Rats
Le Fingolimod, inhibiteur du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate, comme stratégie thérapeutique pour traiter les calcifications vasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
66 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Un régime enrichi en adénine provoque une insuffisance rénale chronique, puis un régime calcique induit des calcifications vasculaires, avant l'administration de fingolimod dont l'effet immunosuppresseur entraîne souvent une baisse persistante des lymphocytes. Les rats sont tués par anesthésie terminale au pentobarbital, avec un prélèvement de sang par ponction cardiaque et une nécropsie. Le porteur affirme qu'une vérification in vivo est nécessaire pour confirmer ses résultats in vitro et espère faire du fingolimod un traitement des patients insuffisants rénaux.
Objectifs
La calcification vasculaire (CV) est un processus actif de formation osseuse par des cellules locales, notamment des cellules du muscle lisse (CML), qui se transdifférencient en cellules calcifiantes entrainant l’apparition des dépôts de cristaux de calcium dans la paroi des vaisseaux. La CV est reconnue comme une complication majeure chez les patients atteints d’une insuffisant rénale chronique (IRC) en augmentant fortement leur morbidité dû à l’apparition des complications cardiovasculaires. Malheureusement, les mécanismes moléculaires impliqués dans la CV restent largement méconnus ainsi que des thérapies ciblées pour éviter sa progression. Nos résultats préliminaires montrent que des patients IRC sous hémodialyse avec un score modéré de calcification abdominale aortique, ont la concentration sérique de la sphingosine 1 phosphate (S1P), un lidpide bioactif, significativement augmentée par rapport aux patients sous hémodialyse sans calcifications. Nous retrouvons également cette augmentation dans le sérum d’un modèle murin d’IRC avec des CV, dans un modèle ex-vivo d’aorte calcifié ainsi que dans le milieu extracellulaire d’un modèle de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. De plus, nous avons impliqué plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P, dans le processus de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Le but de ce projet de recherche est de déterminer si l’inhibition générale du métabolisme de la S1P avec l’immunomodulateur fingolimod a des effets délétères dans la calcification des aortes de nos modèles in vivo et ex vivo ainsi que dans la transdifférenciation des CML d’origine vasculaire en cellules calcifiantes.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des CV associées à l’IRC ; l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la transdifférenciation des CML vasculaires ainsi que dans l’apparition et l’entretien de la calcification de l’aorte. La physiopathologie des CV associées à l’IRC est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse qui a lieu dans les vaisseaux. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur les CV dans notre modèle murin d’IRC et particulièrement sur l’ossification ectopique de l’aorte. Le fingolimod, que nous utilisons dans ce projet comme inhibiteur général de la voie de la S1P, pourrait agir à la fois comme un inhibiteur de la CV ainsi que comme un immunomodulateur. A terme, nos données devraient permettre de valider l’intérêt thérapeutique de l'inhibition du métabolisme de la S1P pour prévenir ou traiter les CV chez des patients IRC et fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante.
Procédures
Néphrectomie chimique : Induction d'une IRC par régime enrichi en adénine (0,75% w/w). Un régime enrichi en adénine est une méthode non chirurgicale pour induire une IRC chez le rongeur (néphrectomie chimique). Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 0,75% (w/w) d'adénine (Sigma Aldrich) Ces régimes sont produits à façon par la société SAFE (Augy, France). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance. Induction des CV chez le IRC - Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 1% (w/w) de calcium et 0.9%(w/w) de phosphore (Sigma Aldrich). Ce régime est produit à façon par la société SAFE (Augy, France). Ce régime est bien toléré par les animaux et n'induit pas de manifestation observable. Ils recevront 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) des injections intrapéritonéales de calcitriol (1,25-dihydroxycholécalciférol ou vitamine D3) (Rocaltrol, Roche) à la dose de 80 ng/kg afin de maximiser la fixation du calcium alimentaire. Le calcitriol est dilué dans du propylène glycol (injection 0,3mL/100 g) qui est un véhicule métabolisé et dépourvu de toxicité.
Impact sur les animaux
A cause de son action immunosuppressive, l’effet secondaire le plus fréquent et le plus préoccupant du fingolimod est une lymphopénie qui s’installe chez les animaux dès le début du traitement et qui persiste, très souvent, tout au long de l’étude. Il a été démontré que dans un modèle d’arthrite induite par le collagène, 4 semaines de traitement avec le fingolimod dans l’eau de boisson à 0,1 mg/kg/jour permettent de diminuer l’incidence de la maladie et de restaurer partiellement la qualité osseuse chez le rat. En même temps, cette dose n’affecte pas le nombre de monocytes ou neutrophiles présents dans le sang périphérique. Dans un modèle murin d’Alzheimer, la même dose de 0,1 mg/kg/jour de fingolimod, également administrée diluée dans l’eau de boisson, ne modifie pas le nombre de lymphocytes par rapport au nombre total de leucocytes, même après 28 semaines de traitement. De plus, la présence du fingolimod dans l’eau de boisson, ne modifie la prise d’eau quotidienne par les animaux. Nous attendons donc du traitement avec le fingolimod à faible dose pendant 5 ou 7 semaines, des effets sur les CV, sans induction de lymphopénie. La procédure expérimentale N°1 nous servira à choisir la dose de fingolimod la plus adaptée à utiliser dans la procédure expérimentale N°2 qui ne provoque pas de lymphophénie et qui ne modifie pas a priori la prise d’eau et/ou de la norriture à cause de son gout. Dans la procédure expérimentale N°2 nous utiliserons un regime à base d’adenine pendant 4 semaines pour provoquer une IRC irreversible. Cette procédure à recemment été validé et publiée par notre équipe (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments. A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du protocole expérimentale par anesthésie terminale au pentobarbital sodique (60 mg/kg). Nous réaliserons également un prélevement terminal de sang par ponction cardiaque et une nécropsie (prélevement de différents tissus pour des études histologiques et biochimiques).
