Rats
Évaluation préclinique de l’Accident de Décompression : injection post-plongée de nanocapsules contenant de la perfluorodécaline.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
76 rats Wistar vont être utilisés, tous les survivants tués à l'issue, dans des procédures que le porteur lui-même classe en gravité sévère. Chaque rat, cathéter posé dans la veine caudale, est maintenu en contention pendant une plongée hyperbare simulée de 83 minutes puis observé une heure, épisode décrit comme provoquant une douleur et une angoisse sévères, pour tester des nanocapsules d'oxygène contre l'accident de décompression. Le porteur indique qu'un analgésique est administré avant la plongée sans modifier l'apparition des symptômes, dont la paralysie fait partie du tableau clinique. Il affirme que l'accident de décompression ne peut être induit et étudié que chez l'animal, faute de marqueur biologique validé.
Objectifs
L’accident de décompression (ADD) représente le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques professionnels et de loisir, mais concerne aussi toutes les personnes soumises à des modifications de la pression ambiante (patients et personnels des chambres hyperbares, pilotes, astronautes, ouvriers tunneliers…). Ses manifestations vont de la simple démangeaison jusqu’à la paralysie définitive ou, à l’extrême, au décès. Or, environ un tiers des personnes accidentées conserve des séquelles invalidantes malgré les traitements actuels. Il est donc nécessaire d’améliorer l’efficacité du traitement de cette pathologie. L’administration intraveineuse de solutions de perfluorocarbone (PFC) a montré son efficacité chez des modèles animaux (rongeurs et miniporcs). Ce transporteur d’oxygène est potentiellement efficace dans le traitement de nombreuses pathologies dont l’ADD. L’encapsulation du PFC dans des nanocapsules d’albumine (Albumin-derived perfluorodecalin-containing nanocapsules, A-PFC-N) offre des perspectives prometteuses. Ces préparations présentent une faible toxicité autorisant des applications thérapeutiques ; de plus, l’enveloppe d’albumine, soluble à la fois dans l’eau et les lipides, ne provoque pas de réaction immunitaire. Enfin, ces capsules sont stables en solution et peuvent être administrées par voie intraveineuse. Un travail récent a montré l’intérêt des A-PFC-N sur un modèle murin d’ADD en réduisant l’apparition des ADD. Aujourd’hui, notre objectif est de tester l’efficacité des A-PFC-N dans la prévention secondaire de l’accident de décompression chez un modèle murin d’ADD. Nous projetons ainsi d’appliquer ce traitement expérimental non plus en préventif, comme précédemment, mais après une plongée simulée, afin de se rapprocher des conditions susceptibles de se produire chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur l’étude de l’efficacité des nanocapsules d’albumine contenant de la perfluorodécaline en traitement secondaire de l’ADD. Nous allons pouvoir confirmer ou infirmer ce que nous avions déjà observé en comparant les différents groupes. A moyen terme, si les résultats sont confirmés positivement, une étude clinique pourra être envisagée pour le traitement secondaire de l’ADD chez l’humain. A long terme, les bénéficiaires seront tous les personnels susceptibles d’être atteints d’ADD.
Procédures
Tous les animaux (n=76) sont soumis à deux actes pendant la procédure. Dans un premier temps, pour chaque animal, un analgésique sera administré 1 heure avant la plongée simulée, avant qu'une anesthésie gazeuse ne soit réalisée. Puis, l'animal sera placé dans un tube de contention et un cathéter veineux souple sera implanté dans la veine caudale latérale. L'ensemble de ces gestes dure 10 minutes au maximum. Puis, toujours sous l’effet de l'analgésique et vigile, les 76 animaux seront maintenus en contention pendant le protocole hyperbare, qui est une procédure sévère et dure 83 minutes au maximum. A l'issue de la plongée simulée, tous les animaux recevront immédiatement, via le cathéter veineux, une injection dont le contenu est différent entre les groupes que nous avons constitués. Ils seront alors extraits du tube de contention et une observation stricte de l’évolution des symptômes sera réalisée pendant une heure à l’aide de la table de suivi de soin. Enfin, à l’issue de la période d’observation de 60 min, tous les animaux vivants seront anesthésiés et mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : le stress généré par la mise en place du cathéter au niveau de la veine latérale caudale (intensité légère, durée 3 heures) ; le stress généré par le maintien du rat dans un tube de contention (intensité modérée, durée 2 heures) ; l’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules (intensité légère et durée maximale de 2 minutes) ; la douleur et l’angoisse lors de la plongée simulée et lors de la période d’observation de l’apparition des symptômes pendant une heure post-plongée (Intensité sévère, durée maximale deux heures) ; le stress généré par la préhension et l’injection de l'anesthésique à l'issue de la période d'observation (intensité modérée, durée maximale 2 minutes).
Devenir
A l’issue de la période d’observation de la plongée simulée, tous les animaux survivants seront mis à mort. Nous prélèverons du sang, des tissus, les organes d'intérêt pour des analyses multiples (Histologie des tissus prélevés, dosages biochimiques des paramètres inflammatoires, détermination des activités enzymatiques) afin de déterminer si notre traitement est efficace.
Remplacement
Les expérimentations cliniques induisant des accidents de décompression ne sont envisageables que chez l’animal. Chez l’humain, le risque d’ADD est quantifié à partir de la quantité de bulles veineuses circulantes, or les données récentes montrent clairement que cette mesure est très insuffisante. Par ailleurs, en l’absence de marqueur biologique validé de l’ADD, les approches in vitro ne peuvent être mises en œuvre que sur des échantillons de tissus prélevés sur des animaux préalablement soumis à des décompressions génératrices d’accidents de décompression. De même, les modèles cellulaires, par ailleurs utilisés au laboratoire, permettent d’étudier les effets de la pression ambiante, mais ne sont pas applicables à l’étude de l’ADD. Le remplacement n’est donc pas possible dans cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe (4 groupes de 15 animaux) correspond à l'effectif minimal pour assurer une puissance statistique de 0,8 au risque alpha = 0,05. Plusieurs variables sont analysées : - la proportion d’animaux souffrant d’un accident de décompression, en relation avec le traitement pharmacologique, - la gravité de l’ADD et son évolution en relation avec le traitement pharmacologique - les paramètres biologiques d’intérêt, déterminés à partir de dosages biologiques dans les tissus prélevés. Les paramètres suivant une loi normale sont comparés à l’aide d’une ANOVA à 1 facteur suivie de tests post-hoc (Dunnett contre un groupe témoin, en l’occurrence le groupe “contrôle NaCl” pour l’incidence et la gravité de l’ADD). Si la distribution normale n’est pas respectée, les différences entre groupes sont analysées à l’aide d’une ANOVA non paramétrique (Kruskall Wallis). En ce qui concerne la procédure expérimentale N°1, dès lors que le profil de plongée simulée est validé, la procédure s’arrête. Si des rats ont déjà été livrés, ils intègrent la procédure expérimentale n°2.
