Rats

42 rats mâles vont être utilisés, tués à l'issue par inhalation de dioxyde de carbone, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent une série de tests fonctionnels, dont champ ouvert, labyrinthe en Y, test d'agrippement, échocardiographie, exercice forcé sur tapis roulant et électromyographie, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur indique une perte de poids légère et un niveau de stress plus élevé chez ces rats, sans souffrance liée au phénotype selon lui. Il affirme que la thérapie génique ne peut être évaluée que dans un organisme vivant, ce modèle reproduisant selon lui la maladie plus fidèlement que la souris mdx.

Objectifs

Ce projet correspond à des recherches translationnelles qui rentrent dans le domaine « prévention, prophylaxie, diagnostic, traitement de maladies chez l’homme, l’animal ou la plante ». En effet, les dystrophies musculaires sont des pathologies invalidantes, dont une faiblesse musculaire, et sans traitement curatif à ce jour. Le modèle en question est un modèle rat de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), portant la grande délétion la plus commune dans le génome des patients DMD. Ce modèle sert à mieux comprendre la pathologie, en suivant sa mise en place et son évolution, ainsi que pour l'évaluation des thérapies pour la DMD.

Bénéfices attendus

La création et la caractérisation d’un modèle de rat portant la grande délétion la plus fréquente chez la population de patients DMD permettra d’avoir une meilleure compréhension du déroulement de la pathologie et des méchanismes impliqués dans la maladie. Une compréhension des mécanismes d’évolution de la maladie est nécessaire pour différentes voies de suivi clinique et traitement de la maladie. Une étude approfondie du modèle peut servir à la détermination de biomarqueurs efficaces pour un diagnostic rapide et un suivi convenable de la maladie. Le modèle joue un rôle important dans la découverte et compréhension de plusieurs voies impliquées dans la mise en place et la progression de la maladie, ce qui est nécessaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Enfin, le modèle servira pour tester des approches thérapeutiques développées par le laboratoire Généthon pour modifier le génome autour de l’exon délété ou dans le hotspot 45-55 afin de traiter de façon permanente la maladie de Duchenne.

Procédures

Nous allons réalisé les tests d'exploration fonctionnelle suivants à 3-4 et 9-10 mois d'age environ, sur 2 cohortes indépendantes, chacun des tests étant réalisés une seule fois: test du champ ouvert pour évaluer l'activité locomotrice et la réaction dans un nouvel environnement (30 minutes); test du labyrinthe en Y pour évaluer la fonction cognitive (8 minutes); test d'agrippement pour évaluer la force musculaire (2 minutes); échocardiographie/ECG pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaque, ainsi que l'activité électrique (10-15 minutes); exercice sur tapis roulant pour évaluer la performance à l'effort (20-45 minutes); électromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (20 minutes); deux prélèvements sanguins pour analyser les biomarqueurs (2 minutes en cas de prélèvement à la veine temporale superficielle sans anesthésie; 4 minutes en cas de prélèvement par voie rétro-orbitale sous anesthésie); le suivi du poids des animaux (1X/semaine)

Impact sur les animaux

A l’âge de l’étude (3-4 mois et 9-10 mois environ) aucune observation indiquant la souffrance de l’animal à cause de son phénotype n’a été indiquée. Une légère perte de poids par rapport aux rats non atteints a été observée aux âges de l’étude, sans affecter leur activité. Les rats DMD présentent un niveau de stress plus élevé que les rats non atteints. Les animaux subiront des tests fonctionnels qui induiront une souffrance minimale, sans induire des blessures ou autres formes d’atteinte physique. Lors du test d'effort qui peut entrainer une fatigue de l'animal (musculaire et/ou cardiaque), les animaux seront surveillés toutes les 30 minutes durant les 2 heures suivant l'interruption du test. L'échographie se déroule quant à elle sous anesthésie pendant toute la durée du test. Les rats seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Le rythme cardiaque et la respiration seront surveillés en continu tout au long de l'échographie. Si la fréquence cardiaque diminue ou si l'animal commence à mal respirer, le test sera arrêté et le rat sera mis dans une cage de réveil chauffée pour récupérer. Lors de l'EMG, si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Si un animal présente des difficultés respiratoires, l'expérience sera également stoppée. Il y aura deux prises de sang prévues, l'une après l'échographie et l'autre après le test d'effort sur tapis roulant. Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés par inhalation de dose croissante de CO2.

