Rats
Mesure de l’activité cérébrale par électrocorticographie chez le rat (Avenant)
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, puis des inhalations répétées de solvants organiques comme le toluène en chambre, avec des tests comportementaux et un test du nystagmus post-rotatoire. Le porteur indique que de fortes concentrations peuvent provoquer troubles de l'équilibre et tremblements, censés disparaître dans l'heure suivant l'exposition. Il rattache le projet à la fixation de valeurs limites d'exposition des salariés et écarte le remplacement, l'électrocorticographie n'étant pas réalisable in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la mise en place d'une méthode de suivi en temps réel de l’action des solvants organiques sur le cerveau par une mesure de l’activité cérébrale. Cette méthode d’enregistrement sans fil permettra de mesurer ces effets chez des animaux vigiles et libres de leurs mouvements lors de l’inhalation des solvants dans des chambres à atmosphère contrôlée. En outre, divers tests comportementaux seront réalisés en fin d’exposition afin de mettre en relation les modifications de l’activité du cerveau avec d’éventuelles déficiences motrices et/ou sensorielles. Ceci permettra d’avoir une vue d’ensemble sur les effets neurotoxiques aigus d’une exposition aux solvants organiques volatils.
Bénéfices attendus
L’e xposition des salariés à des solvants peut conduire à une dépression du système nerveux central et mener à une altération de leurs performances psychomotrices. L’exposition aux solvants peut donc être responsable de d’accidents du travail. Ainsi, afin de protéger la santé des salariés et limiter l’exposition de ces derniers à de fortes doses de solvant, des valeurs limites d’exposition ont été mise en place. Néanmoins, les relations doses/réponses des solvants sur l’activité cérébrale sont mal connues. Ce projet vise à proposer une méthode de mesure objective de l’effet des solvants sur le système nerveux central et d’améliorer les connaisances sur les risques liés aux expositions aiguës aux solvants organiques.
Procédures
Procédure 1 : Etude pilote (N=16) : N=12 : Chirurgie (1h) ; Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; inhalation « toluène » + électrocorticographie (4 x 8h) ; mise à mort et prélèvement de tissus N=4 : Mise à mort et prélèvement de tissus Procédure 2 : Mesure de l'activité cérébrale par électrocorticographie et analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=56) N=14 par dose de solvant : Chirurgie (1h) ; [Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; Comportement (30min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 3 : Mesure du nystagmus post-rotatoire suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : Chirurgie (45min) ; [Inhalation « contrôle » (4 x 8h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 4 : Analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : [Inhalation « contrôle » (4 x 8h); Comportement (30min); Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 5 : Prélèvement sanguin et de tissus neuronaux suite à l’exposition aux solvants (N=96) N=8 par temps de prélèvement (temps 1 : à la fin du 4ème jour des périodes « solvant » ; temps 2 : à la fin de la semaine post-exposition). Les animaux seront mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Dans le cas où les quantités de solvant dans le sang ou le cerveau sont égales à zéro après une semaine de récupération lors de la phase expérimentale 1, le nombre de rats mis à mort au temps 2 pourra être réduit à n=4 pour les expérimentations suivantes.
Impact sur les animaux
Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant. Ils pourront présenter des signes cliniques tels que des troubles de l'équilibre ou des tremblements. Ces signes cliniques devront, néanmoins, disparaître dans l'heure qui suivra la fin de l'exposition.
Devenir
La totalité des animaux prévus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour obtenir des résultats exploitables puisque : - notre approche expérimentale, qui vise à étudier l’activité cérébrale par électrocorticographie, n’est pas possible in vitro. - notre projet étudie les atteintes au niveau comportemental et neuro-sensoriel, expérimentations qui ne peuvent être réalisées que sur l'animal vivant.
Réduction
Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux requis soit réduit à son minimum. Autant que possible, l’utilisation de chaque animal a été optimisée pour récolter un maximum de mesures, à la fois fonctionnelles, comportementales et histologiques. Sont décrites ci-dessous les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux : 1) Les animaux seront leurs propres contrôles : Ils seront exposés initialement à une période de 4 jours d’air ambiant (période « contrôle ») puis 4 jours à des vapeurs de solvants organiques (période « solvant »). Les mêmes mesures fonctionnelles et comportementales seront réalisées pendant et à la fin de ces deux périodes pour comparaison. 2) Lors de la phase expérimentale 2, les effets fonctionnels et comportementaux de trois doses incrémentales du même solvant seront testés sur les mêmes animaux. Chaque exposition à une dose de solvant sera précédée d’une période « contrôle » afin de s’assurer que les animaux sont bien à leur niveau basal en terme de fonction cérébrale et de comportement. 3) Les animaux dont l'activité cérébrale sera mesurée pendant l'exposition aux solvants réaliseront également certains tests comportementaux, et seront ensuite mis à mort pour analyse histologique des tissus d’intérêt. 4) Les animaux dédiés aux tests comportementaux, mais dont l’acitivité cérébrale n’est pas enregistrée, seront également utilisés pour le dosage des solvants dans les tissus d’intérêt afin de réduire au maximum le nombre d’animaux concernés par la procédure de prélèvement seule.
Raffinement
1. Pe ndant toute la durée du projet, les animaux seront traités avec douceur et compassion par le personnel compétent. Des caresses seront prodiguées lors de chaque manipulation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébérgés (si possible) par deux. Leur environnement sera enrichi par un tunnel en carton. 2. Concernant les chirurgies : - Afin d'atténuer la douleur, les animaux recevront un analgésique pré-opératoire et un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l'animal (deux fois à 24h d’intervalle) après les chirurgies. - Pendant l'intervention chirurgicale : o Un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire o La température corporelle de l'animal sera maintenue à l’aide d’une couverture chauffante thermorégulée. - A la fin de l'intervention chirurgicale : o Une pommade sera appliquée afin d’accélérer le processus de cicatrisation. o Une injection de sérum physiologique sera faite afin de palier la déshydratation de l’animal, inhérente à la chirurgie - Suite à l’intervention : o Le réveil des animaux se fera dans une armoire chauffante ; ils bénéficieront d’une surveillance accrue avant le retour dans leur pièce d'hébergement. o De la nourriture sous forme de bouchon et sous forme gélifiée sera mise à disposition à l'intérieur de la cage. o Les animaux bénéficieront d'une période de suivi post-opératoire de 5 jours pendant laquelle ils seront observés (afin de déceler tout signe de douleur ou toute modification comportementale) et pesés quotidiennement. o Les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter l'exploration de sites d'incision et de suture par leurs congénères et la détérioration du dispositif implanté, mais seront mis dans des cages transparentes afin de garder un contact visuel entre eux. 3. Concernant les inhalations de solvants : - Les animaux seront habitués progressivement à être placés dans les enceintes d'inhalation afin de diminuer le stress lié à ce nouveau lieu. - Pendant la période d'exposition, les animaux seront observés toutes les 2 heures et une fiche de suivi clinique individuelle sera remplie en cas d'observation de signes de souffrance chez un animal. 4. Concernant les tests comportementaux : - Les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins deux semaines avant le début des expositions.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal s’est porté sur les rats Long Evans. En effet, le rat présente un métabolisme des solvants proche de celui de l'Homme. De plus, les tests comportementaux utilisés ici visent à évaluer les atteintes des solvants sur le fonctionnement de l’oreille interne. Les expérimentations, donc, doivent être menées sur des souches de rat pigmentées car, comme chez l'Homme, la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne (les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants). Les rats seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 3 mois) car l'oreille interne ainsi que les cytochromes présents dans le métabolisme des solvants doivent être matures.