Raffinement
A partir de l’âge de 10 semaines et jusqu’à 12 semaines, âge d’entrée dans la procédure, les rats sont habitués à l’usage d’un tube de contention quotidiennement et de manière progressive. Ils sont manipulés tous les jours par des personnes formées et habituées à travailler avec des rats de laboratoire. On commence par 5 minutes de contention le premier jour puis on augmente progressivement la durée jusqu’à 2 heures. Une heure avant la plongée simulée, un antalgique est injecté par voie sous-cutanée afin de diminuer la douleur pendant les injections des nanocapsules et la période d’observation sans modifier l’évolution des symptômes. L’implantation d’un cathéter souple au niveau de la veine latérale caudale est réalisée sous anesthésie gazeuse. L’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules est légère et ne dure que 2 minutes après la sortie du caisson hyperbare, cela relève davantage de la contention à laquelle les rats sont déjà habitués pendant la période d’habituation au maintien dans un tube de contention. L’appréciation de la survenue d’un ADD à l’issue du protocole hyperbare ne peut se faire que sur des animaux vigiles et dont le comportement n’est pas modifié par d’autres facteurs que la présence d’ADD. C’est un accident grave mais certains animaux survivent et ne présentent aucun symptôme. La grille que nous utilisons pour évaluer la gravité de l’ADD est un outil robuste avec des critères fiables. Dans cette étude l’évolution de l’ADD sera appréhendée en fonction de sa gravité sur 60 minutes. C’est le temps nécessaire pour observer et s’assurer que les traitements sont efficaces ou pas. Puis les animaux seront mis à mort. Le point limite est la convulsion, seul critère qui conduira systématiquement à l’arrêt de la procédure avant les 60 minutes d’observation.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ce projet sont des rats Wistar. Il s’agit d’un modèle utilisé couramment au laboratoire et lors de notre première étude concernant les nanocapsules de PFC. Chez ce modèle expérimental, nous possédons à la fois de nombreuses données biologiques concernant les effets d’expositions hyperbares et une bonne connaissance des symptômes d’ADD. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Afin d’être certain d’avoir atteint le stade de «jeunes adultes», matures sexuellement, au moment de la plongée simulée dans le caisson hyperbare, tous les animaux sont âgés de 12 semaines pour qu’ils atteignent la masse corporelle de 450g environ (c’est ce paramètre le plus important dans notre projet).
Les inhibiteurs d’ERAP comme nouvelle approche pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
192 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie tous les sept jours jusqu'à J63, pour tester des inhibiteurs d'ERAP contre des maladies auto-immunes comme la spondylarthrite ankylosante. Le porteur indique que l'inflammation de ce modèle reste légère et transitoire, ce qui l'amène à ne prévoir ni analgésique ni anti-inflammatoire. Il présente ces maladies comme relevant d'un fort "besoin médical" et le rat transgénique comme un modèle de référence.
Objectifs
Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Ces enzymes ont beaucoup attiré l'attention depuis la première découverte d'ERAP1, puis d'ERAP2. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le diabète de type 1 (T1D), la spondylarthrite ankylosante (SA), le psoriasis, la maladie rare de Behçet (BD) et l'uvéite de Birdshot (BU). Plusieurs études (voir état de l'art) ont révélé comment les ERAP modulent l'immunopeptidome dans différents contextes pathologiques. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de rat transgénique HLAB-27. Ce modèle présente une maladie inflammatoire multi-systémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives et autres maladies. La susceptibilité génétique des rats transgéniques exprimant l’allèle HLA-B27/β2-microglobuline humaine en fait un modèle de choix pour cet objectif.
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies auto-immunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la spondylarthrite ankylosante et la maladie de Behçet qui sont des maladies à fort besoin médical.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J0 et chaque 7 jours après le début du protocole de traitement, jusqu'au sacrifice (J63). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 500μL. Pour chaque rat, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Le rat transgénique HLA-B27 présente une maladie inflammatoire multisystémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives, et autres maladies. L'apparition et la sévérité des symptômes inflammatoires chez le rat HLA-B27 sont liées à l'environnement extérieur (le microbiote intestinal pathogène est responsable des lésions inflammatoires plus sévères). L'état sanitaire de l'animalerie centrale de l'Institut Pasteur de Lille prévoit un élevage sans pathogènes. Dans ces conditions, notre cohorte de rats HLA-B27 présente des formes légères d'inflammation multisystémique, c'est pourquoi l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires n'est pas envisagée. L'inflammation intestinale, ainsi que les douleurs articulaires apparaissent dès la 10ème semaine de vie mais surviennent de manière ponctuelle, discontinue et transitoire (d'une durée variable d'un ou deux jours) et se manifestent, respectivement, par des diarrhées, sans perte de poids et par des douleurs d'articulations, touchant les membres inférieurs, uni ou bilatérale. L'uvéite se manifeste aussi de façon ponctuelle et transitoire avec un dégrée de sévérité très limité. Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par la plateforme ADME de l'institut Pasteur de Lille et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenaire (Deprez) sera réalisé sur des modèles cellulaires par la plate-forme ADME de l'Institut Pasteur de Lille (incluse dans l'Infrastructure Nationale ChembioFrance), par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les rats HLA-B27.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 8, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes).
Raffinement
Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) -une perte de poids supérieur à 15%. Le suivi quotidien de l'état de santé des rats permettra d'observer l'apparition et l'évolution des manifestations inflammatoires typiques de ce modèle (uvéite, orchite, douleurs articulaires). Le modèle de rat HLA-B27 est maitrisé au laboratoire depuis plusieurs années et nous avons pu observer que ces types de manifestations inflammatoires sont transitoires (d'une durée maximale d'un ou deux jours) et souvent extrêmement légères et ne sont pas prises en compte comme points limites.
Choix des espèces
Le rat transgénique HLA-B27/β2-microglobuline est, à ce jour, considéré comme un modèle animal de référence des maladies inflammatoires systémiques. Caractérisé par un faible nombre de copies de HLA-B27 et une expression transgénique élevée de la β2-microglobuline humaine, le rat HLA-B27 présente une forte ressemblance clinique et histologique avec les spondylarthropathies humaines, avec arthrite réactive, rhumatisme psoriasique, inflammation articulaire périphérique et axiale, uvéite et l'iritis. Chez l'homme, ces maladies sont fortement associées à l'allèle HLA-B27. Les bases moléculaires de la maladie inflammatoire multisystémique chez les rats HLA-B27 résident principalement dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) généré par le mauvais repliement des chaînes lourdes de HLA-B27 avant leur association avec ß2m, avec une accumulation conséquente dans le RE induisant l'activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en particulier dans les macrophages. Ces évidences soutiennent la pertinence du modèle HLA dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des inhibiteurs d'ERAP. L'utilisation des rats non transgéniques (nTg-Fisher 344) de la même colonie sera justifiée par la nécessité de comparer d’un côté la difference du niveau d’inflammation entre les rats HLA-B27 et les rat wild-type et d’un autre coté les effets des molécules testées dans un modèle non inflammatoire.
Évaluation de la toxicité de l’ADCITMER, un nouveau biomédicament dans le traitement du carcinome à cellules de Merkel chez des rats Wistar males.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
20 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection dans la veine pénienne sous anesthésie puis deux prélèvements de sang, avant d'être mis à mort pour mesurer la toxicité d'un biomédicament destiné au carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique surveiller le pelage "piqué", une perte de poids de 20 % et une hausse des transaminases comme seuils déclenchant la mise à mort. Il présente l'étude comme une obligation réglementaire préalable à un essai clinique de phase I.
Objectifs
Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet age de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hemopathie, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée a 1/100000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée a 40%. Au stade métastatique inopérable les cliniciens ont peu d’options thérapeutiques induisant une réponse tumorale durable. L’pression du CD56, glycoprotéine de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire, a été observée dans 66% des cas de CCM confirmant le choix de cette cible thérapeutique. Un immunoconjugué (anticorps anti- CD56 couplé à la drogue MMAE) a été développé, l’Adcitmer, pour cibler spécifiquement le CD56 et induire la mort des cellules tumorales. L'évaluation in vitro de cette molécule a confirmé son effet cytotoxique sur les lignées de CCM. Pour finir, l'impact sur la croissance tumorale a été montré dans un modèle murin de xénogreffe utilisant une lignée humaine de CCM . L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, la toxicité de l’Adcitmer chez le rat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice premier attendu est d'obtenir la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois dans la veine penienne puis deux prélèvements sanguins seront effectués à 4 et 21 jours post-injection de l'Adcitmer. L’injection dans la veine pénienne durera 5 min par animaux, le prélèvement sanguin durera 3 min également.
