Rats

605 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête leur injecte de la collagénase pour provoquer une hémorragie cérébrale, suivie d'IRM, de tests de score neurologique et de force d'agrippement, puis d'une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire, une désorientation et une perte de poids. Il précise que le projet fait l'objet de financements industriels et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester cinq stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’hémorragie : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos cinq stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez le rat par gavage (per-os), par administration intrapéritonéale (i.p) ou bien par injection directe sur le site hémorragique pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur, limiter la lésion ainsi que l’inflammation causé par un saignement cérébral. Chez l’homme, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS), non traumatique, résulte d’une irruption importante de sang dans le parenchyme cérébral, suite à une rupture de micro-vaisseaux. Cette étude pourra mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques dans la lutte contre ce type d’AVC hémorragiques, n’ayant aujourd’hui aucun traitement de référence permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le cerveau. Cet act chirugical durera 15 minutes. Pour les groupes traités par injection directement sur le site hemorragique, une seconde pipette sera insérée au même endroit ou la collagénase a été injectée, 20 minutes post-AVC. Cet acte durera 6 minutes. A J+1 et J+14, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post hémorragie. La mesure du score neurologique durera 10 minutes. En prenant compte des temps de récupération, la mesure de la force d’agrippement durera entre 25 et 30 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. L'hémorragie cérébrale provoque une désorientation au moment du réveil post-chirurgical. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l'hémorragie. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Lors de l'administration des traitements par voie intrapéritonéale, la contention et l'injection peuvent engendrer un stress et une douleur. Un acte rapide réalisé avec du matériel adéquat par du personnel compétent limite drastiquement cette douleur et le traumatisme provoqué.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 10%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront en groupes sociaux avec un ou plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et buchette en bois), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi biquotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. L'expérimentateur ou l'animalier pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5°C grâce à un système de couverture chauffante, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intracérébrale. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids de 300g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.

Dans un bras de l'étude, des rats ont l'abdomen ouvert une première fois pour la création d'un anévrisme de l'aorte, puis une seconde fois trois semaines plus tard pour l'implantation d'une endoprothèse, et ne sont tués qu'au cent vingtième jour. Les 171 rats mâles du projet vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sous aspirine en continu, avec prises de sang et examens d'imagerie sous anesthésie, ceux de l'autre bras recevant l'endoprothèse dans une aorte saine avant d'être tués au septième jour. Il s'agit de tester un revêtement anti-inflammatoire censé limiter le rejet des stents aortiques chez les patients. Le porteur écrit que le bénéfice translationnel est "majeur avec une potentielle diminution des complications", après avoir indiqué que les résultats "pourraient permettre de transposer la technique chez l'homme".

Objectifs

Actuellement, les anévrysmes de l'aorte abdominale sont traités par implantation de stents aortiques. Il existe cependant des complications nécessitant de nouvelles opérations liées à un phénomène de rejet de ces stents. En effet, ils ne sont pas complétement intégrés dans le tissu du patient. L’objectif de l’étude est de concevoir un revêtement applicable sur ces stents aortiques pour améliorer leur intégration et donc diminuer le risque de rejet. Cette étude est une étude expérimentale chez l'animal (rat) dont les résultats pourraient permettre de transposer la technique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Un anévrysme est une déformation pathologique d'un segment vasculaire. Le risque d'un anévrysme est sa fragilisation et sa rupture, entrainant une hémorragie souvent grave. Chez l’homme, les anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA) sont traités avec des endoprothèses (stents aortiques). Ce traitement est toutefois grevé d’un nombre significatif de fuite et de migrations d’endoprothèses au cours du suivi. Ces complications pourraient être liées à un défaut d’intégration de l’endoprothèse L’objectif du projet est de développer une endoprothèse fonctionnalisée avec un revetement permettant sa meilleure intégration dans le tissu aortique. Le bénéfice translationnel est majeur avec une potentielle diminution des complications évolutives du traitement endovasculaire des AAA chez l’homme.