ONCO-SC Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 5000
Près de 250 études par an, au gré des commandes des clients : 62 500 rongeurs, soit 57 500 souris et 5 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une société prestataire de recherche préclinique leur greffe des tumeurs sous la peau, dans la peau ou dans la graisse mammaire, puis leur administre des composés anticancéreux par le nez, la trachée, la bouche ou par injection, jusqu'à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde. Dans le résumé publié, la description des effets néfastes s'arrête au milieu d'une phrase, sur "une évolution du volume tumoral". Le porteur affirme que seuls les petits rongeurs offrent un statut immunodéprimé "indispensable à l'implantation de cellules tumorales humaines". Sur le devenir, il écrit seulement "Les animaux seront mis à mort", alors que le champ structuré déclare 3 000 souris et 200 rats réutilisés.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Implantation de transpondeur pour identifier l’animal en sous cutané, sous anesthésie générale (Isoflurane 3-5%) en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe. Induction tumorale : Sous anesthésie Test de composés chimiques ou biologiques : - Administrations intra-nasales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%), maximum 25µL par narine. - Administrations intratrachéales sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%). - Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale (isoflurane 3-5%) si nécessaire, si possible sous contention. - Administrations PO sous contention Mesure des animaux : sous contention Prélèvements : - Sang : o prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale à l’isoflurane (exemple non exhaustif : veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire). o prélèvement par piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention. o prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Ensuite, constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale. - Prélèvements de tissus (foie, cœur, poumons etc…) post mortem. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique, confirmée par une deuxième méthode physique. Le pentobarbital sera évité en cas de prélèvement des poumons du fait de son caractère irritant. - Mise à mort par le CO2, confirmée par une deuxième méthode physique. Cette méthode sera évitée en cas de prélèvement des poumons. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir : prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale
Impact sur les animaux
Trois types de greffe pourront être faites dans ce projet : Sous cutanée, intradermique et dans la graisse mammaire. Dans chaque cas, il y aura une évolution du volume tumoral ce
Devenir
Les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. Près de 250 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit. Pour des études de screening de composés ou de modèles, il sera proposé d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe (Single Mouse Trial). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Dans l’objectif de raffinement, toutes les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la structure chargée du bien-être animal. Pour les nouveaux modèles la SBEA analysera les conséquences des procédures sur le bien-être des animaux, la validité des résultats scientifiques obtenus, et ils détermineront les points limites. Toutes les procédures invasives, mais aussi la plupart des procédures faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle tumoral. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal est observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance, sont suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Trois types d’enrichissements sont systématiquement ajoutés (sizzle-dri (souris), hutte ou tunnel (rats), batônnets, nourriture dans la cage) La greffe de tumeur est une procédure de gravité modérée, réalisée sous anesthésie générale gazeuse à l’Isoflurane. Lorsque l’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprenorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. En cas de toxicité sur l’animal, afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel validée par la SBEA sera suivi par l’équipe projet. Pour le raffinement, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Dans de rares cas il sera possible de travailler avec des animaux plus jeunes (4 semaines d’âge minimum pour leur réception et 6 semaines pour la manipulation).
Etude de l’effet de composés sur la régénérescence des fibres nerveuses lésées consécutives à l’écrasement du nerf sciatique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur nerf sciatique est écrasé chirurgicalement, puis des composés sont administrés et l'état évalué par un test de répartition du poids et une mesure de conduction nerveuse, sur trois mois au plus. Le porteur indique que la chirurgie et l'écrasement du nerf peuvent provoquer des douleurs et que les effets secondaires des composés en développement ne sont pas connus. Il qualifie d'"incontournable" le recours à l'animal et conclut que les cultures cellulaires n'apportent que des réponses partielles.
Objectifs
La neuropathie périphérique désigne l'ensemble des maladies des nerfs périphériques issus de la moelle épinière. Ces pathologies peuvent avoir des causes variées comme le diabète, la carence en vitamine, des phénomènes inflammatoires, les traitements anti-cancéreux ou des traumatismes. Au vu de l’incidence de ces pathologies et de leur impact sur la qualité de vie des patients de nombreuses recherches sont menées pour prévenir les neuropathies ou favoriser la réparation des nerfs périphériques. Dans ce projet nous nous intéressons aux neuropathies induites par un traumatisme mécanique. Chez l’homme, ce phénomène se produit lors d’un accident qui provoque la section ou l’écrasement d’un nerf. Afin de mimer ce qui se passe chez l’homme, l’écrasement du nerf sciatique chez le rat est un modèle largement utilisé pour décrire les processus de neurodégénérescence mis en oeuvre mais aussi évaluer des moyens de favoriser la réparation nerveuse. Dans ce projet nous utiliserons ce modèle d’écrasement du nerf sciatique pour évaluer l’effet de traitement qui améliore la récupération du nerf lésé. Nous utiliserons plusieurs tests pour évaluer l’état clinique des animaux afin de déterminer si les nouveaux traitements en cours de développement peuvent être bénéfiques ou non pour les patients.
Bénéfices attendus
Il est attendu que ce projet permette de mettre en évidence le potentiel de nouvelles molécules pour la régénération nerveuse. Cela serait une grande avancée pour les patients ayant subit des dommages invalidant lors d’accident par exemple.
Procédures
L'ensemble des animaux subiront une chirurgie (durée 30min maximum) sous anesthésie. Les douleurs peri-opératoires sont prises en charge par un traitement antalgique et anti-inflammatoire. Après la chirurgie les animaux pourront être traité par le composé à étudier (4 administrations par jour maximum incluant les traitements antidouleurs) puis ils seront évalués dans deux tests différents : un test de répartition pondérale lors de déplacement libre (durée 7 min) et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie gazeuse (durée 10 min). Chaque test est réalisé au maximum une fois par semaine pendant 3 mois maximum. A la fin de l’expérience un prélèvement sanguin peut être effectué juste avant la mise à mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Ce projet faisant appel à une chirurgie, les douleurs péri-opératoires sont probables. Il n’est pas exclu que l’écrasement du nerf engendre des douleurs. Comme nous administrons des composés qui sont en phase d’études pré-clinique leurs effets secondaires potentiels ne sont pas connus et peuvent apparaitre au cours de l’étude. De plus les traitements qui sont souvent appliqué de façon chronique peuvent engendrer des contraintes sur nos animaux.
