Rats
Effet d’un traitement probiotique (Lactobacillus rhamonus HN001) sur l’axe intestin-cerveau de la mère et de sa progéniture dans un modèle de rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée. 40 rates gestantes reçoivent un probiotique et subissent des tests d'anxiété en arène ouverte et en labyrinthe en croix ainsi qu'une séparation maternelle, leurs 200 petits étant inclus puis tués pour prélever cerveau et intestin. Le porteur étudie l'effet du probiotique sur l'axe intestin-cerveau de la mère et de sa descendance, et n'attend aucun effet indésirable du produit déjà vendu comme complément alimentaire. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne permet d'étudier ce lien entre comportement et microbiote.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de comprendre comment L. rhamnosus HN001 agit sur le cerveau de la mère dans notre modèle animal en adoptant une approche de circuit neuronal et en se concentrant sur les systèmes neuronaux impliqués dans l'axe intestin-cerveau tels que le système sérotonergique, la composition microgliale et la plasticité synaptique. Les zones cérébrales étudiées pour l'immunoréactivité sérotoninergique, microgliale et synaptique dans le cerveau de la mère et de la progéniture juvénile seront les noyaux du raphé du mésencéphale, l'hippocampe, l'amygdale et le cortex préfrontal. Plusieurs études ont mis en évidence ces zones cérébrales dans un certain nombre de processus cognitifs et émotionnels, plus particulièrement dans la dépression maternelle. Notre hypothèse de travail est que ce traitement par HN001 aura un impact positif sur la neuroplasticité et sur les tests comportementaux et nous suggérons par ailleurs que les mères ou les femelles vierges ne montreront pas des niveaux de réponses similaires à ce traitement. Par ailleurs, nous investiguerons également l’impact de ce traitement maternel sur les variables biologiques de la descendance.
Bénéfices attendus
Des recherches récentes ont mis en évidence l'impact de l'axe intestin-cerveau sur la santé, montrant un lien étroit entre le contenu microbien intestinal, la fonction cérébrale et les troubles psychiatriques. De manière intéressante, la recherche a également montré que la composition du microbiote intestinal maternel est unique et constitue la base de la composition du microbiote intestinal du nouveau-né et peut donc avoir un impact sur l'axe intestin-cerveau en développement tout au long de la vie. Nous avons précédemment montré que l'environnement chimique peut affecter le microbiote intestinal de la mère, et cela est associé à la modulation du comportement maternel et de la neuroplasticité cérébrale. Plus récemment, nos données non publiées montrent que l'exposition au stress et le niveau d'anxiété dans un modèle de dépression post-partum peuvent affecter le microbiote intestinal et la neuroplasticité, mais l'antidépressseur fluoxétine ne peut pas restaurer le microbiote normal ni la neuroplasticité. Ces données sont en accord avec les observations réalisées dans d'autres modèles. La compréhension de l'axe intestin-cerveau nous offre la possibilité de cibler le microbiome intestinal maternel comme traitement pour améliorer l'humeur de la mère, via des changements dans la neurophysiologie du cerveau, et également promouvoir un développement intestin-cerveau sain chez la progéniture.
Procédures
Les 40 mères passeront seront manipulées pour réaliser un frottis vaginal (1 fois pour confirmation reproduction), placées dans des cages individuelles pendant la gestation (18-21 jours) et manipulées pour la prise de poids, tests comportementaux et séparation maternelle pendant 10 minutes) traitement de la moitié des individus par une solution de probiotique pendant la gestation et jusque 10 jours après la mise-bas. Les tests comportementaux auxquels les animaux seront soumis sont proches de situations naturelles (test d'anxiété: arène ouverte et labyrinthe en croix) que le rat pourrait rencontrer. La moitié des mères, durant les 18-21 jours de gestation, seront exposée à du probiotique, actuellement mis sur le marché comme complément alimentaire humain. Tous les jeunes (200) nés de ces mères pourraient être indirectement affectés par les traitements des mères et sont donc inclus dans la procédure.
Impact sur les animaux
Il s'agit d'un probiotique, déjà autorisé comme complément alimentaire. Nous n'attendons aucun effets indésirables sur nos animaux
Devenir
Les animaux passeront de manières successives au travers des différents procédures expérimentales et retourneront après chaque procédure dans leur cage d'hebergement, sauf si les procédures sont réalisées dans les cages d'hebergement (observation passive) et bien évidemment en fin d'expérience, la dernière procédure étant euthanasie pour les femelles gestantes et vierge (qui ont donc été soumises à certaines procédures légères) et la descendance male et femelle non soumis à procédure mais euthanasié en fin d'expérience. Cette procédure est nécessaire à la collecte des tissus (cerveau, caecum, intestin, sang) pour des analyses histochimiques ultérieures qui nous permettront de comprendre au niveau physiologique comment ce traitement impacte le comportement spécifiquement chez les mères et définir les conséquences d'un tel traitement sur la descendance, ce qui n'a pas encore été réalisé à ce jour.
Remplacement
Ces travaux seront réalisés chez la rate, le modèle le plus adapté pour étudier la physiopathalogie de la maternité et les troubles neuropsychiatriques. Les impacts de traitement sur la physiolopathologie du cerveau, l’interaction avec le microbiote intestinal et les conséquences sur le comportement ne peuvent malheureusement être investigués que sur un modèle animal, il n’existe pas d’autre modèle alternatif non-animal pour étudier le fonctionnement du système nerveux central en lien avec le comportement et le microbiote intestinal (REMPLACEMENT).
Réduction
Nous nous attacherons à définir les mécanismes neurobiologiques associés aux changements de comportements après le sevrage des jeunes. Le nombre d'animaux totaux utilisés dans cette expérience (40 femelle, 10 individus par groupe et leur descendance; 200) est limité et est le nombre minimum qui devrait nous permettre, s‘il y a des effets, d'obtenir des différences statistiquement significatives et scientifiquement utilisables
Raffinement
Tous les animaux auront un accès libre à de la nourriture, de l’eau, litière fraiche et environnement enrichi (cylindre pour se cacher, matériel pour faire les nids, ...). Le traitement sera donné dans l'eau de boisson des mères gestantes, procédure déjà utilisée au sein de notre laboratoire. Ce type de traitement mime la situation clinique chez les humains (traitement oral) et surtout élimine le stress potentiel de l’administration chez la mère. Par ailleurs, les animaux sont suivis par la structure chargée du Bien-être animal et par le chercheur responsable de la mise en œuvre du projet et des points limites ont été définis.
Choix des espèces
Le Rat Long Evans, non transgénique, est le modèle historique utilisé au sein de notre laboratoire, mais aussi dans de nombreux autres laboratoires s’intéressant aux effets des antidépresseurs, de la dépression, et également aux interactions sociales et sexuelles. Ainsi, l’utilisation de cette espèce, et de cette souche en particulier, nous permettra de comparer les résultats obtenus avec des données préexistantes au sein de notre laboratoire mais également dans la bibliographie. Par ailleurs, le catalogue de comportements de ces animaux est bien décris. Nos collaborateurs travaillent de même sur cette souche et nous pourrons ici réunir nos données. Les femelles rats sont des animaux adultes (70jours), dont la moitié sera fertilisée par un mâle adulte au laboratoire. La descendance utilisée sera âgée de 10 jours maximum.
Développement de colles résorbables pour la prévention du sérome post chirurgie carcinologique mammaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
98 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée. 88 d'entre eux subissent une ablation de la mamelle avec curage sous anesthésie, avec un suivi pouvant aller jusqu'à 90 jours, tandis que 10 reçoivent des injections sous la peau. Le porteur reconnaît des douleurs après l'opération, des infections locales et des ulcérations possibles de la plaie, pour évaluer une colle destinée à prévenir le sérome après chirurgie du cancer du sein. Il décrit le rat comme l'espèce animale la moins évoluée de taille suffisante et présente cette étape comme un préalable indispensable aux essais chez l'humain.