Remplacement
Nos résultats montrent qu’il existe un lien entre le métabolisme de la S1P et les CV dans l’IRC. Plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P semblent être impliqués dans la transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Des manipulations dans un modèle in vivo s’avèrent nécessaires pour vérifier nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Le ciblage global du métabolisme de la S1P avec le fingolimod semble être une approche idéale pour l’inhibition de la calcification à la fois in vitro et in vivo. Si les résultats s’avèrent concluants, le fingolimod pourrait devenir un traitement de choix pour les patients IRC dans le but de prévenir, diminuer ou ralentir l’apparition des CV et en conséquence diminuer les accidents cardiovasculaires et la morbidité.
Réduction
La procédure expérimentale N°2 ne sera réalisée que si la procédure expérimentale N°1 donne les résultats attendus. La procédure N°1 nous permettra de vérifier que la présence du fingolimod dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une lymphopénie.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’entretien des rats seront adaptés pour éviter des conditions délétères pour l’animal. Les animaux sont réceptionnés des établissements Janvier, deux semaines avant le début de l’expérimentation. La surveillance de l'environnement, fournitures et équipement auxquels les rats sont exposés est essentiel à l'entretien. L’état de bien-être est évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). De la nourriture sera disposée au fond de la cage par prévention dès la période de stabulation afin de permettre aux rats de se nourrir en cas d’apparition de douleur au cours des procédures. Une couche importante de litière sera mise au fond de chaque cage, et le non enfouissement des rats étant un signe de mal-être nous y ferons attention.
Choix des espèces
Le présent protocole sera conduit sur des rats Sprague-Dawley. Les rats IRC développent en 4-5 semaines des CV lorsqu'ils sont soumis à un régime enrichi en P/Ca et qu'il recoivent des injections calcitriol. L'incidence des CV dans cette population est supérieure à 60%. Les rats Sprague-Dawley procedant de Janvier arriveront à l’animalerie avec 6 semaines et seront stabulés 2 semaines avant le début des expériences. A 8 semaines, les rats sont considerés comme jeunes adultes en ayant adquis leur maturité séxuelle à environ 6 semaines. Les rats auront un poids d’environ d’environ 200-250 g à l’arrivée à l’animalerie et de 300-350 g au début des manipulations.
S-nitrosylation des myofilaments cardiaques : conséquences sur l’adaptation du cœur au stress mécanique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
110 rats vont être utilisés, tués à l'issue, la plupart sous anesthésie sans réveil et vingt en gravité modérée. Une partie court sur un tapis roulant motorisé, une autre reçoit un bêta-bloquant pendant vingt-quatre heures, puis les animaux sont tués pour prélever leur cœur et l'étudier en montage isolé perfusé ou en biochimie. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution in vitro n'existe pour évaluer l'effet d'un étirement sur la fonction cardiaque et conclut que le recours à l'animal est "indispensable". Il retient le rat au motif que la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l'humain.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle du monoxyde d'azote et de la s-nitrosylation des protéines mitochondriales et myofilamentaires dans la régulation de la réponse du coeur à un stress mécanique.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress mécanique. En effet, il est bien connu qu'un stress mécanique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfiques du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jours, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié.
Procédures
Les animaux de la procédure 1 seront traités avec un Beta-bloquant afin de réduire le stress adrénergique cardiaque au moment de leurs manipulations. Les animaux de la procédure 2 seront soumis à un protocole d'exercice physique sur tapis roulant motorisé.
Impact sur les animaux
Certaines expérimentations necessiteront de faire courir des animaux sur tapis roulant motorisé. Le laboratoire possède une grande expérience de ce type d'expérimentation. Par ailleurs, les animaux sont surveillés tout au long de leur course par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. Certains animaux seront traités avec un beta-bloquant pendant 24h00 avant leur euthanasie. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.
Devenir
A la fin des deux procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur. Celui sera utilisé soit dans un protocole de coeur isolé perfusé de Langendorff soit pour réaliser des analyses biochimiques.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer d'un stress d'étirement (stretch) sur la fonction cardiaque et sur la réponse contractile du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations seront réalisées sur des organes ou des cellules isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres (facteurs circulants, conditions de charge cardiaque, fréquence cardiaque) et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (microscopie électronique et biochimie à partir d'un même prélèvement cardiaque).
Raffinement
Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites (pièce jointe).
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications.
Evaluation de l’efficacité de produits à visée antiadhérente dans un modèle de chirurgie des cornes utérines chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
96 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque ratte subit une laparotomie et une chirurgie des cornes utérines pour tester des produits anti-adhérence, l'opération abdominale pouvant provoquer des douleurs post-opératoires, avant d'être tuée pour prélever ses cornes utérines. Le porteur indique utiliser les deux cornes de chaque animal pour tester deux produits et réduire ainsi le nombre de rattes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur une autre espèce ne convient et que les produits ont été présélectionnés par méthode alternative.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l'efficacité de produits anti-adhérence, destinés à la prévention de la formation d’adhésions intra-utérines post chirurgie. L’efficacité au niveau des cornes utérines sera réalisée en ex-vivo par imagerie médicale (scanner micro CT) et en histologie. Ces études, réalisées sur des rattes, ont pour but d’évaluer l’effet protecteur de différents produits anti-adhérence en comparaison à un produit de référence déjà présent sur le marché. Ce modèle in vivo est représentatif à la fois des adhérences observées après des chirurgies des cornes utérines chez la femme, mais également des modalités d’administration du futur produit chez le sujet traité. Les analyses par imagerie µCT permettrons d’évaluer les structures luminales de l’utérus et ainsi visualiser et localiser les potentiels adhérences. Ces analyses seront complétées par des analyses histologiques en fin de phase expérimentale.
