2 apparu à Wuhan, en Chine. Il a été démontré que la sous-famille des Murinae, qui comprend les rats et les souris, n'était pas réceptive (la réceptivité étant la capacité de réplication virale) à l'infection par le SRAS-CoV-2, probablement en raison de différences essentielles au niveau du récepteur utilisé par le virus pour infecter son hôte. L'émergence de nouveaux variants du SARS-CoV-2, en particulier les variants préoccupants B.1.351 et P.1, qui peuvent infecter expérimentalement de jeunes souris, a modifié cette situation, d'où la nécessité de surveiller le risque que les rongeurs sauvages deviennent des réservoirs du virus, à partir desquels il pourrait évoluer et se propager à l'homme. Les rats, en particulier Rattus norvegicus sont devenus des habitants importants de nos villes, tandis que Rattus rattus est plus fréquent dans les zones agricoles et portuaires. Dans les villes où les égouts ne sont pas bétonnés, les estimations sont de 1,5 à 1,7 rats par habitant avec des pullulations reconnues dans les grandes villes comme Paris et Marseille, ou lors de conditions particulières comme les grèves des éboueurs. La proximité de ces espèces sauvages avec les humains ainsi que la possibilité de détecter du matériel génétique du SRAS-CoV-2 dans les effluents incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec des implications dramatiques pour les risques de propagation et les efforts d'éradication putatifs et une mauvaise interprétation des concentrations virales dans les eaux usées si le virus est également excrété par les rongeurs vivant dans les égouts. L'objectif de ce projet est d'étudier le risque d'émergence de réservoirs de rongeurs par une approche d’essai de réceptivité et de transmission.

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale couplée à une recherche du virus chez les rats piégés dans de grandes métropoles françaises permettra de répondre à la question de la possibilité de constitution d’un réservoir sauvage d’un des variants du SARS-CoV-2. L’approche expérimentale pemet de savoir si les animaux sont récéptifs et capables de se transmettre l’infection soit de façon directe (par projection d'aérosol entre individus), soit de façon indirecte par voie orale (par le biais des matières fécales). Les études sur le terrain permettront de voir si les rongeurs sont effectivement exposés car il reste toujours une incertitude sur le caractère infectieux du virus retrouvé dans les effluents.

Procédures

1/Lavage nasal sous anesthésie gazeuze (entre 1 à 7 fois selon les procédures et les groups de rats, à raison d'une durée de 30 secondes). 2/Infection intranasale sous anesthésie gazeuse (environ 15 secondes) .3/ Prise de sang à la veine caudale (durée 1 à 2 minutes) sous anesthésie gazeuse (5 répétitions à 3/4 jours d'intervalle sur un seul groupe de 6 rats) 4/ Prise de sang intracardiaque terminale (durée d'une minute environ) sous anesthésie (induction à l’isoflurane et injection intrapéritonéale de kétamine et de Xylazine) + analgésique. 5/ gavage oral sous anesthésie gazeuse (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L’infection chez les rongeurs peut provoquer une baisse d’appétit et une perte de poids. Le contrôle visuel sera quotidien et le contrôle du poids effectué tous les 2 jours pour ne pas perturber les rats (Rattus rattus particulièrement). Tout signe inhabituel (tel qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. L’infection étant respiratoire, un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires, d'une toux très importante ou d'une perte de poids au delà des 20%, entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les lavages nasaux seront effectués sous anesthésie gazeuse (isoflurane)

Devenir

mise à mort de tous les rats afin d'effectuer des prélèvements (organes et sang)

Remplacement

L'étude du potentiel de constitution d’un réservoir de SARS-CoV-2 sur une espèce sauvage ne peut être réalisée que par des expériences in-vivo. Des études in silico et in vitro d’inoculation de cellules de rats ont déjà montré une possible réplication du virus en fonction du variant.

Réduction

La construction du projet en procédures successives dont la mise en œuvre ne se fait que si la précédente est efficace permet de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation de lot de 5 à 6 animaux permet en minimisant leur nombre d’appliquer des tests statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront observés et approvisionnés en nourriture fraîche quotidiennement. Ces rongeurs seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette particulièrement les rats noirs et les rats bruns), et de bâtonnets de bois à ronger. Tout signe inhabituel (telle qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. Un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires (dyspnée, tirage costal, toux très importante, perte de poids au delà des 20%) entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les seuls prélèvements sont des lavages nasaux qui seront effectués sous anaesthésie gazeuses à l’isoflurane. La mise à mort des rongeurs sera effectuée suite à une anesthésie (induction à l’isoflurane puis injection intrapéritonéale de kétamine à 150mg/kg et de Xylazine à 10 mg/kg associée à une prise de sang terminale intra-cardiaque et une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Rattus norvegicus et rattus rattus sont les 2 espèces de rats vivant dans les égouts ou espaces anthropisés suceptibles d’être exposés par les effluents contaminés ou proximité d’avec l’homme. Les rattus norvegicus de laboratoire seront issus d'un éleveur agréé. Les rats bruns et les rats noirs, bien que de type sauvage seront issus d'un élevage également. Seul le rat noir, dont aucun animal de laboratoire ne dérive, nécessite un certificat de capacité puisqu'il est considéré par les autorités comme un animal sauvage. Les essais de réceptivité/sensibilité chez les murinés ayant été menés chez des rongeurs adultes, les rats choisis ici sont des adultes d'un poids compris entre 200 et 300 grammes.