Objectifs
Le cancer du sein représente le 1er cancer et la première cause de décès par cancer chez la femme, dont le traitement de référence consiste dans 80% des cas à l’exérèse chirurgicale de la tumeur, associée ou non au curage axillaire. La complication la plus fréquente après chirurgie oncologique mammaire est le sérome. Il s’agit de la formation d’une masse non cancéreuse ou d’un œdème causé par l’accumulation de sérum. Bien que de nombreuses techniques et colles biocompatibles ont fait preuve de diminution de l’incidence des séromes après mastectomie et/ou curage axillaire, toutes restent encore imparfaites à l’heure actuelle. Ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle approche de prévention du sérome et de ses complications et d’envisager une cicatrisation optimale après la chirurgie oncologique du sein, via l’application d’une colle biologique innovante sous forme de mousse, dans l’espace mort engendré par l’exérèse de la pièce opératoire. Cette étude expérimentale se déroulera chez le rat et constitue un préalable indispensable à la réalisation d’essais cliniques chez l’Homme. Le rat est l’espèce animale la moins évoluée et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie carcinologique et reconstructrice. Le modèle expérimental est le rat adulte ayant fait l’objet d’une mastectomie avec curage axillaire associé.
Bénéfices attendus
Développement d'une nouvelle colle biocompatible qui a pour but de prévenir l'appartition de sérome lors de chirurgies oncologiques du sein.
Procédures
Des animaux seront soumis à des injections sous-cutanées (4 injections, 1 fois) sous anesthésie gazeuse : 10 animaux. Durée de suivi des animaux post-injection : maximum 8 semaines. Des animaux seront soumis à une masectomie sous anesthésie gazeuse : 88 animaux. Durée du suivi post-opératoire : maximum 90 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui pourraient être observés sont - pour les injections sous-cutanées : erythème de différents grades en fonction de la réponse, démangeaisons - pour les animaux subissant une masectomie : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalés et pris en charge par l'expérimentateur.
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort à la fin de chaque procédure afin d'effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de prévention du sérome sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.
Réduction
Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux et compte tenu que les expériences ne sont pas de classe sévère, des cohortes d’animaux pourront être utilisées pour répondre à plusieurs objectifs (informations sur la biocompatibilité, informations sur l’efficacité de la colle, etc. ) Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations).
Raffinement
Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les injections de colle et l'imagerie de fluorescence seront réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile). Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la moins évoluée et de taille suffisante pour permettre l’établissement d’un modèle expérimental de mastectomie et curage axillaire par rapport à la situation clinique chez l’homme. En effet, la physiopathologie du système lymphatique et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modèle permet ainsi la réalisation d’études précliniques de chirurgie carcinologique avec évaluation radiologique et histologique. Rats wistars adultes de 10 semaines pour avoir des rates d’âge adultes, suffisamment âgées pour avoir eu une croissance mammaire suffisante (afin de réaliser la mastectomie) et de taille suffisamment grande pour aider à la réalisation des gestes microchirurgicaux.
Suivi de l’abondance du rat brun (Rattus norvegicus) dans l’Eurométropole de Strasbourg et évaluation du risque zoonotique
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2120 rats bruns vont être utilisés, dont environ 2000 relâchés et 120 tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est piégé pendant moins de dix heures puis manipulé sous sédation, l'échantillon tué servant à évaluer l'état sanitaire et le risque de maladies transmissibles à l'humain. Le porteur présente le rat brun comme l'espèce invasive causant le plus de dommages à l'humain et vise à orienter la gestion urbaine de ces populations. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer l'espèce par un modèle mathématique ou in vitro.
Objectifs
Le rat brun est aujourd’hui considéré comme l’espèce invasive causant le plus de dommages à l’espèce humaine. En effet, le rat peut être le réservoir et le vecteur de maladies zoonotiques, c’est-à-dire transmissibles à l’humain, dont certaines sont mortelles. Les pathogènes transmissibles à l’humain sont des bactéries (Leptospira interrogans, Yersina pestis, Rickettsia typhi, Bartonella elizabethae, Streptobacillus moniliformis, Salmonella enteritidis, etc.), des virus (hantavirus, arénavirus, cow-pox, etc.), des parasites (Angiostrongylus cantonensis, Capillaria hepatica, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, etc.) et la teigne (Trichophyton mentagrophytes). De plus, le rat brun dégrade l’habitat et les ressources alimentaires de l’humain, ce qui engendre un coût économique significatif. En conséquence, cette espèce fait l’objet de plans de destruction dans plusieurs métropoles. Or la plupart des études souligne l’inefficacité des campagnes d’éradication qui entraînent la concentration des rats sur certains sites, favorisant ainsi même la propagation des pathogènes et accroissant le risque pour l’humain. Une meilleure connaissance de la biologie et de l’écologie de ces animaux en fonction de l’habitat urbain et des usages des citadins, devrait permettre d’améliorer le succès de ces mesures, voire de s’en affranchir en proposant des solutions de cohabitation sans risque pour la santé humaine ni conséquences économiques. Dans cet objectif, notre projet propose d’estimer le niveau de populations de rat brun au sein de l’Eurométropole de Strasbourg, d’évaluer l’état sanitaire des animaux et de mesurer s’il existe un risque zoonotique.
Bénéfices attendus
Les objectifs de notre étude sont 1/ de connaître l’état des populations de rats à Strasbourg et 2/ le risque zoonotique qu’elles représentent, afin 3/ de fournir des mesures de préconisations aux gestionnaires et citadins en matière de gestion de l’espèce et de son environnement. Nous escomptons donc des effets positifs de notre étude sur l’environnement en réduisant la présence de l’espèce à Strasbourg par une amélioration des usages, et par conséquent sur les activités économiques, de loisir, et la santé animale et humaine. Un autre objectif est bien sûr scientifique au travers de la valorisation des résultats obtenus dans des journaux scientifiques et conférences, notamment au sein de la Zone Atelier Environnementale Urbaine de Strasbourg et en lien avec les mots clés de la section 52 du CNRS à laquelle appartient le porteur du projet.
Procédures
Les animaux seront capturés ce qui va induire un stress, puis anesthésiés par injection sous-cutanée. Ils ne subiront pas d'intervention à l'état vigile et aucune procédure chirurgicale. La durée de capture est inférieure à 10 heures dans un piège. La durée de la manipulation de l'animal vigile est inférieure à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le seul effet indésirable sur les animaux est un stress lié à la capture et à l'injection de l'anesthésique. Les animaux seront manipulés sous sédation.
Devenir
Les animaux seront relâchés dans leur habitat. Un échantillon de la population sera euthanasié (60 à 120 rats).
Remplacement
L'étude porte sur l'abondance de rattus norvegicus en ville et le risque zoonotique lié à cette espèce, il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre ni par des modèles mathématiques ou in vitro.
Réduction
La souffrance infligée aux animaux sera réduite au maximum : - grâce à des contrôles fréquents des pièges (plusieurs fois par jour), afin de limiter le temps de captivité - en réalisant toutes les manipulations sous anesthésie
Raffinement
Les animaux auront de la nourriture hydratée à disposition dans les pièges. Le temps de captivité sera réduit au maximum. Ils seront relâchés immédiatement après les mesures à leur point de capture.
Choix des espèces
Il s'agit d'étudier l'abondance de cette espèce à Strasbourg au regard de sa pullulation récente et du risque zoonotique qu'elle représente. Au stade adulte uniquement, pour avoir un état sanitaire complet des populations adultes
Infection urinaire à Escherichia coli, contaminant alimentaire et carcinogénicité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'induction d'une infection urinaire par sondage de l'urètre sous anesthésie, répétée une fois, puis un traitement par l'eau de boisson pendant douze semaines associant une mycotoxine et un carcinogène. Il indique que l'infection provoque un inconfort et qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraînerait la sortie de l'animal du protocole. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", l'interaction entre plusieurs organes ne pouvant selon lui être modélisée in vitro.
Objectifs
Nous sommes constamment exposés à une multitude de contaminants chimiques ou toxines biologiques, qui même à faible doses peuvent affecter notre santé, par exemple en provoquant le cancer. La plupart des recherches examinent l'effet de ces contaminants ou toxines une par une, mais rarement en combinaison. Dans ce projet, nous étudierons si la combinaison d'une toxine produite par une bactérie pathogène et d'un contaminant naturel des aliments, une mycotoxine, pourrait provoquer un cancer de la vessie. L'une des infections les plus courantes est l'infection urinaire causée par Escherichia coli. Ce microbe produit des toxines qui peuvent endommager notre ADN et induire des mutations cancérigènes. Une femme sur deux est touchée par cette infection au cours de sa vie. Des études antérieures ont montré que les personnes souffrant de ce type d'infection ont tendance à avoir plus de cancers de la vessie. Nous sommes aussi fréquemment exposés à des toxines prédentes dans l'alimentation, comme celle produite par des moisissures qui poussent sur les céréales: une mycotoxine appelée déoxynivalénol ou DON. Le DON est éliminé par notre corps dans l'urine. On trouve des traces de DON dans 40 à 98% des Européens, c'est donc un contaminant très fréquent. On sait que lorsqu'ils sont ensemble, DON et Escherichia coli induisent encore plus de dommages à notre ADN. Est-ce que manger un aliment contaminé par le DON tout en ayant une infection urinaire pourrait endommager nos cellules et favoriser le cancer de la vessie?
