Rats
Développement de modèles de neuropathies périphériques liées à la chimiothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections répétées de deux anticancéreux, le paclitaxel et la vincristine, pour reproduire les neuropathies douloureuses provoquées par la chimiothérapie chez les patients, avec mesure de l'activité nerveuse sous anesthésie. Le porteur décrit des atteintes possibles, perte de poids, baisse d'activité, agressivité et douleur, et reconnaît avoir eu du mal à trouver dans la littérature une description détaillée de ces effets. Il affirme que la réponse aux chimiothérapies ne peut se modéliser ni in vitro ni in silico et qu'aucune alternative ne remplace l'animal, avant un prélèvement terminal de peau et de nerf.
Objectifs
Dans ce projet pilote, notre objectif est de tester deux protocoles actuellement utilisés dans la chimiothérapie chez l’Homme. Les molécules d’intérêts, bien qu’efficaces dans le traitement contre le cancer, sont responsables de l’apparition de neuropathies périphériques particulièrement handicapantes, qui se manifestent chez plus de 68% des patients traités avec un anti-cancéreux. Les troubles neuropathiques perdurent même après l’arrêt du traitement. La neuropathie périphérique induite par chimiothérapie (CIPN : Chemotherapy-induced peripheral neuropathy) se manifeste par une atteinte sensorielle des membres, tels que des douleurs, picotements, engourdissements, sensations de brûlure, sensibilités à la température, etc. et sont globalement similaires d’un agent chimio thérapeutique à l’autre. Malgré la connaissance des mécanismes de toxicité de ces différents traitements, il n’y a, à l’heure actuelle, aucun médicament capable de soigner efficacement et de manière définitive la neuropathie périphérique, les traitements étant majoritairement à but palliatif. Bien que de nombreux modèles rongeurs (souris et rats) aient été développés, l’incohérence des résultats reste un problème. Ainsi, il existe autant de résultats que de protocoles expérimentaux, engendrant une véritable confusion autour de ces modèles. Ici, nous souhaitons mettre en place un modèle fiable et reproductible, qui serait une représentation pré-clinique fidèle des CIPN observés chez l’Homme, en administrant aux rats de molécules couramment utilisées dans la chimiothérapie en hôpital.
Bénéfices attendus
Une fois validé par analyse statistique, ce modèle nous donnera la possibilité d’envisager différentes approches pharmacologiques et thérapeutiques qui pourraient conduire au traitement des CIPN. La construction de ce modèle est impossible sans l’utilisation d’animaux vivants. L’organisme étant un ensemble complexe, il serait difficile de modéliser la réponse systémique aux chimiothérapies sur des modèles in-vitro ou in-silico. Ainsi, à l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de remplacer l'expérimentation animale par d'autres alternatives pour ce projet.
Procédures
Les animaux de la première procedure (Taxol), auront quatre injections en intrapéritonéale. Ainsi qu'une mesure électromyographique sous anesthésique gazeuse au jour 29. Les animaux de la second procédure (Vincristine), auront cinq injections par voie intraveineuse. Ainsi qu'une mesure électromyographique sous anesthésique gazeuse au jour 18.
Impact sur les animaux
Pour ce modèle, les nuisances possibles sont une baisse du poids, une baisse d’activité, le développement d’une agressivité et/ou de douleur, une inflammation du point d’injection. Cependant, il nous a été très difficile de trouver dans la littérature une description détaillée des effets secondaires qui ont déjà été observés à la suite du traitement par les anticancéreux
Devenir
Tous les animaux subissant des prélèvements de peau et de nerf à la fin de leur procédure, ils sont tous euthanasiés.
Remplacement
Ce projet s’articule autour d’une pathologie nerveuse liée aux effets secondaires d’un traitement anti-cancereux actuellement utilisé en médecine humaine. Les processus mis en jeu dans ce cas ne peuvent être modélisés qu’à travers l’étude de l’animal vivant. Les cultures cellulaires, de même que les modèles in-silico, ne nous fourniraient qu’une réponse limitée et ne pourraient, en l’état actuel des connaissances, remplacer le système complexe qu’est l’organisme vivant. Ainsi même si des études prélimianires sont possibles et faites (selection des molécules, étude de leur mécanisme anti-cancéreux), l’étude présentée dans ce projet ne pourrait être complètement réalisée sans le recours aux animaux.
Réduction
Nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe après analyse une statistique à l’aide d’un logiciel. Chaque molécule sera testée à 1 dose choisie suite à notre revue de la littérature et les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques permettant d'évaluer si les traitements chimiothérapiques testés peuvent induire des neuropathies. Chaque groupe sera composé de 10 animaux. Pour comparaison, nous intègrerons également 20 animaux contrôles qui seront traités avec le véhicule de chaque molécule. Cette expérience sera ensuite répétée une deuxième fois afin de confirmer ou infirmer les résultats de la première session.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans notre animalerie dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations : nous portons une attention particulière aux conditions d’hébergement afin que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les animaux font également l’objet d’une surveillance quotidienne, et tout signe de souffrance entraine un signalement à la structure interne du bien-être animal, pour prendre une décision rapide sur le devenir de l’animal (pouvant aller jusqu’à l’interruption des procédures) et pour raffiner notre grille de points limites pour nos futures procédures. Tous les moyens possibles sont utilisés pour améliorer le bien-être des animaux du projet. Afin de réduire la souffrance dans la mesure du possible, par la détermination de points limites prédictifs et de critères d'arrêt permettant d'interrompre les procédures .
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons pris le parti d’utiliser des rats mâles Sprague- Dawley. Cette souche est une des souches les plus utilisées dans la littérature en ce qui concerne la modélisation de cette pathologie (DOI: 10.1371/journal.pone.0221787). Les études utilisant cette souche semblent les plus robustes et les plus reproductibles. De plus, l’appareillage présent dans les locaux de Neurofit est mieux adapté aux souches de rats. Les animaux que nous utiliserons seront adultes (environ 6-8 semaines soit 250g au moment de la première injection pour les mâles et environ 200g au moment de la première injection soit pour les femelles), les CIPNs observés en clinique touchant en grande majorité les individus adultes. De plus nous souhaitons que les animaux puissent supporter au mieux les traitements entrepris dans ce projet.
TP chez le rat mâle ou femelle : Formation spéciale à l’expérimentation animale – niveau praticien
- Formation professionnelle
290 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils servent de support à des étudiants qui s'entraînent aux injections intrapéritonéales, intramusculaires, intraveineuses et au gavage sur animaux vigiles, un même rat pouvant être réutilisé entre la formation et l'évaluation, avant d'être tué puis disséqué. Le porteur justifie l'usage du rat par une formation réglementaire à l'expérimentation animale de niveau praticien. Il affirme la "nécessité" de manipuler des animaux vigiles pour maîtriser ces gestes.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), que nous proposons à des étudiants de Licence Professionnelle ou de Bachelor Universitaire de Technologie. Ce projet consiste à former des étudiants d'un point de vue pratique sur les procédures faiblement invasives chez le rat (procédures régulièrement utilisées en expérimentation animale), puis de contrôler leurs connaissances pratiques afin de valider la formation réglementaire. Ce TP permettra à certains étudiants de pratiquer ces procédures pour la première fois de façon individuelle. Notre expérience nous montre qu'il est préférable dans une formation réglementaire de niveau praticien que les étudiants aient l’occasion de manipuler des animaux vigiles et d'acquir de l’autonomie. Le rat est une des espèces les plus utilisées en expérimentation animale. Dans la formation de la licence professionnelle ou du Bachelor Universitaire de Technologie, les étudiants réalisent un TP sur la souris leur permettant d’acquérir les gestes de base sur cette espèce. Ainsi dans un souci de réduction des animaux utilisés, nous avons fait le choix de n’inclure que des rats dans le TP dédié à notre formation praticien.
Bénéfices attendus
Ce TP permettra une validation pratique de la formation à l’expérimentation animale niveau praticien dispensée dans notre établissement. En effet, la réalisation de ce TP (partie apprentissage et partie évaluation) est incluse dans le dossier de validation de notre formation praticien. Etant donné que cette formation à l'expérimentation animale niveau praticien donne aux étudiants, l'ayant validée, la possibilité de travailler avec des animaux de laboratoire dès leur sortie de formation, il nous semble nécessaire de leur donner des bases pratiques et de les évaluer pour s'assurer qu'ils sont bien capables de travailler avec des animaux dans les meilleures conditions pour le bien-être de ces derniers. En outre, le retour des employeurs sur notre formation praticien est très positif, car ils trouvent que nos étudiants sont rapidement autonomes après une prise de poste et que leur maîtrise des gestes techniques leur permetttent d'assurer un travail respectueux de l'animal.
Procédures
Les animaux seront répartis en 3 lots qui seront soumis à des protocoles différents faisant appel à la réalisation de procédures faiblement invasives : - Lot 1 : une administration intrapéritonéale (IP)/un prélèvement sanguin (TP formation) et une administration intramusculaire (IM) (TP évalutation). Les rats recevront par voie IP du sérum physiologique, un produit neutre. Le prélèvement sanguin par voie intraveineuse (IV) dans la veine de la queue sera réalisé sur animal vigile à l'aide d'un tube de contention adapté à son poids. Le volume prélevé sera faible (
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces TP sont faiblement invasives. Les produits adminsitrés sont neutres (sérum physiologiques, eau distillée). Les administrations de produits se feront sous le strict contrôle de l’équipe enseignante, y compris lors de l’évaluation pratique. Ainsi les seules nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation mais, afin de diminuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation par l'équipe technique.