Devenir
Tous les animaux sont tous mis à mort à la fin de la procédure soit parce qu’ils subissent des prélèvements de sang ou de tissus soit en raison de la procédure sévère qu’ils viennent de subire.
Remplacement
Ce projet a pour but de développer des molécules à visée thérapeutique. Dans ce domaine, l’utilisation des animaux demeure incontournable. En effet, beaucoup de facteurs sont mis en jeu pour aboutir à une réponse globale de l’animal. Ainsi, les systèmes réduits comme les cultures cellulaires ou les modèles in-silico n’apportent que des réponses sur les mécanismes cellulaires ou moléculaires étudiés. De plus, ces expérimentations permettent de mettre en évidence des effets secondaires qui sont par principe non recherchés et difficiles à prévoir. Ces études restent incontournables avant une étude clinique et ne peuvent être remplacées par des expérimentations in vitro.
Réduction
Nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe après analyse de puissance statistique. Les différents groupes de l’études seront comparés réalisées à l’aide de tests statistique permettant d’évaluer l’effet de nouveau composés sur la régénérescence nerveuse consécutive à une lésion par écrasement du nerf sciatique chez le rat. De plus, nous cherchons toujours un compromis expérimental qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par exemple, nous favorisons le test de plusieurs conditions expérimentales en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes témoins. Quand c’est possible nous utiliserons la patte contra-latérale de chaque animal comme contrôle de la patte lésée . Sur une période de 5 ans, nous envisageons de mettre en oeuvre 4 études par an. Pour chaque étude, nous prévoyons un design expérimental comportant 3 différents groupes test en plus du groupe témoin contrôle sans chirurgie et du groupe témoin avec chirurgie. Chaque groupe expérimental comporte 10 animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations : nourriture et eau ad libitum, température et hygrométrie strictement contrôlées, enrichissement important du milieu, soins. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Le projet comprend une gestion de la douleur par rapport à l’intervention chririgicale réalisées. Un traitement antalgique et anti-inflammatoire est réalisé an amont et en aval de l’opération qui elle-même se déroule sous anethésie gazeuse.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes car les pathologies modélisées dans ce projet ne sont pas des pathologies liées au vieillissement. De plus les animaux doivent pouvoir supporter une intervention chirurgicale sans altération de leur état général.
Imagerie TEP-IRM pour l’identification des métastases chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'un cancer disséminé, ils subissent un jeûne, un prélèvement de sang et une imagerie sous anesthésie avec mise à mort avant réveil, pour valider une caméra hybride TEP-IRM de détection des métastases. Le porteur indique que les métastases peuvent toucher plusieurs organes et provoquer une perte de poids, les animaux étant suivis trois à cinq jours jusqu'à la mise à mort. Il écarte le remplacement au seul motif que l'étude des métastases ne peut s'affranchir du modèle animal.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladie plus disséminées du fait de l’apparition de métastases. Il est aujourd’hui difficile en routine clinique de déceler les métastases dans toutes les parties de l’organisme en utilisant une seule technique d’imagerie. En effet, l’examen clinique de routine consiste dans la détection des cellules cancéreuses grâce à l’injection d’une petite dose d’un glucose radioactif. Les cellules cancéreuses étant très actives métaboliquement, elles vont fixer ce glucose et être détectées grâce à un examen d’imagerie TEP (tomographie par émission de positons). Cependant, On détecte aussi sur ces images des zones non cancéreuses car très consommatrices de glucose comme le cerveau ou le cœur, ou les voies d’éliminations du produit comme les reins et la vessie. Ces zones peuvent gêner à l’interprétation des images et masquer des lésions. Les caméras TEP sont la plupart du temps couplées à un scanner qui ne permet pas la détection de lésions cancéreuses. Une nouvelle technologie permettant d’obtenir un meilleur contraste au niveau des tissus mous comme l’IRM (imagerie de résonance magnétique) présenterait donc théoriquement un grand intérêt pour identifier des lésions rénales ou cérébrales non détectables en TEP. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est de montrer l’intérêt d’une caméra hybride permettant de réaliser en simultané 1/ une imagerie d’un traceur radioactif grâce à une caméra ou TEP, et 2/ une imagerie IRM dans un modèles animal de maladie métastatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de montrer l’avantage de l’imagerie hybride TEP/IRM (en cours de développement pour des applications cliniques) dans la détection des métastases. A terme, le diagnostic des patients atteints de maladie métastatique sera amélioré. Il sera possible également de mieux suivre l’efficacité des traitements en examinant l’évolution des métastases de façon plus précise.
Procédures
les animaux subiront les actes suivant : * mise à jeun de 4-6h (avec accès à l’eau) * prélèvement d’une goutte de sang (10 à 20 µL) à la queue. * injection intraveineuse puis imagerie sous anesthésie avec euthanasie avant tout réveil
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de cancers disséminés sont susceptibles de présenter différents signes cliniques identifiés grâce à l’expérience de nos collaborateurs préparant le modèle. Ces signes sont en relation avec la localisation possible des métastases (ganglions lymphatiques, ovaires, surrénales, cerveau, os et poumons). La perte de poids est cependant le critère le plus souvent observé. Les animaux seront suivis quotidiennement de leur arrivée à leur euthanasie (3 à 5 jours maximum). Le suivi sera intensifié si des signes de détresse sont observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’imagerie afin de pouvoir identifier la localisation des métastases et valider notre technique d’imagerie diagnostique.
Remplacement
L’étude de la maladie métastatique et de traceurs du métabolisme ne permet pas de s’affranchir de modèles animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de faire préparer le modèle par une équipe expérimentée afin de s’affranchir de l’utilisation d’animaux supplémentaires pour la mise en place du modèle. La réalisation de l’étude en 2 étapes nous permettra de stopper l’expérimentation si l’effectif est suffisant pour conclure et réduire le nombre d’animaux de moitié.
Raffinement
L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures impliquant les animaux (injection intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Le modèle animal et les techniques d’imageries ont été développés et caractérisés chez le rat. Les rongeurs sont un modèle de choix en imagerie car leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
Effets du venin d’abeille, et de son dérivé non allergène le delta venin sur les déficits engendrés dans un modèle animal chirurgical de la Maladie de Parkinson chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
175 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de lésion de la substance noire puis huit injections de venin d'abeille, avec des tests moteurs (cylindre, labyrinthe en croix, rotameter), pour évaluer un effet antiparkinsonien. Le porteur indique que la chirurgie et les injections répétées peuvent provoquer perte de poids, inflammation de la suture et lésions cutanées, et que tous les cerveaux seront prélevés après mise à mort. Les retombées annoncées restent un préalable à une éventuelle étude chez l'homme, tandis qu'une partie des données servira à un travail dirigé d'étudiants.