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous répondrons à cette question en étudiant si la combinaison du deoxynivalenol et de l’infection avec Escherichia coli induisent des lésions cancéreuses à long terme. Si nous confirmons qu'ensemble ils peuvent conduire au cancer de la vessie, nous alerterons les médecins et les régulateurs, pour éventuellement modifier la façon de traiter les infections de la vessie et pour diminuer les quantités tolérables de DON dans nos aliments.
Procédures
Une infection urinaire sera induite chez les animaux par injection via leur urèthre, avec une sonde, sous anesthésie générale. Le sondage et l'injection sont effectués par une personne expérimentée, en 1 minute environ. L'injection est répétée une fois sur chaque animal une heure après la première (pour garantir l'infection). Le suivi des animaux est ensuite effectué par des prélèvement d'urine quotidiennement, sur animal vigile avec une simple contention manuelle. Le traitement des animaux avec le contaminant alimentaire et le carconogène urinaire est effectué par l'eau de boisson, sans intervention, pendant 12 semaines. Ces produits ne montrent pas d'effet sur la prise de boisson aux doses utilisées.
Impact sur les animaux
Les traitements avec le contaminant alimentaire et le carcinogène urinaire ne sont pas connus pour induire de la douleur. Les infection urinaires induisent de l'inconfort au niveau de l'aine, mais aucun autre signe clinique est attendu.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issu de l'expérience afin de prélever les tissus qui seront analysés. La technique d'euthanasie est la même que celle utilisée chez les vétérinaires.
Remplacement
Remplacer : des études ont été préalablement conduites sur des cellules en culture permettant d’élucider comment agissent les toxines produites par les UPEC sur les cellules eucaryotes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’évaluer les répercussions à long terme de cette bactérie et ses toxines sur la vessie. Une veille scientifique sera mise en œuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Réduire : Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Le nombre maximum de rats envidagé est de 520 animaux. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, nombre de bactéries, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Raffiner : Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Une perte de poids (non attendue) supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt plus stricts seront mis en place.
Choix des espèces
L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes toxines et métabolites sur la cellule eucaryote en culture. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car les objectifs sont i) de découvrir les rôles des toxines bactériennes produites pendant l'infection urinaire et le cancer de l'urothélium, ii) de déterminer le lieu et la cinétique de production de ces toxines dans le tissu de la vessie et iii) de mesurer les effets des facteurs alimentaires sur leur production lors de l'infection urinaire. Étant donné que les infections urinaires sont des infections ascendantes impliquant plusieurs organes, que la production de toxines bactériennes peut être affectée par les réponses de l'hôte à différents endroits dans l'organisme, cette interaction complexe ne peut pas être modélisée in vitro.
La lactation comme période de reprogrammation du système métabolique et endocrine de la descendance exposée in utero à une hyperglycémie maternelle.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 748 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères subissent une manipulation nutritionnelle, des traites manuelles de lait et des tests de tolérance au glucose, tandis que leur descendance est soumise à des tests comportementaux, des prélèvements sanguins et une chirurgie avec pose d'un cathéter à la jugulaire pouvant durer trois heures. Le porteur indique que les petits sont tués à différents stades, de huit à deux cent soixante jours, pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance.
Objectifs
Le diabète gestationnel (DG), (8% des naissances en France), serait à l’origine du diabète de type 2 (DT2) chez 47% des patients âgés de 10-22 ans. Cette intolérance au glucose, transmise de génération en génération, contribuerait à l’explosion épidémique de la prévalence du DT2 dans le monde. Quelques études récentes montrent que, chez des enfants de 7 ans, exposés à une hyperglycémie maternelle in utero, la durée d’allaitement exclusif est inversement corrélée aux teneurs circulantes en hémoglobine glyquée (marqueur du DT2). Cependant, ces données épidémiologiques, parfois contradictoires, ne prouvent pas que la composition du lait maternel impacte le risque métabolique de la descendance. Nous émettons l’hypothèse que la lactation pourrait avoir un impact sur le devenir métabolique de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie maternelle qui pourrait s’expliquer en partie par des adaptations du métabolisme maternel et de la composition du lait. Nous avons préalablement montré dans des modèles rongeurs de programmation métabolique avec adoptions croisées, que la descendance mâle présentait des changements différents dans leur sensibilité à l’insuline à l’âge adulte selon que la descendance avait été allaitée par des rates maintenues en sous- ou sur-nutrition calorique durant la période périnatale. Ces changements étaient associés à des compositions spécifiques des laits maternels. Ce projet vise donc à caractériser : 1) la composition du lait maternel dans un modèle rongeur d’hyperglycémie maternelle durant la gestation suite à une manipulation nutritionnelle (mimant le DG chez la femme avec un retour post-partum à la glycémie pré-gravide), en lien avec les adaptations métaboliques des 3 organes clés du contrôle hormonal de la lactation que sont le placenta, le pancréas et la glande mammaire, 2) le devenir métabolique (insulino-sensibilité) de la descendance mâle et femelle jeune et adulte en réponse à des compositions de lait de mères DG ou normo-glycémiques (adoptions croisées) ou encore à des supplémentations postnatales en composés bioactifs du lait maternel identifiés dans le lait humain DG. La contribution du DG dans la prévalence des pathologies cardio-vasculaires à l’âge adulte, et neurodéveloppementales pendant l’enfance sera également explorée dans ce projet.
Bénéfices attendus
L’enjeu global de ce projet est d’évaluer l’impact de l’allaitement maternel sur le devenir métabolique de l’enfant soumis in utero à un DG. Le modèle expérimental nutritionnel de DG avec adoptions croisées va permettre d’étudier le rôle de la composition du lait maternel dans la programmation endocrino-métabolique de la descendance. L’objectif in fine est de tester la capacité de composants bioactifs du lait humain à (re)programmer la sensibilité à l’insuline de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie. Cette étude permettrait de prendre en compte ces biomarqueurs dans l’élaboration des formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, dans un contexte de diabète.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation et la lactation, à 4 prélèvements manuels de lait (30 minutes) et/ou 4 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes) selon les lots de rates (procédures expérimentales 1 ou 2). Leur descendance sera soumise à 4 tests de comportement (3 tests avec séquence de 10-15 minutes et 1 test avec une séquence de 1 heure), des prélèvements sanguins, une mesure de masse grasse par ostéodensitométrie (1 heure), 2 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes), une intervention chirurgicale (un clamp euglycémique/hyperinsulinémique avec pose d’un cathéter à la jugulaire et des prélèvements de sang à la veine caudale, durée 180 minutes) sur 260 jours de vie.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang répétés à la queue peuvent occasionner une douleur de classe légère due l'apparition d'une croûte. La cicatrisation qui fait suite à la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire peut être gênante pour l'animal. La traite régulière de lait chez les mères peut engendrer une irritation des mamelles. Le gavage oral peut induire très exceptionnellement une fausse route.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie d'une procédure à l'autre ou sont mis à mort à différents stades de développement (de J8 à J260) afin de prélèver les organes d'intérêt.
Remplacement
Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance en lien avec un diabète gestationnel (DG) et ceci, d’autant plus, que ce projet requiert un modèle d’étude de supplémentation nutritionnelle postnatale avec adoptions croisées pour mieux comprendre l’impact de la fenêtre de lactation sur cette programmation.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction sans compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, nous utiliserons autant que possible le même animal (suivi longitudinal de la glycémie et l’insulinémie). L’effectif retenu de n=8 mâles et 8 femelles par groupe d’adoption représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement une intervention nutritionnelle, prenant en compte le facteur sexe, avec une variabilité interindividuelle importante. Ce projet prévoit donc l’utilisation au maximum de 1332 individus sur une durée de 5 ans avec 372 rates Sprague-Dawley gestantes et allaitantes, 960 petits, mâles et femelles. Selon les résultats obtenus dans la première procédure expérimentale, le nombre de mères gestantes pourra être réduit dans la suivante. De même, si une différence d'effets selon le sexe est observée dans le suivi des descendants, la supplémenation postnatale ne sera mise en œuvre que sur la moitié des effectifs de ratons prévus.