Remplacement

Ce projet a recours au modèle animal et au modèle rat en particulier pour les raisons principales suivantes : on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique ou d’édition du génome dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant. Deuxièmement, l’effet bénéfique d’un traitement sur un phénotype dystrophique au niveau histologique et au niveau fonctionnel va nécessiter une évaluation au niveau de l’organe atteint, en l’occurrence le muscle squelettique différencié et le cœur. Troisièmement, une caractérisation fonctionnelle au niveau des muscles squelettiques, cœur et cerveau du rat sont nécessaires pour la compréhension de mécanismes de la pathologie, à cause de l’implication de plusieurs voies et interactions de systèmes exploitables uniquement in vivo.

Réduction

Les protocoles d’études seront réalisés en incorporant le juste nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions. A cet effet, les 1ères études sont réalisées in vitro pour valider les hypothèses scientifiques et une étude-pilote sera réalisé avec 10 rats afin de valider les protocoles d'exercice sur tapis roulant et d'EMG selon les conditions expérimentales discutées avec le laboratoire porteur du projet. Par ailleurs, une étude préalable de caractérisation a été réalisée permettant de définir le niveau d’atteinte et les caractéristiques des animaux et de définir le nombre d'animaux minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats robustes. En particulier, nous utiliserons 7-9 rats de chaque génotype et 2 ages (3-4 et 9-10 mois environ) pour réaliser les analyses fonctionnelles. Cet effectif est réduit au maximum, mais suffisant pour assurer une analyse statistique fiable et reproductible. D'autre part, les échantillons sanguins ou prélèvement de tissus en cas de mortalité seront partagés avec le laboratoire partenaire afin d'éviter l'utilisation d'un deuxième lot d'animaux pour effectuer ces analyses complémentaires. Enfin, nous n'utiliserons que des males dans cette étude, la pathologie étant liée au chromosome X. Les males porteurs de la mutation sur le chromosome X seront ainsi porteurs de la pathologie et comparés à des males sains.

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance. En cas d’observation de la moindre douleur, les rats recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Des anesthésies seront appliquées lors des procédures d'échocardiographie/ECG et d'électromyographie.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé dans le cadre de la recherche de traitements pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Les modèles utilisés dans ce projet sont des rats, modèles représentatifs de la pathologie étudiée au niveau histologique, fonctionnel et génétique. Le rat est une espèce facile à manipuler, se reproduisant facilement et rapidement, et facile à héberger. Afin de pouvoir obtenir une évaluation de l’effet thérapeutique, nous utilisons des rats déficients en dystrophine, modèle portant une modification correspondant aux mutations les plus fréquentes dans DMD. Ce modèle rat reproduit notamment plus fidèlement la pathologie humaine, en comparaison au modèle de souris mdx. Il présente en particulier une atteinte cardiaque, ce qui nous permettra d’obtenir une évaluation thérapeutique sur le muscle cardiaque. Les rats seront adultes, agés de 3 et 9 mois environ au début des tests d'exploration fonctionnels (4 et 10 mois environ lors du dernier test, l'ensemble des tests étant réalisés sur une période de 4-5 semaines)