130 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris âgées de 20 mois, choisies pour leur barrière hémato-encéphalique naturellement altérée, passent des examens d'IRM sous anesthésie, tandis que les rats subissent des examens de tomographie par émission de positons avec pose de cathéter, tous recevant cinq jours d'injections intrapéritonéales du peptide. Le porteur indique un stress lié aux anesthésies répétées et à la mise à jeun, et une surveillance accrue des animaux âgés plus sensibles. Il répète que l'expérimentation animale est "indispensable" et impossible à remplacer par des méthodes in silico ou in vitro, malgré des données in vitro déjà obtenues.

Objectifs

De nos jours, la maladie d’Alzheimer et le vieillissement cérébral sont des enjeux de santé publique majeurs. En effet, les maladies neurodégénératives et les pathologies entraînant une altération de la Barrière Hémato Encéphalique (BHE) ou une diminution de l’activité cérébrale peuvent entraîner de très importants déficits cognitifs. La spondine est une protéine spécifique du système nerveux central. Elle est active uniquement lors du développement cérébral et est impliquée dans la formation de nouveaux neurones. Dans ce contexte, un peptide dérivé de la spondine a été développé par le laboratoire comme nouvelle thérapie pour ces pathologies. Lors de tests préliminaires in vivo et in vitro, il a montré des effets bénéfiques, tels que l’augmentation de la résistance des couches de cellules des vaisseaux sanguins et l’amélioration de la transmission synaptique (amélioration de l’activité cérébrale). La présente étude vise désormais à évaluer l’effet de ce peptide in vivo sur : - l’intégrité de la BHE chez des souris âgées ayant une BHE altérée, par le biais de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec injection de produit de contraste. Le peptide devrait restaurer l’intégrité de la BHE et cela devrait être objectivé par le fait que le produit de contraste ne pénétrera plus dans le cerveau. - l’activité cérébrale métabolique de rats jeunes et âgés, par le biais de la micro-tomographie par émission de positons (TEP) avec injection d’un sucre radioactif. Le peptide devrait augmenter l’activité cérébrale et la transmission synaptique, ce qui entraînerait une augmentation de la capture de sucre marqué dans les régions cérébrales concernées.

Bénéfices attendus

Cette étude est nécessaire au développement préclinique du peptide médicament, et aura un impact majeur pour son développement clinique dans diverses maladies neurodégénératives et conditions qui présentent une altération de la BHE et une diminution de l’activité cérébrale qui mènent à des déficits cognitifs tels que dans la maladie d’Alzheimer ou le vieillissement. Récemment, le laboratoire a démontré in vitro que le peptide était capable (1) d’améliorer la transmission synaptique (i.e. la communication entre les neurones) et (2) de’renforcer l'intégrité de la BHE. Ce projet va alors permettre de vérifier que les propriétés du peptide qui ont été découvertes sur des modèles in vitro sont bien extrapolables à un modèle in vivo. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet auront donc un impact fondamental puisqu’ils pourront permettre de pousser plus avant le développement clinique du candidat médicament. À plus long terme, un des bénéfices majeurs de ce projet serait de pouvoir utiliser le peptide afin de traiter des patients présentant des déficits de la transmission synaptique et/ou un dysfonctionnement de la BHE. Ce type d’atteintes du système nerveux central ayant notamment été rapportées dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, ou encore du vieillissement normal et pathologique.