Procédures

Les animaux recevront de l’aspirine tout au long de la procédure pour éviter la formation de caillots (thromboses). Les animaux auront une implantation d’endoprothèses comportant des revetements anti-inflammatoires. Ces endoprothèses seront implantées chez des rats dont l’aorte est saine (pour étudier la biocompatibilité de ces endoprothèses) ou chez des rats chez qui des anévrysmes auront été créés préalablement 3 semaines plus tot pour mimer la pathologie humaine. Ces procédures d’implantation se feront par incision au niveau de l’abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et durent 30 minutes. La procédure de création d'anévrysme est également faite par une incision au niveau de l'abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et dure 1h. Afin de mesurer l’inflammation, des examens de sang (prélèvement veineux au niveau de la joue) et d’imagerie (echographie abdominale, TEPscanner) seront réalisés sous anesthésie générale. Les examens de sang se feront 1 semaine après implantation des endoprothèses et juste avant l’euthanasie. L’imagerie sera réalisé à 1 et 4 semaines après mplantation des endoprothèses.

Impact sur les animaux

Les effets nuisibles attendus sont la présence d'un inconfort ou d'une douleur modérée de courte durée après les procédures chirurgicales. D'autres effets peuvent survenir comme une perte de poids, une deshydratation, une diminution de la mobilité ou encore la survenue de caillots sanguins (thrombose). Ces effets nuisibles seront spécifiquement recherchés quotidiennement et un traitement adapté sera appliqué (antalgique, hydratation, soins).

Devenir

Dans un bras de l'étude, les rats auront une implantation d'endoprothèse et des examens d'imagerie (échographie abdominale et TEP sous anesthésie générale à J7 et seront euthanasiés immédiatement après. Cette durée de 7 jours a été fixée pour étudier la biocompatibilité des endoprothèses. Dans un autre bras de l'étude, les rats auront eu 3 semaines avant l'implantation des endoprothèses une premiere chirurgie pour créer un anévrysme. Dans ce bras, les rats auront une échographie abdominale sous anesthésie générale à J7 et J28 et seront euthanasiés à J120. Ce délai de 120 jours est fait pour étudier dans le long terme le potentiel de guérison des anévrysmes après implantation des endoprothèses. En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélévement des endoprothèses précédemment implantées et regarder l’intégration de ces endoprothèses dans le tissu aortique (étude histologique).

Remplacement

Il n’est actuellement pas possible de simuler de facon précise l’action d'un revetement anti-inflammatoire dans un tissu aortique. Il n’existe pas non plus de simulation fiable d’anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA). L'étude chez l'animale reste indispensable. Toutefois, des expérimentations préliminaires ont permis une séléction précise du revetement anti-inflammatoire à tester chez l'animal et d’établir un protocole robuste.

Réduction

Nous avons volontairement choisi d'utiliser des examens d'imagerie non douloureuses et reproductibles dans le temps (échographie abdominale). Cela permet de suivre sur la durée les mêmes animaux sans les euthanasier. Nous avons également calculé préalablement à l'expérimentation le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Cela permet d'obtenir des résultats statistiques robustes tout en évitant d'inclure trop d'animaux.

Raffinement

-Les conditions d’hébergement seront optimisées au maximum : limitation des transports au strict nécessaire, enrichissement de l'environnement (mise en place de coton pour comportement de nidification, mise à disposition de baton à ronger), respect du rythme jour/nuit -Nous avons prédéfinis la liste d'élements de surveillance du bien-etre des animaux: tous les animaux seront surveillés quotidiennement à l'aide d'une grille standardisée de surveillance. Les animaux seront inspectés (poids, présence d'un inconfort/douleur, état de la cicatrice) et des soins adaptés comprenant des anti-douleurs seront administrés. Si une trop souffrance est constatée (présence de points limites), l'animal sera immédiatement euthanasié. -Nous utiliserons une procédure d’imagerie non invasive : l’echographie abdominale a été préférée à l’angiographie invasive. -Nous aurons recours à l’anesthésie et à l’analgésie pour toutes les procédures. -Utilisation de procédures d’euthanasie réglementaires. -Calcul statistique du nombre de sujets nécessaires afin de limiter le nombre d’animaux

Choix des espèces

-Le modèle animal (rat Wistar) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet (implantation d’endoprothèses dans l’aorte saine et dans des anévrysmes). Les dimensions de l’aorte du rat Wistar permettent son analyse en imagerie (echodoppler). Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale est adulte et agée. Les animaux utilisés seront des males car il existe une nette prédominance masculine dans la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale.