Devenir
A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort. Ils seront ensuite réutilisés pour les TP de dissection réalisés en 1ère année dans notre formation.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), il est nécessaire que les étudiants pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (IM, IP, IV et VO) sur animal vigile pour les maîtriser et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations...).
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des étudiants. L'administration par voie orale sera réalisée une fois par rat et par un étudiant, l'injection par voie IP et le prélèvement de sang par voie IV seront réalisés une seule fois par rat et par un étudiant et enfin l'injection IM sera réalisée par 2 étudiants alternativement sur le même rat (une IM par cuisse). Un enseignant réalisera une démonstration de chaque procédure en utilisant 3 rats. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ensemble des rats sera réutilisé pour le contrôle pratique, mais au minimum 4 jours après la formation pratique pour un meilleur confort de l'animal. Au total, 58 rats maximum seront utilisés par an pour 20 étudiants, soit un total de 290 rats pour 5 ans. Ce chiffre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'inscrits à la formation est inférieur à 20. Enfin, certains animaux pourront provenir d'un précédent protocole classé hors champ, dans lequel les rats femelles auront eu 2 frottis vaginaux, ou d'un TP de pharmacologie dans lequel, les rats mâles et femelles auront reçu une administration IP unique d'une molécule pharmacologique à action rapide (anxiolytique, antidépresseur, véhicule des molécules...), suivi de tests comportementaux simples. Ceci permettra de réduire encore le nombre d'animaux que nous faisons nâitre dans notre établissement pour ce TP formation praticien.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés, par groupe socialement harmonieux, en présence de deux éléments d'enrichissement (tunnel en plastique et bâton de bois à ronger ou noix). Les animaux auront été habitués à la préhension / contention avec le personnel de l’animalerie, afin qu'ils soient moins stressés lors des procédures réalisées par les étudiants. Avant toute intervention sur l'animal, les étudiants auront visionné les différentes procédures à exécuter sur des vidéos et/ou images et également en démonstration par les enseignants. La pratique des étudiants sur l'animal ne sera réalisée que sous contrôle rigoureux des enseignants. Une attention particulière sera portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. De plus, les rats seront récompensés à la fin de chaque manipulation à l'aide d'un aliment appétent sucré (type pop corn, biscuit sec...), ce qui permettra de diminuer leur stress tout en sensibilisant les étudiants à l'importance du renforcement positif. Enfin une même procédure ne sera pas réalisée deux fois sur un même animal. Ainsi lors du contrôle, la procédure effectuée sur chaque rat sera différente de celle réalisée pendant la formation pratique. A noter qu'avant les séances de TP, les étudiants auront suivis plusieurs enseignements théoriques de la formation à l'expérimentation animale et seront donc particulièrement sensibilisés au respect des procédures.
Choix des espèces
Cette formation à l'expérimentation animale (niveau praticien) aura pour spécialisation d'espèces animales : les rongeurs rats et souris. Dans le cadre du programme de la Licence Professionnelle et du Bachelor Universitaire de Technologie, un TP est réalisé chez la souris, pendant lequel les étudiants réalisent certaines procédures faiblement invasives (IP, SC). Dans la LP et dans le BUT, les étudiants réaliseront également un TP sur le rat, dans lequel ils pourront réaliser une IP et/ou une VO, mais pas de façon systématique en individuel. Cet unique TP ne permettant pas de former suffisamment à l'utilisation du rat en expérimentation animale nous avons choisi de conserver notre TP de formation à l'expérimentation animale sur le rat, afin de former nos étudiants à d'autres procédures faiblement invasives (IM, prélèvement sanguin) mais également de consolider leur apprentissage de l'IP et de la VO (procédures les plus utilisées en expérimentation animale). Les animaux seront âgés de 8-12 semaines et pèseront entre 250 et 350 g en fonction du sexe, poids qui permettront une contention aisée pour des étudiants qui se forment à l'expérimentation animale.
Evaluation sur la douleur de l’effet d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aigüe microcristalline.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
181 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent deux à trois injections intra-articulaires provoquant une arthrite microcristalline, un modèle de la crise de goutte, avec gonflement et douleur de la patte, suivies de mesures quotidiennes de la douleur par le test de Von Frey sur neuf jours. Le porteur revendique l'originalité d'évaluer la douleur, rarement étudiée dans ces modèles. Il affirme qu'aucun procédé in vitro ou in silico ne permet cette évaluation.
Objectifs
Les dépôts de cristaux d’urate de sodium, de pyrophosphate de calcium ou de phosphate de calcium au sein des articulations sont fréquents, touchent plus de 17.5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante. Cette inflammation est contrée par la colchicine ; mais celle-ci, utilisée par voie orale et systémique expose à des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. L’efficacité de la colchicine dépend de sa concentration locale. Nous développons un nouveau procédé médicamenteux, avec une molécule que nous encapsulons pour former des microparticules, permettant d’obtenir de fortes concentrations locales avec de faibles concentrations systémiques, devant améliorer l’efficacité locale. Les modèles expérimentaux d’arthrite sont utilisés depuis longtemps pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, et non à inhiber les paramètres de la douleur. La douleur est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. Un élément novateur est que les modèles animaux d’arthrite microcristalline n’ont jamais fait l’objet de ce type d’évaluation. Ainsi, l’intérêt du projet est aussi d’établir un nouveau modèle d’évaluation. Finalement notre objectif est de démontrer : - L’intérêt d’une nouvelle formulation, innovante, utilisant une nouvelle technologie de délivrance de médicament. - D’établir l’effet sur la douleur de cette formulation, de la comparer et l’associer à un antalgique local. - De démontrer l’intérêt d’évaluer la douleur dans un modèle d’inflammation microcristalline.
Bénéfices attendus
La douleur dégrade très fortement la qualité de vie des patients atteints de maladie goutteuse. Dans cette maladie très inflammatoire qui altère progressivement les articulations, la douleur peut être associée à une inflammation en cours (douleur inflammatoire) ou peut survenir durant la phase chronique de la maladie, en dehors des poussées. La douleur est ressentie de façon variable par les patients au cours de la maladie (3). Les médicaments anti-inflammatoires sont efficaces sur l’inflammation et la douleur à condition d’être tolérée. On se heurte la plupart du temps à un seuil d’efficacité faute de pouvoir atteindre une concentration synoviale suffisante. L’utilisation d’un anesthésique local (M2), simultanément à une préparation délivrant M1 de façon continue, serait un progrès significatif dans la prise en charge des malades. Ce projet serait donc susceptible d’apporter la preuve de l’efficacité d’une telle approche sur la goutte et permettrait d’envisager un nouveau traitement efficace sur la douleur pour ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 ou 3 injections intra-articulaires (en fonction des groupes) d'une durée de 1 à 2 min sous anesthésie gazeuse ainsi qu'à un prélèvement de sang conservateur d'une durée de 3 min. Ils seront manipulés tous les jours pendant 9 jours pour les mesures de douleur et de score clinique, cette évaluation dure envrion 30 min par rat. Les rats seront également soumis à un prélèvement sanguin terminal d'une durée d'environ 3 min, réalisé sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L'arthrite microcristalline provoquera un gonflement et une douleur transistoire de la patte postérieure injectée. La manipulation des rats pour les tests de douleur peut provoquer un incofort passager. L'isolement des rats pour le test de Von Frey peut être responsable d'un léger stress temporaire.
Devenir
Tous les animaux (181 rats) seront euthanasiés à l'issue de la procédure. Ceci permettra d'effectuer le prélèvement des pattes postérieures nécessaire à l'étude histologique complémentaire.
Remplacement
Les expériences in vivo dans ce projet sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de la drogue par un procédé nouveau utilisant des microparticules dans des conditions inflammatoires, d’autre par car l’originalité principale ici consiste à évaluer l’effet antalgique du procédé que nous étudions.
Réduction
Le nombre de rats nécessaires (181) est défini pour obtenir des données statistiquement exploitables. La taille des groupes a été définie grâce à un calcul de puissance. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale ainsi que de la variabilité inter-individuelle pouvant être observé lors des évaluations cliniques. Sur les animaux seront prélevés le sang et les pattes afin d’obtenir un maximum d’information complémentaires sur l'impact de arthrite microcristalline et son traitement au niveau de l'articulation et limiter ainsi la répétition d'expériences.
Raffinement
Les rats sont maintenus en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Ils sont hébergés dans des cages en plastique munies d’une grille, à raison de 4 animaux par cage maximum. L’enrichissement par des tunnels sera effectué pour améliorer leur bien-être. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C.Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale. Toutes les injections intra-articulaires et les prélèvements de sang se font sous anesthésie gazeuse. Dès les premiers signes cliniques (gonflement de la patte injectée), des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des rats.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis, de l’ordre de 50 µl (moins devient problématique à préparer et à injecter) dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines. Pour l’évaluation de la douleur posturale, des animaux plus gros ont tendance à s’appuyer avec leur corps et non leurs pattes sur le capteur et on perd donc l’information voulue.