Impact sur les animaux
Après 21 jours ou en cas d’atteinte de points limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20%, prostration des animaux ou augmentation des transaminases de 1,5 fois par rapport à la limite supérieur de la norme (normes pour le rat Wistar mâle : ASAT 93 +/- 20 UI/L et ALAT : 32 +/- 5 UI/L), les animaux seront sacrifiés afin d’observer l’impact de l’Adcitmer sur les rats traités versus les rats témoins. Le cœur, la rate, le foie et les poumons seront prélevés pour vérifier que le traitement n’a pas altéré la morphologie des organes. L’analyse histologique sera assurée par les pathologistes de l’équipe. Les critères de jugement de l’étude sont : - Une réduction significative du poids des animaux (une puissance de test supérieure à 80% avec un seuil de risque alpha de 0.05, un test U de Mann Whitney) - Un changement du comportement des animaux Ce protocole suit la règle des 3R : Réduction : Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés. Raffinement : Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires. Remplacement : La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.
Devenir
La mise à mort de tous les animaux permettra d'évaluer la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.
Remplacement
La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.
Réduction
Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires.
Choix des espèces
Le modèle Wistar est un modèle de référence dans les études de toxicité des immunoconjugués. Les males ont été choisi pour injecter en intraveineuse dans la veine pénienne la molécule après une anesthésie. Ceci permet une meilleure réussite et reproductibilité des injections par rapport à la veine caudale. De plus, l’utilisation de sujets d’un même sexe permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. 8 semaines (incluant la semaine d’acclimatation). Stade physiologique : croissance.
imagerie et aide à la chirurgie des nerfs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection intraveineuse d'un agent fluorescent censé marquer les nerfs, puis sont tués avant une chirurgie de dissection des nerfs, pour évaluer un outil d'aide au repérage nerveux en chirurgie maxillo-faciale. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance, la toxicité ayant selon lui déjà été testée et le seul geste sur l'animal vivant étant l'injection sous anesthésie. Il décrit l'expérimentation animale comme "incontournable" pour l'anatomie une fois les tests in vitro réalisés.
Objectifs
Les agents de contrastes fluorescents seront injectés in vivo par voie intraveineuse. De par leur conception, ces agents sont capables de marquer les nerfs en les rendant fluorescents et détectables en intraopératoire lors d’une chirurgie guidée par l’imagerie proche infra-rouge. La visualisation immédiate et en temps réel des nerfs nous permet donc de mieux opérer et enlever les tissus affectés sans endommager les nerfs présents dans le champs opératoire et parfois difficiles à voir par le chirurgien. C’est en particulier un problème aigu pour la chirurgie maxillo-faciale. Chez le rat qui nous servira de modèle, au cours d’une chirurgie cervicale il est possible de repérer les nerfs moteurs équivalent au nerf vague (X) chez l'humain et le nerf grand hypoglosse (XII) chez l'humain. Des dissections préliminaires sont nécessaires pour étudier l'anatomie du nerf facial (VII) chez l'humain au sein de la glande salivaire principale chez le rat (glande parotide chez l'humain).
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu de ce projet est de nous permettre de bien évaluer les performances des agents de contrastes de notre collaborateur. Après injection nous vérifierons donc la capacité de ces molécules à bien colorer les nerfs chez le rat. En termes de chirurgie, les bénéfices attendus concernent : - La qualité du repérage des fibres du nerf laryngée inferieur dans la neurotomie sélective des nerfs laryngées inférieures. Chez les patients, l’endommagement de ces nerfs entraine des problèmes dysphonie spasmodique, qui résistent aux injection de toxines botulique. Nous vérifierons donc que ces nerfs peuvent être très clairement visibles sous lumière infrarouge lors de la chirurgie. - Qualité du repérage du nerf récurrent du larynx pour éviter les paralysies laryngées - Qualité du repérage du nerf laryngé supérieur. Au final, si ces expériences précliniques donnent satisfaction, nous envisageons de lancer des procédure cliniques avec notre partenaire.
Procédures
injection intra veineuse, une fois, 5 minutes
Impact sur les animaux
Nous n'attendons pas de nuisance ni d'effet indésirable sur les animaux. En effet, la toxicité a déjà été testé par notre collaborateur et l'injection de ce produit aux rongeurs ne pose pas de problème. De plus les aimaux seront mis à mort avant la dissection, donc aucun geste ne sera effectué sur les animaux vivants à part l'injection du produit en intra veineuse sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 1 car ensuite une chirurgie autour des nerfs sera effectuée sur l'animal.
Remplacement
A ce stade du projet, tous les tests in vitro ont été effectués. Le modèle murin nous semble le plus approprié, il permet de se rapprocher d'un grand nombre des caractéristiques humaines. De plus, puisqu'il s'agit ici d'anatomie, l'expérimetation animale est incontournable.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides. Dans la première partie du protocole, n=3 est suffisant car nous nous attendons à des résultats très homogènes. Dans la seconde partie du protocole, une partie des nerfs disséqués sans la caméra ne seront pas endommagés, nous devons donc avoir 20 individus par groupe expérimentaux afin d'avoir une puissance statistique nécessaire.
Raffinement
Le composé et la stratégie ont été testés in vitro sur des cultures cellulaires. Ces expériences nous ont permis de déterminer des doses efficaces qui seront injectées in vivo. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63) . Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. L'état des animaux sera surveillé durant les 24h maximum entre l'injection intra-veineuse et la mise à mort. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le modèle rat nous semble le plus approprié, il permet de se rapprocher d'un grand nombre des caractéristiques humaines. Les animaux seront utilisés "à l'âge adulte" c'est à dire à partir de l'âge de 2 mois. A cet âge, les animaux sont de bonne taille et cela facilite la chirurgie post mortem.
Défaut maxillaire chez le rat : un modèle pour tester des biomatériaux destinés à la régénération de l’os alvéolaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une perte osseuse est créée chirurgicalement dans leur mâchoire, puis la régénération est suivie au microscanner pendant deux mois avant la mise à mort pour analyse histologique, afin de tester des biomatériaux de comblement. Le porteur indique que la chirurgie maxillo-faciale provoque une douleur modérée et une gêne à la mastication les premiers jours. Il affirme que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur l'animal et qu'aucune approche in vitro ne répond à la réglementation sur les dispositifs implantables.
Objectifs
Les pertes de substances osseuses représentent un challenge en chirurgie orale et une problématique de santé. Ces pertes osseuses au niveau de la mâchoire peuvent avoir différentes origines : traumatismes dû à un accident, tumeurs bénignes ou malignes, infection, .... En clinique, l'utilisation de greffe pour réparer la zone est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie lourde, problème de compatibilité et d'intégration du greffon...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier à ces limitations et optimiser la prise en charge des patients. Pour évaluer le potentiel ostéogénique des biomatériaux étudiés et envisager à terme de les utiliser chez l'homme, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal. Dans notre projet le modèle proposé est le rat, qui est une espèce pertinente et reconnue dans le cadre de la validation des biométériaux implantables à visée humaine. Le suivi de la régénération osseuse sera réalisé par de l'imagerie par un micro-scanner, cette technologie est composée d'un système d'acquisition et d'un logiciel dédié, qui effectue des analyses de densité radiologique point par point pour reconstituer des images du site d'intérêt extrêmement précises. Cette technologie permet un suivi performant du site d'intérêt et est indolore pour l'animal. Ainsi l'objectif du projet est de tester le pouvoir ostéogénique de biomatériaux implantés spécifiques de ce type de reconstruction au niveau de la face en vue de futur essai clinique chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendrera une douleur modérée pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénientset et toutes les mesures sont mises en place pour prendre en charge le bien-être des animaux tout au long du projet.