496 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une nuit de mise en reproduction et un frottis vaginal, la moitié des femelles gestantes reçoit un régime pauvre en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance chez les fœtus, et toutes subissent au seizième jour une ouverture de l'abdomen pour une électroporation in utero, qui marque les neurones des fœtus. Leurs petits sont tués à trois, huit ou trente jours de vie pour étudier leur cerveau, et une portée sur trois seulement donne un marquage exploitable, selon l'expérience du laboratoire. Les mères et les petits en surnombre sont proposés en interne à un autre projet avant d'être mis à mort.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minute à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative (Annexe 2). Des recherches bibliographiques, des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. En revanche, les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins sur lesquelles le projet s’est inspiré (43% de réussite). Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Selon les expériences passées du laboratoire, 1 portée sur 3 obtient des résultats positifs au marquage in utero. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour P8 et P30. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.

2 000 rongeurs, 1 000 souris et 1 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie gazeuse, ils subissent un prélèvement de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine temporale, puis sont mis à mort, pour valider des kits de dosage de marqueurs sanguins jugés peu fiables. Le porteur précise employer des animaux issus de l'élevage des lignées et non utilisés par ailleurs. Il présente ainsi la mise à mort comme un usage d'animaux déjà destinés à être tués.

Objectifs

De très nombreux marqueurs sanguins circulants permettent d'évaluer chez l'homme l'existence de certaines pathologies et d'en suivre leur évolution. On peut citer par exemple la troponine qui est un marqueur d'infarctus du myocarde et permet son diagnostic et son suivi en clinique humaine. De même il existe des protéines ou marqueurs spécifiques de pathologie, rénales, musculaires, d'inflammation, de cancer,....... Certains modèles de rongeurs génétiquement modifiées, dont les lignées sont présentes dans l'animalerie de notre institut, reproduisent ces pathologies humaines et pourraient nous être utiles à la mise en place et la validation de ces marqueurs chez la Souris et/ou le Rat afin de pouvoir les suivre et les identifier lors d'études scientifiques à venir. Des kits de dosage spécifiques de ces espèces sont commercialisés mais nous avons constaté que beaucoup ne sont pas fiables ou pas spécifiques, c'est pourquoi nous voulons les valider avant de proposer les dosages de ces marqueurs. Pour cela nous envisageons de prélever du sang sur des animaux générés durant l'élevage des lignées, juste avant la mise à mort de ces animaux qui ne sont pas utilisés dans des protocoles expérimentaux. La présence de ces marqueurs dans le sang étant souvent labile, il est nécessaire que les animaux soient encore vivants au moment du prélèvement sanguin. Les lignées seront sélectionnées d'après des critères scientifiques afin d'être sûr que les modèles prélevés représentent des animaux susceptibles d'avoir une perturbation de l'un ou l'autre des marqueurs d'intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de nous permettre de valider des réactifs utilisés dans l'analyse de certains marqueurs sanguins. Ces réactifs sont censés cibler de manière spécifique des marqueurs d'intérêt, comme cela peut être fait lors d'une analyse sanguine humaine. Néanmoins, il apparait que la sensibilité, fiabilitié ou spécificité de ces kits n'est pas toujours garantie, rendant certaines analyses peu fiables. Nous souhaitons ainsi mettre en place une étape de validation afin de garantir que lors de leur utilisation dans un projet d'analyse scientifique, nous pourrons obtenir des informations valides et porteuses d'informations fiables sur lequel pourront s'appuyer les conclusions des chercheurs.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse à l'aide d'une boite à induction puis d'un masque. Ils s'endormiront et nous effectuerons le prélevement sanguin sur les animaux endormis. Pour cela, selon la préférence de l'expérimentateur, nous préleverons le sang à la veine temporale superficielle ou au sinus retro-orbital. Les animaux seront ensuite mis à mort à la fin de la procédure, dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux subiront le stress de l'endormissement durant l'anesthésie générale. Par la suite, ils resteront endormis durant le prélevement sanguin puis leur mise à mort.