Objectifs
Chez l'homme, la MP engendre des déficits moteurs tels que l'akinésie , la bradykinésie, la rigidité musculaire et le tremblement de repos. Chez l'animal, la catalepsie peut être mesurée et est un bon indice du symptome d'akinésie de la MP : une étude pilote sur le modèle pharmacologique nous a permis de connaître la dose efficace ainsi que la cinétique de différentes molécules candidates antiparkinsoniennes : le venin d'abeille (Bee Venom, BV 1/3/5 µG/kG)/ et le venin d'abeille sans son composé allergène, le deltaBV (1/3/10 µG/kG). Toutefois, il est nécessaire de valider les effets de cette molécule dans un autre modèle animal de la MP (modèle chirurgical) imitant la dégénérescence des neurones dopaminergiques. Ce modèle consiste en la lésion unilatérale totale de la substance noire. Ce modèle nous permettra d'aller plus loin dans la connaissance de l'effet thérapeutique des diverses molécules au moyen de plusieurs tests moteurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique de la première étude utilisant un autre type de BV (alyostat)- Mise en évidence de l'effet bénéfique du dBV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme. - Collecte de données pour la réalisation d'un TD
Procédures
Dans le modèle chirugical de la MP, les rats seront opérés (chirurgie de 45 min) puis seront injectés 2 semaines après en ip avec le BV ou le dBV selon le groupe. Ils seront injectés au total 8 fois : en J16/J19/22/25/28/31/34/37 et 40. En J40 les groupes lésés (soit 8 groupes) recevront une dose d'apomorphine (0.1 mG/kG). Les animaux seront testés ensuite en comportement , au niveau du test du cylindre et du cross maze (J16/J22/J28/J34) et au niveau du rotameter (J40)
Impact sur les animaux
La lésion induit plusieurs effets indésirables : une perte de poids après la chirurgie, une possibilité d'inflammation au niveau de la suture. De plus, les injections ip ou sc répétées peuvent induire des lésions cutanées au site d'injection.
Devenir
L'ensemble des animaux (175) sera euthanasié et leur cerveau sera prélevé afin d'effectuer des vérifications histologiques de la lésion.
Remplacement
Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez le rat qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. Le modèle chirurgical de lésion unilatérale de la substance noire chez le rongeur induit des symptômes moteurs (assymétrie posturale)qui ne peuvent être observés que sur l'animal vigile.
Réduction
56 rats proviennent d'une étude antérieure. Les données collectées lors de cette étude vont pouvoir servir de base pour de nombreuses promotions d'étudiants de 2ème année de BUT. De plus, cette étude repose sur l’utilisation d’un modèle chirurgical de la MP et de tests comportementaux validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux necessaire pour obtenir des données fiables. Des études statistiques en amont (GPower) ont été effectuées pour aboir une significativité de 5% avec le nombre d'animaux étudiés.
Raffinement
Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Lors de la chirurgie, ils seront anesthésiés avec un mélange de Kétamine (100 mG/mL) à la dose de 60 mG/kG et Métomidine (1 mG/mL) à la dose de 0.25 mG/kG. Après s'être assuré de l'efficacité de l'anesthésie (retrait de la patte après pincement), les yeux sont recouverts d'une pommade occulaire. De la lidocaîne est introduite également au niveau des oreilles 15 minutes avant la mise en place de l'animal dans le cadre stéréotaxique. Le rat est ensuite positionné dans le cadre sur une couverture chauffante pour maintenir sa température ( contrôlé par sonde anale). Après désinfection de la peau du scalp à la bétadine et injection sous-cutanée d'un anesthésique local (0.1 mL/ de lidocaïne 0.4 % 15 minutes avant), une incision est effectuée afin de révéler le crâne. Après avoir injecté la neurotoxine ou son solvant, la peau est agrafée. De la bétadine est appliquée sur la suture et le rat reçoit une injection sc d'analgésiques (Buprénorphine 0.05 mG/kG). L'animal est ensuite laissé au calme pendant 2 semaines et observé régulièrement (grille de score binaire et note état corporel en annexe). Lors de l'étude pharmacologique, si un abcès apparaît après les injections intrapéritonéales, l'expérimentateur nettoiera la plaie à la bétadine et reportera les injections pour le/les animaux concernés.
Choix des espèces
Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois (matures sans être âgés), nous permettant de comparer les résultats avec nos données antérieures. De plus, les coordonnées stéréotaxiques (atlas de Paxinos et Watson) ont été établies pour des rats de ce poids.
Influence de la géométrie et du fractionnement temporel dans la réponse de nouvelles techniques de radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
1 232 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 106 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 126 un niveau modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée sous anesthésie puis irradiée, parfois deux fois, avec suivi par imagerie et tests comportementaux. Le porteur décrit après irradiation des pertes de poids, une mobilité réduite et des ulcérations du crâne pendant quelques jours. L'étude explore de nouvelles techniques de radiothérapie contre les gliomes, dont les retombées cliniques sont présentées comme lointaines.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. L’alternative, moins délétère, est la nouvelle technique de radiotherapie que nous proposons. Aucun autre traitement (i.e. immunothérapie) a montré de l’efficacité dans ce types de tumeurs. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique de ces techniques innovatrices en explorant différentes géométries d’irradiation et schémas temporels de délivrance de la dose. Par ailleurs, nous évaluerons l’impact sur les tissus sains d’une re-irradiation, nécessaire de façon très fréquente dans le traitement des gliomes, à cause de son haut taux de récurrence. De plus, des études pilotes ont montré une mémoire immunitaire à long-terme que nous cherchons à confirmer avec plusieurs types tumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à l'oncologie pédiatrique (système nerveux central dont les traitements sont très limités en raison du risque de complications dans le développement des nourrissons) et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
-Implantation tumorale sous anesthésie générale (45 minutes) 1056 animaux une fois. 264 animaux subiront une réimplantation sous anesthésie générale (45 minutes) -Irradiation sous anesthésie générale (30 minutes) sur 1182 animaux, une fois et 132 animaux recevront une re-irradiation. Chaque irradiation dure un maximum de 30 minutes. -Imagerie IVIS sous anesthésie générale, 2 fois, 1056 animaux. Durée anesthésie < 10 minutes -Tests de comportement sur animaux vigiles, 3 fois, 126 animaux, une durée de 2-3 heures. - Des prélèvements sanguins (3 à 4) sous anesthésie générale seront réalisés sur chaque animal. Durée de l’anesthésie (< 5 minutes)
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours)
Devenir
Mis à mort des animaux pour analyses histologiques des cerveaux
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ce n'est donc pas possible de faire nos d’études in vitro en utilisant des organoïdes. Les organoïdes en plus sont très petits en taille pour mettre en évidences l’effet des patrons d‘irradiation en pic et vallée caractérisques de nos techniques d’irradiation Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide du logiciel G*power. Pour mettre en évidence une différence de 25%, biologiquement significative, entre groupes traités et groupes témoins, il nous faudra inclure 15 animaux par groupe (t-test: p
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, nous veillerons 5 fois par semaine au bien-être des animaux pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de chaque procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Pour y remédier, des aliments appétants (Dietgel recovery) sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation : une crème, l’Ialuset sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (environ 1 semaine, application quotidienne) et / ou du PicriBaume (1 fois par jour).