Devenir
Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine au sein de l'animalerie sera respectée avant le début des expérimentations. Les mesures de raffinement sont mises en place tout au long du projet, notamment lors de la phase de la chirurgie : les animaux recevront au préalable une couverture analgésique (anti-douleur), ils seront ensuite endormis, sous anesthésie générale durant toute l'opération. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part sur tapis chauffant. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage et il sera suivi individuellement pendant quelques jours afin de s'assurer que l'opération s'est bien passé et que l'animal récupère correctement. Les critères d'évaluation et de suivi sont définis et adaptés au projet. Suite à cette surveillance, les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec un raffinement des conditions d’hébergement adapté à leur espèce : enrichissement de l’environnement d’hébergement (litière en copeaux, jouets, bâton à ronger...).
Choix des espèces
Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses chez l'homme. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mâchoire. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre, afin à terme leur utilisation chez les patients. Des rats Sprague-Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance au niveau osseux pour répondre à l'objectif de l'étude.
Effets du venin d’abeille et de son dérivé non allergène, le delta venin, sur les déficits engendrés dans un modèle animal pharmacologique de la Maladie de Parkinson chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
56 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés vivants pour une seconde étude ultérieure. Ils reçoivent une injection d'halopéridol induisant une catalepsie réversible, suivie d'une injection de venin d'abeille ou de son dérivé, pour tester un effet contre l'akinésie dans un modèle pharmacologique de la maladie de Parkinson. Le porteur rappelle qu'un premier essai clinique du venin d'abeille n'a pas amélioré le score moteur des patients et n'a réduit que les doses de L-DOPA. Il affirme que l'étude des performances comportementales rend l'utilisation des animaux "indispensable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer le rôle bénéfique d'un venin d'abeille (Bee Venom, BV), sans son composé allergène la phospholipase A2 (sPLA2), appelé deltaBV, sur les symptômes mesurés dans un modèle pharmacologique de la Maladie de Parkinson (MP) par une approche comportementale. Nos études récentes ont démontré une action bénéfique du BV (alyostat) dans des modèles de la MP chez le rongeur. L'étude préliminaire clinique, quant à elle, n'a pas reporté d'effets bénéfiques marqués. Ces études ont été évaluées positivement par les comités scientifiques des fondations suivantes (Association France Parkinson, Fondation de France, AP-HP) et du CNRS. Notre projet vise donc à tester le delta BV, comparé au BV, afin d'établir les doses efficaces sans induire d'effets secondaires (choc anaphylactique) . Ce projet posera les bases à une étude clinique qui sera menée à plus long-terme chez des patients parkinsoniens. En effet, la première étude clinique menée chez un petit nombre de patients après une injection mensuelle de BV à faible dose pendant 1 an, n'améliore pas le score moteur (UPDRS) mais permet de diminuer les doses thérapeutiques de L-DOPA administrées chez les patients. Au vu du faible effet observé, il serait nécessaire de tester le BV à plus forte dose dans une nouvelle cohorte. Pour cela, le deltaBV, sans la sPLA2 responsable des allergies et récemment synthétisé à Sophia Antipolis à partir du BV (américain), doit être testé au préalable chez l'animal dans un modèle d'akinésie parkinsonienne (défaut d'inititation motrice). Nous comparerons les effets de la forme non allergène , deltaBV, à ceux obtenus avec le BV (américain) dont il est extrait. Cette première étude (présente DAP) dans le modèle d'akinésie induite par l'halopéridol (modèle pharmacologie de la MP) nous permettra de mettre en évidence les doses significativement efficaces pour contrecarrer l'akinésie et de tester dans une deuxième étude (seconde DAP) dans un modèle lésionnel de la maladie avec plusieurs tests moteurs. De plus, l'ensemble des expérimentations sera filmé de sorte qu'il fournira des données pour plusieurs séances de travaux dirigés dans le cycle 2 du Bachelor Universitaire Technologique de Génie Biologie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique du BV américain en comparaison avec le BV alyostat - Mise en évidence de l'effet bénéfique du delta BV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme - Données sur la concentration efficace du BV et deltaBV sur l'akinésie motrice- Collecte de données pour la réalisation d'un TD
Procédures
Pour l'étude sur le modèle pharmacologique, les animaux reçoivent tous une injection ip d'halopéridol suivie d'une injection ip de BV/dBV selon le groupe. Ces deux injections seront réalisées à une demi-heure d'intervalles et ceci une seule fois.
Impact sur les animaux
L'injection d'halopéridol (1 mG/kG, volume injecté 1mL/kG) induit une catalepsie réversible en 12 H. L'injection intrapéritonéale de BV (1/5/5 µG/kG, volume injecté 1mL/kG) ne devrait pas induire de choc anaphyllactique car des études antérieures utilisant les mêmes concentrations d'un BV d'une autre composition n'en avait pas engendré.
Devenir
A la suite du test de catalepsie, les animaux seront hébergés dans l'animalerie par cage de 2 dans un environnement enrichi et seront laissés au repos jusqu'à l'obtention de l'autorisation pour la 2ème étude.
Remplacement
Cette étude concerne les effets du BV et du dBV sur des performances comportementales. L'utilisation des animaux est donc indispensable.
Réduction
Des études précédentes utilisant ce modèle nous ont permis de réaliser des statistiques en amont afin de réduire le nombre d'animaux tout en gardant une significativité de 5%.
Raffinement
Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Pour éviter le stress lors des injections intrapéritonéales, les animaux seront manipulés durant la semaine précédente.
Choix des espèces
Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. De façon à pouvoir réutiliser ces rats (coordonnées stéréotaxiques pour induire la lésion), nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois.
Formation aux gestes techniques pour l’administration de composés et le prélèvement sanguin chez le rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 500
Cochons d'Inde : 100
1 100 rongeurs, soit 500 souris, 500 rats et 100 cochons d'Inde, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des expérimentateurs aux gestes d'administration de substances et de prélèvement sanguin, lors de séances de deux à trois heures répétées selon l'habileté de chaque stagiaire. Le porteur reconnaît que des gestes mal maîtrisés par des personnes novices peuvent produire une contention prolongée, du stress et des gestes plus douloureux. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer l'animal pour cette formation et qu'un même animal sert à apprendre plusieurs gestes avant d'être tué.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de former les expérimentateurs aux gestes techniques pour l’administration de composés et le prélèvement sanguin chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de former les nouveaux arrivants dans notre société et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie.
Procédures
Les animaux subiront des administrations d’eau de boisson pour les administrations per os et de liquide physiologique pour toutes les autres voies d’administration. Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur tous les animaux en fonction des gestes techniques à apprendre. La durée de cette formation donc des gestes techniques appliqués sur les animaux dépendra de l’habilité de chaque collaborateur. Il semble cohérent de prévoir des séances d’entraînement de 2 à 3 heures environ par jour où tous les gestes à apprendre peuvent être combinés.
Impact sur les animaux
Ce projet est réalisé pour valider ou former de nouveaux collaborateurs aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins. Ces personnes pouvant être novices, il est possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…). Cependant, dans un premier temps, les gestes à apprendre seront réalisés avec un formateur afin de limiter tout stress à l’animal.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Aucune méthode substitutive ne permet actuellement de remplacer l’animal pour réaliser la formation de la réalisation des gestes techniques d’administration ou de prélèvement sanguins en reproduisant toutes les réactions physiologiques de l’animal lors des contentions, des administrations, des prélèvements et lors des anesthésies.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de réduire le stress de l’animal ainsi que la douleur. En effet, la personne sera formée par un autre collaborateur expert dans tous les gestes à apprendre afin de lui enseigner les bonnes techniques de contention, les bons gestes techniques afin de réduire au maximum le stress chez l’animal. De plus, le formateur adaptera la formation en fonction de chaque collaborateur (besoin de plus de temps si besoin pour apprendre la contention, le rapport à l’animal…). Sachant qu’un même animal pourra être utilisé pour apprendre différents gestes techniques, ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin de maintenir la température corporelle des animaux et d’éviter toute hypothermie.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études in vivo. Cependant nous utilisons également des cobayes et une formation à la contention et à la réalisation des gestes techniques peut être nécessaire selon chaque expérimentateur (trice). Nos projets d’études utilisant des animaux adultes, il sera préférable d’apprendre les gestes techniques sur des animaux adultes (de 6 à 8 semaines minimum).
