Rats

212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.

Impact sur les animaux

Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).

Devenir

Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.

Remplacement

La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.

Réduction

La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.

Raffinement

Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale à la naissance puis, à l'âge adulte, une seconde intervention et une mesure par voltamétrie sous anesthésie, avant de recevoir du THC pour modéliser l'effet du cannabis sur la schizophrénie. Les rates nouveau-nées sont tuées dès le sevrage à 21 jours, les mâles gardés pour la suite puis tués pour contrôle histologique. Le porteur affirme que l'étude de la maladie chez des patients non traités est difficile sur les plans éthique et pratique, ce qui rendrait la modélisation chez le rat "irremplaçable".

Objectifs

La schizophrénie est une maladie neuropsychiatrique complexe qui apparaît à l'adolescence et au début de l'âge adulte, avec un risque plus élevé d'apparition chez les individus de sexe masculin. La schizophrénie est une maladie mentale très invalidante (1ère source de handicap et de suicide des 25-35 ans) touchant environ 1% de la population, évoluant dans +60% des cas vers un état chronique. Son coût global pour la société est considérable. Les causes et les mécanismes biologiques mis en jeu dans la schizophrénie ne sont pas entièrement compris. Actuellement, on considère que la schizophrénie résulterait de connexions défaillantes entre différentes régions cérébrales ayant pour origine une perturbation du développement cérébral, notamment au niveau du cortex antérieur. Ces connexions défaillantes pourraient contribuer au dysfonctionnement des neurones dopaminergiques ; il s’agit d’un groupe de neurones dont l’implication dans l’expression des symptômes schizophréniques est communément acceptée. Récemment, un certain nombre de travaux laissent penser que l’usage du cannabis peut précipiter l’apparition de la schizophrénie ou aggraver les symptômes caractéristiques de cette maladie aussi bien lors d’une consommation chronique, qu’aigüe. Il s’agit non seulement d’un problème de société actuel de première importance, mais aussi d’un problème de santé majeur en raison de la consommation croissante du cannabis dans la population des adolescents et jeunes adultes. L’abord de cette question chez les malades atteints de schizophrénie non-traités par des antipsychotiques, est très difficile à mettre en œuvre, tant sur le plan éthique que pratique, en raison même de la nature de la pathologie, ce qui rend la modélisation chez l’animal tout à fait irremplaçable. Le projet proposé a pour but de mieux comprendre l’impact de l’inactivation néonatale de la partie antérieure du cortex cérébral sur les réponses comportementales et dopaminergiques lors de l’administration du principal composé du cannabis pouvant induire des troubles psychotiques, le delta-9 tétrahydrocannabinol (THC), chez l'animal (rat mâle) jeune adulte.

Bénéfices attendus

Le projet proposé se situe dans le cadre d’une modélisation chez l’animal de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait permettre de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait contribuer in fine au développement de nouvelles approches thérapeutiques ; les traitements existants n’étant pas totalement satisfaisants.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 1)Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né (intervention unique ~15 min); 2) Intervention chirurgicale chez l’animal adulte (intervention unique 1h30 à 2h00); 3) Etude pharmacologique à l’aide de la voltamétrie in vivo (intervention unique~3h).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, les animaux sont soumis à deux interventions chirurgicales à l’issue desquelles ils peuvent ressentir de la douleur. Pour ce qui est de la chirurgie réalisée chez l’adulte, les animaux peuvent présenter une légère perte de poids variable selon les animaux. Pour la majorité d’entre eux le retour vers des valeurs normales s’observe au bout de 7jours. Lors de l’étude pharmacologique les animaux peuvent ressentir une légère douleur transitoire au niveau du site d’injection, due à l’aiguille, lors de l’administration de THC. Par contre, le THC lui-même n’est pas décrit comme induisant de douleur, ni de détresse. Les réponses comportementales mesurées sont les réponses spontanées de l’animal. Il n’y a donc aucun effort à fournir par l’animal lors de cette étude.