Devenir

Les animaux employés dans cette procédure sont des animaux générés durant l'élevage et le maintien des lignées. Ils ne seront pas employés dans des procédure expérimentales additionnelles et seront mis à mort.

Remplacement

Cette étude a pour but de mettre en place le dosage de marqueurs sanguins chez la Souris ou le Rat en vue d'etudes scientifiques futures et à venir visant à reproduire et étudier des pathologies humaines Etant donné que nous avons à disposition de nombreux modèles génétiquement modifés reproduisant des pathologies humaines ce modèle ne peut être substitué.

Réduction

Les lignées de Souris ou de Rat étant déjà existantes dans l'institut cette étude ne génèrera pas un supplément d'animaux utilisés. Nous utiliserons en effet des animaux générés durant les élevages de ces lignées mais non utilisés pour des procédures expérimentales. Si les fonds génétiques sont similaires, nous essaierons au mieux de rapprocher les prélevements et analyses pour mutualiser les groupes controles et réduire le nombre d'animaux utilisés. Etant donné la variabilité des analyses biochimiques, nous utilisons 10 animaux par condition expérimental soit 40 animaux par marqueur étudié (10 males controles, 10 males mutants, 10 femelles controles, 10 femelles mutantes). A raison de 5 lignées étudiées par années, durant 5 ans, cela représente 1000 animaux au maximum par espèce étudiée, soit un total de 2000 animaux (Souris et Rat). Nous utiliserons des analyses paramétriques de type analyse de variance à deux facteurs suivies d'analyses post-hoc pour pouvoir conclure sur la significativité des résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes avec un enrichissement, accès à la nourriture et à l'eau sans restriction. Ils seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bon état général. Une anesthésie générale gazeuse sera effectuée avant le prélèvement sanguin des animaux afin d'empêcher toute souffrance. Les animaux seront ensuite mis à mort sans réveil.

Choix des espèces

Notre institut possède une animalerie de rongeur (Souris et Rat) et nos études portent sur l'étude de ces animaux génétiquement modifiées, c'est pourquoi nous avons choisi ces espèces Par ailleurs la souris représente un modèle de choix pour l'étude de pathologies humaines S'agissant de lignées en élevage dont la mise à mort est décidée par le chercheur en charge des animaux, l’âge va dépendre des projets Certains marqueurs évoluant avec l’âge il peut être intéressant de prélever des animaux d'âges différents. Des marqueurs de vieillissement pourront être évalués sur des animaux âgés dans le cas où cela se présenterait

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.

10 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour implanter des électrodes et un dispositif d'enregistrement sous la peau, reste isolé cinq semaines, puis est exposé à des odeurs et images de chats pour provoquer un stress de prédation. Le porteur reconnaît que l'isolement prive l'animal de son comportement social et que la présence simulée d'un prédateur induit "probablement" un stress, objet même de l'étude. Ce projet préliminaire vise à obtenir des données pour une demande de financement, et les animaux sont tués pour analyser leur cerveau et les tissus entourant l'implant.