Rôle des récepteurs de la Ryanodine dans la cardiomyopathie induite par le sepsis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat est sédaté, intubé et ventilé, puis reçoit une injection intraveineuse de LPS provoquant un choc endotoxinique et une défaillance cardiaque, avant une échographie du coeur puis la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun traitement de cette cardiomyopathie en médecine humaine et renvoie l'intérêt thérapeutique à une validation ultérieure sur un "gros animal" puis chez l'humain. Il décrit le modèle rat comme "incontournable" et juge les cultures cellulaires non pertinentes.
Objectifs
L'objectif du projet est d'identifier des molécules qui pourraient traiter la cardiomyopathie induite par le sepsis (CMIS) qui est la dysfonction cardiaque causée par une infection sévère. Plusieurs études chez l'animal ont permis de mettre en avant l'implication des voies de l'inflammation, de modifications redox et des troubles de l'homéostasie calcique. Des travaux précédents ont mis en évidence l'existence de dysrégulations des RyR dans la CMIS. Notre objectif est de montrer que certaines molécules pourraient protéger de la CMIS par leur impact sur une régulation des RyR. On s'intéressera particulièrement aux molécules connues pour avoir un impact sur l'homéostasie calcique (notamment via les récepteurs de la ryanodine, RyR) en les évaluant sur un modèle de rat après induction d'un choc septique (ou plus précisément endotoxinique) par injection d'un fragment de bactérie (le LPS d'Escherichia coli).
Bénéfices attendus
Dans nos précédents travaux nous avons mis en évidence l'implication des RyR parmi les mécanismes physiopathologiques de la CMIS. Ceci laisse entrevoir de nouvelles possibilités thérapeutiques qui doivent être validées chez l'animal avant de pouvoir envisager leur utilisation en médecine humaine. La mise en évidence d'une potentielle efficacité sur l'atténuation de la CMIS par une ou plusieurs molécules, en monothéréapie ou en association, permettra son ou leur évaluation sur un modèle de gros animal puis en médecine humaine. Le bénéfice attendu in fine est la mise à disposition de thérapeutique active contre la CMIS, alors qu'il n'en existe aucune disponible en médecine humaine aujourd'hui.
Procédures
Chaque journée d’expérimentation est dédiée à un seul animal. L’individu est sédaté (hypnotique et morphinique), intubé, ventilé, et monitoré en continue (ecg, pression artérielle, échelle de sédation). Un choc endotoxinique (LPS) est ensuite réalisé par injection intraveineuse de LPS afin de générer une CMIS. Une échographie cardiaque est réalisée à la phase initiale puis après 4 heures. L’individu est ensuite euthanasié et les tissus et le matériel biologique destinés aux analyses sont prélevés pour réalisation des analyses biochimiques (immunoprécipitation et Western blot) et analyses fonctionnelles avec la mesure des propriétés biophysiques (bilayer) des canaux calciques, issus de microsomes des tissus. On appliquera cette procédure à 10 groupes de 12 rats, soit 120 animaux au total.
Impact sur les animaux
Décés (les animaux sont euthanasiés en fin d'expérimentation)
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le coeur, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle de rat est incontournable pour l'analyse physiopathologique de la CMIS. Il est important de souligner que les cultures cellulaires de cardiomyocyte, déjà réalisées dans d'autres laboratoires, ne permettent pas d'appréhender l'impact des interactions entre le cœur et les différents organes, le cœur et la ventilation, et les effets des variations de volémie. L'utilisation de méthodes alternatives ou substitutives n'est donc pas pertinente. Le modèle rat après sédation, intubation et ventilation devrait permettre d'obtenir des résultats extrapolables au patient de réanimation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement significatif. Nous avons défini une stratégie d'expérimentation que nous espérons la plus optimale possible. Nous réaliserons dans la mesure du possible les exploration electrophysiologique, la mesure de pression, les mesures échographiques et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement avant l'expérimentation et de façon rapprochée, toutes les heures durant l'expérimentation. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche le rat wistar est l'espèce retenue. Cette espèce a déjà été utilisée dans la litérature pour étudier la CMIS. D'après d'autres études sur des modèles animaux variés, les mécanismes physiopathologiques de la CMIS semblent être généralisables entre les espèces de mammifères. De plus, un certain nombre d'études réalisées chez l'homme confirment les similitudes physiopathologiques avec les autres espèces de mammifère et notamment les rats. Ainsi, les résultats du modèle rat devraient permettre une extrapolation chez le gros animal et chez l'homme. Afin d'obtenir des résultats représentatifs de notre cohorte clinique et comparable à la littérature existante, les rats seront utilisés à un stade adulte (8-10 semaines).
Etude du rôle de métabolites de la flore microbienne intestinale dans le développement de l’obésité et du diabète chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Rats : 210
490 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils subissent des prélèvements de sang hebdomadaires par microcoupure de la queue, des tests de tolérance au glucose par gavage, et une inoculation de flore intestinale par voie rectale sous anesthésie, pour étudier le lien entre bactéries intestinales et diabète. Le porteur indique que des transferts de flore antérieurs ont parfois provoqué des diarrhées sans déshydratation aiguë, et que la microcoupure de la queue relève d'une douleur modérée. Il juge les modèles animaux encore "nécessaires" faute de reproduire in vitro les interactions entre organes, avant mise à mort pour prélever les tissus.
Objectifs
Ce projet vise à mettre en évidence un lien de cause à effet entre la modification de la flore intestinale et la santé métabolique du rongeur. De nombreuses études mettent en évidence le rôle de modifications de l’architecture de la flore intestinale dans le risque de nombreuses maladies auto-immunes, métaboliques, neuro-développementales et neuro-dégénératives, y compris au cours du diabète de type 2. En revanche, l’impact physiopathologique de bactéries individuelles de la flore intestinale, connues pour synthétiser des produits à effets bénéfiques sur la santé, sur les caractéristiques et l'évolution de ces maladies est mal connu, et ce projet vise à en élucider les mécanismes à travers des études in vivo chez le rat et la souris. Plus particulièrement nous étudierons l'impact de bactéries productrices de 4-cresol, un métabolite synthétisé exclusivement par la flore bactérienne, sur l'homéostasie glucidique dans des modèles précliniques de diabète de type 2 d’étiologies complémentaires, le rat Goto-Kakizaki (GK) et la souris soumise à un régime hyperlipidique. L'impact d'une modulation de la flore de la femelle gestante sur l'homéostasie glucidique de sa descendance sera également étudié pour envisager des applications thérapeutiques sur le contrôle du diabète gestationnel et la réduction du risque de transmission du diabète à la descendance. De plus, nous étudierons également l'impact d'un transfert de flore venant d'animaux résistants à l'obésité afin de mettre en évidence des effets protecteurs éventuels chez les souris receveuses. Ce projet sera réalisé en conformité avec la règle des 3Rs et dans le respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l'effet de métabolites de la flore bactérienne sur l'homéostasie glucidique de l'hôte et d’envisager des applications thérapeutiques dans le diabète chez l’Homme. En effet le rôle causal de produits de bactéries individuelles présentes naturellement microbiote sur la modulation de la prise de poids et de l'équilibre glycémique. qui est une piste prometteuse dans le traitement du diabète, n'est pas encore complètement démontré, de même que les effets sur la descendance de mère ayant reçu des enrichissements de flore. Les résultats attendus ouvriront de nouvelles perspectives pour le traitement du diabète de type 2, à moyen terme, avec l’élaboration de nouveaux produits probiotiques.