Devenir

Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né : Les nouveaux-nés femelles sont mis à mort lors du sevrage au 21ème jour, puis soumis à un contrôle histologique. Lors du sevrage, tous les animaux mâles sont gardés en vie pour être soumis à l’Intervention chirurgicale chez l’animal adulte, puis à l’étude pharmacologique. A l'issue de cette étude, tous les animaux adultes implantés sont mis à mort, puis soumis à un contrôle histologique.

Remplacement

La schizophrénie étant une maladie mentale se traduisant notamment par des troubles comportementaux, il n’y a pas de méthodes alternatives permettant de remplacer les protocoles mis en œuvre chez l’animal vivant, en situation comportementale, et en interaction avec l'environnement. En particulier, l’étude de l’apparition ou l’aggravation de symptômes schizophréniques suite à la consommation de cannabis (notamment de THC) sont très difficiles à étudier chez des malades non-traités, pour des raisons non seulement pratiques, mais surtout éthiques.

Réduction

Dans ce projet, le nombre total d’animaux, maintenu aussi faible que possible, est contraint par le nombre des animaux mâles nécessaires pour réaliser l’étude pharmacologique à l’âge adulte. En effet, pour des raisons de reproductibilité de l’expérience, et d’application du principe de réduction chez les animaux adultes, seuls les animaux mâles sont utilisés. L'utilisation des femelles nécessiterait l'utilisation d'un nombre d'animaux beaucoup plus important que celui proposé. Un nombre de 12 rats mâles par groupe a été déterminé à partir de travaux publiés concernant des études pharmacologiques du même type. Ce nombre apparaît nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment robustes d’un point de vue statistique. L’analyse statistique des résultats sera réalisée en prenant en compte la répétition des mesures dans le temps pour un même animal. Cette stratégie de mesures répétées, conduit grandement à réduire le nombre d’animaux mâles utilisés et, en déterminant le décours temporel des réponses, permet de raffiner l’analyse de celles-ci.

Raffinement

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre. Ainsi, les interventions chirurgicales chez le rat nouveau-né et chez le rat adulte sont réalisées à l’aide d’une anesthésie gazeuse ce qui permet de contrôler au mieux la profondeur de l’anesthésie. Des analgésiques sont aussi utilisés pendant la phase chirurgicale. Pendant la phase post-opératoire, chez le nouveau-né, la bonne cicatrisation de l’incision est suivie quotidiennement en même temps que la pesée des animaux. Chez l’animal adulte, pendant la phase post-opératoire d'au moins 7j, l'eau et la nourriture sont placés dans des récipients adaptés situés directement sur le fond de la cage afin de faciliter la récupération des animaux. Pendant cette phase de récupération post-opératoire les animaux recoivent un traitement analgésique. Les animaux sont aussi habitués à être manipulés. Des points-limites permettant de soustraire les animaux à une éventuelle souffrance ont été établis et feront l’objet d’une attention quotidienne (voire 2 à 3 fois par jour). Un suivi régulier de la littérature sera effectuée tout au long de ce projet pour identifier l’émergence de nouvelles procédures permettant de raffiner celles mises en œuvre dans le projet.

Choix des espèces

Une grande part, pour ne pas dire la majorité des études visant à modéliser chez l'animal la physiopathologie de la schizophrénie ont été réalisées chez le rat, notamment en raison de la grande homologie qui existe entre les réponses comportementales et pharmacologiques observées chez le rat et chez l'homme. L'ensemble des données acquises chez le rat constitue donc un cadre de référence justifiant le choix de cette espèce pour conduire notre projet. Les animaux (rats) nouveau-nés subiront une première intervention chirurgicale au 8ème jour postnatal qui représente un moment crucial du développement cérébral chez le rat, comparable à la fin du second trimestre de gestation chez l’homme, période qui est considérée comme une période de grande vulnérabilité au développement de la schizophrénie. Dans la mesure où la modélisation animale proposée concerne une pathologie (la schizophrénie) ayant une origine neurodéveloppementale, s’exprimant chez le jeune adulte, les animaux mâles ayant subi l'intervention néonatale seront ensuite utilisés à l'âge adulte (11 semaines) pour tester leur réactivité au THC.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le stade juvénile ou adolescent, ils subissent une chirurgie d'injection d'un lentivirus dans l'amygdale, puis des tests comportementaux d'anxiété et de comportement social et un apprentissage de la peur par "légers chocs électriques", certains recevant des électrodes implantées, avant d'être tués. Le porteur veut comprendre comment une hyperactivité de l'amygdale à l'adolescence modifie durablement les comportements émotionnels, avec en vue le stress post-traumatique chez l'humain. Il affirme que ces réseaux neuronaux ne peuvent être étudiés ni in silico, ni sur cellule isolée, ni chez les invertébrés.