Objectifs

Ce projet utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10) est une demande préliminaire à une demande ANR jeune chercheur. Il a pour but de valider la fonctionnalité et la pérennité d’un système d’enregistrement électrophysiologique, la tolérance de l’animal à l’implantation sous cutanée du dispositif dans une durée de 30 jours maximum. Il aura également pour but d’exposer le rat à un contexte de prédation, uniquement sous réserve d’une totale cicatrisation des plaies et de scorage de suivis nuls. Cette expérience permettra de récolter des données préliminaires de sommeil simulant l’exposition à un contexte de prédation le plus écologique possible. Ces données serviront de base à une resoumission de projet à l’ANR en mars 2022. L’objectif global de l’ANR est de comprendre comment la prédation (l'un des principaux facteurs de sélection naturelle) a façonné le phénotype et l'évolution du sommeil. En effet, l’omniprésence du sommeil dans le règne animal suggère qu'il est essentiel à la survie, cependant, le sommeil et ses sous-états restent mal compris. Les animaux exposés à la prédation doivent être plus vigilants pour augmenter leur chance de survie, cependant quand ils dorment ils sont potentiellement plus vulnérables car moins sensibles à leur environnement. Le sommeil constitue donc un comportement extrêmement risqué pour de nombreuses espèces. Pour cette raison, la pression de prédation a été proposée comme explication de la diversité des habitudes de sommeil observées chez les mammifères et autres animaux. Une variabilité de certaines caractéristiques du sommeil, telles que sa durée quotidienne chez les paresseux, les quantités relatives de sommeil paradoxal et sommeil lent chez les rats, la durée quotidienne de sommeil chez les rats, le sommeil unihémisphérique chez les canards et la fragmentation du sommeil chez les colombes, a pu être corrélée indirectement avec une pression de prédation. Cependant, aucune étude n'a testé expérimentalement (sur des animaux élevés en laboratoire ou sauvages) comment les phénotypes du sommeil à plusieurs niveaux (physiologie, activité cérébrale, métabolisme et comportement) sont affectés par la pression de prédation, et si les processus associés à cette interaction sont plastiques (régulé par les effets environnementaux) ou génétiques et donc héréditaires. C’est le but de du projet ANR, qui se basera sur l’étude du sommeil de populations de rats sauvages ayant grandi avec ou sans prédation.

Bénéfices attendus

Outre l’obtention de données préliminaires qui permettront grandement d’augmenter les chances de financement, ce projet permettra le développement d’une méthodologie d’enregistrement complet du sommeil des animaux en conditions semi-naturelles. En effet, le développement d’un implant sous cutané, miniature, de grande autonomie, dédié au sommeil ouvre de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension des animaux en veillant à leur bien être puisqu’ils ne seront plus équipés de câble et pourrons même être, à terme, stabulés en groupe. C’est une vraie amélioration d’un point de vue qualité et quantité des données acquises, permettant ainsi de répondre à des questions plus complexes tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, étudier l’effet de la prédation sur le sommeil permet aussi de comprendre le lien entre stress/peur et sommeil, deux états étroitement liés et source de nombreux troubles chez l’homme.

Procédures

Les 5 animaux seront isolés durant les 5 semaines prévues pour la procédure. Ils subiront une anesthésie générale pour une intervention chirurgicale consistant à implanter des électrodes pour les enregistrements des paramètres physiologiques (activités cérébrales, musculaires, oculaires, cardiaques et température) et un dispositif autonome sous cutané de récolte des données physiologiques pendant 40 jours. La durée de l'intervention chirurgicale durera 2 heures maximum. Après 15 jours de récupération et validation de la tolérance à l'implant sous cutané et 1 semaine pour ceux ayant un implant externe, les animaux seront exposés au protocole de prédation pendant 1 semaine (à raison de 2 fois 3 heures par jour).