120 rats mâles de quatre souches vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une craniotomie créant deux trous dans la voûte crânienne, l'un laissé vide et l'autre comblé par une céramique, des séances d'imagerie répétées, puis une thoracotomie que le porteur décrit lui-même comme douloureuse, réalisée en condition péri-mortem. À la fin, les rats sont mis à mort pour analyser la réparation osseuse. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation osseuse, rendant selon lui le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La réparation / régénération osseuse est une composante importante de la pratique clinique et vise à combler les défauts de tissu osseux résultant de traumatismes, de défauts congénitaux ou d’excision de tumeurs. La réparation des grands défauts osseux (en particulier les défauts dits de taille critique, c’est-à-dire ceux ne réparant pas) reste en particulier un défi clinique. Dans le domaine de la régénération osseuse, en particulier en site maxillo-facial, le modèle de défaut au niveau du crâne est couramment utilisé pour évaluer la performance de nouveaux biomatériaux de comblement ou nouveaux protocoles de régénération osseuse. Quant au modèle animal, le rat est très largement utilisé en recherche orthopédique en raison de sa taille supérieure à la souris tout en gardant les avantages du rongeur, que sont la standardisation biologique des souches de rats, sa facilité d’élevage et la disponibilité d’outils d’évaluation en biologie et imagerie. Néanmoins, l'utilisation de différentes souches de rat dans les nombreuses études publiées chaque année (utilisant le même modèle chirurgical) est une cause de non-productibilité et d’impossibilité de comparaison des données. Dans ce cadre, l’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel de réparation de défauts crâniaux chez 4 souches de rats couramment utilisées par la communauté scientifique dans le domaine de la régénération osseuse et d’en mieux comprendre les mécanismes sous-jacents. Deux souches non-syngéniques (ayant une diversité génétique ; Wistar et Sprague-Dawley) et deux souches syngéniques (ayant une homogénéité génétique, Fisher et Lewis) seront utilisées et comparées. Nous utiliserons un modèle de défaut crânial 5mm de diamètre (dit sub-critique car large mais pouvant réparer) afin de pouvoir observer des différences entre les 4 souches. Deux défauts seront réalisés par rat (de part de d’autre de la suture dans l’axe fronto-dorsal) ; l’un des défauts sera laissé vide et l’autre comblé par un matériau en céramique macrostructuré pour évaluer le potentiel de régénération en absence et présence de biomatériau de comblement ostéoconducteur.

Bénéfices attendus

La comparaison de la réparation osseuse selon la souche de l’animal et la détermination de paramètres critiques responsables des différences observées devraient être d’une grande utilité pour la communauté scientifique, en particulier dans son choix de modèle pour les études à venir dans le domaine. Par ailleurs les résultats nous aideront à mieux comprendre les mécanismes de réparation et de non-réparation osseuse, en particulier dans des contextes cliniques peu favorables chez certains patients

Procédures

1-Craniotomies latérales et dépôt d’un implant ( 1X ; durée ~40 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (Max 7X; durée 15 min) 3- Prélèvement sanguin au niveau de la Veine saphène latérale ( Max 4X; durée 10 min) ; 4- Injection de fluorochromes (2X, durée 5 min) 5- Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Les craniotomies réalisées sont généralement bien tolérées chez le rat. Un effet indésirable potentiel est le glissement de l’implant sous la voute crânienne au moment de la pose. Cela nous est arrivé une fois ; les animaux sont scannés en post-op (encore sous anesthésie générale) et cet événement est donc tout de suite détecté. En telle situation, il est impossible de récupérer l’implant ; l’animal est donc euthanasié avant son réveil par injection massive d'anesthésique. Si cela arrive pendant les 12 semaines, et observé soit par un comportement inhabituel de l’animal dû à la compression du cerveau soit après imagerie par scanner, l’animal sera euthanasié. Ce projet comprend aussi une thoracotomie (ouverture de la cage thoracque pour accéder au coeur) . La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au μCT à une résolution de 9 μm + histologie des cranes réparés)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe . Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le suivi de la formation osseuse par imagerie in vivo et l'analyse du réseau vasculaire au temps final seront réalisées sur les mêmes animaux. Elles nécessiteront 8 animaux compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo et de l’étape de perfusion vasculaire qui, parfois faillit en ne remplissant pas parfaitement le réseau vasculaire, notamment les capillaires. L'évaluation de l’inflammation dans les défauts osseux nécessitera 6 animaux par groupe pour obtenir un pouvoir statistique suffisant. Le modèle de défaut osseux sub-critique (5 mm) permet de réaliser 2 défauts par animal de part et d’autre de la suture sagittale (jointure longitudinale qui relie les deux os pariétaux symétriques), et ainsi d’évaluer sur le même animal la réparation d’un défaut laissé vide et comblé par un matériau ostéoconducteur.