Bénéfices attendus
Les adhésions sont une complication commune après de nombreuses chirurgies, incluant les chirurgies gynécologiques. Les adhésions post chirurgies peuvent entrainer des problèmes médicaux importants, comme l’infertilité, de la douleur chronique ou une perte de fonction. Des produits anti-adhérences peuvent ainsi aider à prévenir ou réduire le risque d’adhérences post-chirurgie en créant une barrière entre les tissues et l’organe pendant le process de réparation. Ce modèle animal permet de mimer ce qui est observer chez les femmes et ainsi tester de nouveaux produits. Ainsi, les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices éventuels dont pourront profiter les patientes présentant des adhérences intra-utérines.
Procédures
Tous les animaux subiront une laparotomie en vue d’une chirurgie des cornes utérines (à l’exception de l’animal contrôle chirurgie qui ne subira qu’une laparotomie) pour administration locale des produits anti-adhérence sous anesthésie générale réalisée par un chirurgien vétérinaire compétent.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de produits anti-adhérence sur les tissus intra-utérins post-chirurgie. La chirurgie abdominale (laparotomie) peut entrainer des douleurs post-opératoires. Une surveillance poussée des plaies abdominales et l’utilisation d’analgésiques est donc prévus pendant la durée nécessaire au rétablissement des animaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les cornes utérines et analyser les adhérences des tissus post-mortem via des analyses d’imagerie à rayons X et histologiques.
Remplacement
L’étude in-vivo chez le rongeur est la meilleure alternative en en termes de modèle chirurgical et de sélection de nouveaux produits candidats. La procédure expérimentale décrite dans le présent projet ne dispose pas de modèle in-vitro ou in-vivo sur une espèce alternative. Les produits tests ont été préselectionnés par méthode alternative in-vitro.
Réduction
L’utilisation des 2 cornes utérines de chaque ratte permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation de l’organe et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes.
Raffinement
Afin d’éviter les phénomènes d’automutilation qui peuvent survenir suite à la chirurgie, une période d’acclimatation est prévue. Les animaux bénéficieront de 12 jours d’acclimatation minimum dont une période d’habituation de 7 jours minimum permettant aux groupes sociaux de se faire plusieurs jours avant la chirurgie. De plus, une surveillance accrue et quotidienne des rattes pendant 7 jours après la chirurgie (avec observation clinique de l’état général, observation des plaies abdominal, pesées) et l’utilisation d’analgésique pendant 3 jours après la chirurgie est prévu afin de prévenir et réduire la douleur post-chirurgicale. Des points limites adaptés à la procédure ont également été définis : - Perte de plus de 20% du poids maximum relevé dans l'étude, - Un état général de l'animal altéré associant différents signes cliniques (poil hérissé, dos vouté, prostration, perte de mobilité rendant l'abreuvement ou alimentation difficile, détresse respiratoire particulièrement si elle est accompagnée d’un écoulement nasal et/ou de cyanose, saignement ou écoulement purulent d’un orifice, écoulement au niveau des yeux, ataxie, tremblement) à l'appréciation des personnels en charge des animaux. - En soins post-opératoire : infection et/ou un gonflement de la zone opérée non compatible avec le comportement normal de l'animal, gonflement de la cicatrice, extériorisation d'organes par rupture de points.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée pour réaliser des modèles chirurgicaux. En effet, l’anatomie du rat est bien connue et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). De plus, c’est une espèce largement décrite dans la littérature pour la recherche sur les adhésions utérines et les traitements associés. Des rattes adultes seront utilisées dans ce projet pour avoir des utérus matures.
Apports postnataux en gangliosides : effets sur l’absorption intestinale des oméga-3 et leur incorporation dans la rétine.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
96 rats vont être utilisés, tués au sevrage vers le vingt-et-unième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons sont nourris à la pipette chaque jour de leur quatrième au vingt-et-unième jour de vie, puis reçoivent un gavage intragastrique de marqueurs suivi d'un prélèvement de sang à la queue. Le porteur reconnaît que le gavage peut induire de rares fausses routes et que la prise de sang provoque une douleur qu'il qualifie de légère. Il affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité des fonctions en jeu, les retombées visant les formulations infantiles.