Objectifs

L’amygdale, une structure cérébrale située en profondeur du lobe temporal, est composée de plusieurs noyaux, chacun jouant un rôle différent dans la fonction amygdalienne et possédant ses propres projections vers des structures cérébrales différentes. Le noyau basolatéral (BLA) est la principale zone d’entrée des informations provenant du système sensoriel et des structures plus intégrées telles que le cortex préfrontal. Les neurones du BLA projettent aussi bien en dehors de l’amygdale que vers la circuiterie intra-amygdalienne. Au cours du développement postnatal, les connexions neuronales entre les structures des circuits de la peur (comme l’amygdale et le cortex préfrontal médian) sont modelées selon leur état de maturation et l’expérience de l’animal. Chez l’humain, l’hyperactivité amygdalienne est souvent corrélée avec des dysfonctionnements sociaux et émotionnels. De plus, l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. Vu son rôle primordial dans les comportements émotionnels et le fait que l’amygdale arrive tôt à sa maturité fonctionnelle, il est suggéré qu’un dysfonctionnement de l’amygdale à l’adolescence pourrait être à l’origine d’un développement altéré de sa connectivité avec, entre autres, le cortex préfrontal médian, ce qui pourrait avoir des conséquences sur des comportements émotionnels à long terme (chez l’adulte). Nous chercherons à perturber l’activité de l’amygdale chez le rat aux stades de l’adolescence et la préadolescence (juvénile) grâce aux injections d’un lentivirus qui a pour but d’augmenter l’activité d’une voie de signalisation ubiquitaire, exclusivement dans les neurones principaux de cette structure. Nous étudierons l’impact de cette sur-activation sur les propriétés membranaires des neurones principaux du BLA et des neurones du cortex préfrontal médian, sur la plasticité synaptique de la voie mPFC-BLA, ainsi que sur les comportements de type anxieux et émotionnels chez les jeunes animaux et chez les adultes, ainsi que sur l‘activité du réseau pendant les comportements de peur. Le but de notre recherche à long terme est donc de comprendre les mécanismes impliqués dans des dérèglements émotionnels déclenchés pendant l’adolescence et ayant des conséquences importantes chez l’adulte.

Bénéfices attendus

Nous avons précédemment montré que la modification de l’amygdale (par l’injection d’un virus) lors de l’adolescence réduit l’extinction et augmente la généralisation de la peur chez l’adulte dans un protocole de conditionnement aversif. La quantification d’un marqueur de l’activité neuronale dans les structures du circuit lié à la peur montre que les modifications comportementales sont associées à une augmentation de l’activité neuronale des neurones du cortex préfrontal. Ce projet vise à comprendre comment le virus modifie l’activité électrique des neurones principaux de l’amygdale et comment cette modification peut impacter la connectivité du circuit neuronal sous-tendant le comportement de la peur. Concernant des bénéfices du projet à court terme, il semble fondamental et essentiel de connaitre les effets sur les propriétés électriques et la plasticité des neurones de l’amygdale. Une hyperactivité ou une hyper-réactivité de ces neurones pourrait conduire à des changements durables dans la connectivité des réseaux neuronaux connectés à l’amygdale et contribuer aux modifications comportementales observées chez l’adulte. A long terme, des connaissances apportées par ce projet nous aideront à mieux comprendre comment la modulation de l’amygdale pendant la période critique de l’adolescence pourrait conduire aux effets durables sur la cognition émotionnelle et sociale, qui persistent jusqu’au stade adulte. Nos résultats nous permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la prédisposition à certains syndromes psychiatriques chez l’Homme tel que le stress post-traumatique (PTSD).