Impact sur les animaux

Ils subiront d’abord une anesthésie générale pour une chirurgie implantatoire (pose d’électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques du sommeil et d’un implant sous cutané au niveau dorsal pour enregistrer le sommeil en autonomie totale). La procédure chirurgicale de la pose des électrodes est maitrisée. Le caractère novateur de ce projet d’un point de vue expérimental sera la présence d’un implant sous cutané dont la taille a été réduite au maximum (1cm x 4cm x 1.5cm et 15g) et rendu biocompatible (encapsulation en silicone). Ceci pourra donc entrainer une gêne pour l’animal. C’est d’ailleurs ce que nous chercherons à évaluer et à éviter grâce à un suivi quotidien des animaux et à l’optimisation de notre implant. Enfin, si l’aspect implantation sous cutané est validé et ne pose aucun problème aux animaux, durant les 15 jours de récupération, ils seront exposés individuellement et de façon périodique pendant une semaine des stimuli olfactifs et visuels provenant de chats. Bien que les animaux soient en totale sécurité dans leur cage dotée d’un abri, ils vont ressentir probablement un stress dû cette présence. C’est d’ailleurs aussi tout l’objet du projet, évaluer l’impact de ce stress sur leur sommeil. Enfin, dans l'intérêt de leur bonne récupération, l'obtention de résultats reproductibles en éliminant toute interférence provoquée par l'effet groupe, les rats seront isolés durant les 5 semaines de la procédure. Ils n'auront donc pas la possibilité d'exprimer leur comportement social durant cette procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Bien que rendu biocompatible, il sera nécessaire d'évaluer le degré de tolérance de l'implant sous cutané. Pour cela, l'implant sous cutané sera retiré. Les données d'enregistrements seront récoltées et les tissus environnants seront prélevés pour effectuer une analyse histologique qui nous indiquera le degré éventuel d'inflammation provoqué par sa présence. De plus, il sera primordial de prélever le cerveau des animaux et d'analyser histologiquement les potentielles structures cérébrales impactées par le contexte de prédation et les perturbations attendues du sommeil.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer le modèle animal dans le cadre de ce projet qui s’intéresse à la réponse complexe d’un organisme. Le rat est le modèle idéal de par sa taille, sa disponibilité et l’étendu des connaissances que nous avons déjà sur sa physiologie.

Réduction

En augmentant la quantité des paramètres collectés nous réduisons le nombre d’expérience et donc le nombre d’animaux. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, le nombre a été limité au strict minimum (5 animaux avec implant sous cutané et 5 avec implant externe) pour permettre la validation du dispositif et la collecte de données préliminaires. De plus, nos connaissances et notre maitrise en chirurgie implantatoire sur cette espèce nous permet de prévoir un nombre d'animaux minimal. A noter que ces effectifs ne seront pas utilisés dans leur totalité si nous sommes capable d'enregistrer la totalité des expériences prédation avec les animaux avec implant. L'objectif global est recolter des données de sommeil en contexte de predation sur 4 animaux au total et de valider la fiabilité de l'implant sur deux animaux (car sa tolérance a déja été validée sur deux animaux pendant 30 jours) cf DAP V6.

Raffinement

En développant un implant sous cutané, nous permettons à l’animal de se déplacer librement et d’exprimer toute la complexité de son comportement. Ce projet préliminaire s'inscrit d'ailleurs dans un projet futur plus large, qui nous permettra d'enregistrer des animaux en milieu semi naturel donc hautement enrichi. L’enregistrement de plusieurs paramètres physiologiques et cérébraux permet aussi en une expérience d’accumuler beaucoup d’information qui aurait nécessité plusieurs dispositifs parfois filaires auparavant et donc plus gênant pour l'animal.

Choix des espèces

Ce projet est préliminaire et permettra, une fois validé expérimentalement, d’utiliser le dispositif d’enregistrement dans le cadre d’un futur projet de plus grande envergure sur des rats sauvages en milieu naturel. Le rat est suffisamment gros pour supporter notre instrumentation et son sommeil est très bien connu en laboratoire. Par ailleurs c’est une espèce invasive. Il est donc disponible facilement à l’état sauvage. Il a aussi colonisé différent milieu plus ou moins exposé à la prédation, il est donc un modèle de choix pour notre projet. De plus, le sommeil est un état complexe. L’objectif de l’étude est de déterminer quelle part de son expression est influencée par la prédation (rythme, physiologie, mouvement, position, localisation, activité cérébrale). Des rats adultes de 4 mois seront utilisés pour ce projet. Les animaux devront d’une part avoir un âge avec unepleine maturité cérébrale et, d'autre part, une taille et un poids suffisants (400g environ) afin de supporter l’implant sous cutané.