Objectifs
Les gangliosides sont des composants majeurs des membranes plasmiques, notamment des cellules intestinales, dont la composition varie au cours du développement. Ils régulent leurs propriétés et divers évènements de signalisation. En particulier, ils servent de récepteurs aux virus, bactéries et toxines et sont ainsi impliqués dans la mise en place de l’immunité intestinale chez le jeune. Très peu de données concernent leur rôle dans la fonction absorptive. Seul un travail ex vivo semble indiquer que les gangliosides favoriseraient l’absorption intestinale des lipides (Birecki, 2006). Les gangliosides sont naturellement présents dans l’alimentation, en particulier le lait maternel dont les composants bioactifs sont connus pour influencer la maturation intestinale et la mise en place de la fonction absorptive. Parmi les nutriments dont l’absorption intestinale est particulièrement critique en période post-natale figurent les acides gras polyinsaturés oméga-3. La rétine est un tissu particulièrement sensible aux apports alimentaires en période périnatale, notamment en oméga-3 qui sont fondamentaux pour le bon développement des fonctions visuelles. Chez l’enfant, des études cliniques ont montré que la consommation de formulations infantiles pauvres en acide linoléique et dépourvues en acide docosahexanoique (DHA) du fait de l’origine végétale des lipides, conduisait à une baisse d’environ 40% des taux de DHA dans le système nerveux et les globules rouges associée à une baisse significative de l’acuité visuelle et un retard de maturation des photorécepteurs (cellules rétiniennes en charge de la conversion du signal lumineux en signal nerveux) et une baisse significative de l’acuité visuelle ont été montrés, en comparaison des nouveau-nés allaités. Nous formulons l’hypothèse que les gangliosides apportés en période postnatale pourraient jouer un rôle dans la maturation intestinale et moduler l’absorption lipidique, notamment des oméga-3, favorisant ainsi leur incorporation dans la rétine. L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact des apports postnataux en gangliosides sur les capacités d’absorption intestinale des oméga-3 et les conséquences sur leur incorporation dans la rétine.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de vérifier les impacts positifs potentiels des apports postnataux en gangliosides sur les capacités de la muqueuse intestinale à absorber efficacement les oméga-3, ainsi que sur l’incorporation rétinienne des oméga-3, connus pour leurs bénéfices dans ce tissu en période de développement. De plus, mâles et femelles seront étudiés de façon à documenter un éventuel effet du sexe. Ainsi, ce projet devrait permettre de soutenir l’importance des apports en gangliosides dans le développement post-natal et le fait que les gangliosides font partie des composants bioactifs du lait maternel à considérer dans les questions de nutrition infantile. Il pourrait ouvrir la voie à des travaux visant une prise en compte des gangliosides dans les formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, à l’instar de ce qui s’est mis en place auparavant pour les oméga-3.
Procédures
Les animaux seront "biberonnées" un fois par jour entre J4 et J21, à l'aide d'une pipette souple par des solutions nutritionnelles (volumes adaptés à leur âge). Un gavage intra-gastrique de marqueurs de perméabilité intestinale suivi par un prélèvement de sang à la queue (quelques gouttes, environ 60 uL) sont prévus une seule fois dans la vie des ratons (J19/J20).
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet sont de classe légère. Des nuisances peuvent être attendues lors du gavage intra-gastrique de la solution permettant la mesure de la perméabilité intetsinale ion vivo ainsi qu'au moment du prélèvement d'une goutte de sang à la queue pour les dosages. Le gavage intra-gastrique peut induire des fausses routes mais c'est extrêmement rare chez les ratons de 20 jours et lorsque réalisé par du personnel compétent. Le prévèlement de sang à la queue peut induire une douleur qui reste légère car la zone est peu innervée.
Devenir
Les aniamaux sont gardés en vie à l'issu de chaque procédure et seront mis à mort à l'âge du sevrage à J21/22.
Remplacement
L’objectif de cette expérimentation est d’évaluer les effets d’une supplémentation nutritionnelle post-natale sur l’accrétion lipidique de la rétine. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité des différents fonctions physiologiques qui interviennent (digestion, absorption intestinale, distribution et incorporations tissulaires). L’expérimentation animale ne peut donc pas être remplacée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé à 10 par groupe sur la base d’un calcul d’effectif à partir de données bibliographiques permettant d’estimer l’effet attendu (sur l’accrétion en oméga-3 dans la rétine mais également sur les voies mécanistiques explorées telles que la perméabilité intestinale et la mesure d’expression de transporteurs lipidiques), pour une puissance de test statistique de 90% et un risque d’erreur de 5%. Toutes les analyses seront réalisées à partir d’un seul animal. L’utilisation des mâles et des femelles dans les groupes expérimentaux valorise au maximum les animaux obtenus à la mise bas.
Raffinement
L’environnement des mères gestantes et allaitantes sera enrichi (matériau cellulosique pour le nid, tunnel, bâton à ronger). Les procédures prévues relèvent toutes de la classe de sévérité « légère » : biberonnage selon réflexe de tétée des nouveau-nés, administration orale de marqueurs de perméabilité intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. Les protocoles ne devraient pas entraîner de souffrance pour les animaux, cependant ils feront l’objet d’une visite quotidienne, y compris le week-end. Les points limites clairement définis conduiront à la mise à mort des animaux le cas échéant.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans notre laboratoire et bien adaptée à nos recherches. La taille des ratons facilite la manipulation et le biberonnage. Cette espèce, en particulier la souche choisie, possède également des qualités maternelles qui participeront de la réussite de l’expérimentation. La taille des organes d’intérêts des ratons au sevrage fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1 de gestation) et 10 d’entre elles seront gardées pendant toute la période de lactation. Les petits seront utilisés de la naissance au sevrage (J21) puisque l’expérimentation vise à déterminer les effets de la supplémentation post-natale pendant la durée de la lactation.
Etude de l’effet des conopeptides dans les neuropathies induites par constriction chronique du nerf sciatique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 344 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit la pose chirurgicale d'un manchon autour du nerf sciatique qui provoque une douleur neuropathique pendant quatre à six semaines, avec de possibles conséquences anxio-dépressives, avant des tests de douleur quotidiens. Les rats ayant reçu les conopeptides ou subi la chirurgie sont tués à l'issue, les rats naïfs sous placebo pouvant être réutilisés. Le porteur revendique un "réel besoin" de nouvelles molécules antalgiques et affirme qu'il est impossible de se passer de sujets vivants dotés d'un cortex développé.