Raffinement
Dans un souci de raffinement les animaux seront hébergés au moins 2 par cage pour le suivi de la descendance DG (sauf pour les périodes de gestation et de lactation des mères, où les mères seront seules avec leur portée après la mise-bas jusqu’au sevrage). Leur milieu de vie sera enrichi avec un tunnel et des frisottis leur permettant de faire leur nid, et de jouer. Aucune souffrance n’est attendue lors des manipulations nutritionnelles prévues : les rates en régime hypercalorique 1 semaine avant la conception et jusqu’à la fin de la gestation (4 semaines) ou jusqu’à la fin de la lactation (7 semaines) ne présentent pas d’obésité. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et manipulés quotidiennement (jeux, manipulations, caresses…) afin de réduire au maximum douleur et détresse et leur assurer un bien-être, en particulier après les chirurgies pour s’assurer de leur parfaite récupération. Les prélèvements de sang seront réalisés avec l’usage d’analgésiques afin de contrôler la douleur et dans des conditions d’asepsie nécessaires pour assurer des résultats reproductibles. Lors des prélèvements de lait, les rates seront anesthésiées et disposées sur un tapis chauffant. Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront anesthésiés après avoir reçu un antalgique qui agira pendant et après l’opération. Jusqu’au réveil et au-delà, les animaux seront surveillés et une grille comportementale pour chaque animal sera complétée avec des points limites à partir desquels les animaux seront pris en charges pour supprimer leur souffrance avec des injections d’antalgiques ou seront mis à mort si cette souffrance est trop importante.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle d’étude de la nutrition périnatale en raison de sa petite taille (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures), et de sa rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Contrairement à l’espèce souris, l’espèce rat (en particulier la souche Sprague Dawley choisie) présente des grandes qualités maternelles, permettant de mener à bien cette stratégie expérimentale avec des adoptions croisées en limitant notamment les risques de cannibalisme et d’abandon lors des adoptions, et limite sa prise de poids sous régime calorique, permettant de s’affranchir du paramètre obésité dans cette étude. Enfin, le volume de lait collecté par rate fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses individuelles de phénotypage du lait maternel de rate contrairement à la souris. Des femelles gestantes âgés de 8 semaines et de souche Sprague Dawley seront commandées. Ces femelles auront été soumises à un régime chow (CTL) ou HFHS, 1 semaine avant l’accouplement, chez le fournisseur d’animaux à qui nous aurons fourni l’aliment. A leur arrivée, les femelles seront en cage individuelle pendant la gestation et la lactation. Les rates utilisées pour les prélèvements de lait seront mises à mort en fin de procédure expérimentale N°1. Dans la procédure expérimentale N°2, 96 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles par mère adoptive, issus de mères biologiques différentes) seront constituées afin d’avoir au final 16 ratons (8 mâles et 8 femelles) par groupe d’adoption et par âge (6 temps). Ces groupes seront suivies durant la lactation (J8, J14), au sevrage à J21), au stade jeune (2 mois) et à long terme (âge adulte, 4 mois, sous régime standard et sous challenge hyper-énergétique durant 20 semaines).
Etude de l’impact d’une séparation maternelle néonatale sur les propriétés électrophysiologiques des neurones relais du système nociceptif spinal et supraspinal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment une séparation précoce d'avec la mère, présentée comme un reflet de la prématurité humaine, modifie la perception de la douleur, 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus nerveux. La moitié des ratons est retirée de la cage maternelle trois heures par jour, du deuxième au douzième jour de vie, sous une lampe chauffante. Le porteur parle d'"épisodes de stress non douloureux", tout en décrivant chez les rats séparés une anxiété chronique et, d'après des travaux antérieurs, des "hypersensibilités douloureuses". Chaque mère est tuée après le sevrage, sans retour à l'élevage, parce que selon le porteur la séparation "altère le fonctionnement de son système nerveux" et accroît son anxiété.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.
Procédures
La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.
Impact sur les animaux
La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.
Devenir
Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.
Réduction
Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.
Raffinement
Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.
Choix des espèces
Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent
Effet d’un régime cétogène sur le métabolisme cérébral chez le rat EU1/2 (porteur)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque semaine, un prélèvement d'urine les isole une nuit de 14 à 16 heures dans une cage sans litière ni enrichissement, situation que le porteur décrit lui-même comme probablement aversive. Après six semaines de régime cétogène, ils sont anesthésiés pour un prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour un enregistrement intracérébral de 4 à 6 heures, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, le remplacement in vitro étant selon lui impossible actuellement.
Objectifs
Le métabolisme cérébral s’adapte à la nutrition, ce qui peut avoir des conséquences considérables sur la santé mentale et les maladies neurologiques. Par exemple, les effets bénéfiques du jeûne ont été reconnus dès l’antiquité, notamment sur l’épilepsie. Le jeûne peut être remplacé par des régimes moins contraignants comme le régime cétogène, riche en graisses et appauvri en protéines et en sucres. Ce régime est caractérisé par un apport calorique diminué et une augmentation plasmatique de corps cétoniques, un état interne appelé cétose. Les effets bénéfiques de la cétose s’étendent au-delà de l’épilepsie, à un large ensemble de problématiques comme un meilleur vieillissement, une augmentation de l’espérance de vie et une protection contre les maladies neuro-dégénératives comme les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Ce projet testera l’hypothèse selon laquelle l’administration de corps cétonique chez des patients ou chez des animaux pourrait constituer une stratégie neuroprotectrice, notamment après un accident vasculaire cérébral ou un traumatisme crânien. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer l’effet neuroprotecteur du régime cétogène. D’abord, une modulation de la fonction mitochondriale combinée à une augmentation d’enzymes antioxydantes qui pourraient diminuer le stress oxydant des neurones et des cellules gliales. Ensuite un changement de l’équilibre entre neurotransmetteurs excitateurs et inhibiteurs en faveur de l’inhibition pourrait expliquer une diminution de l’excitabilité des réseaux neuronaux et une amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre les effets métaboliques du régime cétogène à la fois sous l’angle des concentrations basales de métabolites, et de façon dynamique, au cours d’une épreuve métabolique modélisée par une dépolarisation corticale envahissante. Cette approche permettra de comprendre dans quelle mesure le régime cétogène affecte le fonctionnement basal du cerveau ainsi que sa capacité à répondre à une stimulation. Elle permettra aussi de tester pour la première fois in vivo l’hypothèse selon laquelle le régime cétogène diminue la disponibilité des neurotransmetteurs excitateurs comme le glutamate et le stress oxydant, représenté ici par le monoxyde d’azote. L’ensemble des connaissances obtenues au cours de ce projet permettra de d’évaluer si le régime cétogène ou la cétose en général peut représenter un état neuroprotecteur et dans quelle mesure induire cet état chez des patients cérébrolésés peut améliorer leur évolution clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements d'urine une fois par semaine pendant sept semaines. Ce prélèvement dure une nuit au cours de laquelle l'animal est isolé sans enrichissement. A la fin des six semaines de régime alimentaire contrôlé, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour une expérience de monitorage intracérébral durant entre 4h et 6h.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à six semaines de régime cétogène. Ce régime permet d’induire un état de cétose sans restreindre l’accès à la nourriture et ses effets indésirables sont limités. Toutes les semaines, un prélèvement d’urine sera réalisé. Pour cela, les animaux seront placés seuls dans une cage à métabolisme. Ce dispositif ne comporte pas de litière ni d’enrichissement et permet de récupérer l’urine par un système de gouttière. Le recueil d’urine se fera au cours de la nuit, ce qui représente une période d’isolement de 14-16h qui sera probablement perçue par l’animal comme une situation aversive. A la fin des six semaines de régime cétogène, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane après administration de buprénorphine pour l’analgésie dans le but de prélever le liquide céphalorachidien ou pour effectuer une expérience de monitorage intracérébral pendant 4h à 6h. Les animaux n’étant pas réveillés, les effets indésirables des expériences sont minimes.