Procédures
Les animaux seront pesés 2 fois par semaine. Des prélèvements de sang au niveau des vaisseaux caudaux seront réalisés une fois par semaine (10 microlitres) pour mesure de la glycémie et de l'insulinémie basale (sauf pour les animaux des lots 1 et 2 utilisés comme donneurs de caecums). Des tests de tolérances au glucose (gavage par voie orale d'une solution de glucose 20% à 2g/kg) seront réalisés 15 jours après le transfert de flore, puis 2 mois après (les 2 tests seront donc espacés de 6 semaines). La glycémie sera mesurée aux temps 0, 10, 30, 45, 60 et 90) à l'aide d'un lecteur de glucose grâce à des prélèvements par les vaisseaux caudaux et à raison de 5 microlitre par prélèvements (25 microlitre par test). Pour résumer pour chaque animal: prélèvement basal (une fois par semaine):10 microlitres. Test de tolérance au glucose : 50 microlitres. Les animaux destinés au transfert de flore seront anesthésiés à l'isoflurance pendant quelques minutes dans la cage d'induction afin de s'assurer de leur immobilité pendant l'inoculation de la flore par voie rectale. Cette voie d'administration est parfaitement maîtrisée par l'équipe.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre expérience dans le type de procédures mises en œuvre dans ce projet, qui ont toutes été déjà optimisées, nous ne prévoyons pas de nuisances ou effets indésirables (sauf l'induction du diabète) qui pourraient conduire à la mise à mort anticipée des animaux. En ce qui concerne l'acte "transfert de flore", l'inoculation de flore par gavage que nous utilisons chez l’animal est une technique qui nécessite une contention de courte durée (
Devenir
A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux), qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins, et qui sont sous influence de modifications de l’architecture et de la fonction du microbiote intestinal. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type organ on chips qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier des cibles d'intérêts grâce à des analyses de criblage in vitro et in silico. Ainsi cette sélection abouti à ne retenir que les candidats les plus fiables et ce sont eux qui seront testé in vivo, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaire à l'étude.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance.
Choix des espèces
Nous utilisons deux modèles précliniques de deux espèces différentes, chacune représentative du diabète de type 2 Humain. - Le rat de la souche isogénique GK (Goto-Kakizaki), qui porte des gènes de prédisposition au diabète et présente spontanément une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline, sans obésité manifeste. - La souris C56BL6/J nourrie par un régime riche en graisse, qui développe expérimentalement, en réponse à un stimulus alimentaire, une intolérance au glucose et une obésité, ce qui est représentatif de l’effet de l’environnement sur le développement de ces maladies. Il s'agira d'adultes, le diabète de type 2 apparaissant principalement à l'état adulte dans l'espèce humaine.
Evaluation des paramètres pharmacocinétiques d’un produit test aprés une administration unique par voie orale ou rectale avec recueil de tissus et de feces chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une administration unique d'un produit test par voie orale ou rectale, puis subissent des prélèvements de sang par ponction jugulaire et intracardiaque et sont placés en cage à métabolisme pour recueillir leurs fèces. À la fin, les 12 rats sont mis à mort pour prélever foie, reins et cerveau. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang au niveau de l'"organisme entier" et juge le recours au rat entier "indispensable", sans qu'aucune analyse statistique n'appuie l'effectif.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test aprés une simple administration orale ou rectale chez le rat à la dose de 0.5 mg/kg.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que le produit test peut s'administrer soit en voie orale soit en voie rectale et de pouvoir comparer les paramètres pharmacocinétiques en comparant les deux voies d'administration.
Procédures
Dans ce projet, il est prévu de faire des administrations rectale et orale sur animal vigile. Ces administrations seront de trés courte durée (durée d'une administration moins d'une minute). Puis des prélèvements sanguins seront réalisés dans le but de suivre la concentration dans le sang de la molécule testée. Ils seront réalisés sur animal anesthésié au préalable, par ponction directe aux veines jugulaires ( ou en intracardiaque dans le cas du prélèvement terminal). La durée d'un prélèvement de sang est de l'ordre de la minute également. Les prélèvements de sang se feront avant administration, puis à 30min, 2h, 3h, 4h et 6h aprés l'administration rectale et avant administration, 30 min, 2h, 3h, 4h et 6h aprés l'administration orale. Le volume de prélèvement sanguin sera d'environ 300 μL par prélèvement soit 1.8mL au maximum. Les prélèvements de sang se feront selon les bonnes pratiques de laboratoires et conformément à la réglementation en vigeur. La durée de la phase animale est de 6h aprés les administrations. Les administrations et les prélèvements de sang seront réalisés par un personnel expérimenté et conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront placés en cage à métabolisme pour une collecte de féces sur une durée de 6h aprés administrations. Les animaux auront un contact visuel entre eux. D'un point de vue scientifique il est necessaire de collecter les fécès pour doser la quantité de principe actif dans les échantillons.
Impact sur les animaux
Le produit test fait partie de la classe thérapeutique infectiologie. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, poils ebouriffés, prostration, site de prélèvement abimés, hématome ou saignement au site d'administration pour la voie rectale...)
Devenir
A la fin de ce projet, les 12 animaux seront euthanasiés aprés le prélèvement sanguin conformément à la réglementation en vigeur et aux bonnes pratiques vétérinaires. Des prélèvements de tissus seront réalisés. Le foie, les reins et le cerveau seront prélevés
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.
Réduction
12 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront réparti en 2 groupes de 6 animaux. Les animaux du groupe 1 seront administrés par voie orale et les animaux du groupe 2 par voie rectale. Aucune approche statistique n'a été réalisée
Raffinement
Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés individuellement en cage à métabolisme pour collecter les fécès durant 6 h aprés administration. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, poils ebouriffés, prostration, site de prélèvement abimés , hématome ou saignement au site d'administration pour la voie rectale...) Le vétérinaire désigné ou suppléants toujours présents sur site pourront intevenir rapidement si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Dégradation marquée de l'état général (ex : détresse respiratoire, décubitus) - Atteintes ou traumatismes à l'origine de douleurs sévères (ex : convulsions, mouvements ou postures anormaux... - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : prostration, poil ébouriffé ou souillé, alopécie extensive...) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...) - Site de prélèvements sanguins trés abîmés, douleurs au niveau des sites de prélèvements - Hématomes ou saignements au niveau du site d'administration pour la voie rectale La contention des animaux sera faite par du personnel expérimenté pour éviter toute mauvaise manipulation de l'animal. Evaluation quotidienne de l'état de santé général de l'animal pour une détection précoce des signes cliniques anormaux.
Choix des espèces
Le rat, Sprague Dawley est l'espèce utilisée dans ce type d'étude. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques dans le domaine de l'infectiologie. Adultes. Rat d'environ 200-250g
Effets extra-oraux chroniques et aigus des édulcorants chez le rat
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
704 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des chirurgies, des jeûnes répétés, des injections de glucose ou d'édulcorants et de multiples prélèvements sanguins, avant une chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil pour prélever des tissus de l'hypothalamus. Le projet cherche à comprendre comment les substituts de sucre non nutritifs perturbent le métabolisme du glucose et la prise alimentaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution ne permet d'étudier ces mécanismes mettant en jeu des dialogues entre organes.