Procédures

Durée totale de la procédure 1 = 18 jours avec 4 examens d’imagerie (1h20 dont 40 minutes d’anesthésie par examen), et 5 jours d’injections quotidiennes d’un traitement en intra péritonéal. Durée totale de la procédure 2 = 18 jours avec 4 examens d’imagerie d’une durée de 30 minutes chacun, sous anesthésie générale, et 5 jours d’injections quotidiennes d’un traitement en intra péritonéal. Les animaux seront soumis à 4 examens d’imagerie sous anesthésie générale. Chaque examen TEP aura une durée totale de 1h20 dont 40 minutes sous anesthésie générale. Les rats seront mis à jeun 4h avant l’examen, puis ils seront soumis à une pose de cathéter veineux en condition vigile. Chaque examen IRM aura une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale. Les souris seront soumises à une pose de cathéter veineux. Dans les deux cas, les animaux (rats et souris) auront une administration quotidienne du traitement ou du véhicule en intra péritonéal pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

La dose du peptide médicament utilisée dans cette étude est très inférieure aux doses maximales ne présentant pas d’effet nocif observé dans des études toxicologiques réglementaires. Cependant, l’administration répétée du traitement en intrapéritonéal (IP), la mise à jeun pendant 4h lors des examens TEP, l’injection intraveineuse (IV) du radiotraceur chez l’animal éveillé (rat), l’injection IV de produit de contraste (souris), ainsi que l’induction de l’anesthésie peuvent entrainer un stress. D’autre part, les animaux âgés, pouvant être plus sensibles, feront l’objet d’un suivi plus étroit.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélever le cerveau en vue d'analyses immunohistochimiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Des études antérieures menées par le laboratoire ont permis de démontrer in vitro un effet bénéfique du peptide sur l'intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et sur la transmission synaptique. Bien que des brevets aient déjà été déposés pour chacune de ces propriétés, des résultats obtenus dans des modèles in vitro ne peuvent se substituer à une preuve de concept in vivo de l’effet de la molécule dans le cadre du développement d’un candidat médicament. L’expérimentation animale est donc indispensable si l’on veut pouvoir faire progresser le développement préclinique puis clinique de la molécule. Dans le cas de ce projet, il est donc impossible de remplacer les animaux par des méthodes in silico et/ou in vitro. Toutefois, la société a pris le soin de réaliser plusieurs études in vitro en amont afin de s’assurer de la robustesse de l’effet du peptide. Les principaux résultats de ces études sont les suivants : - le peptide promeut l'étanchéité et la résistance de monocouches de cellules endothéliales in-vitro. - le peptide améliore la transmission synaptique basale (activité cérébrale). Cela nous donne la garantie de réduire au maximum le risque que ce projet d’étude in vivo, bien qu’indispensable, soit effectué vainement.

Réduction

L’utilisation de méthodes d’imagerie permet un suivi longitudinal des animaux ce qui entraine une réduction notable des effectifs nécessaires à l’obtention de résultats significatifs, ceci augmenté par le fait que chaque animal inclus est son propre contrôle (diminution de la variabilité inter individuelle). Les inclusions des animaux seront faites séquentiellement et les résultats de chaque lot seront analysés avant de démarrer un nouveau lot. En TEP nous souhaitons avoir 5 rats jeunes traités avec le véhicule (qui serviront de groupe témoin et permettront de prendre en compte un potentiel effet du suivi longitudinal), et 10 rats jeunes traités avec le peptide. Ainsi que 5 rats âgés traités avec le véhicule, et 10 rats âgés traités avec le peptide. Nous prévoyons 5 rats âgés supplémentaires afin de prendre en compte les risques accrus liés à l’anesthésie. Cependant, la procédure sera finalisée dès que l’effectif de 15 rats âgés sera obtenu, ne nécessitant pas forcément de commander ces 5 rats supplémentaires. Toutes ces images seront analysées voxel à voxel et comparées à la baseline de chaque sujet. En IRM, nous souhaitons avoir 10 souris âgés traitées avec le véhicule, 10 souris âgées traitées avec le peptide et 5 souris jeunes traitées avec le véhicule. Nous choisissons un modèle d’altération de la BHE naturellement existant chez les souris âgées. Chez l’homme, 30% des individus présentent une BHE altérée à partir de 55 ans. Par analogie, nous estimons que 30% des souris testées pourraient être incluses dans le protocole. Cette étude étant prospective et n’ayant pas de certitude concernant le pourcentage d’animaux présentant une BHE altérée nous calculerons nos effectifs avec 20% des souris testées incluables. A nouveau, les inclusions des animaux seront faites séquentiellement et les résultats de chaque lot seront analysés avant de démarrer un nouveau lot. Si moins d’un tiers des souris testées présentaient une BHE altérée, le protocole serait immédiatement arrêté.