Devenir
La survie de l'animal n'est pas compatible avec le prélèvement d'organes ou avec les enregistrements intracérébraux sous anesthésie prévus dans le projet.
Remplacement
Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme au cours des six semaines suivant le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues dans le groupe d’animaux soumis au régime cétogène à celles obtenues chez des animaux nourris normalement. Des tests de t de Student seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 8 animaux par groupe. Pour les expériences de monitoring intracérébral, des analyses statistiques seront pratiqués dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.
Raffinement
Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paires dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. La période d’isolement nécessaire aux prélèvements d’urine est restreinte à une nuit par semaine pendant six semaines et une nuit d’habituation, ce qui minimisera l’inconfort lié à la procédure. De plus, les animaux auront été entrainés à rester dans les cages à métabolisme une fois avant le début du régime cétogène. Toute la phase de prélèvement et d’enregistrements intracérébraux est prévue sous anesthésie après analgésie par la buprénorphine, ce qui réduit le stress ou la douleur à un niveau minimal. Tout au long du projet, l'état général de l'animal sera évalué grâce à une grille de score et des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux, par exemple l'administration d'analgésique (carprofène, ou Rimadyl 5 mg/kg) en cas de douleur avérée, ou adminsitration de nourriture ramollie en cas de perte de poids.
Choix des espèces
La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine. Par rapport à la souris, le rat présente une taille plus importante et un volume cérébral plus grand. Les volumes de liquide céphalorachidien et d'urine seront plus facilement récoltés chez le rat que chez la souris.
TL EVOTEC IMMUNO Mise au point de solutions thérapeutiques modulant le système immunitaire dans les domaines de l’inflammation de l’immuno-oncologie et de la vaccination
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 700
Lapins : 500
55 000 animaux non-humains vont être utilisés, en majorité des souris avec 700 rats et 500 lapins, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés-tests, des prélèvements sanguins répétés et des immunisations, certaines souris étant irradiées puis greffées de cellules immunitaires humaines, pour sélectionner des candidats médicaments destinés aux dossiers réglementaires. Le porteur indique que les hébergements longs, les doses mal tolérées et l'injection de cellules humaines peuvent provoquer perte de poids et difficultés de déplacement. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires.
Bénéfices attendus
Sélectionner de nouvelles entités thérapeutiques innovantes pour des pathologies dont les besoins médicaux et la prise en charge de patients sont non satisfaits aujourd'hui.
Procédures
Administration unique ou répétée (plusieurs fois par jour sans dépasser 3 fois) de composés-tests à des doses pharmacologiquement actives. Prélèvements de sang sériés sur un même animal sans dépasser 7.5% du volume total du sang sur une semaine. Administration d'un antigène afin d'immuniser un animal sous anesthésie. Irradiation non létale de souris hautement immunodéfiscientes afin d'éliminer les cellules immunitaires murines avant de greffer des cellules immunitaires humaines.
Impact sur les animaux
Ces modèles sont de longue durée (1 à 40 semaines) pour se mettre en place. Cela signifie un impact négatif relatif à un hébergement de longues durées en groupe sociaux sur le bien-être des animaux bien que tous les moyens disponibles sont utilisés pour minimiser cet aspect. Les effets indésirables peuvent provenir de niveaux de doses administrées mal tolérées pour obtenir un effet pharmacologique ou d’un effet adverse de l’injection de cellules humaines dans un environnement murin. Les signes en seraient alors une perte de poids, des difficultés à se déplacer. Des administrations de composés à des doses sub-toxiques durant plusieurs jours, des prélèvements de sang sériés pour évaluer l'exposition à un composé peuvent nuire au confort des animaux, peut générer du stress.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang terminaux ou des collectes d'organes pour mesurer certains paramètres ou la concentration des composés-test adminsitrés. Les animaux dits "contrôle" sont mis à mort également pour des prélèvements de sangs ou d'organes afin de disposer d'échantillons contrôles au niveau des analyses faites ultérieurement.
Remplacement
A notre connaissance il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité du rôle du système immunitaire dans le développement des réponses immunitaires anti-tumorales et l’activation du système immunitaire à des fins vaccinales. Les actions du système immunitaire impliquent de nombreux tissus et organes avec des mécanismes sous-jacent encore largement inexpliqués. Le modèle animal est également nécessaire pour recueillir des données pertinentes sur les mécanismes d’action du système immunitaire suite à l’administration d’un composé afin de développer des solutions thérapeutiques innovantes.
Réduction
Les composés passeront des filtres pour réduire le nombre des études in vivo et la quantité d’animaux utilisés dans ce projet. Ces filtres comprennent des tests in vitro et des études pharmacocinétiques chez le rongeur. Seuls les produits à forts potentiels seront testés dans les études d’efficacité in vivo. Les modèles animaux utilisés suivront les protocoles décrits dans la littérature. Nous confirmerons la taille des groupes qui permettrait de détecter un effet statistiquement significatif pour une différence entre les gropes controles et traités de 40% en considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront sous anesthésie. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Des consignes spécifiques seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Les animaux affectés recevront des soins adaptés, par ou sous autorité du vétérinaire ou seront euthanasiés
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : • Espèce développant une maladie identique à celle touchant l’homme (par exemple, la rage) (Souris) • Espèce sensible à l’infection (par exemple l’Herpès Simplex) (Souris, lapin) • Espèce développant une réponse immunitaire similaire à l’homme (par exemple CMV) (Souris, Rat) • Type d’antigènes (protéines, polysaccharides, germes atténués…) ou d’adjuvants D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire. Dans la plupart des procédures, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Pour des demandes particulières, des animaux âgés peuvent être utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles peuvent être utilisés (souriceaux, ratons ; etc…).
Implantation de biomatériaux après mise au point d’un modèle pré-clinique de défaut critique osseux mandibulaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
100 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un défaut osseux est créé de part et d'autre de la mandibule sous anesthésie, suivi d'imageries avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste, avant une mise à mort au CO2, pour mettre au point un modèle d'implantation de biomatériaux. Le porteur qualifie les douleurs post-opératoires de modérées pendant 48 à 72 heures, avec hématomes et fracture mandibulaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que le recours au modèle in vivo est "indispensable".
Objectifs
La sphère cranio-faciale est particulièrement exposée aux pertes osseuses d'origine traumatique, tumorale, infectieuse ou congénitale, dans lesquelles le défaut de tissu osseux implique des reconstructions complexes. Actuellement, des substituts osseux synthétiques ou biologiques sont développés et nécessite des modèles de défauts osseux pour les valider chez l'animal. Le modèle cranio-facial le plus répandu est celui situé dans la calvaria des souris et des rats. Ces modèles, très utiles pour étudier la réparation osseuse sont néanmoins limités, l’os mandibulaire étant soumis à des contraintes mécaniques fortes. La nécessité de tester des substituts osseux dans des environnements le plus proche de la réalité est indispensable en recherche pré-clinique. Ce projet vise à mettre au point un modèle de défaut osseux mandibulaire chez le rat permettant de tester différents biomatériaux et répondre aux exigences de réduction et de remplacement avant d’envisager de le tester sur de plus gros animaux (lapin ou brebis). Ce modèle permettra ainsi de tester des biomatériaux d'intérêt pour une future application clinique chez les patients souffrant de pertes osseuses de grandes étendues.
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet de recherche fondamentale pré-cliniques en ingénierie osseuse cranio-faciale. La stratégie proposée ici va bien au-delà de l'état actuel de l'art avec le développement d'un dispositif adaptable unique pour chaque patient. Le matériau sera dessiné puis imprimé en 3D pour correspondre aux dimensions exactes du défaut. Il devra posséder des propriétés mécaniques comparables à celles de la mandibule d'origine, permettant ainsi la pose d'un implant dentaire pour restaurer la mastication. En parallèle, la partie interne sera adaptée pour favoriser son intégration tissulaire par l'ajout d'une matrice de collagène cellularisé. Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux, notamment ceux de la mandibule. Il s'attaque à un problème de santé majeur par le biais d'une stratégie d'ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble. En outre, l’utilisation d’un modèle de défaut mandibulaire chez le rat permettra de mettre au point différentes étapes d’analyse d’ingénierie osseuse en restant chez le petit animal pour respecter au maximum le principe des 3R.