Objectifs
Consommés régulièrement des substituts de sucres non nutritifs (SNN) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et par voie de conséquence une augmentation de la glycémie à long terme. De plus, il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces changements métaboliques pourraient entrainer des dysfonctions physiologiques notamment par l’intermédiaire des récepteurs T1Rs au goût sucré. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier sur les vaisseaux sanguins et l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) de substituts de sucre non nutritifs (SNN) à court mais aussi à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer les effets métaboliques (dont le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline) et sur la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations nous permettrons de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entrainent un dysfonctionnement du métabolisme glucidique et du contrôle de la prise alimentaire en lien avec l’hypothalamus, et indépendamment de la perception gustative orale.
Procédures
Etude de l’effet chronique des édulcorants Par voie extraorale : Une partie des animaux subira une chirurgie de 30 à 45 minutes (procédure1), après 6 semaines, la moitié de ces rats opérés suivra la procédure 2 (reprise alimentaire après un jeûne) avec mise à jeun de 8 heures suivie d’une injection intrapéritonéale (IP) PBS ou IP glucose puis 3 prélèvements sanguins sur 4 heures. Ces animaux seront ensuite utilisés, une semaine après en procédure 4 avec chirurgie sans réveil. L’autre moitié subira la procédure 3 : soit un test de tolérance au glucose avec mise à jeun de 4 heures suivi d’une IP de glucose puis 6 prélèvements sanguins sur 2 heures soit une échoMRI, ils subiront la procédure 4 sans réveil après une semaine de repos. Par voie orale : Ces animaux auront les édulcorants pendant 8 semaines dans l’eau de boisson. Après 8 semaines, la moitié de ces rats suivra la procédure 2 avec mise à jeun de 8 heures suivie d’une IP PBS ou IP glucose puis 3 prélèvements sanguins sur 4 heures. Ces animaux seront ensuite utilisés une semaine après en procédure 4 avec chirurgie sans réveil. L’autre moitié subira la procédure 3 : soit un test de tolérance au glucose avec mise à jeun de 4 heures suivi d’une IP de glucose puis 6 prélèvements sanguins sur 2 heures soit une échoMRI, ils subiront la procédure 4 sans réveil après une semaine de repos. Pour l’étude de l’effet aigu : un groupe de rats subira la procédure 2 : avec un jeûne de 8 heures une IP de glucose, de PBS, ou de l’un des deux édulcorants étudiés et 3 prélèvements sanguins sur 4 heures. Après une semaine de repos ils subiront la procédure 4 sans réveil. Aucun animal n’aura plus d’une procédure avec prélèvement alors qu’il est éveillé.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie mais aussi chez les rats chroniques per os s’ils ne buvaient pas l’eau contenant l’un des 2 édulcorants (ou à l’inverse une prise de poids importante)
Devenir
Procédure 1 : Classée modérée : ces animaux seront gardés en vie : cette procédure permettra d'étudier le ou les effets des édulcorants diffusés de façon chronique par voie extraorale, ils seront utilisés dans d'autres procédures : 2 (ou 3) et 4. Procédure 2 : Classée légère, cette procédure permettra l'étude des effets des édulcorants (soit aigus soit chroniques : par voie orale ou par diffusion extraorale) sur la reprise alimentaire après un jêune, ces animaux seront gardés en vie et utilisés en procédure 4. Procédure 3 : Classée légère, cette procédure permettra l'étude des effets des édulcorants sur le métabolisme glucidique et la répartition des masses maigres et grasses après traitement ces animaux seront gardés en vie et utilisés en procédure 4. Procédure 4. Classée sans réveil : Etude de la réponse hypothalamique au glucose en fonction du traitement aux édulcorants (aigu ou chronique par voie orale ou par diffusion osmotique). Cette procédure prévoit le prélèvement de tissus gluco sensibles frais ainsi que des tissus fixés pour les études d'immunohistochimie. Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
L’étude des mécanismes biologiques à la base des comportements alimentaires nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. Il n’existe actuellement pas de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier les paramètres physiologiques d’intérêt dans nos études (prise alimentaire, dépense énergétique, thermogenèse, glycémie, adiposité, etc), car ces paramètres mettent en jeu des arcs-réflexes, des rétrocontrôles, et des dialogues entre organes.
Réduction
Les procédures décrites, ainsi que la stratégie expérimentale ont été optimisées, standardisées et validées dans des projets antérieurs, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle et d'éviter des études pilotes supplémentaires, et permet donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Nous utiliserons des tests statistiques afin de calculer le nombre minimum d’animaux permettant une représentation de la population et suffisant pour détecter des différences significatives.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Lors des expérimentations réalisées sous anesthésie générale, les animaux recevront une dose d’analgésique morphinique puis seront sédatés avant de recevoir l’anesthésique. Les doses et les produits utilisés le sont sur les conseils du vétérinaire désigné du laboratoire. Un suivi quotidien sera fait pour s’assurer du bien-être des animaux. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle lumineux inversé permettant l’expression de comportements innés et favorisant la protection des animaux. Les expérimentations auront lieu durant la période d'activité des rats en leur laissant leur période de repos pendant le cycle de jour. Deux semaines seront nécessaires pour l'habituation à leur nouvel environnement et au personnel. Ce raffinement contribue au bien-être animal, ce qui réduit la variabilité inter-individuelle engendrée par le stress, et par conséquent limite le nombre d’individus nécessaires pour les études statistiques.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés Nous voulons que les animaux aient le même âge pour les études aigues et les études chroniques, sans pathologies dues à l'âge : Pour les études des effets aigus des édulcorants, les rats arriveront à l’âge de 12 semaines, en tenant compte des deux semaines d’habituation à leur nouvel environnement, ils auront 14 semaines au moment des expérimentations. Pour les études des effets chroniques des édulcorants consommés dans l’eau de biberon, les rats arriveront à l’âge de 4 semaines, en tenant compte des deux semaines d’habituation à leur nouvel environnement, ils auront 14 semaines au moment des expérimentations. Pour les études des effets chroniques des édulcorants injectés par voie carotidienne à l’aide des mini-pompes osmotiques (diffusion pendant 6 semaines maximum), les rats arriveront à l’âge de 6 semaines, ils auront 8 semaines au moment de la mise en place de la mini-pompe, 14 semaines au moment des expérimentations
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle d’endométriose induite par administration de LPS chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 450
Une chirurgie abdominale de dix minutes sous anesthésie, puis, selon les études, jusqu'à quatorze injections ou vingt-huit administrations par la bouche des molécules testées, enfin un prélèvement de 500 µL de sang derrière l'œil juste avant la mise à mort : 1 800 rongeurs, 1 350 souris et 450 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le projet teste des molécules anti-inflammatoires sur une endométriose induite par administration de LPS, dont la mise en place provoque, selon le porteur, des "douleurs inflammatoires" liées à la maladie et à la chirurgie, repérées aux expressions faciales des souris et des rats. En cas de signes de souffrance, la buprénorphine "pourra être administrée" à partir d'un score cumulé de 2, et la mise à mort intervient à 4, ou dès que l'un des scores atteint 2. Les souris et les rats qui n'atteignent aucun point limite sont tués entre 24 heures et 14 jours après l'induction de la maladie, selon la molécule, pour prélever organes et tissus.