Raffinement

Les animaux arriveront à l’animalerie minimum une semaine avant le début du protocole pour une période d’acclimatation. Les souris seront hébergées par groupe de 6 et les rats par groupes de 5, ce qui leur permettra d’exprimer des comportements sociaux. Les mises à jeun nécessaires aux imageries TEP seront réalisées séquentiellement et dans une cage commune. De ce fait la mise à jeun sera précisément de 4h pour tous les rats sans stress supplémentaire lié à un isolement. Les imageries TEP et IRM seront réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec un monitorage continu du rythme respiratoire. Cette méthode d’anesthésie permet de régler finement et en temps réel la quantité nécessaire à la sédation de l’animal et limite les risques de surdose. Tout au long du protocole les animaux seront suivis quotidiennement avec une grille de score permettant de détecter précocement tout signe de mal être.

Choix des espèces

En IRM, la souris est choisie car sa taille est compatible avec les spécifications de la machine. Des souris de 20 mois seront incluses dans ce projet car elles présentent naturellement une rupture de la BHE, qui sera visible grâce à l’administration de produit de contraste. Les souris jeunes serviront de contrôle expérimental d’une activité cérébrale dite « normale » et d’une BHE intègre respectivement. Seuls les animaux âgés seront utilisés comme des modèles de « condition pathologique » chez lesquels l’efficacité de la molécule pourra être évaluée. Il est donc nécessaire d’utiliser un nombre d’animaux âgés suffisant pour pouvoir conclure quant à l’effet de la molécule d’intérêt. Le nombre d’animaux dits « contrôles » peut en revanche être réduit, ce qui explique le déséquilibre entre les effectifs d’animaux jeunes et âgés. En TEP, le recours au rat est indispensable. En effet, sur cette procédure on ne cherche pas à observer un effet global mais à identifier quelles zones cérébrales sont impactées par le traitement, il est donc plus favorable de faire l’étude sur un cerveau de plus grande taille. Des sujets jeunes (2 mois) et âgés (20 mois) seront inclus dans ce projet. Il est nécessaire de recourir à des rats jeunes et âgés pour évaluer l’activité cérébrale métabolique à l’état basal en fonction de l’âge et évaluer l’effet du peptide dans ces deux conditions. En effet, des études electrophysiologiques in vitro antérieures ont montré une augmentation de l’activité synaptique en présence du peptide.

1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé dans leur veine jugulaire pour qu'ils s'auto-administrent une drogue lors de dizaines de séances de six heures, certaines associant la prise à des chocs électriques sur les pattes pour mesurer jusqu'où ils la poursuivent. Le porteur qualifie ces chocs de "légers" et rappelle que l'animal peut à tout instant cesser de répondre, les rats étant tués pour analyses moléculaires. Il affirme que ce type d'étude de l'addiction ne peut être mené que sur un animal vivant aux réseaux neuronaux intacts.

Objectifs

L’addiction est une maladie comportementale et psychiatrique chronique pour laquelle il n’existe pas de traitements efficaces et qui apparaît chez certains consommateurs de substances d’abus. Afin de trouver des stratégies thérapeutiques efficaces, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’apparition de cette pathologie. Pour cela, ont été développés chez les rongeurs, des modèles d’addiction, qui miment les critères de diagnostics de l’addiction chez l’Homme, comme, par exemple, leur incapacité à limiter la recherche ou la prise de drogue malgré des effets désagréables. Ce projet a pour but de mimer et caractériser cette difficulté à contrôler la consommation de drogues malgré les conséquences négatives associées à cette dernière. Dans un modèle d’addiction chez le rat, nous nous focaliserons sur la capacité individuelle des rats à contrôler leur prise de drogue quand celle-ci est associée à des effets désagréables. Pour étudier cette vulnérabilité individuelle, nous utiliserons une approche qui permet de déterminer l’effet désagréable maximal qu’un rat est prêt à recevoir pour obtenir des injections de drogue et ainsi déterminer un seuil de vulnérabilité à développer une addiction pour chaque rat. Ce modèle servira donc à distinguer les animaux développant une addiction des animaux capables de contrôler leurs prises de drogues. Ce projet pourrait apporter une explication au fait que parmi tous les utilisateurs de drogues, seule une proportion devient addict, et perd le contrôle de sa consommation et de rechercher les mécanismes neurobiologiques impliqués. Ce projet vise à caractériser la distribution du comportement compulsif vis à vis de la drogue au niveau d’une population de rats et les informations obtenues seront utilisées dans le futur pour raffiner les prochaines expériences utilisant le même modèle.