Procédures
Procédure 1 : Etape 1 : Imagerie non invasive sous AG (10min) Etape 2 : Réalisation d'un défaut osseux mandibulaire bilatérale sous AG, (30min), Etape 3 : Imagerie scanner sous AG avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste (1min injection, 10min scanner) et mise à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié (4min induction et 3min de repos). Procédure 2 : Etape 1 : Réalisation d'un défaut osseux mandibulaire bilatérale sous AG, avec insertion d’un matériau lors de cette étape (30 à 40min) Etape 2 : Imagerie scanner sous AG avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste (1min injection, 10min scanner) et mise à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié (4min induction et 3min de repos).
Impact sur les animaux
Un stress lié au anesthésie lors des imageries. Les douleurs post opératoires sont considérées "modérées" pendant 48 à 72h (hématomes, fracture mandibulaire).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. La mise au point d’un modèle in vivo de défaut osseux mandibulaire chez le rat permettra de sélectionner les biomatériaux adéquats dans un défaut osseux de ce type avant de passer à un modèle de défaut osseux chez le gros animal qui sera plus proche de l’homme notamment par la présence d’os spongieux (ex le lapin et la chèvre). Il n’existe à ce jour aucune méthode alternative.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à l’utilisation de l’imagerie en amont des chirurgies pour vérifier sa faisablité (hauteur/largeur osseuse disponible, édification des racines des molaires de rats, situation du canal incisif). Les biomatériaux utilisés seront tous validés préalablement par des tests in vitro pour vérifier leur biocompatibilité cellulaire. Le nombre d'animaux par groupe et par temps d'analyse (6) est justifié en fonction de nos objectifs de mise au point et permettra une étude adéquate sur le plan statistique. Compte tenu des publications relatant ce modèle mandibulaire, un effectif de 6 sujets par groupe et par temps d’analyse est indispensable. Au vu de 3 temps d’analyse histologique prédictible cela fait 18 animaux par groupe que nous augmentons à 20 par groupe pour tenir compte d’éventuelle exclusion d’animaux. Sur 3 ans un nombre maximum de 100 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante.
Raffinement
La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie générale (Kétamine/xylasine) en IP, l’utilisation d’une anesthésie locale (SC), (Lidocaïne sans épinéphrine et bupivacaïne) et d’analgésique (Buprénorphine) adaptée durant les procédures avec une médication systématique en per et également post-opératoire 72h, et l’établissement de points limites adéquats. Une nourriture en poudre sera donnée la semaine suivant la chirurgie pour prévenir au mieux tout risque de douleur et de fracture. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée les premières 72h puis quotidienne. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de 3 individus, avant et après les procédures.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux. Il permet une faisabilité technique et la biologie de leur tissu osseux est proche de celle de l’homme avec notamment la présence du périoste. Notre laboratoire possède une expertise sur l’étude du tissu osseux du rat. La taille de sa mandibule permet d’y envisager un défaut critique de 4 à 5mm dans l’angle mandibulaire, ce qui n’est pas possible chez la souris, la mandibule étant trop petite. Les animaux seront étudiés entre 5 semaines de vie et 3 mois post chirurgie, les animaux étant alors des jeunes adultes, le potentiel de réparation osseuse y est optimal. Les mâles seront étudiés pour plus de standardisation inter-animal afin de s'affranchir de tout biais lié à l'incidence hormonal oestrogénique variable des femelles. L'âge idéal de ces chirurgies sera validé grâce au suivi par scanner pour sélectionner les rats ayant une taille de la mandibule adéquate. Nous bénéficions d’une animalerie d’élevage au sein du laboratoire.
Traitement des fistules après chirurgie oesogastrique par transplantation mitochondriale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fistule digestive est créée par chirurgie, puis deux injections locales de mitochondries et des imageries sont réalisées avant la mise à mort au 45e jour, pour tester une transplantation de mitochondries sur la cicatrisation. Le porteur indique des risques de douleur post-opératoire, d'infection, de déshydratation, de perte de poids et de décès. Il affirme qu'aucun modèle ex vivo ne reproduit la dynamique de cicatrisation des fistules et que le modèle rat vivant ne peut être remplacé.
Objectifs
Une fistule digestive est une communication anormale entre un organe digestif (l'estomac par exemple) et la peau. L’origine des fistules digestives est postopératoire dans plus de ¾ des cas. Dans la chirurgie de l'estomac, la fistule postopératoire, en rapport avec un défaut de cicatrisation de la suture réalisée (anastomose), est une complication fréquente (10-30%) et potentiellement grave, source d’infections, d’allongement de durée d’hospitalisation voire de décès. Le traitement actuel consiste essentiellement en des procédures invasives de drainage par voie endoscopique, radiologique ou chirurgicale, plus ou moins combinées et répétées. Il s’agit donc d’un enjeu de recherche majeur pour apporter de nouvelles alternatives moins invasives dans la gestion de cette complication. Des travaux récents ont montré l’impact des dysfonctions des mitochondries dans de nombreuses maladies comme les infarctus du myocarde ou les maladies dégénératives. Pour contrer ces effets, des méthodes de transplantation de mitochondries sont en cours de développement avec des résultats prometteurs au niveau cardiaque, neurologique, cutané… mais aucune donnée n’est disponible sur le traitement des fistules digestives. Ce transfert mitochondrial peut réduire l’inflammation locale et booster le métabolisme énergétique au sein du tissu endommagé. Ces actions sont par ailleurs nécessaires au processus de cicatrisation d’une fistule digestive. Les travaux récents dans notre unité ont évalué les effets anti-inflammatoires et pro-cicatrisants de nouvelles thérapeutiques dérivées de cellules souches (vésicules extracellulaires) sur ces modèles de fistules digestives. Cette thérapie dite sub-cellulaire utilise le même type de propriétés que la transplantation mitochondriale justifiant ainsi notre travail. Les objectifs de ce projet seront : 1/ de reproduire/développer un modèle de fistules après chirurgie oeso-gastrique chez le rat, 2/ d’évaluer l’efficacité de la transplantation mitochondriale pour améliorer la cicatrisation des fistules post-chirurgicales.
Bénéfices attendus
La thérapie par mitochondrie est une nouvelle thérapeutique dans l'arsenal de la médecine régénérative. Ses effets sont reconnus dans différentes pathologies comme les maladies dégénératives et les processus d'ischémie-reperfusion mais n'ont jamais été utilisés dans le traitement des fistules digestives jusqu'à présent. Nos précédents travaux ont montré des résultats encourageants concernant la thérapie à base de vésicules extracellulaires dans la cicatrisation des fistules digestives, qui est un traitement apparenté à la transplantation mitochondriale dans le cadre des thérapies sub cellulaires. L'application et la mise en place d'une étude pilote chez l'homme pourra se justifier et sera valorisée par une étude expérimentale animale dans cette indication.
Procédures
Une procédure unique est réalisée pour tous les animaux avec différentes phases. La première phase comprend une intervention chirurgicale, sous anesthésie générale, avec la création du modèle de type fistule digestive. Cette intervention dure 30 minutes. Deux injections locales (dans la zone de fistule) de traitement sont réalisés à J14 et J21 sur les animaux vigiles sont réalisées, sans douleur particulière pour le rat. L'évaluation de la cicatrisation est également effectuée à J14 et J21, sous une courte anesthésie gazeuse (quelques minutes). Aucun prélèvement n'est effectué pendant la durée de l'expérimentation. La dernière phase de la procédure à J45 comprend une étude morphologique par imagerie, sous anesthésie générale (environ 45 minutes), avant la mise à mort de l'animal puis le prélèvement de la zone de fistule pour l'étude histologique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels sont la douleur post-opératoire, le risque infectieux pour les risques immédiats. De manière plus retardée, peuvent apparaître, la déshydratation, la perte de poids et le décès.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure (J45), sous anesthésie générale, avant les prélèvements de la zone à étudier.
Remplacement
Après avoir validé "in vitro" les caractéristiques du produit (mitochondries), il convient de vérifier ses propritétés et effets régénérants "in vivo" avant le transfert chez l'homme. Le modèle rat vivant est le modèle permettant une transposition la plus proche et simple des fistules digestives. A ce jour, le modèle animal vivant ne peut être remplacé, car il n'existe pas de modèle ex-vivo permettant de reproduire la dynamique des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la cicatrisation des fistules.