Objectifs
L’endométriose est une maladie caractérisée par la présence anormale de tissu utérin en dehors de la cavité utérine pour laquelle il n'existe aucun traitement aujourd'hui. Cette anomalie engendre des lésions composées de cellules qui possèdent les mêmes caractéristiques que celles de la muqueuse utérine (l’endomètre) et se comportent comme elles sous l’influence des hormones ovariennes. Il s’agit d’une maladie gynécologique fréquente, retrouvée chez 10% des femmes. Les symptômes induits par l’endométriose sont le plus souvent des douleurs et une infertilité. Un examen clinique et échographique, voire par IRM, permet de détecter une endométriose, même si le diagnostic définitif doit passer par l’analyse du tissu endométrial prélevé au cours d’une chirurgie. Une endométriose asymptomatique, non douloureuse et qui ne pose pas de problèmes de fertilité n’est en général pas détectée et donc pas traitée. Dans un cas d’une endométriose douloureuse, un traitement hormonal sera proposé en première intention destiné à supprimer les règles (contraceptifs œstroprogestatifs monophasiques en continu, progestatifs, danazol ou analogues de la GnRH (gonadotropin releasing hormone)). Ce traitement réduit les douleurs liées à la réponse hormonale des lésions d’endométriose et peut permettre de stabiliser les lésions, voire de diminuer légèrement leur volume. Dans certains cas où le traitement hormonal n’est pas suffisant, un traitement qui provoque une ménopause artificielle peut-être mis en place (injection d’analogue de la LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone); hormone destinée à stopper la production d’oestrogènes). Lorsqu’il y a échec du traitement médical (persistance des lésions et/ou nombreux effets indésirables), la chirurgie reste le seul traitement permettant l’élimination des lésions associées à l’endométriose de façon ponctuelle permettant ainsi à la patiente d'envisager une grossesse. Aucun traitement (hormonal ou chirurgical) ne permet à ce jour de guérir de l’endométriose. Il est donc urgent d’identifier des candidats médicaments efficaces et avec peu d’effets indésirables. Ce projet a pour but de tester des nouvelles molécules à visées thérapeutiques (à caractère anti-inflammatoire) dans un modèle in vivo d'endométriose induite par administration de LPS (lipopolysaccharides) (Xiaofei Ma ,et al. 2021). Le projet pourra comporter jusqu'à 20 études (5 études rat + 15 études souris), inculant au maximum 90 animaux, soit 1800 animaux au total.
Bénéfices attendus
L’inflammation joue un rôle prépondérant dans la progression de l’endométriose. Une augmentation de la production de prostaglandines, de certaines cytokines pro-inflammatoires et de facteurs de croissance susceptibles d’induire inflammation, néo-angiogenèse et prolifération d’implants endométriosiques dans la cavité péritonéale, a été observée chez des femmes présentant une endométriose. Ces processus inflammatoires sont largement responsables de l’apparition des douleurs. A ce jour, aucune molécule anti – inflammatoire spécifiquement indiquée dans le traitement de l'endométriose n’est proposée. Les traitements actuellement proposés sont destinés à soulager les douleurs incluant notamment, des antalgiques, des antispasmodiques, des AINS, des traitements hormonaux (progestatifs et œstroprogestatifs) qui vont interrompre le cycle ovulatoire responsable des poussées douloureuses. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules à caractère anti-inflammatoire dans un modèle d'endométriose induit par administration de LPS. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel dans ce modèle, plusieurs prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages immunologiques, analyses histologiques, extraction d'ARN. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées.
Procédures
Une seule chirurgie abdominale sous anesthésie générale (par injection intrapéritonéale de xylazine/kétamine + une injection sous cutanée de lidocaine) ou sous isoflurane (+ une injection sous-cutanée de buprénorphine + une injection sous cutanée de lidocaine). Le temps des injections est de 3 secondes/injection. La chirurgie dure 10 minutes par animaux. Les animaux se réveillent 45 minutes après la chirurgie dans le cas d'une anesthésie générale par injection de xylasine/kétamine ou dans le cas d'une chirurgie sous isoflurane, les animaux se réveillent environ 5 minutes après avoir retiré l'isoflurane. Un prélèvement de sang rétro orbital (500μL, durée du prélèvement 30 secondes) sous isoflurane (2-3%) sera effectuée une seule fois juste avant la mise à mort. En ce qui concerne les traitements (voie d'administration variable en fonction des études): -Administration Intra-péritonéale: 1 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 14 administrations, durée : 3 secondes/injection -Administration intra -veineuse: Nombre d’administration: 2/semaine espacé de 2 jours, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 4 administration, durée : 3 secondes/injection -Administration orale: 1 à 2 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 28 administrations, durée : 3 secondes/administration -Administration sous-cutanée: 1 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 14 administrations, durée : 3 secondes/injection -Administration Intra-nasale ou intra-trachéale: 1 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 14 administrations, durée : 3 secondes/administration
Impact sur les animaux
L'animal utilisé est la souris (C57BL/6 ou BALB/c) ou le rat (WISTAR ou SPRAGUE DAWLEY). Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie ainsi qu'à la chirurgie. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. La douleur utilise les expressions faciales chez la souris (Langford, 2010): - Rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, - Renflement du nez - Renflement des joues - Positionnement des oreilles vers l'arrière - Changement de position des vibrisses qui peuvent être regroupées vers l’arrière ou hérissées en avant. Chez le rat, les quatre expressions faciales caractérisant la douleur ayant été retenues sont : - Rétrécissement des orbites oculaires avec paupières mi-closes à fermées, - Aplanissement du nez et des joues avec éventuellement disparition de la ridule entre le nez et les joues, - Changement de position des oreilles qui s’orientent vers les côtés ou en arrière ce qui peut entraîner une augmentation de l’espace entre les oreilles, - Changement de position des vibrisses qui ont tendance à se regrouper. Outre ces expressions faciales, la douleur pourra générer une perte de poids qui sera suivi quotidiennement et retranscrite par un score défini dans la grille de scores du suivi journalier. Ces études permettront d'étudier l'efficacité in vivo des molécules testées sur le développement de la maladie (signes cliniques) et l'inflammation de l'utérus.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation.
Remplacement
Remplacement : Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (hormonales, inflammatoires ou immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans l’endométriose demande l’étude d’un organisme complet. De plus, il est observé chez les femmes de nombreuses variabilités individuelles. Il n’existe pas une mais des endométrioses, et travailler sur un organisme vivant permet d’introduire un peu de variabilité individuelle (dans la limite génétique) qui serait complètement inexistante dans les études in vitro.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé sera un test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post test de Dunns de comparaison multiple et un Two-way ANOVA suivi par un post-test de Dunnett de comparaison multiple pour les suivis de poids. Les analyses statistiques sont réalisées avec Graphpad Prism, V7.
Raffinement
La partie chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale xylazine/kétamine et de la lidocaine sera administrée quelques minutes avant l'ouverture du plan cutané. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer du bien-être des animaux et détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux montrent des signes de souffrance (point limite décrit dans la Procédure), de la buprénorphine pourra être administrée (si score cumulé de 2 atteint) ou ils seront mis à mort (si score cumulé atteint 4 ou si un des scores atteint 2). Si aucun point limite n'est atteint, les animaux seront mis à mort entre 24h à 14 jours après induction de la maladie selon les études (Ce temps dépendra de la pharmacocinétique des molécules candidats). Les souris/rats seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des capsules de gel hydratant seront déposées dans les cages 24h avant la chirurgie afin de palier à la légère déshydratation des animaux (miction accrue car myorelaxation, pertes liées à la chirurgie, diminution de la prise hydrique) suite à la chirurgie. Elles seront retirées 24h après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris (C57BL/6 ou BALB/c) ou le rat WISTAR est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Au sein d’un même étude les animaux proviendront du même fournisseur afin de réduire les variabilités. L’utilisation de lignées consanguines permet de supprimer l’hétérogénéité génétique entre les individus étudiés, de réduire les fluctuations phénotypiques incontrôlées qui caractérisent les études effectuées sur des populations naturelles. Nous utiliserons des souches (C57BL/6 ou BALB/c pour la souris WISTAR pour le rat) mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 8 semaines) afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).