Bénéfices attendus

Cette approche a plusieurs bénéfices. Notre procédure présente 2 avantages par rapport aux procédures traditionnelles : 1) elle « s’auto-ajuste », c’est à dire que l’intensité des conséquences gênantes de la prise de drogue s’adapte au comportement individuel de l’animal avec la possibilité d'arrêter la prise de drogue à des niveaux de stress très faible et éviter ainsi des stress de durée plus importante. Au contraire, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui est souvent plus élevé de ce que les rats auraient supportés s’ils avaient le choix. 2) elle permet de mesurer finement la résistance à la sanction en une seule session en déterminant le niveau maximal de sanction qu’un animal est prêt à supporter pour recevoir de nouvelles doses de drogue. En effet, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui permet une distinction entre les rats résistants et vulnérables à la punition. D’un point de vue plus général, les 2 variations de paramètres proposées nous permettent de se rapprocher de ce que l’on peut observer dans l’addiction chez l’Homme. En effet, l’utilisation d’un délai entre la prise de drogue et la punition (paramètre 2) nous permet de mimer le fait que, chez l’Homme, la conséquence négative n’est pas instantanée et arrive plutôt de façon décalée temporellement après la prise de drogue. L’autre paramètre (1), donne la possibilité de distinguer la recherche et la prise de drogue et nous permettra de caractériser plus facilement les différents mécanismes motivationnels sous-jacents à la persistance de la recherche et de la prise malgré des conséquences désagréables. La découverte des mécanismes neurobiologiques impliqués dans nos effets pourrait aider à une meilleure prise en charge de ces pathologies, tenant compte de la vulnérabilité / résistance individuelle aux effets désagréables associées à la prise de drogues.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Ils suivront ensuite tous des sessions d’entrainement d’auto-administration sans sanction pour développer un comportement de prise de drogue stable (15 sessions, 1 session par jour), 6h/ jour. Une fois le comportement opérant de prise acquis et stable, tous les animaux suivront des sessions d’auto-administration sans et avec sanction (6h maximum / session, 1 session / jour), 50 sessions. Ils suivront également des sessions d’auto-administration pour déterminer le niveau individuel de motivation de l’animal qui est le niveau de réponse maximale fournit par l’animal pour obtenir la drogue (1 session par semaine, 6h maximum / session), 10 sessions.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. - sanction / stress : Les stress délivrés lors des phases de sanction sont de légers stress au niveau des pattes des rats (sur la grille du sol des cages). Les stress utilisés ne sont pas d’intensité et/ou durée telle d’induire des conséquences négatives durables, les animaux pourront à chaque instant éviter le stress induit (et diminuer son intensité) en renonçant à répondre pour obtenir la drogue.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration avec et sans sanction, seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'une maladie psychiatrique telle que l’addiction aux drogues, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude de cette pathologie comportementale et psychiatrique nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques de type ANOVA et un calcul de puissance qui permet de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaires par groupe sera de 12. Nous estimons un ajout de 2 animaux par groupe dus aux pertes liées à la compléxité du geste des procédures chirurgicales (lors de l’insertion du cathéter dans la veine, la veine peut céder) ou liées à la durée du projet avec le risque que le catheter se bouche sur la longueur de la période d’auto-administration. Ainsi 14 animaux par groupe, seront nécessaires à notre étude. Avec 18 lots (9 lots mâles et 9 lots femelles) soit 1008 animaux au maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré par l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick de bois (pour répondre à leur besoin naturel de ronger) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 5 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

1 800 rats vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue et vingt réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des antibiotiques puis des gavages quotidiens de probiotiques pendant six semaines, avec des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester des produits censés limiter les effets digestifs des antibiotiques. Le porteur indique que les antibiotiques peuvent provoquer perte de poids et diarrhées et que les gavages répétés génèrent stress et irritations, le tube digestif étant prélevé après mise à mort. Il affirme que la physiopathologie digestive ne peut pas être reconstituée hors de l'animal vivant.

Objectifs

En clinique, il existe différents effets secondaires induits par un traitement antibiotique : par exemple, une diarrhée survient chez 10 à 25% de patients traités avec l’association amoxicilline/acide clavulanique qui est très largement prescrite dans le monde. 5 à 10% des patients traités à l’ampicilline ont également des diarrhées. Il existe d’autres effets secondaires comme les crampes abdominales, une fièvre ou une leucocytose. Un traitement antibiotique peut également provoquer un risque accru d’infection par des organismes pathogènes. Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui peuvent avoir un effet protecteur sur les effets délétères induits pas les antibiotiques. Ce projet a pour but d’étudier les effets protecteurs de molécules probiotiques sur les effets secondaires gastro-intestinaux induits par différents antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de produits sur les effets secondaires induits par l’utilisation d’antibiotiques sur certains paramètres physiologiques (prise alimentaire, consistance des fèces, altération de la barrière intestinale) et sur la composition du microbiote et du métabolome intestinal. Ces données permettront de supporter le développement ou l’utilisation de produits pour limiter les effets secondaires de l’usage d’antibiotiques.