Réduction
Après la validation in vitro et afin d'obtenir des différences significatives pour apporter de la puissance à nos résultats, un nombre minimal de 10 animaux analysables par groupe est nécessaire. En prenant l'hypothèse d'une cicatrisation de 20% dans le groupe contrôle et l'hypothèse de 65% de cicatrisation dans le groupe de traitement, nous aurons besoin de 10 animaux par groupe pour un risque alpha de 5% et une puissance de 90%. 30 animaux évaluables sont nécessaires pour l'évaluation de ce traitement. Une analyse intermédiaire de futilité (taux de cicatrisation
Raffinement
Toutes les procédures sont réalisées par une personne habilitée. Le zootechnicien sera en charge de l'animal avant le début des procédures puis le responsable du projet prend le relai à partir du début de la procédure expérimentale. Pour éviter toute souffrance animale, les différentes phases seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Lors du suivi, une grille d’évaluation des points limites sera utilisée afin d'anticiper toute souffrance animale excessive. Une grille de scoring de l'état général de 0 à 3 par variable sera établie prenant en compte l'apparence, le poids, le comportement spontané et provoqué. Les rats seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de la procédure. Dans le cas où le traitement serait à l'origine de douleurs visibles non soulagées par les antalgiques, de détresse ou de difficulté d'alimentation importante, le traitement sera interrompu et, si nécessaire, la mise à mort de l’animal sera anticipée. Il s’agit de la première étude qui évalue l’impact du traitement par mitochondries dans la cicatrisation des fistules digestives postopératoires. Cette étude animale justifiera l’application humaine par la suite.
Choix des espèces
Les animaux choisis sont des rats Wistar femelles. Le rat Wistar est un modèle expérimental idéal par ses caractéristiques: - l'anatomie digestive est proche de celle de l’Homme, il est donc possible de mimer la pathologie humaine - les modèles de fistules digestives sont validés par de nombreuses publications et sont considérés comme de bons modèles précliniques - L'expertise de l’équipe des zootechniciens et des chercheurs sur la prise en charge des rats - L'accessibilité, la fiabilité et la disponibilité de l'animal Des rats Wistar de 7-11 semaines sont utilisées car la taille et les mensurations sont adaptées aux manipulations expérimentales et permettent un séjour en captivité respectant la réglementation en vigueur.
Evaluation de l’efficacité de la Fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sur la fibrose pulmonaire et cutanée induite par l’acide hypochloreux chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
87 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une sclérodermie est induite par des injections intra-dermiques d'acide hypochloreux cinq jours sur sept pendant six semaines, avec imageries et injection d'une fraction du tissu adipeux, pour évaluer une nouvelle approche thérapeutique. Le porteur indique que les injections répétées causent stress et douleur et peuvent provoquer des ulcérations cutanées susceptibles de s'infecter. Il affirme que cette recherche est réglementairement impossible chez l'humain sans modèle animal préalable.
Objectifs
Il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les formes cutanées diffuses et l’atteinte pulmonaire fibrosante de la sclérodermie systémique (ScS). Compte-tenu de la complexité de la ScS, le choix du modèle préclinique de la maladie est crucial, devant refléter les différentes facettes de la maladie. Nous avons ainsi choisi le modèle induit par des injections d'acide hypochlroreux (HOCl) à la fois pour son caractère inductible sur une courte période, une atteinte cutanée diffuse, des lésions de fibrose pulmonaire et la production d’anticorps spécifiques. Il est donc très proche des conditions physiopathologiques observées chez les malades et apparaît pertinent pour l’évaluation d’une nouvelle approche thérapeutique, visant à cibler la fibrose pulmonaire et cutanée. L’équipe travaille sur la Fraction vasculaire stromale (FVS) du tissu adipeux. Nos travaux ont démontré l’effet anti-fibrosant et pro-angiogénique de la FVS. Le modèle chez la souris rendant difficile le recueil d’une quantité suffisante de FVS pour une utilisation en autologue, il a été décidé de transposer le modèle chez le rat. Le recours à la voie intra-veineuse s’impose également dans l’optique d’une thérapeutique systémique visant l’amélioration à la fois de la fibrose pulmonaire et cutanée. Nous avons choisi pour cette étude de « preuve de concept » de transposer le modèle de ScS induite par l’HOCl décrit chez la souris chez le rat pour y évaluer l’effet thérapeutique d’une injection intra-veineuse de FVS. Objectifs et moyens : 1/ Mettre en place le modèle ScS-HOCl chez le rat au laboratoire, 2/ Caractériser la fibrogénèse cutanée et pulmonaire induite par l’injection répétée d’HOCl chez le rat, 3/ Comparer les caractéristiques de la FVS des rats sclérodermiques et sains, 4/ Tester la faisabilité et la sécurité de l’injection IV de la FVS, 5/ Etudier les effets d’une injection IV de FVS hétérologue (rats sains) et autologue sur les lésions induites de fibrose pulmonaire et cutanée, 6/ Comparer les différentes doses de FVS utilisées à la recherche d’un effet dose et évaluer l’effet de la FVS déplétée de la fraction leucocytaire CD45+
Bénéfices attendus
Développement d'un modèle de sclérodermie systémique présentant les différents aspects systémiques de la maladie, complémentaire du modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine déjà utlisé antérieurement par l'équipe. Evaluation de l'effet systémique de la FVS injectée par voie IV. La faisabilité de l'injection IV de FVS chez le rat a déjà été démontrée dans la littérature dans des modèles de pathologies ischémiques cardiaques. Perspectives : pouvoir évaluer l'effet d'autres thérapies cellulaires ou d'autres traitements sur une espèce animale différente de la souris.
Procédures
Procédure 1 / 15 rats induction du modèle (+/- 12 animaux supplémentaires pour recherche dose optimale), + 6 animaux pour valider la reproductibilité de l'induction une fois la dose optimale trouvée). L’induction se fait par injection intra-dermique d’HOCl à 2 endroits de part et d’autre de la colonne avec une aiguille de 27G. Ces injections seront répétées 5 jours/7 pendant 6 semaines. Les injections se feront 30 minutes après application de crème anesthésiante et sous anesthésie à l’isoflurane (induction 5%, maintien 1,5%,durée 5min). Les animaux feront l’objet de 3 imageries (J0, J21 et 41). Les animaux sont endormis une première fois (isoflurane induction à 5% puis maintien à 1.5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min) afin de cathétériser une veine caudale pour injecter le radiotraceur en solution isotonique stérile (volume maximum 500µl). Une heure après l'injection du radiotraceur, les animaux sont de nouveau anesthésiés pour le passage sous les caméras (durée 30min). Procédure 2 / Induction de la fibrose (cf procédure 1) chez 27 rats. La FVS obtenue à partir de la graisse de rats sains (hors saisine) (lots 2,3 et 4) ou une solution de Ringer Lactate (lot 1) sera injectée aux rats par voie IV au niveau d’une des veines caudales sous courte anesthésie (5minutes) (isoflurane induction à 5% et maintien à 1.5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min). Les rats feront l’objet de 4 imageries sur la période (J0, J21 et 41 et J63) protocole identique procédure 1. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage et gardés jusqu’à la fin du protocole où ils seront mis à mort. Procédure 3 / Induction de la fibrose (cf procédure 1) et imageries (cf procédure 2) chez 27 rats. Prélèvement de la graisse : 30 minutes avant le début de l’anesthésie les rats reçoivent une injection s.c de Buprénorphine. Les rats sont ensuite pré-anesthésiés dans une chambre spécialisée par administration de Isoflurane à 5% sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min, puis maintenus sous anesthésie générale en ventilation spontanée au masque par administration de Isoflurane 2% environ sous mélange air/oxygène 30% à raison d'1L/min. L’abord chirurgical sera fermé sur 2 plans. Injection de ropivacaine au niveau de la cicatrice. Réveil des animaux. Prévention des douleurs par injection s.c de buprénorphine pendant 48-72h. La FVS ou le ringer lactate sont ensuite réinjectés (cf procédure 2). Les animaux sont gardés jusqu’à la fin du protocole où ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Fort de l'expérience sur les expérimentations antérieures, la répétition des injections génère un stress pour les animaux du fait de leur contention nécessaire et est source de douleurs. Afin de limiter ses souffrances, nous avons décidé après évaluation de la bonne tolérance lors des expérimentations antérieures, de réaliser les injections sous courte anesthésie gazeuse et d'administrer systématiquement aux rats dans les suites des injections du paracétamol. Des ulcérations cutanées peuvent apparaitre suite aux injections répétées d'HOCl. Malgré les mesures d'aseptie prises, il y a un risque de surinfection de ces lésions possible qu'il faudra surveiller et traiter si cela arrive. De part l'objectif visé, le développement de la fibrose cutanée pourrait entraver les mouvements du rat et limiter sa mobilité. L'apparition de cette fibrose est par contre indolore. Il faudra veiller à adapter la localisation de la nourriture et de l'eau si les rats venaient à presenter des difficultés à se mobiliser afin qu'il ne perde pas de poids ni se déshydrate. Avec le développement d'une fibrose pulmonaire, nous pouvons envisager l'apparition de difficultés respiratoires qui pourraient retentir sur l'activité du rat (difficultés respiratoires à l'effort tout d'abord) voir sur son état général ensuite (difficultés respiratoires au repos, fatigue, difficultés à manger). En ce qui concerne les rats de la procédure 3 qui auront un prélèvement de leur graisse péri-épididymaire, il est attendu des douleurs post-opératoires au niveau sus-pubien et testiculaire éventuellement qui seront prises en compte et traitées. Il y a un risque d'infectieux potentiel et possiblement un risque d'iléus réflexe avec rétention d'urines et constipation à surveiller.