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie pour injection virale chez le jeune (préadolescent ou adolescent) dans l’amygdale, procédure invasive qui nécessite une anesthésie générale (~1h) et un suivi post-opératoire après réveil. Quatre séries expérimentales sont ensuite planifiées : (1) 2-3 semaines plus tard, les animaux sont profondément anesthésiés pour l’extraction et analyse du cerveau frais. (2) A l’âge adulte, les animaux seront à nouveau anesthésiés pour la totalité de l’expérimentation sous anesthésie (~4h) puis mis à mort sans réveil. (3) Les animaux adolescents seront soumis à des tests comportementaux (anxiété, stress, comportement social ; 1 semaine), puis à un apprentissage de peur à l’âge adulte (1 semaine). (4) Une fois adultes, les animaux sont anesthésiés pour l'implantation d'électrodes suivi de réveil pour enregistrement de l’activité neuronale chez l'animal éveillé pendant qu’il est soumis à un apprentissage de peur (4-5 semaines). Ils sont tous euthanasiés sous anesthésie, suivi d’une exsanguination pour certains afin de réaliser une perfusion intracardiaque permettant de fixer le cerveau.

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissant une chirurgie pourraient potentiellement montrer des signes de douleur ou d’infection : perte rapide de poids > 15%; forte réactivité à la manipulation ou posture anormale (dos rond, yeux mi-clos, tête basse). Dans ce cas, l’animal sera traité (selon conseils du responsable de l’animalerie ou du vétérinaire) et placé sous surveillance maximale durant 48h. S’il n’y a pas de signes d’amélioration, l’animal sera euthanasié avec accord du responsable de l’animalerie. Selon nos études antérieures, le virus injecté dans l’amygdale n’entraine pas d’effets comportementaux majeurs, à part lorsque les animaux sont soumis à des tests particuliers pour produire un état légèrement anxieux (espace éclairé) ou émotionnel (légers chocs électriques). Ces états ne perdurent pas en dehors des tests. En dehors de ces cas, aucun effet indésirable n’est prévisible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort , soit pour l'expérimentation, soit pour analyse histologique.

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences Cellulaires et Comportementales. L’évaluation des réseaux neuronaux et comportementale d’une modification cérébrale au cours du développement post-natal jusqu'à l'adulte nécessite l’utilisation d'animaux vivants possédant les structures et les connectivités cérébrales requises. Cela ne peut donc pas être réalisé in silico ou en cellule isolée ou chez les invertébrés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera le strict minimum permettant un analyse statistique valide des expériences. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature (voir Joly et al, 2022), incluant, après vérification de l'homogénéité des variances et la normalité des données, des analyses de variance à un ou plusieurs facteurs en fonction des expériences, suivies d'analyses post-hoc appliquant une correction pour la répétition des comparaisons (ex. Bonferroni ou False-Discovery-Rate). Il est à préciser que les femelles et les mâles issus de la colonie de reproduction seront utilisés dans cette étude.

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes, et utiliserons de l’anesthésie combinée quand approprié à une analgésie pendant les chirurgies et la mise à mort des animaux. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress induit et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques et antibiotiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les animaux seront hébergés par groupes (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible. Les animaux en situation comportementale seront habitués à l’expérimentateur par manipulation au cours des jours précédents.

Choix des espèces

Le rat est le modèle du choix du laboratoire. En raison de la cohérence avec nos études précédentes, nous poursuivons ce projet sur Rattus norvegicus. La littérature scientifique pertinente à ce projet, en particulier les analyses des comportements sociaux et anxieux, est riche en études réalisées sur le rat. Nous bénéficierons et nous contribuerons donc d’une base de donnés importante. Il est connu que la période de l’adolescence est associée à une susceptibilité au stress et un développement important des structures impliquées, notamment l’amygdale, dans les réponses à la peur. Toutefois de nombreuses structures impliquées dans les comportements émotionnels sont encore immatures à l’adolescence. Nous voulons modifier l’activité de l’amygdale à deux stades du développement, le stade de préadolescence (juvénile) et le stade d’adolescence, qui correspondent à des périodes critiques dans le processus de connectivité de l’amygdale avec d’autres structures du réseau. Les expériences commenceront donc dès l’âge préadolescence jusqu’à l'adulte.