Procédures

Certains traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 6 semaines maximum. Certains paramètres mesurés nécessitent un prélèvement sanguin. L'animal sera anesthésié avant celui-ci. Le prélèvement sanguin aura lieu au maximum une fois par semaine avec une semaine de récupération entre chaque prélèvement minimum et au maximum pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’administration d’antibiotiques peut entrainer une perte de poids et des diarrhées. Les rats seront observés attentivement pour respecter les points limites. L’administration répétée par gavage peut générer du stress et entrainer des irritations. Les traitements seront effectués par une personne expérimentée afin de limiter l'angoisse des animaux au maximum et à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérience car leur tractus digestif doit être prélevé pour des études histologiques. Dans la phase de mise au point certains animaux n'ayant pas reçu d'antibiotiques pourront être réutilisés.

Remplacement

La physiopathologie du tractus digestif est complexe et ne peut pas être reconstituée dans des modèles non in-vivo.

Réduction

La variabilité des réponses aux effets d’un traitement antibiotique justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus.

Raffinement

Les rats seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels pour qu’ils puissent s’abriter. Ils seront suivis quotidiennement et des points limites sont mis en place pour éviter la souffrance.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs jeunes adultes sont des modèles fréquemment décrits. Eventuellement, si les résultats de la première partie du projet ne sont pas concluants, des adultes plus âgés pourront être utilisés. Le rat a été choisi car les quantités de fèces qu'il génère sont plus importantes que chez les souris, ce qui permet de limiter le nombre d'animaux utilisés.

1 800 rats et souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des plaies circulaires leur sont découpées à l'emporte-pièce sous anesthésie, entourées d'un anneau collé et suturé, et suivies jusqu'à quinze semaines chez des animaux souvent rendus diabétiques et hébergés seuls. Le porteur indique que ces plaies provoquent une douleur modérée et peuvent s'infecter, les animaux étant anesthésiés jusqu'à deux fois par semaine pour photographier les plaies puis tués pour prélever peau et sang. Il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas la réparation d'un tissu vivant, ce qui justifierait le recours au rongeur.

Objectifs

L’objectif est de tester l’efficacité cicatrisante de composés chimiques ou biologiques dans le cadre de la cicatrisation de plaies, notamment chez le sujet diabétique qui est plus enclin à développer des plaies non cicatrisantes, avec à la clef des complications infectieuses et nécrosantes. Il est estimé que 20 % de toutes les hospitalisations pour le diabète sont liées à des complications de lésions cutanées au niveau du pied. En effet, le risque de gangrène chez le sujet diabétique est multiplié par 17 comparé à celui de la population non diabétique. Les amputations consécutives à des lésions de gangrène, de nécroses, ou d'ulcérations sont chiffrées à plus d’un million par an dans le monde. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la cicatrisation et ainsi éviter la chirurgie d’amputation chez le sujet diabétique. Dans ce contexte, un modèle animal est nécessaire pour étudier les différentes phases de la cicatrisation, car les modèles cellulaires in vitro ne permettent pas de mimer tous les processus mis en place lors de la réparation tissulaire in vivo, avec l’implication de types cellulaires différents au cours du temps. Les composés chimiques ou biologiques évalués dans ce projet seront pré-sélectionnés in vitro sur des critères d’efficacité et de faisabilité de développement, afin de limiter le nombre de produits à tester chez l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour accélérer la cicatrisation de plaies. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies pour les plaies étendues et/ou à cicatrisation trop lente, par exemple chez les diabétiques.

Procédures

Des biopsies de peau (plaies circulaires de petite taille) seront réalisées sur des rats ou souris diabétiques et potentiellement non diabétiques anesthésiées avec analgésie (anesthésie d’une heure environ, une fois dans l’étude), à l’emporte-pièce, puis des anneaux de caoutchouc ou silicone seront fixés autour de la plaie (colle chirurgicale et sutures), et les plaies seront protégées par des pansements. Si les sutures d’un anneau venaient à se rompre, elles seraient reprises sous anesthésie générale (anesthésie d’environ une heure). Suite à cela, les animaux devront être hébergés individuellement, dans des cages à parois transparentes leur permettant de voir leurs congénères. Les études dureront au maximum 15 semaines et la cicatrisation des plaies sera suivie. Les animaux pourront recevoir des traitements pour vérifier l’effet de ces traitements sur la cicatrisation. Les traitements douloureux seront réalisés avec une analgésie préalable et sous anesthésie (une heure d’anesthésie environ). Les traitements stressants seront réalisés sous anesthésie (une heure environ). Les traitements peu stressants seront réalisés vigile (5 minutes environ). Les traitements seront réalisés au maximum 3 fois par jour sur toute la durée de l’étude (maximum 15 semaines). Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine (manipulation d’un quart d’heure), manipulés pour observer les plaies tous les jours (manipulation d’un quart d’heure), et anesthésiés pour photographier les plaies au moins 2 fois par semaine (anesthésie une heure). Des prélèvements sanguins et urinaires pourront être réalisés durant l’étude si besoin de mesurer le taux de produit circulant ou d’autres biomarqueurs pertinents. Les prélèvements peu stressants seront réalisés vigile (10 minutes environ) et les prélèvements stressants seront sous anesthésie (1 heure environ). Au maximum, 3 prélèvements par jour seront réalisés. En fin d’étude, les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de sang et de peau.