Etude de la matrice extracellulaire (MEC)de cœurs post- infarctus UE 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
8 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une ligature de l'artère coronaire leur provoque un infarctus, avec un risque de mortalité dès la chirurgie, suivi de 30 jours de survie et d'échographies avant le prélèvement des cœurs. Le porteur décrit l'objectif comme l'obtention de cœurs infarcis pour adapter un appareillage d'assistance cardiaque. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la structure et la composition du tissu cardiaque infarci.
Objectifs
Nous souhaitons obtenir des coeurs infarcis durant la phase de remodelage post-infarctus (30 jours (n=6+2)). Après une période d'acclimatation de 7 jours, les infarctus seront créés par ligature de l'artère coronaire sur 6 rats mâles wistar ; 2 animaux supplémentaires sont inclus pour pallier aux pertes éventuelles dues à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'obtenir des données en vue d'adapter un appareillage d'assistance cardiaque biocompatible en tenant compte des forces à appliquer sur les zones malades.
Procédures
Le projet se déroule sur 30 jours et les animaux subiront une opération chirurgicale visant à ligaturer une artère coronaire provoquant un infarctus. Des échographies seront aussi réalisées afin d'analyser la fonction cardiaque au moment de la ligature, 7 jours après et à la fin de la procédure 30 jours après la ligature.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles engendrées par la ligature coronaire qui induit l'infarctus. Les complications et le risque de mortalité sont présents dès la chirurgie et dans la grande majorité des cas, le pronostic vital n'est engagé que dans les quelques heures qui suivent. D'après notre expérience, les animaux ne montrent pas de signes de détresse cardiaque au delà des 24 premières heures.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de prélever les coeurs et de continuer l'étude microscopique et l'étude des protéines.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation d’animaux car l’objectif de notre étude est d’étudier la structure 3D et la composition protéique du tissu cardiaque infarci, il est donc impératif de travailler sur un modèle vivant. Aucun modèle in vitro ne permet d’appréhender ces paramètres.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet. La mortalité inhérente à l'établissement du modèle pathologique d'infarctus nécessite d'anticiper un nombre légérement supérieur d'animaux pour cette étude mais notre expérience du modèle permet de réduire considérablement ce nombre et de le limiter à 2 animaux supplémentaires. Un groupe témoin de 6 animaux sera ajouté à l'étude. Ces animaux ne subiront aucune procédure, ils serviront de banque de tissus après mise à mort. Cette étude devrait être concomittante avec l'enseignement de microchirurgie, les rats utilisés pour cet enseignement serviront de donneurs d'organes pour le groupe témoin.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (enrichissement du milieu), de soins (établissement de points limites) et surtout les méthodes utilisées (opérations sous anesthésie générale, analgésie contrôlée) qui sont des méthodes dérivées directement de la pratique clinique chez l'homme permettent ainsi un raffinement de la méthodologie. Nous avons établi des points limites (modification des paramètres cardiaques et respiratoires indiquant un réveil, une douleur ou un inconfort de l’animal durant l'opération chirurgicale mais aussi comportement inadéquat, modifications physiques...pendant toute l'étude) qui ne seront pas dépassés grâce aux procédures médicamenteuses disponibles au laboratoire (analgésie, anesthésie chirurgicale) ou à une prise en charge suffisamment précoce avec des soins adaptés
Choix des espèces
Le rat est une espèce utilisée couramment comme modèle d’infarctus pour sa similitude avérée avec les processus physiologiques se déroulant chez l’homme. Le management du rat reste plus facile que le gros animal. Des rats de 350g seront utilisés permettant d'avoir un animal de taille adaptée à la chirurgie envisagée.
Impact de l’exposition précoce aux drogues sur le comportement et le système dopaminergique dans un modèle de comorbidite schizophrénie – troubles de la consommation d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le septième jour de vie, une chirurgie lèse leur hippocampe pour induire un modèle de schizophrénie, puis ils sont exposés jeunes à l'alcool et à des cannabinoïdes avant une seconde chirurgie d'implantation de canules, pour étudier l'impact de ces drogues sur la consommation d'alcool. Le porteur signale des douleurs postopératoires après chaque chirurgie. Il présente ce modèle par lésion comme le plus utilisé et le plus complet pour cette comorbidité.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission. En effet la dérégulation des systèmes de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.
Bénéfices attendus
Il n'existe à l'heure actuelle aucune étude visant à étudier l'impact de la co-exposition précoce à l'alcool est aux cannabis ni chez l'Homme, ni chez l'animal alors que la consommation de ces drogues est relativement fréquentes chez les adolescents et jeunes adultes. Grâce aux expériences proposées dans ce projet nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques. Nous ajouterons à cette étude neurobiologique un aspect purement comportemental qui nous permettra d'évaluer l'impact de cette exposition précoce aux drogues sur les comportements associés à la consommation d'alcool et à ceux associés à la schizophrénie.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Chacune de ces opérations ne durera jamais plus de 20 minutes. Par la suite à l'âge adulte 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. Lors de ces chirurgies les animaux subiront une anesthésie gazeuse et recevront une injection d'analgésiques adaptés. En soins post-opératoires, les animaux (au 7ème jour de vie et à l'âge adulte) recevront pendant au moins 2 jours post-opératoires au moins 2 injections quotidiennes d'analgésique adapté.
Impact sur les animaux
- Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. - Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à l'âge adulte suite à l'implantation des canules par chirurgie stéréotaxiques. Durée attendue : 3-4 jours.
Devenir
Procédures 1, 2, 3: Ces procédures ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis soit dans la procédure 4 (640 rats) soit dans la procédure 5 (320 rats). Procédure 4 : A la fin des analyses comportementales les cerveaux de ces animaux devront être récupérés pour des analyses post-mortem en vue d’étudier l’expression de marqueurs biologiques importants dans ces pathologies et iront donc en procédure 6. Procédure 5: Tous les animaux seront euthanasiés pour vérifications histologiques des sites d'implantation des électrodes d'enregistrement et de stimulation. Procédure 6: Tous les animaux seront euthanasiés au cours de cette procédure.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle en prennant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).
Choix des espèces
Le modèle de lésion choisi pour induire des symptômes de schizophrénie est le plus utilisé en recherche sur la comorbidité addictive car ce modèle est sans doute celui qui représente le mieux l'évolution de la maladie. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Ce modèle nécessite une lésion du cerveau au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.
Evaluation d’une méthode d’imagerie permettant de mesurer l’intégrité de nanovecteurs lipidiques après injection intramusculaire chez le rat
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
108 rats femelles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures mêlant gravité modérée et actes menés sous anesthésie sans réveil. Ils reçoivent une injection intramusculaire de nanocapsules lipidiques et subissent des examens d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésies répétées, avant le prélèvement du muscle injecté, pour évaluer une méthode de suivi de nanomédicaments. Le porteur signale que les anesthésies répétées peuvent entraîner une déshydratation. Il indique que le remplacement reste difficile faute de reproduire in vitro l'environnement musculaire.
Objectifs
Depuis plusieurs années, les nanoparticules thérapeutiques suscitent une grande attention dans le domaine pharmaceutique en raison de leur capacité à délivrer des traitements personnalisés et efficaces avec moins d'effets secondaires. Malgré la présence de nombreuses publications sur les avantages des nanoparticules thérapeutiques, seul un faible nombre de « nanomédicaments » sont actuellement mis sur le marché. La compréhension des mécanismes complexes d’interaction des nanoparticules avec les barrières biologiques et l’étude de leur intégrité post-administration sont actuellement des limites à dépasser pour accroitre le développement de nouveaux médicaments. Une connaissance approfondie de ces paramètres permettrait à terme d’optimiser les performances de ciblage, mais aussi d’améliorer la délivrance d’actifs thérapeutiques en comparaison aux traitements existants. Dans le cadre de futures études pré-cliniques visant à la validation de candidats médicaments nanovectorisés, il est actuellement essentiel de développer des outils permettant de caractériser leur devenir une fois administré in vivo. Au cours de la pandémie de COVID-19, l’usage thérapeutique des nanoparticules lipidiques s’est amplifié via le développement des vaccins Pfizer/BioNtech et Moderna. Depuis plusieurs années, la communauté scientifique a acquis une expertise dans le développement de nanoparticules lipidiques - notamment des nanocapsules lipidiques - utilisant des matériaux biocompatibles et biodégradables. Alors que l’innocuité in vitro des nanocapsules lipidiques a été montré au cours de multiples études, leur profil pharmacocinétique après injection intramusculaire in vivo demeure peu connu. Une méthode innovante de spectroscopie localisée de diffusion par résonance magnétique a été développée par notre plateforme technique. À ce jour, cette nouvelle méthode permet de caractériser in vitro les propriétés intrinsèques de chacun des composants qu’ils soient pris séparément ou associés sous forme de nanomédicaments. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la capacité de cette nouvelle méthode de caractérisation à suivre le devenir, et potentiellement l’intégrité, de thérapies in vivo. Les objets testés seront des nanocapsules lipidiques de tailles variables afin de solliciter différents mécanismes d’internalisation cellulaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus par ce projet seront de proposer une méthode de suivi des nanomédicaments, en particulier des nanocapsules lipidiques qui sont des nanoparticules analogues à celles actuellement largement utilisées dans le cadre de la lutte contre le COVID-19. La méthode proposée se base sur des appareillages largement rependus en clinique et pourra de ce fait être déployée dans les services de radiologie. Il est à noter que cette méthode d’imagerie fonctionne en l’absence de rayonnements ionisants et de part son caractère non invasif, permet des mesures répétées sur les mêmes individus et in fine permet d’obtenir l’information recherchée tout en limitant le nombre d’individus nécessaires. Dans le cadre de l’étude du devenir des nanocapsules lipidiques après injection intramusculaire, cette technique nous permettra de caractériser la cinétique de dégradation et ou d’internalisation de ces nanomédicaments en fonction du temps mais aussi d’étudier l’influence de la taille de ces nanomédicaments sur les cinétiques de dégradation et ou d’internalisation puisqu’il a été démontré qu’en fonction de la taille des objets, la voie d’internalisation préférentielle diffère. À plus long terme, nous pouvons espérer que cette technique pourra être déclinée pour l’étude d’autres nanomédicaments ou de vesicules endogènes.