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Etudes de toxicologie de la reproduction avec observations post-natales longues chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 57566
71 086 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par gavage quotidien, les femelles subissent des lavages vaginaux et les petits nés sont suivis jusqu'à l'âge adulte, avant mise à mort pour examen des organes. Le porteur présente ces tests de toxicité sur la reproduction comme "indispensables" et "nécessaires" réglementairement pour la mise sur le marché de produits. Les effets attendus incluent des atteintes de la gestation, de la mise-bas et du développement des descendants.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché ou d'enregistrement d'un produit et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).
Bénéfices attendus
A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.
Procédures
Les animaux (adultes principalement, parfois des juvéniles) sont traités, le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle, observations ophtalmologiques, mesures de pattes, évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. Le produit administré peut cibler chaque phase du cycle de reproduction. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les procédures et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés à l’âge des animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage, tube de contention). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation, etc.
Choix des espèces
Bien que le rat soit l’espèce la plus fréquemment utilisée, le rat et la souris sont des espèces de choix car : - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits générés par gestation, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).
Modèle experimental de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 3300
Lapins : 3300
9 900 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Une sécheresse oculaire leur est induite par instillations répétées, pose de patchs, pompes osmotiques sous-cutanées ou ablation chirurgicale des glandes lacrymales, avant mise à mort pour analyses. Le porteur décrit picotements, brûlures et sensibilité à la lumière comme nuisances attendues. Les modèles doivent servir à tester de futurs traitements, dont l'efficacité reste à démontrer.
Objectifs
L'objectifs de ce projet est de pouvoir proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire plus fréquente chez les femmes, les personnes âgées et qui concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien représentés et décrits dans la littérature. Nous en avons sélectionné 3, parmi les plus référencés, les plus efficaces en terme d’impact sur la surface oculaire et la diminution de la sécrétion de larmes et les moins contraignants pour l’animal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleurs conditions possibles et dans le respect du bien-être animal.
Procédures
Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie transdermique (pose de patchs dermiques), sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Dans certains cas, comme la pose de pompes osmotiques en sous cutanée ou l'ablation des glandes lacrymales extra-orbitales situées juste sous la peau, une petite chirurgie unique dont la durée n'excèdera pas cinq minutes sera nécessaire. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur les recommandations du Gircor et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux ou bien encore une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme. L'administration en sous cutanée ou en transdermique pourra occasionner une petite inflammation avec l'apparition de rougeurs sans conséquence majeure.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, ELISA...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (cornéen, rétinien, vitréen, vasculaire, nerveux...) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. l'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans l'études auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 3 jours minimum.
Ostéoradionécrose mandibulaire : exploration de la physiopathologie des lésions et évaluation de l’efficacité de traitements chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
564 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une irradiation de la mandibule puis une extraction dentaire, avec difficulté à s'alimenter et perte de poids, et une coupe des incisives toutes les trois semaines, avant d'être tués pour prélever la mandibule. Le porteur décrit une nécrose osseuse chronique et douloureuse reproduisant une complication de la radiothérapie sans traitement curatif connu. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier cette maladie.
Objectifs
L’objectif de cette étude est : (1) de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’évolution de l’ostéoradionécrose (ORN) et (2) de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de réduire, voire traiter la maladie en utilisant un modèle animal de rat développant des lésions osseuses radio-induites similaires à celles observées chez les patients
Bénéfices attendus
Suite à une radiothérapie pour traiter un cancer des Voies Aéro-Digestives Supérieures (VADS), une ostéoradionécrose (ORN) peut survenir chez certains patients (5%) principalement au niveau de la mandibule. Le développement de l’ORN, qui correspond à une mort de l’os causée par les irradiations est une complication tardive de la radiothérapie parmi les plus redoutée par les cliniciens car elle peut engager le pronostic vital du patient. Il s’agit d’un processus lent, qui ne guérit pas spontanément. Les différents processus cellulaires et moléculaires induisant une ORN ne sont pas complètement élucidés. Au niveau clinique, l’ORN se caractérise par une nécrose chronique et douloureuse associée à une perte et une déformation osseuse permanente. Aujourd’hui aucun traitement curatif n’est disponible. Le traitement de référence est la chirurgie avec une greffe osseuse autologue sur un site ectopique. Nous avons développé dans un projet précédent un modèle animal d’ORN mandibulaire chez le rat Lewis, induisant des lésions similaires à celles observées chez les patients. Les investigations menées sur ce modèle dans le cadre de ce projet nous permettront : - Le développement des connaissances de la physiopathologie de l’ORN et - La mise en place de nouveaux traitements et l’évaluation de leur efficacité. A terme ce projet permettra une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux sauf les témoins non irradiés subiront une irradiation localisée de la mandibule inférieure gauche sous anesthésie (durée 15 min) ; puis à une extraction dentaire (molaire médiane de la mandibule gauche), 3 semaines après sous anesthésie générale (durée 30 min). Les animaux témoins de subiront que l’extraction dentaire. Des scanners au micro-CT seront réalisés sous anesthésie isoflurane (durée environ 5 min). Les incisives supérieures seront coupées à l’aide d’une fraise de dentiste sous anesthésie gazeuse, toutes les 3 semaines (durée de la procédure environ 5 min en tout). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés, puis perfusés avec du sulfate de baryum (durée 15 min).
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation de la mandibule et l’extraction dentaire, les animaux auront du mal à s’alimenter et vont perdre du poids au cours des 3 premières semaines. Pour pallier ce déficit, les animaux seront nourris avec de l’aliment hyper-énergétique mou. Cependant cette alimentation molle ne permettra pas l’usure des incisives supérieures qui poussent continuellement chez les rongeurs. Pour cela les incisives seront coupées toutes les 3 semaines environ. Il est également possible que des lésions à la peau soient observées : dans ce cas de la vétédine sera appliquée pour éviter toute surinfection.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés, les mandibules seront prélevées pour des analyses histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Le développement des lésions osseuses nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, muqueux, inflammatoire et osseux), conditions retrouvées chez le modèle animal vivant. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques de l’ostéoradionécrose mandibulaire ni la mise en place de procédure de traitements.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques (mesure de volume osseux), vasculaires et d’expression génique, des groupes de 16 animaux pour chaque technique sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey. Afin d’avoir des résultats robustes, nous avons identifié 3 techniques d’analyses différentes et complémentaires pour étudier la physiopathologie et le bénéfice thérapeutique des traitements. L’utilisation du scanner in vivo nous permet d’utiliser le même groupe d’animaux pour l’analyse au cours du temps du volume osseux et l’histologie.