Impact sur les animaux

Des plaies seront induites chez les animaux, et celles-ci cicatriseront plus ou moins lentement selon les animaux (cicatrisation particulièrement lente chez les animaux diabétiques). Ces plaies induiront une douleur modérée et potentiellement une légère réduction de mobilité. Des traitements antalgiques seront mis en place si besoin, et de l’eau et de la nourriture gélifiée seront mises en place en fond de cage. Les signes d’infection seront suivis tout au long de l’étude (3-4 semaines) car ces plaies de longue durée pourraient avoir tendance à s’infecter. En cas d’utilisation d’animaux diabétiques, ceux-ci présenteront de facto un phénotype dommageable (diabète).

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes, de peau et de grands volumes de sang.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être évaluée chez le rongeur.

Réduction

Nous estimons qu’un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe sera nécessaire pour observer une réduction significative d’un seul paramètre d’intérêt (taille de la plaie). Ce nombre pourrait monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement (analyse histologique). Les effectifs minimums seront réévalués à l’issue des premières études afin de trouver le bon compromis entre réduction du nombre d’animaux et atteinte des seuils de significativité statistique.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. En cas de perte de poids, ils seront réhydratés. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. La douleur est évaluée pour décider de la nécessité d’administrer un traitement antalgique et l’atteinte des points limites. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation. Si les signes persistent, une décision de suivi ou d’euthanasie devra être prise. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus constatés lors des premières études et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. Les souris et rats diabétiques boivent beaucoup et urinent beaucoup, donc les cages et biberons seront donc changés tous les jours. Afin de pouvoir si possible limiter l’hébergement individuel, des essais d’habituation au pansement seront réalisés lors des études pilotes.

Choix des espèces

Les troubles de la cicatrisation chez les rats diabétiques et souris diabétiques des deux sexes sont bien documentés et s’apparentent à ceux observés chez les humains diabétiques. Des rats ou souris hétérozygotes pourront être utilisés comme contrôles de par leur proximité génétique mais leur absence de phénotype dommageable. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum). En effet, dans la bibliographie, les études de cicatrisation chez les animaux diabétiques sont réalisées sur des animaux adultes.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats de souche ZSF1, sélectionnés pour développer une insuffisance cardiaque, sont anesthésiés deux heures pour recevoir un produit de contraste et une imagerie du cœur par ultrasons, avant d'être euthanasiés pour prélever le cœur. Le porteur décrit surtout un stress léger à l'introduction en chambre d'induction et situe les atteintes du côté de la pathologie développée par les animaux. Il affirme que la complexité du système vasculaire empêche de mettre au point cette méthode sans rats, et présente ce marqueur d'imagerie comme un futur outil clinique.

Objectifs

La circulation coronarienne est responsable de la perfusion du myocarde. Les modifications du débit coronarien ont des conséquences graves sur les performances du cœur, comme dans l’infarctus du myocarde. À ce jour, seules les grosses artères épicardiques de l’ordre du millimètre peuvent être visualisées in vivo chez l'homme et l’animal par les techniques d'angiographie telles que les rayons X, la tomodensitométrie ou l’IRM. Ces dernières années, nous avons démontré au laboratoire la faisabilité de la microscopie ultrasonore de localisation. Cette technique d’imagerie permet de visualiser en profondeur dans les organes les flux sanguins dans les micro-vaisseaux de quelques dizaines de microns de diamètre. Au-delà de la simple visualisation,d'autres nouvelles techniques échographiques de mesure des flux sanguins permettent de quantifier les vitesses de flux dans les vaisseaux, ce qui est crucial pour évaluer la fonction des micro-vaisseaux. Nous avons récemment amélioré cette technique pour faire de l’imagerie 3D, ce qui permet de visualiser et de quantifier les flux au niveau d'un organe entier tel que le cerveau et le cœur. Une première étude sur des rats témoins a démontré la faisabilité de la mesure des diamètres et des flux des vaisseaux de la microcirculation ainsi que leur réactivité au cours d’une vasodilatation. Nous voudrions maintenant mettre en évidence une différence de réactivité et d’anatomie de ces vaisseaux dans l’insuffisance cardiaque. Cette pathologie a touché 40 millions de personnes en 2015 dans le monde. La moitié des patients sont atteints d’une forme appelée insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICEP) très difficile à diagnostiquer. Cependant, des altérations de coronaires apparaissent très tôt et pourraient être un marqueur précoce de l’ICEP car Il est maintenant bien établi que la dysfonction de la microvascularisation coronarienne est un marqueur pronostique des altérations du muscle cardiaque. Nous utiliserons une souche de rats mutants ZFS1 obèses développant cette pathologie au cours de leur croissance. Avec ce modèle d’imagerie microscopique non invasif, nous pourrons mettre en évidence les effets précoces du développement de l’insuffisance cardiaque sur la microcirculation dans le cœur. Pour ce projet nous prévoyons d’utiliser 20 rats sur une durée de 5 ans. Il est important de noter que le projet s'inscrit dans la démarche des 3R.