Procédures
Trois procotoles sur des rats Sprague-Dawley femelles de 12 semaines permettront d’évaluer par imagerie par résonance magnétique (IRM) le devenir de nanocapsules lipidiques de différents diamètre (50 nm, 100 nm et 25 nm respectivement) après injection intramusculaire de 50 µL de suspension. Chacun de ces protocoles sera divisé en deux études. La première étude évaluera la dose permettant d’observer les nanocapsules lipidiques durant la phase précoce après l’injection. 3 lots de 5 rats recevront une injection intramusculaire de nanocapsules lipidiques à différentes doses et suivront juste après un examen d’imagerie/spectroscopie par IRM. Tous les gestes de cette étude sont réalisés sous anesthésie générale en 40 à 50 minutes pour chaque animal avec un suivi permanent de la température et la respiration. La seconde étude évaluera l’impact du temps sur la mesure suivant l’injection intramusculaire de nanocapsules lipidiques. 2 lots de 8 rats recevront une injection intramusculaire de suspension de nanocapsules lipidiques (dose déterminée selon les résultat de la première étude). Tous les animaux de cette étude suivront un examen d’imagerie/spectroscopie par IRM selon ces temps d’observation : Groupe 1 : 1h, 6h, 12h, 24h, 48h. Groupe 2 : 1h, 3h, 9h, 24h, 48h. Tous les gestes de cette étude sont réalisés sous anesthésie générale en 40 à 50 minutes pour chaque point d’étude pour chaque animal avec un suivi permanent de la température et la respiration.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels sont principalement liés à l’injection intramusculaire et aux anesthésies répétées. Dans des études antérieures (Nel, 2018 & 2019), l’injection IM de 40µL de suspensions de nanocapsules lipidiques (LNC) ne s’est jamais accompagnée d’effets indésirables notoires. Toutefois, nous avons identifié cette phase du protocole comme point de vigilance. Il est à noter que nous aurons une information anatomique du point d’injection grace à la réalisation d’IRM. Les anesthésies répétées peuvent quant à elles s’accompagner de déshydratation. Une injection de 1 ml de serum physiologique sera réalisée au niveau de l’espace interscapulaire à la fin de chaque série de mesure. D’ordre général, une attention particulière sera portée à l’évaluation de l’inconfort des animaux durant les heures et les 2 jours suivant l’injection intramusculaire.
Devenir
Procédure 1 : Injection intramusculaire de suspensions de nanocapsules lipidiques (LNC) et examen d’imagerie/spectroscopie par IRM : évaluation de la dose permettant d’observer les LNC durant la phase précoce après l’injection (étude 1). Cette procédure requierts la mise à mort de l’ensemble des animaux, car le prélevement du muscle injecté est prévu en fin d’étude (à T = 1h post-injection). Une analyse histologique de la zone prélevée sera ensuite faite par microscopie électronique à transmission pour localiser les nanocapsules lipidiques. Cette localisation visuelle permettra d’établir d’éventuels liens de corrélation entre les résultats obtenus par spectroscopie de diffusion et microscopie électronique à transmission. Procédure 2 : Injection intramusculaire de suspensions de nanocapsules lipidiques (LNC) et examen d’imagerie/spectroscopie par IRM : évaluation de l’impact du temps suivant l’injection d’une suspension de LNC sur la mesure (étude 2). Cette procédure requierts la mise à mort de l’ensemble des animaux, car le prélevement du muscle injecté est prévu en fin d’étude (à T = 48h post-injection). Une analyse histologique de la zone prélevée sera ensuite faite par microscopie électronique à transmission pour localiser les nanocapsules lipidiques. Cette localisation visuelle permettra d’établir d’éventuels liens de corrélation entre les résultats obtenus par spectroscopie de diffusion et microscopie électronique à transmission.
Remplacement
Le remplacement a été évalué mais la complexité de l’environnement musculaire associé à la dynamique du flux sanguin, la réponse inflammatoire engendrée par l’injection intramusculaire ainsi que la contrainte mécanique du muscle sur le produit injecté (provoquée par le déplacement de l’animal post-anesthésie notamment) ne sont actuellement pas reproduite in vitro. Le remplacement est par conséquent difficilement envisageable.
Réduction
La méthode d’imagerie à évaluer permet un suivi non-invasif du site d’injection. Cette méthode permet ainsi d’effectuer des mesures de manière répétées sur un même animal. En conséquence, cette méthode d’analyse permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre a été estimé en fonction des protocoles précédemment réalisés par le laboratoire (pour des résultats statistiquement exploitables) en tenant compte des risques inhérent à chaque phase. L'évaluation du devenir des nanocapsules lipidiques se fera par mesure du coefficent de diffusion de chaque constituant. Nous étudierons sur chaque groupe de rat l’évolution statistique de ce coefficient de diffusion.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages normalisées et en groupes, en pièce ventilée à hygrométrie et température contrôlées et auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour/nuit – 12h/12h sera respecté. Il sera mis à leur disposition un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Avant toute expérimentation, une période minimale de 7 jours d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement sera observée. Lors des expérimentations, une attention particulière sera portée au maintien en normothermie des animaux à chaque phase, y compris lors de l’injection intra-musculaire et de l'examen en Imagerie par Résonance Magnétique par l'utilisation de tapis chauffant avec contrôle rectal de température. Toutes les expérimentations sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi en temps réel de la fréquence respiratoire de chaque animal sera effectué durant tout l’examen d’imagerie/spectroscopie. Une réhydratation par injection sous-cutanée de sérum physiologique est prévue en fin d’anesthésie pour chaque animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état évalué à partir d’une grille de scores comprenant des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance. L’examen d’imagerie a déjà été validé in vitro et est bien maitrisé. Cet examen permet d’observer la présence ou l’absence d’inflammation grâce à l’acquisition locale de données d’imagerie au niveau de la zone d’injection. En cas d’inflammation observée par IRM, un suivi renforcé de l’animal sera effectué au réveil. Cet examen est en mesure de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est un modèle utilisé au laboratoire comme modèle préclinique. Des rats Sprague Dawley femelles de 12 semaines seront utilisés afin de pouvoir injecter en totalité le volume de suspensions de nanocapsules lipidiques nécessaire sans induire de souffrance pour l’animal ni de perte de produit, qui seraient conséquentes à un volume musculaire trop faible rencontré chez des rats plus jeunes.
Etude sur la résistance de câbles de télécommunication, diélectriques à fibres optiques, aux attaques de rongeurs.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Après une phase d'observation, ils sont privés de nourriture pendant 72 heures, l'accès à la mangeoire étant bloqué par des câbles qu'ils doivent ronger pour manger, afin de tester la résistance de gaines de fibre optique aux rongeurs. Le porteur signale un possible amaigrissement et l'ingestion de fragments de plastique, et justifie la mise à mort par l'absence de recul sur ces matériaux confidentiels. Il décrit une commande d'un opérateur télécom, sans autre méthode que la mise en situation avec l'espèce cible.
Objectifs
La justification du projet découle du fait que, placés dans un milieu naturel, les câbles à fibres optiques doivent être résistants aux attaques des rongeurs, en particulier celles des rats. Pour y remédier, les fournisseurs de câbles doivent développer des solutions dites « anti-rongeurs » et prouver leur efficacité par la mise en œuvre d’essais tels que ceux décrits dans ce projet. En effet, une mise en situation avec l’espèce cible est la plus adaptée pour tester la résistance dans des conditions proches des conditions réelles. De manière générale, les câbles optiques sont attaqués de préférence par rapport aux conducteurs d´énergie, par raison de leur manque de danger pour ces animaux. Il a d’ailleurs été démontré que le rat peut dans certaines conditions s’attaquer aux câbles à fibres optiques, notamment lorsque ces derniers sont placés comme un obstacle sur la trajectoire de son déplacement habituel, ou s’il lui obstrue l’accès à un point de nourriture. L’objectif de ce projet est de tester des conceptions de câbles qui ont fait l'objet d'innovation technique afin de renforcer les matériaux qui recouvrent les fibres optiques. Ce projet a également pour objectif de compléter des résultats issus d’une précédente étude réalisée en 2021 au cours de laquelle 3 conceptions de câble ont été testées individuellement en soumettant les rats à une motivation alimentaire : les câbles obtruaient l’accès à la nourriture et les rats devaient ronger le câble pour se frayer un chemin. Les résultats n’étant pas concluants, des propositions ont été faites afin d’optimiser l’exploitation des résultats. Ainsi, il a été proposé de tester les câbles en les présentant par 2 aux rats afin d’identifier celui qui est le plus résistant vis-à-vis de l’attaque des rongeurs. En plus de l’expérimentation au cours de laquelle les rats sont soumis à une motivation alimentaire, une expérimentation supplémentaire est proposée pour vérifier si les rats ont une préférence naturelle pour l’un ou l’autre câble : les 2 câbles sont posés dans la litière et seront accessibles pour les rats (pour jouer, ronger…) qui auront accès librement à la nourriture et la boisson.