Raffinement

La souffrance sera limitée par analgésie pré-opératoire puis post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Pour chaque analyse (micro-scanner), les rats seront anesthésiés par anesthésie gazeuse. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. Les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. L'analyse du réseau vasculaire nécessite une thoracotomie et perfusion intracardiaque ; la thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem avant ouverte de la cage thoracique.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le rat male. Le rat est un bon compromis entre la souris (trop petite pour obtenir un défaut de taille suffisante pour l’évaluation d’implants massifs) et le lapin (couteux et trop gros pour permettre un suivi en imagerie micro-scanner in vivo). De plus le modèle de défaut au niveau de la calvaria est bien décrit dans la littérature et autorise la réalisation de défauts reproductibles et contrôlés. Les souches Wistar, Sprague-Dawley, Fisher et Lewis seront utilisées car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’impact de la souche de rat sur la réparation de défauts crâniaux. Jeunes adultes (3 mois) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.

Sous anesthésie, chaque rat reçoit dans le cerveau une injection de vecteurs viraux qui lui fait surproduire de la neuromélanine et développer peu à peu un syndrome parkinsonien. 56 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à cinq séances d'IRM de deux heures trente sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, et une observation de cinq minutes dans une cage propre en guise de test comportemental. Le porteur affirme que leur phénotype "n'est pas considéré comme dommageable dans la limite d'âge attendue", puis que le syndrome pourrait "mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats". Tous sont tués pour prélever leur cerveau et analyser les neurones de la substance noire.

Objectifs

La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.

Procédures

Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteurs viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 56 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 56 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min.

Impact sur les animaux

Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux AAV-hTyr. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats AAV-hTyr n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats AAV-hTyr, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de NM, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.

Réduction

Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. Au total un nombre de 56 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane et recevront une analgésie par dérivé d'opioïde (injection sous-cutanée par aiguille 25G) 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. Un gel oculaire sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux,une analgésie par dérivé d'opioïde (injection sous-cutanée par aiguille 25G) sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l'imageur par résonance magnétique 11,7T rongeurs. Un anesthésique local sera appliqué sous forme de gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique. Des points limite seront mis en place entraînant la mise à mort de l'animal (perte de poids supérieure à 10% lors du suivi hebdomadaire, hémorragie, accident d'anesthésie entraînant un arrêt respiratoire).

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés dès leur arrivée à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.

1000 souris et 1000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un millier d'entre eux réutilisés et les autres tués à l'issue. Ils subissent selon les cas une ligature d'un uretère, l'ablation des deux tiers puis de la totalité d'un rein ou des protocoles de diurèse, avec des prélèvements sanguins et une insuffisance rénale attendue, pour tester des candidats médicaments de firmes pharmaceutiques. Le porteur indique que les animaux des procédures chirurgicales sont euthanasiés pour prélever les reins, ceux d'une procédure pouvant être gardés vivants sauf si un prélèvement incompatible avec la survie est requis. Il reconnaît que des cultures cellulaires apportent des données préliminaires mais affirme qu'elles ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'environnement immunologique intact.

Objectifs

Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabète ou d’hypertension artérielle entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale chronique. L’insuffisance rénale aiguë, qu’elle soit par exemple d’origine obstructive (obstruction des voies urinaires dont la cause peut-être la présence de calculs ou d’un adénome prostatique) ou toxique (intoxication médicamenteuse), est également une situation clinique fréquente. Si elle n’est pas prise en charge, une insuffisance aiguë peut rapidement évaluer en insuffisance chronique. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales chroniques, aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. L’insuffisance rénale chronique est un enjeu majeur en santé publique. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Elle se caractérise par une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire conduisant à la destruction progressive du parenchyme rénal. L’insuffisance rénale peut rapidement détériorer l’état de santé des patients (exemples : anémie, fatigue, confusion mentale, troubles psychiques, hypertension, troubles du rythme cardiaque) ou mettre en jeu le pronostic vital (exemples : œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral, les infarctus du myocarde). Comprendre et lutter contre le développement de l’insuffisance rénale et de l’apparition de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments, ou de s'assurer qu'ils ne modifient pas la fonction rénale ou n'induisent pas eux-mêmes une insuffisance rénale.