Objectifs
Les douleurs chroniques affectent 30% de la population mondiale et ont un impact socio-économique considérable dans notre société moderne. A côté des symptômes douloureux traduisant l’hypersensibilité du système nerveux, elles génèrent un véritable handicap de vie en induisant des comorbidités anxieuses, dépressives, cognitives et des troubles psychosociaux. Les mécanismes sous-jacents à ces douleurs chroniques sont encore mal compris, et leur traitement clinique est souvent insuffisant. Ainsi, 2 patients sur 3 estiment que la prise en charge de leur douleur est insuffisante. Les traitements classiques recommandés pour les douleurs chroniques sont en effet souvent inefficaces, parfois source d’effets adverses dont l’accoutumance. Il est donc nécessaire d’identifier et développer de nouvelles molécules antalgiques capables de soulager les douleurs chroniques car elles sont très fréquemment réfractaires aux traitements disponibles. Les conopeptides contenus dans les venins de cones marins font partie des molécules antalgiques prometteuses dans ce domaine. L’un d’entre eux, le ziconotide (Prialt) est utilisé en clinique pour traiter les douleurs neuropathiques refractaires. Le projet sur 5 ans vise donc à caractériser les effets antalgiques de conopeptides contenus dans des extraits préparés à partir de différentes espèces de cones marins et préalablement testés dans des modèles in vitro.
Bénéfices attendus
Les antalgiques classiques opioidergiques utilisés pour les douleurs réfractaires, et notamment pour les douleurs neuropathiques sont inefficaces chez 2/3 des patients. Il existe donc un réel besoin de trouver de nouvelles molécules antalgiques pour traiter ce type de douleur. Ce projet cherche à caractériser le bénéfice analgésique de 3 extraits de conopeptides, administrés par 2 différentes voies, dans un modèle murin de douleur neuropathique par compression du nerf sciatique.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie pour induire une douleur neuropathique par la pose d'un manchon de polyetylène sur la branche principale du nerf sciatique. La chirurgie est rapide et dure entre 5 et 10min par animal. Elle provoque des douleurs neuropathiques pendant 4 à 6 semaines, avec de potentiels conséquences anxio-dépressives. Ain de monitorer l'évolution des symptomes douloureux et anxio-dépressifs, les animaux subiront des test nociceptifs (une fois par jour, test rapides durant de 15min pour les tests mécaniques et 30min pour les tests thermiques et induisent peu d'anxieté chez l'animal ) et anxio dépressif (une fois par semaine, durant une dizaine de minute par animal).
Impact sur les animaux
La chirurgie du cuff provoque le développement d'une douleur chronique chez l'animal, ainsi que de potentiel comorbidités de comportements anxieux et dépressifs. L'injection de conopeptides peut comporter des risques de légères paralysie musculaire et difficultés respiratoires. Ces effets ne sont cependant pas attendus au vu des doses prévues pour ce projet. Aucun effet secondaire n’est attendu suite aux injections intrathécales.
Devenir
A la fin du protocole de tests comportementaux, les animaux ayant reçu les conopeptides et les animaux ayant subi une chirurgie seront mis à mort. Les animaux naïfs ayant reçu le placebo pourront être réutilisés si la demande est faite conformément aux usages du chronobiotron.
Remplacement
Le projet portant sur la perception de l'information douloureuse par le système nerveux et les propriétés analgésiques des molécules d’intérêt, il est actuellement impossible de se passer de sujets vivants et dotés d’un cortex développé. Les extraits de conopeptides auront été testé in vitro au préalable afin de déterminer les doses efficaces sans causer de toxicité.
Réduction
Le nombre d’animaux prend en compte i) les risques liés à la chirurgie du cuff, ii) les risques liés aux différentes injections de conopeptides et iii) les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests statistiques significatifs et robustes.
Raffinement
Raffinement par hébergement en cages collectives enrichies (frisure, bâton de bois et tunnel) après sevrage et maintien des fratries selon les sexes dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie et analgésie. Les injections entre les vertèbres seront également effectuées sous anesthésie. Des points-limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le rat est un standard en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Notre équipe travaille sur la transmission nociceptive chez cet animal, ce qui permettra une analyse appropriée des résultats et une qualité optimale des mesures effectuées et de l’interprétation des résultats. L’étude du projet portant sur les douleurs neuropathiques chez l’adulte, nous utiliserons des animaux adultes. La bonne analyse des données implique que le réseau nociceptif soit totalement mature.
Intérêt des facteurs de croissance hépatocytaires à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral chez le rat (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
92 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une première phase pharmacologique porte sur 30 rats ensuite réutilisés dans d'autres projets, une seconde induit chirurgicalement un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère pendant 90 minutes avec suivi par IRM, ces animaux étant mis à mort à 24 heures pour prélèvement du cerveau et du coeur. Le projet teste un facteur de croissance censé réduire les lésions de l'AVC. Le porteur indique que l'AVC ischémique n'induit pas de douleur en soi et affirme que l'imagerie in vivo et le mécanisme d'action rendent l'animal vivant nécessaire.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aigüe d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. Cette reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi aux séquelles de l’AVC. L’un des enjeux du développement de nouvelles approches thérapeutique dans l’AVC, en complément des traitements actuels, serait de combattre les dommages liés à la reperfusion. L’objectif de ce projet est de déterminer si une protéine d’intérêt appelé Hepatocyte Growth Factor (HGF) permet de diminuer la taille et les conséquences de l’AVC. Il s’agit d’un élément majeur en santé publique car la taille de l’AVC est directement reliée au handicap et à la mortalité. Les données de la littérature sont croissantes depuis une dizaine d’année. Notre hypothèse est en faveur d’une diminution de la taille de l’infarctus et une amélioration de la fonction cérébrale lorsque HGF est utilisé dans l’AVC.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Ce projet de recherche a pour objectif de tester un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC liée à l’occlusion d’une artère cérébrale. La molécule testée a déjà montré des bénéfices dans l’attaque cardiaque. Si notre étude apporte des preuves d’efficacité, un essai clinique pourrait être mis en place rapidement pour évaluer cette nouvelle approche thérapeutique chez les patients. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour pouvoir concevoir correctement de futurs essais cliniques.