Bénéfices attendus

Il est maintenant bien établi que la dysfonction de la microvascularisation coronarienne est un marqueur pronostique de l’insuffisance cardiaque. Nous pensons que cette technologie permettant l’exploration des flux myocardiques des petits vaisseaux de quelques dizaines de micron mettra en évidence des différences significatives chez les animaux insuffisants cardiaques. Ces données recueillies sur l’animal entier présentent un intérêt thérapeutique majeur qui pourront être utilisées en clinique dans le futur comme un marqueur précoce du développement de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

Les interventions auront toutes lieu sous anesthésie générale pendant 2 heures. Pour chaque animal, Il y aura : - Injection intraveineuse de produit de contraste et d'adénosine ou de sérum physiologique. -Tonte de la peau au niveau de la cage thoracique. - Positionnement d'une sonde échographique en contact de la peau sur la cage thoracique. - Euthanasie à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Au cours des expérimentations, une manipulation pour introduire le rat dans la chambre d’induction peut engendrer un léger stress de l’animal. Un soin particulier sera donné dans la surveillance des rats pendant leur hébergement notamment pour les rats développant une insuffisance cardiaque. A part cela, les opérations auront lieu sous anesthésie générale. Les prélèvements de coeur seront réalisés après euthanasie du rat.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés a la fin de la procédure. Un prélèvement de cœur sera effectué afin de réaliser une analyse quantitative du degré de l'insuffisance cardiaque de l'animal.

Remplacement

Cette étude a déjà été mise au point au cours de l’étude coronarographie 3D. La complexité du système vasculaire ne nous permettait pas de mettre au point cette méthode sans utiliser des rats. Dans cette étude des mécanismes de développement de l’insuffisance cardiaque nous sommes obligés d’utiliser des modèles qui sont très spécifiques. Seule L’application de cette méthode qui est nouvelle sur ce modèle nous permettra de découvrir les mécanismes du développement de la maladie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de cette étude dans la mesure où nous utiliserons les mêmes conditions expérimentales que l’étude « Coronarographie par ultrasons en trois dimensions ». Les conditions expérimentales sont parfaitement maîtrisées et nous n’aurons donc pas besoin d’animaux pour la mise au point. Pour cette étude, une comparaison entre deux groupes sera effectuée. Un groupe témoin composé de 10 rats sains et un groupe composé de 10 rats insuffisants cardiaques. Une deuxième comparaison sera effectuée entre les résultats avant et après ajout d’agents pharmacologiques sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront reçus au moins une semaine avant la procédure et seront manipulés régulièrement afin de les habituer et éviter le stress le jour de la procédure. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats pour favoriser leurs comportements sociaux dans un environnement enrichi (tunnel en carton et bâton en bois) avec un accès illimité en eau et nourriture. Durant l’opération sous anesthésie générale, la température et les constantes de l’animal (température corporelle, fréquences respiratoire et cardiaque et saturation d’oxygène) seront contrôlés et toute anomalie conduirait à l’ajustement immédiat des paramètres de l’anesthésie, si les modifications n’amélioraient pas l’état de l’animal, la procédure serait arrêtée et l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

Les développements effectués sur les coronaires de rats dont la structure est élaborée et complexe pourront être utilisés de façon fiable sur les études futures chez l’homme. La souche de rats ZSF1 répond aux critères d’exploration de la méthode, il n’y aura pas de mise au point supplémentaire à effectuer. Des rats adultes seront utilisés afin de s’assurer que l’imagerie est faite sur des cœurs pleinement développés.