Bénéfices attendus

Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'insuffisance renale aiguë ou chronique. Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter la fibrose rénale. Jusqu’à présent, la dialyse ou la greffe restent les seules stratégies appropriées.

Procédures

Dans les procédures chez la souris (fibrose par ligature d’un uretère, diurèse), un prélèvement sanguin terminal (sans réveil) sous anesthésie gazeuse (isoflurane) peut être réalisé. Dans les procédures chez le rat, un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (isoflurane) est réalisé juste avant l'euthanasie. Selon les besoins de l'étude (rat/souris), des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans ce cas, le volume prélevé sera inférieur ou égal à 15% de la volémie sanguine et ne sera répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure de ligature d’un uretère, une phase de chirurgie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés (isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Un uretère est ligaturé. Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récupération post-chirurgicale, les animaux reçoivent un antalgique. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la ligature de l’uretère. Dans la procédure de 5/6 néphrectomie, deux phases de chirurgie sont nécessaires. Pour chaque phase (espacée d’une semaine), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une petite laparotomie latérale est pratiquée en condition d'asepsie. Dans la première phase, le rein gauche est exposé et les 2/3 du rein sont excisés. Dans la seconde phase, le rein droit est entièrement excisé. Après chaque phase de chirurgie, les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la 5/6 néphrectomie. Dans les 3 procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude. Le traitement est généralement effectué en une occasion (procédure de diurèse) ou pendant plusieurs semaines (4 ou 12 semaines maximum après la ligature d’un uretère ou la 5/6 néphrectomie).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédures, il est attendu une insuffisance rénale. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (réduction de la masse rénale, ligature unilatérale d'un uretère), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Pendant les périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum), l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Après la procédure de ligature d'un l'uretère, la rétention de l'urine ou hydronéphrose peut être accompagnée de douleurs lombaires. Les stades d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde, observés chez l'homme à un stade avancé de l'insuffisance rénale nécessitant le plus souvent une greffe (d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) ne sont pas atteints dans les procédures décrites dans ce projet (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.

Devenir

Dans la procédure 1, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang (et/ou un prélèvement d'organe) non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures 2 et 3, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

En amont des tests in vivo sur des modèles d’insuffisance rénale, des tests in vitro (exemple: culture cellulaire 3D de fibroblastes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (mort cellulaire, prolifération des fibroblastes, modification de la matrice extracellulaire), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 6-12 animaux par groupe selon la procédure (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur le système renal du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et et 6 mois, conformément aux données historiques.

224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur

Bénéfices attendus

Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.

Impact sur les animaux

Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, puis une plongée simulée en caisson hyperbare suivie d'une heure d'observation pendant laquelle un accident de décompression peut provoquer des symptômes douloureux. Le porteur indique que les rats seront tués dès l'apparition des premiers symptômes, et qu'ils sont tous mis à mort pour prélever sang et organes. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de biomarqueur fiable et par l'étude sur "l'organisme entier".