Bénéfices attendus
Les installations des bâtiments comme les câblages optiques subissent régulièrement les agressions des rongeurs tels que les rats. Ces dégradations vont jusqu’à rendre inopérant le fonctionnement des réseaux optiques de l’opérateur téléphonique et peuvent non seulement générer des impacts économiques importants mais aussi fortement pénaliser la sécurité des biens et des personnes. D’un point de vue développement de l’innovation, si une des 2 conceptions testées permet de protéger efficacement l’attaque des rongeurs, elle sera déployée plus largement au niveau national à d’autres opérateurs téléphoniques. Afin d’approfondir les résultats, ce projet a été construit en tenant compte des données et observations de l’étude précédente. En effet, dans ce projet, les rats seront exposés non pas à 1 câble mais à 2 câbles simultanément. Une partie de ce projet s’intéresse également au comportement des rats vis-à-vis des câbles dans un contexte où ils ne sont pas soumis à une quelconque motivation alimentaire. Ainsi ,lors de l’expérimenation 1, les 2 câbles sont présentés aux rats mais sans les empêcher d’accéder à la nourriture. Les rats auront accès librement à la nourriture et l’objectif est de voir s’ils s’attaquent aux câbles pour d’autres besoins (jouer / ronger).
Procédures
Tous les animaux du projet (48 rats) seront soumis à 2 expérimentations successives. La première expérimentation a pour objectif d’observer leur comportement en présence des 2 câbles posés dans la litière. Aucune intervention sera réalisée sur les animaux au cours de ces 28 jours d’expérimentation. Au cours de la 2ème expérimentation, les rats seront mis à jeûn pendant une période de 72 heures. Les seules interventions seront des pesées quotidiennes afin de suivre l'évolution de la chute de poids.
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation 1, les seuls effets indésirables pourraient être liés à l’absorption de matières plastiques lorsque les rats rongeront les câbles. Lors de l’expérimentation 2, les effets indésirables seraint une perte de poids si un des câbles n'était pas rompu rapidement. En effet, afin d'inciter les rats à ronger un des câbles, les échantillons de câble seront fixés de manière à empêcher l'accès à la mangeoire. Les rongeurs doivent donc se frayer un passage en sectionnant un des câbles obstructeurs. Les câbles seront placés pendant une période de 72 heures au cours de laquelle les rats seront à jeûn. Des pesées seront réalisées quotidiennement afin de suivre l’évolution de cette perte de poids et mettre fin à la période de jeûne si un animal atteint le poids limite, c'est à dire une chute de 15% par rapport à son poids initial. A titre d’information, lors de l’étude de 2021, la chute de poids moyenne était de 10% après 48 heures de mise à jeun.
Devenir
A l'issue des expérimentations impliquant une procédure légère, les animaux (au nombre de 48) seront mis à mort. Deux raisons justifient cette décision prise en accord avec les chargés d’étude et la vétérinaire référente de l’unité expérimentale PFIE : 1) Chaque rat aura été utilisé 2 fois au cours du projet (pour les 2 expérimentations). Une des conceptions de câbles a été conçue avec des matériaux innovants (compositions protégées par un accord de confidentialité). Il n’est pas exclu que des microparticules ou de petits fragments soient ingérés par les animaux au moment de la dégradation des câbles. Nous n’avons à ce jour aucun recul pour évaluer la toxicité de ces microparticules à la fois vis-à-vis de la santé des rats mais aussi sur le rejet dans l’environnement de particules potentiellement polluantes. 2) Ces animaux seront hébergés dans une zone expérimentale en confinement dans laquelle des agents pathogènes zoonotiques de classe 2 et 3 sont manipulés. Même si les conditions de confinement sont rigoureusement respectées et contrôlées, nous préférons prendre le maximum de précautions pour nous prémunir de la moindre suspicion quant à nos pratiques à l’égard des personnes qui accueilleraient ces animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer la résistance des câbles à l’attaque des rongeurs. Une mise en situation avec l’espèce cible est la plus adaptée pour tester la résistance dans des conditions proches des conditions réelles. Les conceptions de câbles testés ont été préalablement soumis à (1) des tests dimensionnels pour vérifier que les composants sont en quantité suffisante pour assurer leur rôle de protection, (2) tests mécaniques pour garantir que le câble reste fonctionnel après être contraint mécaniquement lors de la pose et pendant sa vie, (3) essais d’environnement permettant de tester leur étanchéité, leur résistance à la température…
Réduction
Avec l’accord du partenaire, il a été convenu de réutiliser les mêmes rats pour les 2 expérimentations. Si une répétition se révélait nécessaire pour confirmer les résultats. Les mêmes rats seraient utilisés après une période de repos pour qu’ils retrouvent leur poids initial. Ainsi la conception de ce projet permet de réduire de moitié le nombre d’animaux (48 au lieu de 96). En s’appuyant sur les résultats de la précédente étude, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour déterminer qu’un des câbles est plus résistant que l’autre avec une différence de 1.5 dans la notation moyenne des dégradations (sur une échelle de 0 à 8). Les moyennes seront comparées grâce à un test non paramétrique (Wilcoxon). La puissance du test a été estimée à 81 % avec un risque de 0.05 (utilisation du logiciel GPower 3.1).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 4 dans des cages adaptées, dans des conditions environnementales (température et éclairage) contrôlées. Deux visites quotidiennes seront réalisées afin de surveiller l’état de santé des animaux et l’apparition des signes cliniques (prostration, absence de toilettage, diarrhée, amaigrissement). Lors de l'expérimentation 1, des friandises (pétale de maïs, pop corn, raisin sec, morceaux de noix…) seront proposées 2 à 3 fois par semaine aux animaux. Lors de l’expérimentation 2, les animaux seront pesés chaque jour afin de surveiller l’évolution de la chute de poids liée au jeûne. Une chute de poids de 15% conduira à l’arrêt immédiat de l’expérimentation pour la cage entière : les câbles seront immédiatement retirés afin que les animaux accèdent à la nourriture.
Choix des espèces
Cette justification se trouve dans le cahier des charges du client qui spécifie que les câbles sont soumis aux attaques des rats. Une mise en situation avec l’espèce cible permet de tester la résistance dans des conditions proches des conditions réelles Le choix de la souche Long-Evans réside dans le fait que cette dernière est la plus active en termes de dégradations observées lors de précédents essais. Adultes avec un poids d’au moins 200 g (spécification requise par le client)
Suivi de la cicatrisation chez le rat après implantation de biomatériaux dans des défauts osseux de calvaria créés chirurgicalement
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux interventions chirurgicales créent un défaut osseux dans leur crâne puis y implantent un biomatériau, pour évaluer une méthode de régénération osseuse. Le porteur présente ce test in vivo comme la validation de résultats obtenus in vitro, avant un passage vers un modèle plus proche de l'humain. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la réparation osseuse dans ce contexte.
Objectifs
L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité sur la régénération osseuse chez le rat d’une méthode originale d’ingénierie tissulaire osseuse utilisant un assemblage tridimensionnel couche par couche de cellules souches mésenchymateuses autologues et d’un biomatériau imprimé en 3D.
Bénéfices attendus
On attend de ce projet qu’il vienne valider les résultats expérimentaux préliminaires obtenus in vitro. On a pu montrer que le matériau utilisé était biocompatible, non cytotoxique et qu’il permettait de guider la néoformation osseuse. Sa dégradation est également compatible avec une utilisation in vivo. Les bénéfices attendus sont donc de valider cette procédure de régénération osseuse dans un modèle de petit animal, avant de pouvoir passer sur un modèle plus proche de la clinique humaine.
Procédures
Selon les recommandations de l’annexe VIII de la directive 2010/63/UE du 22/09/2010, la procédure chirurgicale est considérée comme modérée en termes de souffrance (chirurgie sous anesthésie générale et analgésie appropriée). Les opérations seront réalisées sous anesthésie générale. La réduction de la douleur sera assurée par une analgésie pré-opératoire avec injection sous cutané de 0.05 mg/kg de Buprénorphine et l’injection sous cutané de 1 mg/kg de Meloxicam en post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Le poids des animaux sera relevé en continu. La cicatrisation des plaies sera suivie : en cas de problème, les animaux seront anesthésiés pour effectuer des soins nécessaires : selon la gravité, la plaie sera nettoyée et un traitement antibiotique sera délivré. L’estimation de la souffrance sera réalisée en suivant des critères spécifiques. Au-delà du score limite de 14, l’animal sera euthanasié. Les critères permettant cette évaluation sont l’apparence de l’animal, la prise d’eau et de nourriture, les signes cliniques et les comportements naturels et provoqués (les points limites sont décrits dans la partie 4.2) Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration de Meloxicam pendant 3 jours. La persistance de douleurs malgré ce traitement entraînera la mise à mort de l’animal. Les rongeurs seront maintenus en fratrie (4 à 5 par cage selon la taille des animaux) en respectant la composition du groupe pré-opératoire. Chaque cage sera composée d’un milieu d’enrichissement adapté favorable au bien-être de l’animal. Afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, en prenant en compte le risque de perte d’animaux, nous ferons des groupes de 10 animaux pour chaque condition. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons appariés à l’aide du test de Wilcoxon, le test t de Student, et pour les échantillons non appariés avec le test U de Mann-Whitney. La durée de le pemière procédure (prélèvément de tissu adipeux) est de 10 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil) La durée de la seconde procédure (défaut osseux de calvaria et implantation) est de 15 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux sont principalement en rapport avec la douleur associée aux deux interventions chirurgicales prévues dans le déroulé de l’expérimentation. Comme décrit plus bas, ces douleurs sont de classe modérée et seront prises en charge avec un protocole antalgique déjà validé dans ce modèle chirurgical. Par ailleurs, les activités des animaux ne seront pas modifiées par la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés en fin d'expérimentation car nous devrons prélever les tissus d"intérêt (os de la calvaria et tissus attenants)
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier la réparation osseuse dans ce contexte.