Raffinement
Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues - Hébergement en groupe (4 animaux par cage duplex « Double Decker ») avec enrichissement (bâtons de bois et tunnel rouge) - Alimentation : les animaux sont nourris avec un aliment mou et hyperproteiné et mise à disposition de croquettes directement dans la cage - Suivi des animaux : Observation des animaux tout au long de l’expérimentation, pesée 2 fois par semaine, coupe des incisives supérieures toutes les 3 semaines - Douleur : Traitement à la buprénorphine après l’irradiation, avant et après l’extraction dentaire - Soin des lésions cutanées à la vétédine - Chirurgie dentaire : Utilisation d’anesthésiques spécifiques pour l’extraction dentaire : myorelaxation et sédation profonde suivi d’une réversion permettant un réveil très rapide des animaux. - Utilisation d’une plaque chauffante et de de gel oculaire pendant la chirurgie - Utilisation d’enceintes de réveil chauffées pour les phases d’endormissement et de réveil, - Réalisation de la chirurgie par des personnes compétentes et formées, avec du matériel adapté aux gestes et aux animaux
Choix des espèces
Chez l’homme, l’extraction dentaire est un des facteurs qui favorise le développement de l’ostéoradionécrose mandibulaire. Le rat est un animal de taille suffisante pour permettre cette extraction et permettre des approches de médecine régénératrice par comblement local. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte seront utilisés afin qu’ils aient un poids suffisant pour « résister » aux séquelles des irradiations.
Evaluation d’un candidat médicament sur la fréquence des crises d’épilepsie dans un modèle de l’épilepsie absence chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une microchirurgie du cerveau sous anesthésie puis des enregistrements EEG sous contention répétés sur vingt-trois jours, avant d'être tués pour prélever sang et cerveau, afin de tester une molécule anti-épileptique. Le porteur indique des douleurs liées au cadre stéréotaxique et un stress lié à la contention. Il présente ce modèle génétique d'épilepsie absence comme "incontournable" pour évaluer un nouveau médicament.
Objectifs
L'épilepsie est le syndrome neurologique le plus répandu, avec environ 70 millions de patients dans le monde. Elle se caractérise par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, comme une absence de manifestation visible caractérisant les épilepsies absences, ou des convulsions généralisées très spectaculaires dans beaucoup de formes d’épilepsies. Il existe de nombreux médicaments anti-épileptiques (MAEs) sur le marché, dont l’objectif est de contrôler (supprimer) les crises d’épilepsie. Néanmoins, 30 % des patients ne peuvent pas être libérés des crises malgré le large panel de MAEs disponibles. Le développement de nouvelles molécules, est donc nécessaire. C’est le sens de ce projet, visant à évaluer une nouvelle molécule dont les bénéfices ont déjà été démontrés in vivo. Il envisage de tester l’effet de la molécule sur un modèle rat d’épilepsie absences reconnu comme un modèle classique d’épilepsie généralisée d’origine génétique.
Bénéfices attendus
Les épilepsies absences affectent majoritairement les jeunes enfants. Le nombre journalier de crises peut être très élevé. Au-delà de l’impact immédiat que ces crises peuvent avoir au moment où elles se produisent (le jeune patient apparaît pour l’extérieur comme « dans la lune »), les crises peuvent altérer profondément les performances scolaires, via des mécanismes de défaut de consolidation mnésique durant le sommeil, induisant de ce fait des retards importants dans les différents apprentissages. Le développement de MAEs pertinents dans ce syndrome pourrait permettre de maintenir à un bon niveau les capacités d’apprentissage et de mémoire. De surcroît, au-delà de l’intérêt direct pour cette forme d’épilepsie, l’épilepsie absences est un modèle d’épilepsie généralisée d’ordre génétique incontournable pour l’évaluation d’un nouveau MAE.
Procédures
Micro Chirurgie cérébrale sous anesthésie général et analgésie, 30 min par rat sur 48 rats. Limitation de mobilité légère (monitoring EEG), 10 X 3h étalé sur 23J sur 48 rats.
Impact sur les animaux
Des douleurs (prise en charge par l’anesthésie et l’analgésie) liées au placement de l’animal dans le cadre stéréotaxique et à l'incision de la peau au dessus du crâne. Stress momentané (quelques minutes) dû à la contention de l’animal nécessaire pour connecter le système électroencéphalographique au rat.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement du sang et du cerveau
Remplacement
Les processus physiopathologiques conduisant à la récurrence des crises épileptiques sont différents d’un syndrome à un autre. Il n’est pas donc pas envisageable d’utiliser une approche in-vitro, encore moins in-silico, en remplacement de l’approche in-vivo puisque le trait évalué (fréquence des crises épileptiques) correspond à la réponse mettant en jeu tout un processus physiologique intégré chez un sujet respirant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit autant que possible tout en garantissant l’atteinte de l’objectif scientifique visé. Ainsi, la taille des échantillons a été calculée de sorte à mettre en évidence de façon statistique une réduction de 30% de la fréquence des crises épileptiques.
Raffinement
Le protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Ceci se traduit par une visite quotidienne à l’animalerie pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. En outre, avant les procédures chirurgicales et les enregistrements EEG, les rats seront emmenés aux salles d’expérimentation, pour habituation et diminution du stress induit par la nouveauté.
Choix des espèces
Ce modèle génétique d’épilepsie absences établi chez le rat a été validé aussi bien pour la période d’installation de l’épilepsie (épileptogénèse) que pendant la période où l’animal est considéré comme présentant une épilepsie stabilisé. Dans ce modèle d’épilepsie absences, les crises apparaissent spontanément et progressivement à partir de l’âge de 2-3 mois chez tous les rats et se stabilisent à l’âge de 6 mois, atteignant alors un plateau. Nous réaliserons donc les chirurgies et les enregistrements EEG à partir de l’âge de 6 mois.
Plasticité adaptative des réseaux corticaux somesthésiques et moteurs après ischémie corticale focale chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
390 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une lésion ischémique du cortex moteur par chirurgie, des cartographies du cerveau de plusieurs heures, une restriction alimentaire et des tests comportementaux, avant d'être tués pour analyse du cerveau. Le porteur indique que le modèle provoque une paresthésie de la patte antérieure qu'il juge inévitable et affirme minimiser l'inconfort. Il conclut que ces approches invasives ne peuvent pas être menées chez l'homme et justifie le recours au rat par trente ans de travaux du laboratoire.