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) est un syndrome systémique survenant suite à la formation de bulles dans la circulation sanguine et dans les tissus lors d’une diminution de la pression environnementale. Les mécanismes de l’ADD sont encore aujourd’hui assez peu connus et cet accident est décelé uniquement sur la base des symptômes qu’il déclenche. Dans le but d’approfondir les connaissances sur le rôle de l’inflammation et de la coagulation dans la mise en place et la susceptibilité à l’ADD, nous allons étudier les réponses cellulaires de globules blancs et de plaquettes lorsque ces dernières sont exposées à différents stress rencontrés en plongée. L’objectif de ce projet est donc double : (i) confirmer/infirmer l’existence d’une relation entre la résistance à l’ADD et des modifications fonctionnelles des globules blancs et des plaquettes, (ii) étudier les différences liées au sexe dans les mécanismes de résistance à l’ADD.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de résistance à l’accident de décompression (ADD) ainsi que les mécanismes physiologiques impliqués dans la mise en place de ce syndrome. Ces travaux pourront être bénéfiques en santé humaine et plus particulièrement dans un cadre de prévention de l’ADD. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension de la sensibilité à l’ADD. Plus particulièrement, sur l’implication des réponses leucocytaires et plaquettaires face à une modification de la pression hydrostatique et de la pression de l’air. A moyen terme, l’intégration de ces réponses au niveau physiologique et la caractérisation du type de stress ayant eu un impact plus marqué sur les réactions cellulaires permettra d’orienter nos recherches futures. A plus long terme, la mise en évidence de facteurs de risque permettrait de prévenir l’ADD avant une plongée. La perspective d’avoir une meilleure approche sur les mécanismes de l’ADD permettrait de mettre en place des protocoles de décompression toujours plus fiables afin de mieux prévenir l’accident.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire réalisé sous anesthésie / analgésie. Si cela est nécessaire, les animaux de l'étude préliminaire pourront être soumis à un deuxième prélèvement sanguin dans les mêmes conditions. Les deux prélèvements seront séparés d'une période de 3 semaines. Au minimum 4 semaines après le dernier prélèvement retro-orbitaire, les animaux seront soumis à un protocole hyperbare de 60 minutes au total suivi d'une période d'observation d'1 heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - Le stress lié à la préhension et à l’injection d'asnesthésiques / analgésiques. Ces nuisances légères ne durent que le temps de l’injection (1 – 2 minutes). - Une possible diminution de la température corporelle au cours de l’anesthésie. Cette nuisance est légère et dure environ 20 minutes. - Le prélèvement sanguin au niveau du sinus rétro-orbitaire entraine un stress. Ces nuisances ne durent que le temps du prélèvement (1 – 2 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée. Cette nuisance est légère et dure 2h30 (temps de l’exposition hyperbare et temps d’observation). - La douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD lors de la période d’observation. Ces nuisances seront modérées et très brèves (moins de 1 minutes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure car nous avons besoin de prélever du sang et des organes afin de réaliser des analyses multiples (Cultures primaires, dosages sanguins (facteurs inflammatoires, facteurs de coagulation), histologie…).

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude de la sensibilité à l’accident de décompression (ADD). Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler uniquement sur le modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident. De plus, l’accident de décompression est un syndrome systémique impliquant de nombreuses réponses autres que l’inflammation et la coagulation comme le stress oxydant et la dysfonction vasculaire par exemple. L’analyse des tissus post exposition hyperbare nous permettra de confronter nos résultats obtenus au niveau des globules et des plaquettes sanguines à ce que l’on observe sur l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et de permettre la réalisation d’une mise au point de la culture primaire (déterminer la quantité de cellules que nous pouvons mettre en culture suite au premier prélèvement, viabilité cellulaire…). Les tests statistiques utilisés intègreront 2 facteurs à étudier : susceptibilité à l’accident de décompression et sexe. De plus, après mise à mort des animaux, les prélèvements tissulaires vont nous permettre d’approfondir nos résultats de manière intégrée en sortie de plongée.