Procédures
Ce projet multisite se découpera en 2 procédures : 1) Etude pharmacologique de N Acetyl Heparin sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane - classe légère : La veine caudale est cathétérisée puis le produit est injecté par voie intraveineuse à différentes posologies, soit uniquement en bolus, soit par bolus puis perfusion continue pendant une heure (anesthésie de 10 minutes pour les injections en bolus seul, de 1h10 pour les injections en bolus puis anesthésie). Les animaux auront des prises de sang régulières, par voie caudale, de 50 μL : avant injection de NAH, à 10 minutes, à 1h puis à 24h (le prélèvement réalisé à une heure chez les animaux ayant uniquement un bolus intraveineux et celui réalisé à 24h seront réalisés après anesthésie locale caudale). 2) induction chirurgicale de l’AVC et administration des traitements - classe modérée : - (H0) Induction chirurgicale de l’AVC - (H1) Examen IRM basal afin de vérifier la bonne efficacité de la ligature artérielle - (H1,5) : le filament est laissé en place pendant 90 minutes (ischémie), après quoi il est retiré (reperfusion), et l’animal peut être définitivement suturé à l’aide de fils stériles. Le traitement est administré par voie intraveineuse (cathéter caudal) 5 minutes avant la reperfusion (HGF, NAH ou NaCl). Les animaux sont anesthésiés pendant 1h30. La durée de la chirurgie en elle-même est d’environ 30 minutes. - (H23) Examen fonctionnel : Evaluation du Neuroscore - (H24) Examen IRM final : imagerie IRM à 24h sous anesthésie générale. Les animaux sont anesthésiés une quinzaine de minutes pour l’acquisition des différentes séquences.
Impact sur les animaux
L’induction d’un AVC ischémique chez le rat nécessite une procédure de classe modérée avec une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients, le parenchyme cérébral étant dépourvu d’innervation). Une des complications, rare, est l’œdème cérébral malin. Par ailleurs, le modèle animal induit des déficits sensoriels et moteurs reproduisant la physiopathologie humaine. Les cerveaux et les cœurs seront prélevés en fin de procédure afin d’évaluer les mécanismes d’action du traitement sur le cerveau et, à distance, sur le coeur. Un nombre total de 92 rats au maximum seront utilisés au cours de ce projet (phase 1 + phase 2), afin de disposer d’une étude statistique robuste.
Devenir
Les animaux issus de la phase 1, utilisés pour l’étude pharmacologique de N Acetyl Heparin, pourront être réutilisés dans d’autres projets de recherche utilisant des rats. Les animaux issus de la phase 2 seront mis à mort à 24h afin de pouvoir analyser les mécanismes d’action en jeux. Les différentes techniques d’analyse nécessitent d’utiliser le cerveau et le coeur des rats après sacrifice des animaux pour analyses en laboratoire.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données expérimentales déjà publiées. En effet l’activation des cellules cérébrales par la protéine HGF les protégeraient de la mort cellulaire. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie « in vivo » dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme ; et d’autre part le mécanisme d’action de NAH qui n’est pas reproductible « in vitro ».
Réduction
Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. L’imagerie « in vivo » permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Tous les animaux utilisés lors de la phase 1 seront réutilisés dans d’autres projets. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé par un biostatisticien. Nous avons utilisé un test satistique spécifique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. Les animaux sont surveillés de façon rapprochée avec utilisation de grilles de score pour évaluer le bien-être et prise de poids quotidienne (même en l’absence de chirurgie). Ils ont un accès facilité à la nourriture et à l’eau en période post-opératoire.
Choix des espèces
Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Il s'agira de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre. Cette fourchette de poids est par ailleurs celle utilisée dans les études antérieures et sur lesquelles s’appuient notre retour d’expérience et nos statistiques.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur un modèle d’inflammation par injection d’adjuvant complet de Freund chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1800
3 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour le compte de clients pharmaceutiques. Une injection d'adjuvant complet de Freund dans une patte provoque une inflammation douloureuse, certains animaux étant en outre génétiquement modifiés ou injectés deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, avant une mise à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque pour prélèvement d'organes. L'objet est de tester ex vivo des molécules contre la douleur. Le porteur reconnaît que l'adjuvant provoque des douleurs et que les animaux modifiés ne peuvent échapper à leur phénotype, tout en jugeant l'organisme vivant nécessaire.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. Par ailleurs, pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour se faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le Patch-Clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de douleurs induit par une inflammation périphérique. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule a des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies de douleur du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), chaque animal peut être son propre contrôle puisque une seule patte est lésée; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Durée : injections deux fois par jour (6min/injection), trois mois au maximum. Les animaux vigiles seront injectés pour assurer une exposition in vivo. Les contentions répétées génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée, soit intrapéritonéale ou soit intramusculaire. Durée : Hébergés trois mois maximum. Si les animaux sont génétiquement modifiés, ils ne peuvent pas par définition échapper à leur phénotype dommageable. Nous travaillerons uniquement sur des animaux asymptomatiques. Durée : une seule injection (6 min) Ils seront tous injectés, une seule fois, par une solution d’un agent inflammatoire, en sous cutanée dans une patte postérieure. Tous les animaux seront mis à mort par deux techniques, en fonction de leur âge : durée instantanée par décapitation rapide après anesthésie gazeuse ou par perfusion intracardiaque (durée = 3 min) sous anesthésie gazeuse au plus tard 48h après le déclenchement de l’inflammation.
Impact sur les animaux
Notre procédure amène des effets indésirables: *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection d’adjuvant inflammatoire provoque des douleurs ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress pre-mortem important.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, la possibilité que chaque animal soit son propre contrôle diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant l’étape par quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes ou 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et au maximum un mois de temps d’hébergement avant le début de la procédure. Il se fera en en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptômes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses à l’inflammation dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. Toutefois, les symptômes ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limites modifiés pour pallier des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des adultes ou plus âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (douleurs chroniques ou aigues). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.