Objectifs
L’AVC constitue la première cause de handicap physique acquis de l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité, avec 20% des personnes qui décèdent dans l’année suivant l’AVC. En dépit d’importants progrès survenus depuis 50 ans, tant au plan diagnostique que thérapeutique, les AVC demeurent un véritable fléau, d’abord pour les patients, puis en termes de coût de santé publique et d’incidence socioprofessionnelle. Ils entraînent des dysfonctionnements cérébraux responsables de graves déficiences physiques et intellectuelles. Les symptômes des AVC dépendent de la localisation et du volume de la lésion, chaque région du cerveau étant spécialisée dans des fonctions particulières (mouvement, sensibilité somatique, vision, audition, langage…). Les séquelles les plus fréquentes et invalidantes sont l’hémiplégie et l’aphasie (troubles du langage oral et écrit, affectant l’expression et la compréhension). En cas d’atteinte motrice, la majorité des patients récupèrent partiellement leur capacité à marcher, mais le contrôle de la motricité du bras et de la main reste souvent altéré. Les troubles de la marche et de l’équilibre sont très fréquents après un AVC. Ils sont associés à un risque élevé de chute. Une prise en charge précoce après un AVC limite la gravité des séquelles. Une fois la phase d’urgence passée, le patient bénéficie d’une rééducation commencée le plus tôt possible et d’un traitement adapté à ses facteurs de risque. Notre projet de recherche fondamentale est centré sur une meilleure compréhension de la neuroplasticité corticale qui sous-tend la récupération comportementale après une lésion vasculaire ischémique du cortex moteur. Il inclut une composante translationnelle. En effet, il s’articule avec des préoccupations majeures dans les domaines médical et sociétal, et plus particulièrement celui des méthodes de rééducation fondées sur des connaissances neurophysiologies précises. Il existe des lacunes dans ce domaine et une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux de la réadaptation doivent permettre d’optimiser et de standardiser les approches thérapeutiques au bénéfice des patients AVC, afin qu’ils retrouvent plus rapidement leur autonomie et qu’ils puissent renouer avec leur vie sociale antérieure. Ce projet est le prolongement d’une recherche qui a été évaluée positivement par l’HCERES dans le cadre du renouvellement du laboratoire accordé pour la période 2018-2022.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu de cette étude originale est une meilleure compréhension des interactions neurophysiologiques dynamiques entre les réseaux sensorimoteurs corticaux au cours de la récupération post-AVC. Le remodelage des cartes somatotopiques du cortex est un témoin fiable des réorganisations cérébrales qui sous-tendent la récupération comportementale après lésion corticale, comme en atteste une littérature abondante. Par ailleurs, l'investigation immunohistochimique apportera un éclairage précis sur les mécanismes neurochimiques impliqués dans les réorganisations corticales. Le deuxième bénéfice attendu consiste en un étayage neuronal d'une pratique clinique (thérapie par mouvement contraint) dont les mécanismes cérébraux restent largement incompris. Cette méthode thérapeutique consiste en une immobilisation temporaire du membre sain chez les patients cérébrolésés, en vue d'encourager l’utilisation du membre parétique et réactiver ainsi les circuits neuronaux de suppléance dans l’hémisphère lésé. Les mécanismes neuronaux sous-jacents restent méconnus, ainsi que la période et la durée optimales d'application de cette thérapie, sachant qu'elle peut être compromise par des processus d'excitotoxicité si elle est initiée trop tôt et avec un régime trop intense. Une meilleure compréhension des mécanismes de neuroplasticité qui sous-tendent la thérapie induite par mouvement contraint permettra une meilleure standardisation de cette approche thérapeutique chez les patients cérébrolésés.
Procédures
Cette étude inclut différentes interventions (procédures de chirurgie, de cartographie corticale, d’évaluation comportementale, de réhabilitation fonctionnelle et d’immunohistochimie). Les interventions chirurgicales (durée d’environ 2h) constituent une étape préliminaire aux enregistrements corticaux réalisés en vue d’étudier la malléabilité des cartes somatotopiques du cortex somesthésique primaire (S1), consécutives à la lésion ischémique corticale dans le cortex moteur (M1), au cours du temps postlésionnel. Les cartographies électrophysiologiques et optiques seront réalisées après la lésion à différents délais. Elles dureront environ 5h. L’approche en cartographie électrophysiologique inclut, pour un sous-groupe d’animaux, une méthode d’inactivation temporaire de l’activité des neurones du cortex somesthésique par application de muscimol (agoniste du neuromédiateur inhibiteur GABA), en vue d’établir des relations causales entre les réorganisations corticales attendues et la récupération des déficits sensorimoteurs. La première méthode d’inactivation par injection ponctuelle de muscimol dure environ 2h. La seconde méthode consiste en une diffusion chronique de muscimol durant quelques jours au cours de la période de récupération postlésionnelle s’étalant sur 2 mois. Nous analyserons quantitativement, à l'aide de tests comportementaux, l’évolution postlésionnelle des déficits sensorimoteurs induits par la lésion ischémique. La durée des tests quotidiens est d’environ 2h par animal en début d'apprentissage, puis elle se réduit à 45-60 min après apprentissage, chez les animaux lésés. De plus, nous chercherons à améliorer les réorganisations corticales, ainsi que la récupération fonctionnelle, par deux méthodes de réadaptation sensorimotrice incitant l’animal à utiliser son membre parétique. L’application de chacune de ces méthodes ne dépasse pas 2h par séance. Au stade final de cette étude, une analyse immunohistochimique sera effectuée afin d'explorer des mécanismes neurochimiques du remodelage des aires corticales (étude de l’expression des récepteurs inhibiteurs GABAA et B, des récepteurs excitateurs glutamatergiques NMDA…). Cette procédure est réalisée en post-mortem, après une étape de perfusion du cerveau dont la durée est d’environ 1h.