Raffinement

Tout au long du protocole, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et les animaux sont suivis quotidiennement. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. Pour réduire au maximum la douleur du prélèvement sanguin, l’animal sera ponctionné sous anesthésie/antalgie. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par voie gazeuse afin de réduire au maximum le stress lié à la préhension et à l’injection. L’animal sera placé sur tapis chauffant et sa température corporelle sera monitorée jusqu’au réveil. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole de plongée utilisé limite au maximum l’apparition d’ADD sévère et les animaux seront mis à mort dès l’apparition des premiers symptômes pour réduire au maximum la souffrance.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, en particulier sur la souche Wistar qui est couramment utilisé au laboratoire afin de caractériser les mécanismes de résistances à l’accident de décompression. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement. Lors de l’étude préliminaire, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 8 et 11 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 15 semaines. Lors de l’étude définitive, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 10 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 14 semaines.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit une injection de collagénase dans un disque de sa queue pour provoquer une discopathie que le porteur décrit comme une douleur "intense et longue", puis une pompe analgésique, une injection de plasma enrichi en plaquettes et un suivi par IRM chaque semaine pendant douze semaines. À la fin, les rats sont tués pour prélever leur queue et réaliser des coupes histologiques. Le porteur présente l'application à l'humain comme un transfert facile si la régénération du disque est démontrée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de l'injection de Plasma riche en plaquettes (PRP) pour la régénération discale chez le rat.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de deux ordres : 1) si l’injection de PRP permet une régénération discale chez le rat, ceci pourra être facilement transféré en clinique pour aider au traitement des discopathies humaines. 2) l’IRM est une méthode d’imagerie non-invasive qui devrait permettre d’évaluer l’efficacité thérapeutique du PRP sans biopsie et à des temps précoces.

Procédures

Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale, grâce à l'inhalation d'isoflurane à dose contrôlée. Chaque rat de ce projet subira une discopathie dans 1 disque de la queue grâce à une injection de collagénase. Sept jours plus tard, une pompe osmotique sera implantée en sous-cutané pour libérer un analgésique en continu. Puis 1mL de sang sera prélevé par la veine caudale pour préparer le PRP. Celui-ci sera injecté dans le disque pathologique la même journée. Finalement, des examens IRM seront réalisés 1 fois par semaine (sans nécessité d’injection d’agents de contraste) pendant 12 semaines.

Impact sur les animaux

La discopathie mécanique entraine une douleur intense et longue si elle n’est pas soignée, comme c’est le cas chez l’humain. C’est pour cela qu’une administration continue d’analgésique sera réalisée depuis l’induction de la maladie jusqu’à l'euthanasie de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés lorsque les points limites seront atteints ou lorsqu'ils auront subi les 12 semaines de suivi IRM. Cette euthanasie est nécessaire pour prélever les queues et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence de sites inflammatoires, valider la régénération du complexe disco-vertébral et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.

Remplacement

La technique IRM permet de définir, chez l’homme, la maladie établie. Notre projet, à visée translationnelle, vise à optimiser une séquence IRM permettant un diagnostic plus précoce de la maladie humaine de discopathie dégénérative, afin d’améliorer la prise en charge de la maladie chez l’homme. Ce projet utilise un modèle animal de discopathie chez le rat dans cet objectif.

Réduction

Seulement 12 rats seront utilisés car notre étude précédente a permis de suivre par IRM l’inflammation discale sans traitement par PRP. Nous souhaitons donc désormais utiliser principalement des rats traités au PRP. Nous analyserons la différence de vitesse de réparation du disque entre les 2 groupes. Un test Anova sera pratiqué.

Raffinement

Les 12 rats seront répartis dans 4 cages avec des tubes en carton, de la paille, du coton, un bois à ronger, de la nourriture et de l’eau à volonté. Des observations quotidiennes et des scorages d’évaluation de la douleur hebdomadaires seront pratiqués dès le début de l’expérimentation pour évaluer l’évolution de la maladie. De ce fait, des points limites ont pu être établis. La cellule bien-être du laboratoire sera impliquée quotidiennement dans l’évolution du protocole. L’analgésie sera appliquée dès le début de l’expérimentation sur l’animal, et sera administrée en continue grâce à l’installation de pompes osmotiques en sous-cutanée tout au long des 12 semaines d’observations IRM.

Choix des espèces

Les rats Lewis seront utilisés du fait de leur utilisation courante dans la littérature. Nous pourrons ainsi comparer facilement nos résultats. Comme nous souhaitons transférer les séquences IRM 3D nouvellement développées à l’homme, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g pour les rats) car la croissance est terminée et le prélèvement sanguin de 1 mL possible.