Evaluation de la fonction musculaire après injection intra-musculaire d’une toxine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 870 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance est déclarée légère. Une toxine est injectée dans un muscle de la patte après incision de la peau refermée par une agrafe, puis la faiblesse musculaire est évaluée en soulevant l'animal éveillé pour observer l'écartement des doigts, sur plusieurs semaines. L'objet est de tester des toxines botuliques destinées au traitement de la spasticité. Le porteur indique que l'injection peut entraîner une perte de poids suivie comme point limite, et affirme que l'efficacité ne peut à ce stade être évaluée que sur l'animal vigile.
Objectifs
Chez l’homme, la toxine botulique est utilisée dans le traitement des maladies neurologiques caractérisées par une contraction exagérée d’un muscle entraînant des troubles des mouvements et/ou de posture qui peuvent être chroniques et douloureux (spasticité des membres, torticolis, le pied bot équin, contractions de la mâchoire, contraction des paupières entraînant la fermeture répétitive et incontrôlée des paupières…). Le traitement consiste en l'injection de petites quantités de toxine botulique dans les muscles atteints empêchant la stimulation du muscle par le nerf associé. La toxine botulique induit alors une faiblesse des muscles hyperactifs injectés. Ce traitement est efficace mais n’agit qu’après quelques jours et doit être renouvelé après plusieurs mois. Des recherches sont donc faites pour améliorer la puissance, la rapidité et la durée d’action des toxines. L’activité des toxines est testée selon un processus qui débute par une évaluation in vitro (mesure de l’activité de la toxine sur sa cible) puis sur des cultures de différents types cellulaires et ensuite différents types de muscles isolés de rongeurs. Le recours aux animaux n’est fait que si les toxines ainsi testées répondent aux critères recherchés. Elles seront alors testées sur le rat. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de toxines sur la fonction musculaire spontanée de la patte en utilisant une méthode largement décrite et utilisée.
Bénéfices attendus
La toxine botulique est efficace dans le traitement de la spasticité mais nécessite des injections régulières. L'amélioration des caractéristiques (puissance, rapidité d'action et durée d'action) des toxines à des fins thérapeutiques permettra une meilleure efficacité.
Procédures
Tout d’abord, le composé ou son solvant est injecté dans un muscle de la patte arrière gauche du rat anesthésié. Cette injection est faite après une petite incision de la peau ceci afin de bien identifier le muscle d’intérêt. L’incision est refermée par une agrafe et suivie lors de la surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux. La faiblesse musculaire spontanée de la patte injectée est ensuite évaluée par simple observation et quantification de l’écartement reflexe des doigts lorsque l’animal éveillé est soulevé (score) 1 fois par jour pendant 5 jours puis éventuellement prolongé 3 fois par semaine pendant maximum 6 semaines. Un suivi pondéral quotidien est réalisé.
Impact sur les animaux
L'injection des toxines peut entrainer, à certaines doses, une perte de poids des animaux : un suivi pondéral journalier est mis en place pour suivre ce point limite.
Devenir
L'effet des toxines sur l'animal n'étant pas prévisible, il n'est pas envisageable de réutiliser les animaux à la fin de la procédure. Tous seront mis à mort.
Remplacement
Nos activités s’inscrivent dans le respect de la règle des « 3R » pour l’expérimentation animale. Si des méthodes alternatives existent lors des phases précoces de développement d’une toxine (une évaluation in vitro puis sur cultures cellulaires et ensuite sur muscles isolés de rongeurs), l’avancement de la caractérisation de la molécule d’intérêt ne permet pas à l’heure actuelle de remplacer l’étude de son efficacité chez l’animal vigile.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est Réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes.
Raffinement
Notre activité permet néanmoins de Raffiner les conditions d’utilisation des animaux en les hébergeant conformément à la réglementation dans des salles à atmosphère contrôlée (température : 22 ± 2°C) sous un cycle jour/nuit de 12 heures (lumière de 06:30 à 18:30) avec eau et nourriture (Rat/Souris Entretien A04 Safe, Epinay/Orge, France) ad libitum. Un enrichissement du milieu (briquettes à ronger et tunnel) est apporté aux animaux. Les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir de l’injection de toxine et un suivi pondéral journalier sera mis en place.
Choix des espèces
L’utilisation du rat se justifie par la taille et la réponse de l’animal qui permet une évaluation de l’effet de la toxine ainsi qu’une injection précise dans le muscle péroneus. Le modèle décrit dans ce projet est largement utilisé chez le rat pour lequel le matériel est adapté et des résultats de référence disponibles. Des rats adultes de poids 170-190g le jour de l’injection de toxine sont utilisés. A ce stade les animaux permettent: * Une manipulation facile * Leur taille est bien adaptée aux matériels utilisés * L’évolution de leur prise de poids facile à suivre L’utilisation d’une gamme de poids restreinte contribue à réduire la variabilité des résultats et ainsi le nombre d’animaux utilisé. Cette gamme de poids est utilisée dans l’article référence pour ce test.
Evaluation ex vivo des effets pharmacologiques de molécules sur des animaux génétiquement modifiés ou traités ou opérés grâce à des explants de cerveau et/ou de moelle épinière de rongeurs sur la base de mesures électrophysiologiques.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1500
6 300 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique. Selon les cas, ils reçoivent des injections deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, sont des lignées génétiquement modifiées ou ont été opérés, avant d'être mis à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélèvement de tissus nerveux. L'objet est de mesurer ex vivo l'effet de molécules candidates sur le système nerveux. Le porteur affirme que des réseaux neuronaux "plus physiologiques" sont nécessaires et qu'aucune reproduction in silico n'est possible.