Réduction
Ces expériences sont conçues pour limiter le nombre d’animaux à 10 par temps et pour chacune des conditions expérimentales, en utilisant des tailles de groupes basées sur des travaux antérieurs et permettant des comparaisons statistiques. Du fait des expérimentations prévues, nous envisageons d'utiliser 50 rats.
Raffinement
Une méthode d’analgésie des animaux en pré- et post-opératoire sera réalisée par injection d’analgésique 30 minutes avant l’opération et une injection d’un AINS en post-opératoire. Après l’intervention, les animaux seront replacés en fratrie avec des conditions d’hébergement et un milieu d’enrichissement adaptés, favorables au bien-être de l’animal (litière avec copeaux de peuplier, tuyaux pour jouer).
Choix des espèces
Un test in vivo en site osseux chez le petit animal est indispensable, et constitue la première étape de la démarche scientifique du projet. Le défaut de calvaria chez le rat est un modèle largement utilisé au laboratoire BIOTIS, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. De plus, les cellules souches mésenchymateuses issus de tissu adipeux de rat sont bien décrites dans la littérature. Des modèles autologues ont déjà été utilisés et leur capacité à aider la réparation osseuse également. La souris n’est pas adaptée à la taille des matériaux et à la taille de défaut envisagé. Le lapin n’est pas envisagé pour des raisons de coût et à cause de sa fragilité. Nous avons choisi une souche de rat robuste et adaptée à nos besoins : les rats WISTAR. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.
Rôle des anticorps IgG dirigés contre des bactéries commensales dans un modèle animal de colite (rat HLA-B27)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
373 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils développent une colite spontanée et reçoivent des injections puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours, pour étudier le rôle d'anticorps dirigés contre le microbiote dans les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que ces rats développent aussi arthrite et uvéites, sans prévoir de surveillance spécifique de ces atteintes. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit ces maladies.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent 2 entités la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique dont l’étiologie et la physiopathologie restent mal connues. L’inflammation intestinale chronique serait le résultat d’une réponse immunitaire aberrante, dirigée contre des antigènes du microbiote intestinale, et survenant chez des individus génétiquement susceptibles. Parmi les anticorps couramment associés au développement des MICI ont été identifiés les anticorps anti oligomannane de Saccharomyces cerevisae (ASCA), les anti-flagelline (anti C-bir1), les anti-porine C d’Escherichia coli (anti-OmpC). A l’heure actuelle, ces anticorps sont considérés par les cliniciens comme de simples marqueurs biologiques. Toutefois des avancées récentes tendent à montrer qu’il existerait des interactions complexes entre la réponse immunoglobuline (Ig) G et le développement ou l’évolution des lésions intestinales dans les MICI. Les objectifs principaux de ce travail de recherche seront dans un premier temps d’étudier la présence, la nature et le rôle de la réponse humorale chez le rat HLA-B27, modèle classique de colite expérimentale puis dans un second temps de déterminer si la réponse humorale dirigée contre un antigène donné du microbiote a un rôle bénéfique, délétère ou neutre dans le développement et la progression des lésions de colite dans notre modèle de rat HLA-B27. Enfin, il sera essentiel de déterminer la participation de la réponse humorale dans l’évolution naturelle de la colite de nos animaux grâce à l’injection d’immunoglobulines polyvalentes qui rentreront en compétition avec les immunoglobulines des rats. Nous étudierons l’effet préventif et curatif de ces IVIG.
Bénéfices attendus
Ce modèle animal adapté à l’exploration des IgG spécifiques du microbiote est intéressant pour éclairer le mécanisme pathologique à l’œuvre dans les MICI humaines et éventuellement permettre d’aboutir à des thérapeutiques modulant la production ou l’action de ces anticorps.
Procédures
Procédure 1 : Les 320 rats recevront 3 injections de 300µl de composés (150µg/ml en NaCl 9‰) ou NaCl 9‰ (groupe contrôle) en intra-péritonéale à 5 ,7 et 9 semaines de vie (durée de l'injection 10 sec) . Ces injections se feront sur animaux vigiles. Ces mêmes animaux sous anesthésie générale auront tous les 15 jours, de la semaine 5 à 24, un prélèvement sanguin (durée de l'anesthésie 5 min). Une endoscopie sous anesthésie générale pendant 20 minutes pourra être réalisée à semaine 16 et 20 de vie. Procédure 2: Les 10 rats de l'expérience préliminaire recevront sous anesthésie de 5 minutes une série de 5 injections dans la veine caudale d'immunoglobulines polyvalentes (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) à 6 semaines de vie puis ils auront tous les 15 jours jusqu'à 18 semaines de vie un prélèvement sanguin toujours sous anesthésie de 5 minutes. Pour la procédure dite préventive, les 24 rats recevront sous anesthésie (5 minutes) deux série d'injections intra-veineuses d'IVIG (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) ou NaCl 9‰ à 6 et X semaines de vie (X déterminé par l'expérience préliminaire). A partir de la 6ème semaine, un prélèvement sanguin quinzomadaire aura lieu sous anesthésie générale de 5 minutes. Pour la procédure dite curative, 24 rats recevront sous anesthésie (5minutes) une série de 5 injections intra-veineuse d'IVIG (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) ou NaCl 9‰ à 12 semaines de vie . A partir de la 12 ème semaine, un prélèvement sanguin quinzomadaire aura lieu sous anesthésie générale de 5minutes jusqu'au sacrifice à 24 semaines.
Impact sur les animaux
L'immunisation par des antigènes bactériens pourrait engendrer une colite plus sévère et donc une perte de poids plus importante ou anticipée chez ces rats. Des points limites veilleront à surveiller cette éventualité. De plus, les rats HLA-B27 développent d'autres pathologies inflammatoires telles l'arthrite, les uvéites. Dans notre animalerie et sur le fond génétique Fischer F344, ces pathologies se développent a minima. Aucune surveillance ou prévention spécifique (mesure épaisseur articulations)n'est donc prévue. Cependant, les animaux sont observés quotidiennement et si les points limites (identiques à ceux de la colite) sont atteints, les animaux seront euthanasiés. Dans le cas où il y aurait difficulté à s'alimenter, des croquettes et de l'eau gélifiée seraient disposés dans la cage afin d'en faciliter l'accès.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront sacrifiés et différents organes seront prélevés pour étudier la réponse immune muqueuse, et l'état inflammatoire de nos rats.
Remplacement
Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire la physiopathologie complexe des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin: les interactions entre le microbiote, la barrière intestinale et le système immunitaire sont indispensables pour étudier la réponse humorale envers les bactéries commensales. Il n'existe pas d'autres méthodes capables de reproduire in vitro ce processus physiopathologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu par groupe est de n=8 sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes). Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal et Wallis, Wilcoxon Mann Whitney, corrélation de Spearman). Pour la deuxième procédure, une expérience préliminaire nous permettra de déterminer le meilleur timing d'injection afin de pouvoir analyser les données générées dans de bonnes conditions.
Raffinement
Les rats sont élevés sur place donc pas de transport et de changement d'environnement, uniquement changement de portoirs. Procédures classiques: minimum de bruits, enrichissement des cages et respect du nombre d'animaux par cages, manipulation calme et douce. Les animaux en phase expérimentale seront observés quotidiennement et pesés de façon bi-hebdomadaire avec une attention particulière aux points limites suivants: modifications du comportement (poils hérissés, prostration, cris, blessures) et perte de poids supérieure à 15%.
Choix des espèces
Le rat transgénique HLA-B27 est utilisé comme modèle expérimental de maladies inflammatoires dont les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Le modèle de colite spontanée chez ce rat s'inscrit dans le cadre d'une maladie systémique comme chez l'homme. Pour les 2 procédures, les animaux utilisés auront de 6 à 24 semaines de vie pour un suivi longitudinal de la réponse humorale.
Système nerveux central : Fonction cognitive
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2650
4 900 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent des tests cognitifs mêlant exploration, récompenses alimentaires et chocs électriques brefs (jusqu'à quatre secondes, répétables vingt fois par jour) et reçoivent des substances à tester pendant jusqu'à dix-huit semaines. Le croisement du champ structuré et de la narration indique que 980 animaux contrôles sont réutilisés et 3 920 tués à l'issue. Le porteur qualifie les chocs de "brefs et de faible intensité" sans blessure, et affirme que ces tests comportementaux ne peuvent être remplacés par des méthodes alternatives.