Devenir
A l'issue de l'ensemble des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront mis à mort. Procédure 1 : Au bout des 6 semaines, tous les rats seront mis à mort pour caractériser la fibrogénèse en récupérant les poumons et de la peau pour analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires. Procédure 2 : A J63 les 27 rats induits puis traités seront mis à mort pour évaluer l'efficacité de l'injection de FVS saine. Procédure 3 : A J63, les 27 rats induits puis traités seront mis à mort pour évaluer l'efficacité de l'injection de FVS autologue.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de recherche chez l’homme sans un modèle animal avant pour évaluer l’efficacité et les risques. Le modèle de fibrose induite par l’acide hypochloreux chez la souris est bien connu pour l’étude des mécanismes impliqués dans le développement de la ScS et pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le modèle HOCl reproduit des caractéristiques proches d’une forme diffuse de ScS avec une fibrose cutanée et pulmonaire et la production d’anticorps spécifiques. Il est ainsi très proche des conditions physiologiques observées chez l’homme. Bien qu’il ne soit pas parfait surtout pour une maladie aussi complexe que la ScS, le modèle HOCl chez le rongeur apparait pertinent pour l’évaluation d’une nouvelle approche thérapeutique visant la fibrose pulmonaire et cutanée. Vue la complexité de la pathologie, il n'est pas possible non plus de la modéliser in vitro ni in silico.
Réduction
Un maximum de 87 rats wistar est envisagé pour ce projet en espérant pouvoir se limiter à 75 rats. Le nombre de rats prévus est minimum mais suffisant pour chaque étape pour espérer obtenir des résultats significatifs. Pour la mise au point du modèle, suite aux résultats préliminaires, nous avons décidé de tester 3 concentrations d’acide hypochloreux d’emblée afin de limiter le nombre de rats témoins nécessaires et nous espérons ne pas avoir à tester 4 autres doses avec 12 rats supplémentaires. N=3 est suffisant à cette étape car l’induction de la fibrose ne doit pas induire de décès, que les animaux sont suivis longitudinalement par imagerie et que le résultat attendu est présence ou non de fibrose. Nous avons prévu 6 rats pour s'assurer de la reproductibilité d'induction du modèle avec la dose optimale trouvée. Pour l’étude de l’efficacité de la FVS, nous avons aussi prévu l’évaluation de 2 doses différentes de FVS + d'une dose de FVS déleucocytée dans le même temps afin de limiter le nombre de rats témoins également. Le nombre d’animaux (n=6 ou 7 / lot) a été déterminé en fonction des études sur l’injection IV de cellules souches mésenchymateuses sur le modèle murin de fibrose induite par l’acide hypochloreux et en tenant compte du risque de décès des animaux à la hauteur de 5-10%. L’évaluation de la FVS autologue permettra si les résultats avec la FVS hétérologue issue de rats sains sont comparables de ne plus avoir à utiliser des rats uniquement pour le recueil de la FVS à l’avenir et chez les patients seule la FVS autologue est envisageable. Le suivi de l’apparition et de la régression de la fibrose par imagerie permet également de limiter le nombre de rats puisque tous les rats seront mis à mort uniquement à la fin de l'expérimentaton et non à chaque point d'évaluation. Les paramètres quantitatifs seront comparés à l’aide du test t ou du test non paramétrique de Mann-Whitney. Une ANOVA sera utilisée lorsque l’analyse inclura plus que 2 groupes. Le seuil de significativité est fixé à 5%.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 2 en armoire ventilée durant la période d’acclimatation puis d’expérimentation pour diminuer leur stress. Nous habituerons les animaux durant la période d'acclimation à être manipuler afin de limiter leur stress par la suite. Chaque cage sera agrémentée de tunnel rouge afin d'amener un enrichissement aux rats et les stimuler dans la réalisation de leur propre nid au sein de la cage. Ils auront à disposition nourriture et eau, le cycle jour nuit sera respecté et la température ambiante sera de 22°C. Une petite balle en plastique sera mise dans la cage afin qu’ils puissent se divertir le temps où nous ne sommes pas présents. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé afin d’optimiser le bien-être des rats et l’obtention de résultats positifs. Les injections id pour l'induction de la maladie seront réalisées après l’application d’une crème anesthésiante et avec l’administration orale en systématique de paracétamol dans les suites. Des soins locaux cutanés seront réalisés en cas de lésions cutanées induites par les injections id. Afin de limiter le stress important des animaux lié à la contention nécessaire aux injections, les injections seront réalisées sous une courte sédation gazeuse. Cela a été réalisé lors des expérimentations préalables avec succès et une très bonne tolérance. En cas de difficultés des rats à se mobiliser du fait du développement de la fibrose cutanée et/ou pulmonaire avec gêne respiratoire, nous leur mettrons à disposition dans la cage eau et nourriture afin d'éviter toute perte de poids. En cas de difficultés respiratoires, nous adopterons la concentration d'isoflurane et pourront ajouter de l'oxygène. Le recueil du tissu adipeux se fera sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Nous serons vigilants si difficultés respiratoires au réveil de l'anesthésie et à la tolérance des injections de buprémorphine. Une injection de ropivacaine au niveau de la cicatrice permettra de limiter le recours à la buprémorphine en post-opératoire immédiat. L'injection de la FVS et les imageries prévues seront réalisées sous anesthésie également. La même attention sera portée aux anesthésies pour ces gestes. De plus, la douleur et le bien-être des rats seront évalués quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin d’adapter leur prise en charge en fonction. Si une souffrance sévère irréversible était objectivée, une mise à mort du rongeur sera réalisée sans délai.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener notre expérimentation chez le rat pour différentes raisons : -La faisabilité du prélèvement de tissu adipeux pour pouvoir obtenir une quantité suffisante de FVS et pouvoir travailler en autologue. Nous nous sommes notamment inspirés des études dans l’infarctus du myocarde. -La caractérisation de la FVS chez le rat déjà publiée validant un recueil uniquement de la graisse péri-épididymaire pour obtenir une quantité de FVS suffisante pour les objectifs cellulaires souhaités. -La faisabilité de l’injection intra-veineuse de FVS Nous utiliserons des rats wistar de 200-225 grammes afin d'avoir un poids des rats au bout des 8 semaines d'expérimentation (Acclimation + induction) suffisant pour obtenir une quantité de graisse péri-épidydimaire permettant l'obtention de FVS (3ml de graisse nécessaire). Le recueil de la graisse péri-épidydimaire a été choisi compte tenu des données de la littérature et cela permet de se limiter à une incision sus-pubienne et d'être moins invasif que si de la graisse abdominale doit être prélevée. Les suites opératoires en seront facilitées avec notamment moins de douleurs et un risque infectieux diminués.
Etude des mécanismes d’invasivité des adénomes hypophysaires chez le rat et évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.
Objectifs
L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.
Procédures
Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.
Réduction
Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.
Raffinement
Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.