90 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée pour d'autres formations, le reste tué. Ils servent de support à une formation réglementaire pour concepteurs de projets, avec préhension, contention, injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins, puis un travail pratique de mise à mort et d'autopsie sous anesthésie. Le porteur affirme que la formation pratique est "indispensable" à l'acquisition de bases solides et qu'une partie des travaux pratiques "doit" passer par des animaux non-humains, malgré le recours annoncé à des démonstrations filmées et des outils de substitution. Il privilégie des individus de réforme et enchaîne les enseignements pour réutiliser les mêmes animaux d'un exercice à l'autre.

Objectifs

L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques en France est réglementée par le décret 2013-118 et cinq arrêtés datés du 1er février 2013, publiés le 7 février 2013, en application de la directive 2010/63/UE. Ainsi, des règles strictes, basées sur le principe des 3Rs, encadrent le fonctionnement de la recherche dans le domaine. De ce fait, les personnes utilisant des animaux se doivent d'être formées et qualifiées pour travailler dans ce domaine. Différents niveaux règlementaires permettent donc de définir les taches que les personnels seront à-même de réaliser ainsi que les niveaux de responsabilité par rapport au projet donné. De ce fait, afin d'assurer une formation complète à la direction d'études utilisant des animaux, l'université de Caen a mis en place un diplôme universitaire pour la formation reglemenatire obligatoire et spécifique à la conception de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques, approbée par le CNEA. La formation est réservée aux personnes disposant d'une formation initiale bac +5 minimum (études scientifiques, médicales, pharmaceutiques, vétérinaires) ou bac +2 avec 5 ans d'expérience. Une capacité maximale de 15-20 stagiaires est prévue. La formation se déroulera sur deux semaines en 71 heures : 58 heures de cours théoriques et 13 heures d'aspects pratiques en une séance par an. Cette formation a pour but de former les étudiants à la conception de projets scientifiques nécessitant d'animaux à des fins de recherche tant sur le plan théorique (réglementation, méthodes alternatives, anatomie comparée, recours aux procédures expérimentales faiblement invasives) comme théorique et pratique (anesthésie, douleur et analgésie, stress et enrichissement du milieu, ...) Cette formation privilégie autant que possible le recours aux méthodes alternative par l'utilisation de démonstrations filmées, organisations en groupes de travail et/ou réutilisation quand il est possible. L'enchainement des enseignements a été réfléchi afin de pouvoir effectuer des formations sucessives sur les mêmes animaux. L'utilisation d'outils pédagogiques de substitution est prévue de façon qu'un minimum d'animaux est utilisé par séance et se limite à 9 rats et 9 souris par an pour tous les stagiaires. Les stagiaires auront une base solide théorique et pratique pour la conception de projets utilisants des rongeurs à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les stagiaires qui auront réussi l'examen écrit auront un diplome universitaire de l'université de Caen "Formation à Expérimentation animale appliquée à la Recherche Biomédicale : conception des projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques" Formation spéciale destinée aux personnes assurant la responsabilité scientifique directe d’expérimentations conformément à la directive 2010/63/UE relative à l’expérimentation animale.