Objectifs
Les déficiences cognitives apparaissent souvent avec le vieillissement des personnes. Elles sont également présentes dans les maladies neurodégénératives telles Alzheimer ou Parkinson et des troubles neuropsychiatriques comme la schizophrénie. Les fonctions cognitives regroupent en particulier la mémoire , l'attention, le language, fonctions exécutives (logique, stratégie, planification, raisonnement) et fonctions visuo-spatiales (orientation). Ces déficiences affectent la qualité de vie des patients et de leur entourage et à ce jour, il n'existe pas de traitements efficaces de ces déficiences: Donepezil et memantine n'ont pas montré une réélle efficacité pour réduire les troubles cognitifs dans la maladie d'Alzheimer. De même, les antipsychotiques permettent le traitement des symptômes positifs et négatifs (sociabilité) de la schizophrenie mais pas les déficits cognitifs (en particualier flexibilité / adaptation). L'objectif du projet est donc permettre le développement de nouveaux modèles et l’utilisation de tests comportementaux pour étudier l'efficacité de nouveaux traitements afin d’atténuer ces troubles cognitifs. Ces tests peuvent également permettre d’établir le profil de sécurité au niveau des fonctions cognitives de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
L’absence de traitement totalement efficace chez l'Homme pour traiter les troubles cognitifs liés au vieillissement, maladie d'Alzheimer , de Parkinson, schizophrénie ou tout autre pathologie neurologique et/ou psychologiques rend nécessaires l’utilisation de modèles murins pour la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces. Ces études permettent également d’établir un profil de sécurité de nouveaux médicaments pour éviter de mettre sur le marché des traitements qui pourraient avoir de forts effets secondaires sur les fonctions cognitives.
Procédures
Les procédures utilisées sont basées sur 1) l'exploration d'environnements, d'objects, de congénères pour une durée maximum de 30 minutes), 2) des renforcements positifs (récompense alimentaire) 3) des renforcements négatifs (chocs électriques brefs max 4 sec). Ces procédures peuvent être répétées quotidiennement (20 fois maximum). Dans chacune des procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une ou plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude (en général, maximum 18 semaines).
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées sont principalment basées sur l'exploration de nouveaux environnements, objects, congénères..., des renforcements positifs (récompense alimentaire) ou négatifs (chocs électriques). Les enceintes d'exploration et objects sont conçu de sorte à ne pas engendrer de blessure (absence de bord tranchant...); les chocs électriques sont brefs et de faible intensité, n'induisant pas de blessure (brûlure) ou décès. Ces procédures n'engendrent pas de réelle souffrance mais selon les stimuli utilisés, leur durée et fréquence, elles peuvent engender un léger stress sont donc classées en légère ou modérée. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées
Devenir
Tous les animaux contrôles peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux face à différentes tâches permetttant l'évaluations des capacités cognitives (reconnaissance spaciale (visuelle). reconnaissance sociale (olfactive), mémoire associative (évitement d'un stimuli potentiellement aversif).
Réduction
La stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant la substance à tester à un groupe contrôle déficitaires, l'objectif étant de réduire les déficits observés par le veillisement ou les agents pharmacologiques tentant de mimer les maladies telles Alzheimer (scopolamine) ou Schizophrenie (PCP ou MK-801). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle de ces mesures comportementales, 12 à 15 rongeurs minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux. Une analyse de variance à un facteur ou plusieurs factuers sont utilisés pour comparer les groupes entre eux ainsi que des paired Student's t tests pour comparer les performences individuelles (intra group comparaison).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger, tunnel, présence de congénères. Les méthodes analytiques choisies sont suffisamment sensibles pour effectuer l'intégralité des mesures sur chaque animal et donc de limiter la répétition des études. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Dans le cadre de démence ou pathologies liès au veillissement, des rongeurs âgés de 18 à 24 mois seront utilisés. Dans le cadre d'autres pathologies psychotiques ou les troubles cognitifs peuvent apparaitre dès l'adolescence, des rongeurs de 6 à 10 semaines seront utilisés.
Neurochimie chez le rongeur
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2000
20 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules à tester en administration unique ou répétée jusqu'à quinze jours, puis sont tués dans les quatre heures pour prélever des structures cérébrales et en mesurer les neuromédiateurs. Le porteur indique que les composés peuvent provoquer prostration, hyperlocomotion, perte de poids, stéréotypies, agressivité voire convulsions, auquel cas les animaux sont écartés et tués. Il justifie le recours au rongeur par la "nécessité" d'un système nerveux "intègre" pour évaluer les molécules.
Objectifs
La communication entre les différentes cellules du système nerveux central s’effectue via la libération de molécules, des neuromédiateurs, se liant à des récepteurs localisés sur les cellules cibles. Les nouveaux composés à tester, agissent sur ce système de transmission entre cellules nerveuses en activant ou inhibant la libération de neurotransmetteurs, en activant ou bloquant les récepteurs cibles. Afin de connaitre l’action de nos nouveaux composés sur l’activité de ces systèmes neurochimiques nous avons besoin d’évaluer les contenus en neuromédiateurs (dopamine, noradrénaline, acétylcholine, histamine…) et leurs métabolites (molécules résultant de leur dégradation) dans le cerveau ou des zones particulières du cerveau (hippocampe, hypothalamus, striatum, cortex…) de rongeurs. Pour ce faire nous avons besoin d’administrer nos composés à des rongeurs afin d’observer leurs effets sur les contenus en différents neuromédiateurs cérébraux.
Bénéfices attendus
La technique de neurochimie va permettre d'orienter la recherche de nouvelles molécules à visée thérapeutique - en permettant de vérifier leurs actions positives sur des systèmes neurochimiques connus pour être défaillants dans certaines pathologies psychiatriques (trouble du sommeil, dépression, anxiété, schizophrénie...). - au contraire en vérifiant leur absence d'effet délétère sur certains systèmes neurochimiques pouvant être impliqués dans des effets indésirables (addiction, hypolocomotion...). - en aidant la chimie médicinale à déterminer les familles de molécules ayant le plus d'activité sur un système neurochimique ciblé et à optimiser le(s) composé(s).
Procédures
Les animaux vont recevoir une administration aigüe ou chronique (maximum 15 jours, deux fois par jour) de molécules à tester. La mise à mort se fera au maximum 4 h après la dernière administration de composé.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de sélectionner les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être une prostration ou une hyperlocomotion, une perte de poids (si traitement chronique), des stéréotypies, de l'agressivité voir des convulsions. Si ces signes sont détectés, les animaux sont écartés de l'expérimentation et euthanasiés.
Devenir
L'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever les différentes structures centrales d'intérêt.
Remplacement
L’utilisation de souris ou de rats pour les mesures de neurochimie est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système nerveux intègre. En effet, le fonctionnement neurochimique du cerveau est particulièrement complexe avec de nombreuses interactions entre les différents systèmes neurochimiques des différentes régions du cerveau.
Réduction
Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'euthanasie des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien-Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors l’euthanasie de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Dans le cas d'une expérimentation chronique, en plus de la surveillance continue pendant 1h30 post-traitement, une fiche de suivi journalier est mise en place : tout signe de mal être (prostration, poils hérissés, perte de poids supérieure à 15% dans le cas des traitements chroniques, convulsions) entraînera l'exclusion de l'animal du protocole et son euthanasie (par exposition à une concentration croissante de CO2).
Choix des espèces
- La taille adéquat de l’animal : les rats et les souris présentent une taille suffisante pour permettre des microdissections de structures déterminées du cerveau. - Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée et documentée chez le rat et la souris. Les études de neurochimie pourront être menées aussi bien sur de jeunes animaux sevrés que sur des animaux adultes en fonction des objectifs.