Impact sur les animaux
Dans une exploration neurophysiologique et comportementale des conséquences d'une atteinte cérébrale, l’apparition de déficits fonctionnels (dans notre étude une paresthésie de la patte antérieure) est inévitable. Dans notre étude, toutes les précautions sont prises pour supprimer la douleur durant les approches invasives, et neutraliser les risques d'infection. De plus, notre approche vise à réduire au mieux l'impact du syndrome postlésionnel, qui régresse rapidement au cours du temps, sur les fonctions physiologiques, l'état psychologique et la vie relationnelle et des animaux. Les effets indésirables sont liés à l'état de l'animal cérébrolésé qui ne dispose pas de ses fonctions sensorimotrices normales pour maintenir une posture optimale et réguler correctement ses déplacements. Par ailleurs, comme indiqué, la méthode de contention est relativement contraignante pour l'animal, mais elle est temporaire et rapidement réversible selon la méthode que nous avons mise au point. Elle contraste avec les méthodes d'immobilisation par plâtrage du membre antérieur communément utilisée dans la littérature. De plus, le comportement de l'animal lorsqu'il est à nouveau libre de ses mouvements ne révèle aucun signe d'inconfort ou de souffrance, l'animal se déplaçant immédiatement avec sa mobilité habituelle, compte tenu de l'état d'avancement du processus de récupération fonctionnelle. Par ailleurs, la perte de poids liée à la restriction alimentaire reste dans les limites recommandées, car elle n'excède pas 10 % du poids mesuré en début d'étude, sur une période de 72h.
Devenir
Les animaux seront réveillés après les procédures de chirurgie et de première cartographie pour un suivi comportemental de l’évolution de leurs déficits sensorimoteurs. Ils seront mis à mort après la session finale de cartographie intervenant au terme de cette évaluation comportementale, avant ou après la procédure de perfusion en vue de l’étude en immunohistochimie. Les animaux de la procédure d'inactivation transitoire du cortex seront mis à mort à la fin des observations comportementales.
Remplacement
Les objectifs même de cette étude, axés sur la compréhension des mécanismes de plasticité mis en jeu après une atteinte ischémique et leur corrélation avec la récupération fonctionnelle nécessitent le recours à des animaux. En effet, nos questionnements impliquent des approches invasives in vivo (1 : cartographies électrophysiologiques ; 2 : optiques) qui permettent une résolution spatiale et temporelle (1: 100 microns; 2: 50 microns, 0,3 ms) qui ne peuvent être obtenues par une exploration fonctionnelle chez l’homme que cela soit en électrophysiologie ou en neuro-imagerie. Par ailleurs, l’étude des mécanismes neurochimiques nécessite une approche post-mortem sur coupes histologiques.
Réduction
Le nombre de rats par groupe expérimental sera limité à son strict minimum compte tenu des contraintes de chaque technique expérimentale, avec des analyses statistiques adaptées. Nous limiterons notre étude de la réorganisation corticale après lésion à des délais post-lésionnels cruciaux, que nous avons établis au regard de la littérature dans le domaine. Une médication adaptée (anesthésiques, analgésiques, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mise en œuvre pour éviter toute douleur ou souffrance des animaux. En ce qui concerne les conditions d’hébergement, et selon les nouvelles directives européennes, sera rajoutée dans les cages de la litière foisonnante à base de frisure de papier qui sera renouvelée lors de chaque change.
Raffinement
Au cours de l’expérimentation, le maintien d’un niveau d’anesthésie stable prévient la souffrance des animaux. L’efficacité de l’anesthésie sera vérifiée, à intervalles réguliers, par l’absence de réaction au pincement de la queue ou d’une patte ; la surveillance d’un éventuel mouvement des vibrisses, des modifications des rythmes cardiaque (enregistré lors des enregistrements optiques) et respiratoire sera également effectuée. Après son réveil, la douleur et/ou la détresse de l’animal sera évaluée par l’expérimentateur et les zootechniciens dès son réveil puis au minimum 2 fois par jour en observant son apparence (poil, propreté), son comportement spontané (posture, locomotion, alimentation, toilettage), ou son comportement provoqué après stimulation/incitation comportementale. Des mesures adaptées sont alors entreprises. Un traitement analgésique immédiat (carprofène, 5mg/kg; 0,1ml/100g ; SC) sera prodigué si des signes de douleur apparaissent ; Une euthanasie sera réalisée si des signes neurologiques anormaux sont constatés ou si un comportement apathique persiste pendant les 1ères 24h après le réveil de l’anesthésie.
Choix des espèces
Les études antérieures dans le domaine de la plasticité post-lésionnelle du système somesthésique ont été menées chez l’homme, le primate non humain et majoritairement chez le rat, surtout pour celles qui utilisent des approches en cartographie électrophysiologique, en imagerie optique et immunohistochimie. Par ailleurs, le système somesthésique et ses représentations corticales chez le rat sont particulièrement bien documentés dans la littérature scientifique. De plus, les études développées dans notre laboratoire dans ce domaine depuis plus de 30 ans, ont été réalisées sur la même espèce, constituant des travaux de référence pour l’avancée de notre projet. De même, les tests comportementaux visant à évaluer les déficits sensorimoteurs et leur récupération sont bien standardisés dans les études conduites chez le rat, et sont maîtrisés dans notre équipe de recherche. Cette étude sur la plasticité post-lésionnelle du cortex cérébral, en relation avec la récupération fonctionnelle après atteinte ischémique corticale sera réalisée sur des rats Long-Evans âgés de 3 mois (± 15 jours), chez qui le système nerveux est considéré comme mature.
Criblage chez le rat (Rattus norvegicus) d’un nouveau groupe de molécules (inhibiteurs présynaptiques) dans le traitement des maladies de la contraction musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
1 062 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une injection dans le muscle puis sont soumis au test du digit abduction score pour mesurer l'effet myorelaxant de nouvelles molécules, avant d'être tués pour prélever les muscles. Le porteur qualifie ce test de bref, indolore et peu stressant, tout en signalant une douleur liée à l'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles de co-culture cellulaire restent d'une pertinence débattue et ne reproduisent pas la diffusion dans le muscle.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser une nouvelle génération de produits potentiellement d’intérêt identifiés récemment Cette étude a pour objectif de caractériser le pouvoir myorelaxant de nouvelles molécules ; ces molécules ont été décrites dans la littérature scientifique, notamment en termes d’efficacité in vitro sur les cellules cibles (IC50). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi de de la tolérance sur un petit nombre d’animaux dans un premier temps. Puis dans un second temps, nous réaliserons un suivi du « digit abduction score » (DAS). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence afin de s’assurer de leur bénéfice.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 1 injection , durée 30 secondes / animal - Pesée des animaux = maximum 8 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 4 minutes / animal - Test du DAS ( uniquement pour les animaux suivant la procédure 2) = 30 sec / test DAS (environ 28 stimulation sur la durée de l'étude / animal ) => 14 minutes / animal
Impact sur les animaux
Bien que certaines des 20 molécules de ce projet n’aient jamais été injectées chez l’animal, elles font partie de la même famille. Or, certains membres de cette famille ont été injectés, sans aucun signe clinique rapporté. Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection des FTP-8xx ; toutefois, afin de se prémunir de tout imprévu, nous suivrons avec attention tout signe, et avons mis en œuvre les mesures décrites dans le tableau fourni en annexe. De plus, dans cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur liée à l’injection i.m.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les muscles injectés seront prelevées pour des analyse histo-pathologiques.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis pour les sections B & C); Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.