Procédures

5 rats et 5 souris suivront des procédures non invasives pendant 4 heures maximum (gestes zootechniques pour la préhension et contention; administration de produits; prélèvements sanguins). Ces gestes sans anesthésie étant réalisés par des personnes non habituées, nous ne considérons pas la possibilité de réutiliser ces animaux pour le reste de la formation, privilégiant une récupération du stress subi. 4 autres rats et 4 autres souris suivront également le TP de physiologie pendant 2h : techniques de surveillance de la physiologie normale sous anesthésie générale. Ces 4 rats suivront le TP d'anesthésie et analgésie avec les méthodologies exérimentales pendant 3h maximum. Ils suivront sans réveil le TP de mise à mort et autopsie. Les 4 souris suivront également le TP de mise à mort et autopsie. Un rat et une souris sont prévus en plus pour anticiper au cas ou un problème subviendrai rapidement après anesthésie par exemple pour ne pas handicaper un groupe de stagiaires si ce cas apparaissait. Si non utilisés, ces animaux pourront être réutilisés dans des formations du laboratoire en comportement.

Impact sur les animaux

Nuisances du TP 1 : Les animaux seront manipulés et contenus par du personnel non formé : du stress est à prévoir. Il y aura également des douleurs légères et de courte durée (injections de liquide physiologique) dues aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins. Nuisances du TP 2 : Les animaux seront anesthésiés et ne souffriront pas de gestes invasifs, nous ne nous attendons pas à des nuisances. Nuisances du TP 3 : les animaux seront seront anesthésiés et auront une couverture analgésique nous ne nous attendons pas à des nuisances.

Devenir

La première procédure est légère mais réalisée par du personnel non habitué. Nous préférons laisser ces animaux récupérer et les inclure dans des apprentissages de tests comportementaux au lieu de les réutiliser cinq jours après pour une autre procédure (5 rats et 5 souris par année). La deuxième procédure inclut des démonstrations pour l'observation de la physiologie cardiaque et respiratoire sous anesthésie générale. Les animaux sont prévus d'être reutilisés le lendemain pour une démonstration procédure (4 rats et 4 souris par année). La troixième démobstration consiste au TP sur l'anesthésie et analgésie avec l'utilisation de méthodologies expérimentales fréquentes en recherche préclinique chez le rongeur (4 rats par année). A la suite de cette procédure et sans réveil entre deux, le TP de mise à mort et autopsie utilisera les 4 rats et les 4 souris de la procédure 2 qui seront anesthésiés profondément comme décrit dans la procédure avant mise à mort.

Remplacement

La formation pratique est indispensable à l'acquisition de bases solides pour les concepteurs de projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques. Bien que le maximum d'approches seront réalisées sur des systèmes de substitution et l'utilisation d'outils pédagogiques qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux, une partie des travaux pratiques doit être pratiquée sur des animaux. De ce fait les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie par du personnel formé et expérimenté et sous la supervision dans chaque atelier d'enseignants experts dans les domaines abordés. Une partie des démonstrations est réalisés sur des techniques non invasives (comportement, techniques de préhension) et ne nécessitent donc pas de méthodes d'anesthésie.

Réduction

Les stagiares sont regroupés en groupes de travail afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Les thématiques de formation sont enchainées permettant la réutilisation des animaux d'un TP à l'autre. Néanmoins, un minimum de 9 rats et 9 souris par an est prévu pour la totalité des enseignements pour 20 stagiaires.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés par anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’induction est effectuée à 5% isoflurane dans un mélange gazeux 30%O2 / 70%N2O pendant 3minutes. Ils sont ensuite maintenus sous anesthésie par inhalation d’isoflurane (2% dans 30%O2 / 70%N2O) en respiration spontanée ou en ventilation mécanique (TP correspondant). Une vaporisation de Lidocaïne sera faite au larynx pour soulager tout incorfort. Une couverture analgésique est assurée par injection sous cutanée de buprénorphine (0.1mg/kg, 200μL) avant la manipulation et pose de cathéter (TP correspondant). La thermorégulation (37.5 ± 0.5°C) est assurée par une couverture chauffante (groupes anesthésiés) rétrocontrôlées par une sonde de température rectale.

Choix des espèces

La formation est destinée specifiquement aux concepteurs de projets nécessitant l'utisation de rongeurs. Cette formation est donc basée sur l'utilisation de rats et des souris. Nous privilégions de préférence l'utilisation d'animaux de réforme. Les animaux seront des adultes, aucune incidence d'age ou de sexe. Nous privilégions si possible l'utilisation d'animaux de réforme.