Effets de l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques sur le lien entre lésions cérébrales et hépatiques en cas de surcharge en lipides : rôle des vésicules extracellulaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Âgés de six semaines, 180 rats Sprague-Dawley reçoivent pendant 30 à 90 jours une alimentation standard ou riche en graisses, avec un gavage un jour sur deux en semaine, d'huile seule ou d'un mélange d'hydrocarbures aromatiques polycycliques à 80 ou 800 µg/kg. 84 sont exploités dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 96 un niveau sévère. Ils subissent des prises de sang, des prélèvements de poils et des passages de 24 heures, isolés, en cage à métabolisme, puis 96 rats passent entre J60 et J90 des tests d'anxiété et de cognition non nommés, 24 heures sur roue d'activité et le test de Porsolt. 36 autres subissent trois tests de tolérance au glucose de 180 minutes et une heure de contention pour mesurer leur réponse au stress, épreuves que le porteur associe à des prises de sang à la queue et à une sonde rectale à demeure, alors qu'il décrit le test au glucose comme une "procédure facile à mettre en œuvre et peu contraignante pour l'animal". Les rats sont tués à J60 ou à J90, 24 heures après leur dernière épreuve, pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes (stéatose) associée à une inflammation de l’organe (hépatite). En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles fonctionnels cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de la stéatose vers la stéatohépatite, forme sévère de la maladie. Les études d’exposition ont montré que les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques sont les polluants prédominants en secteur résidentiel, ce qui rend leur exposition presque inévitable pour l’homme. L’alimentation est la principale source d’exposition en hydrocarbures aromatiques polycycliques. En raison de leur forte rémanence et de leur propriété lipophile, les hydrocarbures aromatiques polycycliques s’accumulent dans le foie et le cerveau, lieux principaux de métabolisation, avec pour conséquence de pouvoir entraîner des lésions hépatiques et des altérations cérébrales (troubles de l’anxiété liés à des altérations de la fonctionnalité cérébrale localisées dans des aires impliquées dans la régulation de ces comportements ainsi que des atteintes cognitives. L’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques modifie également la quantité et les caractéristiques des vésicules extracellulaires (nanovésicules entourées par une membrane) physiologiquement libérées par des cellules au sein de tout type d’organes. Des travaux ont mis en exergue la capacité des hydrocarbures aromatiques polycycliques à déclencher la libération de vésicules extracellulaires modifiées provenant d’hépatocytes qui, une fois absorbées par d’autres hépatocytes sains, peuvent entraîner la mort de ces derniers. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons : 1) les effets hépatotoxiques et neurotoxiques induits par une exposition répétée à un mélange d'hydrocarbures aromatiques polycycliques dans un contexte de NASH ou non chez le rat adulte, et 2) Les modifications en terme de niveau de production et caractéristiques des vésicules extracellulaires libérées par le foie et le cerveau et isolées du plasma et des urines de ces mêmes animaux.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des hydrocarbures aromatiques polycycliques et de nouvelles cibles thérapeutiques en décryptant le rôle des vésicules extracellulaires dans la physiopathologie de la stéatohépatite et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : 1) d’évaluer les effets d’une exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques dans un contexte enrichi en lipide ou pas, sur le niveau de production et les caractéristiques des vésicules extracellulaires et l’impact de ces changements sur les pathologies hépatiques et cérébrales, 2) de comprendre si les vésicules extracellulaires libérées par les cellules hépatiques et de la microglie, suite à l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques peuvent être des vecteurs de toxicité pour les cellules réceptrices, 3) de déterminer la fiabilité de la caractérisation ces vésicules extracellulaires en tant que biomarqueurs d’exposition et/ou de toxicité précoces, modèle facilement transposable chez l’humain, 4) d’évaluer l’interaction avec un stress de nature différente et d’identifier des comorbidités (la libération de vésicules extracellulaires et l’inflammation dues à une surcharge en acides gras libres au niveau plasmatique pouvant être considérée comme un stress supplémentaire venant s’ajouter à l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques).
Procédures
Ce projet inclura 3 lots regroupant 6 groupes d'animaux : 3 groupes nourris avec la nourriture standard de l'animalerie et 3 groupes alimentés avec un régime riche en lipides. Dans chaque bras, un groupe sera utilisé comme contrôle en étant administré avec l'huile végétale (huile isio 4, Lessieur, exempt d'hydrocarbures aromatiques polycycliques) analysée comme servant de véhicule pour la solution d'hydrocarbures aromatiques polycycliques, les 2 autres lots recevant la solution d'hydrocarbures aromatiques polycycliques à 2 doses différentes (80 ou 800 µg/kg de poids corporel). Les animaux seront nourris avec l'une ou l'autre nourriture pendant 30, 60 ou 90 jours et recevront de façon simultanée une administration de la solution d'hydrocarbures aromatiques polycycliques ou d'huile à raison d'une administrations par gavage (une minute par animal) quotidienne un jour sur deux au cours de la semaine (n'est pas prévu d'administration le week-end). Les animaux du lot 1 d’un total de 48 rats (n=8 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0, J28 et J58) et de l’urine (à J30 et J60, cage à métabolisme pendant 24h) pour une mise à mort à J60. Les animaux du lot 2 d’un total de 96 rats (n=16 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0 et J88) et de l’urine (à J90, cage à métabolisme pendant 24h) pour une mise à mort à J90. De plus, ce lot servira à explorer les performances comportementales au plan de l'anxiété (mesurée pendant 5 minutes), de l'activité (mesurée pendant 24h), des performances cognitives (mesurée pendant 2 séances de 10 minutes chacunes) et de la résignation (mesurée pendant 5 minutes) entre J60 et J90. Enfin, Les animaux du lot 3 d’un total de 36 rats (n=6 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0 et J88) et de l’urine (à J90, cage à métabolisme pendant 24h) pour une mise à mort à J90. Ce lot sera dédié à l’étude de la réactivité à un stress psychologique (exposition à un stress pendant une heure) et la tolérance au glucose. Ces 6 animaux seront réutilisés au 3 stades (J30, J60 et J90) pour pouvoir suivre chez les mêmes individus l'évolution de la tolérance au glucose (test d'une durée de 180 minutes) en lien avec le développement de la stéatose puis la stéatohépatite. Une fois les mises à mort effectuées, les tissus d’intérêts seront prélevés pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus tout au long du projet que suivront les animaux sont les suivants : stress lié à l'administration par gavage des hydrocarbures aromatiques polycycliques, l'inconfort qui pourrait etre lié à la prise de poids du fait des régimes alimentaires qui seront utilisés, le stress généré par le passage en cage à métabolisme pour une durée de 24h pendant laquelle l'animal sera isolé, l'isolement de l'animal lors de son passage pendant 24h dans le test d'actvité avec une roue d'activité, le stress/mal-être généré par le passage dans le test de Porsolt, le stress voire douleur liés à l'épreuve de réponse au stress et le test de tolérance au glucose (stress lié à la contention, aux prises de sang à la veine de la queue, pose et maintien de sonde rectale à demeure pour prise de température).
Devenir
La mise à mort des animaux se fera 24h après le prélèvement des urines en cage à métabolisme pour 48 rats à J60 et 96 rats à J90 après passage dans les tests de comportement. La mise à mort des 36 derniers animaux se fera 24h après l'étude de la réactivité au stress induite par une contention à J90. Après chaque mise à mort, les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L'objectif du projet étant d'étudier le rôle des vésicules extracellulaires produites au niveau du foie dans un contexte d'exposition à un régime enrichi en lipides ou pas, associé à une exposition répétée longue aux hydrocarbures aromatiques polycycliques dans le dialogue entre le foie et le système nerveux, il n'est pas possible de procéder au remplacement des animaux par un système alternatif. Aucun système alternatif ne permet de simuler le niveau de complexité de l'organisme entier nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 180 animaux prévu a été déterminé pour un calcul de puissance statistique de 80%, des effectifs égaux dans les 6 groupes expérimentaux (n=30/groupes) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. Par ailleurs ce nombre de 180 animaux est réparti en 3 lots de respectivement, 48, 96, et 36 rats destinés à des mesures à un stade déterminé pour chaque lot plutôt que d'avoir un seul lot nécessitant de répéter à chaque stade d'investigation un nombre conséquent de procédures contraignantes avec pour conséquence un risque en terme de mal-être des animaux tout au long de l'expérimentation et une prise en charge inadaptée compte-tenu d'un volume de travail trop important.
Raffinement
Le raffinement dans cette expérimentation tient dans la répartition des animaux en 3 lots distincts, destinés aux investigations prévues à un ou deux des 3 stades d'étude au cours de l'expérimentation (J30, J60 et J90). Il a été choisi de raffiner de la sorte l'expérimentation au détriment de la réduction du nombre total d'animaux pour garantir au mieux le déroulement de l'expérimentation et la prise en charge des animaux en matière de bien-être. Seuls les animaux destinés à l'étude de la réactivité au stress à J90 seront également sollicités à J30 et J60 pour la réalisation d'une épreuve de tolérance au glucose, procédure facile à mettre en œuvre et peu contraignante pour l'animal. Cette dernière sera réalisée de manière à suivre simultanément les niveaux de glucose et de corticostérone circulant, les hydrocarbures aromatiques polycycliques ayant un impact connu sur l’axe hypothalomo-hypophyso-surrénalien. Par ailleurs, les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation (installations agréées, conditions de température, d’hygrométrie et de lumière contrôlées, (22°C+/- 2°C, 55%+/-10%, cycle lumineux 12h:12h, allumage à 20h, eau et nourriture disponibles à volonté). Les animaux seront placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires en termes de rapport surface (900 cm2 et une hauteur de 18 cm minimum) / nombre d’animaux dans des portoirs ventilés avec une feuille de papier absorbant comme dispositif d'enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. La croissance des animaux soumis au régime riche en lipide sera évaluée régulièrement de manière à pouvoir maintenir les animaux par 2 dans des cages de plus grande taille afin d’éviter l'isolement de ces derniers et l'impact qu'il pourrait avoir sur leurs performances comportementales et leur bien- être. La prise de poids des animaux traités au régime riche en lipide ne devrait pas excéder 10 à 12% comparativement au contrôle. En ce qui concerne les prélèvements vigiles à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon à la lidocaïne. L’éventuel mal être lié à l’isolement en cage à métabolisme sera réduit en plaçant les cages les unes à côté des autres de manière à permettre une communication entre les animaux et sur une période limitée à 24 h et une seule fois.
Choix des espèces
Le projet de recherche nécessite le recours à des analyses physiologiques, cellulaires, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques induisant une stéatose hépatique non alcoolique. Les rats Sprague- Dawley sont utilisés pour la recherche sur la physiologie et le métabolisme. De plus, il a été montré dans la littérature que les rats Sprague-Dawley constitue un meilleur modèle d’étude d’induction de stéatose hépatique non alcoolique par voie orale que la souche Wistar. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.