Objectifs
Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleur appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le developpement de modèle rongeur génétiquement modifé (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’evaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ ou de cellulles nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le PATCH = un enregistrement à l'echelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques (composés « LEADS ») en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule, le cas échéant - afin de pouvoir déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire. Notre direction scientifique valide une stratégie d’étude, comportant plusieurs conditions, en se basant sur des données bibliographiques.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphallique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développment de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.
Procédures
Procédure 1, par étude, 60 animaux vigiles seront injectés deux fois par jour. Ces injections seront réalisées par du personnel entrainé, qualifié et du matériel adapté. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne un mois. L’animal sera habitué à la contention, limitant le stress lors des gestes à venir. La plus grande vigilance de suivi sera portée pour éviter les problèmes dus aux injections répétées. 2700 animaux maximum entreront dans les 5 ans du projet. La Procédure 2 permettra de phénotyper 60 animaux génétiquement modifiés par étude, 2700 animaux sur 5 ans. Nous travaillerons sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Procédure 3 : 900 animaux subirront une chirurgie par notre partenaire, 15 jours avant leur envoi. Avant réception dans nos locaux, les animaux auront pleinement récuperer leur état de santé. En fonction de l’opération subie, les animaux devront être isolés depuis leur intervention jusqu’à leur MAM et donc être isolés 3 semaines. Tous ces animaux seront mis à mort par deux techniques: *- en fonction de leur âge, l’animal sortira de la zone d’hébergement par décapitation rapide sous anesthésie gazeuse; *- certains animaux sevrés seront mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthéise gazeuse.
Impact sur les animaux
Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables: La procédure 1 peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. Nous habituerons les animaux concernés à ces manipulations avant leur entrée dans le projet; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. Pour éviter, par exemple, les inflammations génerées, nous varierons les sites d’injection autant que possible et assurerons une surveillance précise des animaux pour limiter la persistance d’effets indésirables provoqués en suivant nos règles de point limites. Nous utiliserons, aussi, le matériel d’administration adapté à l’espèce, au poids et l’âge des animaux ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important. Elle sera réalisée par du personnel dûment formé et quanlifié régulièrement avec utilisation d’un analgésique ; La procédure 2 peut par : *-La nature des animaux GMs, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptômatiques. Nous adapterons, tout de même, notre surveillance et nos points limites en fonction des symptômes possibles pout anticiper toute apparition précoce de douleur, qui ne devraient pas se declencher avant leur mise à mort et nos enrigistrements dans ce projet ; La procédure 3 peut par : *-la nature des opérations faites sur les animaux reçus et opérés par notre partenaire, induire des problèmes de type post-opératoire. Nous contrôlerons avec notre partenaire que les animaux opérés sont stables et aptes à être transportés, deux semaines après leur chirurgie. De plus, les conditions d’hébergement ainsi que les points de surveillance spécifique enrichieront nos points limites et nos points de surveillance au cours des 3 semaines d’hébergement des animaux. .
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Tous les animaux génétiquement modifiés de la procédure2 et tous les animaux opérés de la procédure 3 sont mises à mort pour enregistrement électrophysiologique, ex vivo. Ces mis à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégéneratives et nos protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale que nous maitrisons.
Remplacement
Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ».Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.
Réduction
Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato encephalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne sgnificativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils béneficent d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le founisseur ou le partenaire. Pour les animaux opérés, ils seront adaptés au mieux et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. Les animaux utilisés en Procédure 1 seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur inoccuité. Les animaux seront surveillés deux foix par jour et pesés. Pour la procédure 2, les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptomes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deça de la limite préetablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Pour les animaux opérés (Procédure3), les conditions d’hébergement seront transmises par notre partenaire. Les animaux seront reçus après une complète récuperation de la chirurgie. Toutefois, un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera exercé. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération.
Choix des espèces
La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée ou opérée (Procédure 2 et Procédure 3) fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques ou ayant pleinement récupérés de leur chirurgie. Toutefois, la connaissance des phénotypes et chirurgies ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limite modifiés pour palier à des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux. Les animaux, des procédures 1 et 3, seront exclusivement des animaux post sevrage. L’âge des animaux de la procédure 2 dépendra de l’âge de l’apparition des symptômes de la maladie.
DU microchirurgie avec mise au point d’un modèle expérimental d’anévrisme
- Enseignement supérieur
1 310 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, pour l'entraînement de chirurgiens à la microchirurgie, une partie des procédures étant menée sous anesthésie sans réveil. Jusqu'à 60 rats servent à mettre au point un modèle d'anévrisme de l'aorte, les autres à des séances de formation, dix chirurgiens réalisant chacun vingt-cinq séances par an sur cinq ans. Les animaux sont euthanasiés par surdosage anesthésique intracardiaque, et le porteur déclare n'attendre "aucune nuisance". Il affirme que la pratique sur le vivant est "indispensable" et qu'un "organisme entier et vivant" est nécessaire, le calibre des vaisseaux du rat se rapprochant de celui des vaisseaux humains.
Objectifs
Le Diplôme d’Université (DU) de microchirurgie a pour objectif de former des chirurgiens et/ou internes voulant acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie nécessaires à certaines spécialités chirurgicales (en discipline humaine : chirurgie des lambeaux, chirurgie de la main, neurochirurgie, chirurgie de la face, chirurgie pédiatrique, notamment et aussi dans les disciplines vétérinaires). Dans le cadre de cette formation (DU de microchirurgie), nous souhaitons également mettre en place une procédure supplémentaire et nouvelle au DETERCA pour l’entrainement de nos apprenants : le modèle anévrisme. Il s’agit d’induire sur l’artère aorte du rat un anévrisme (malformation artérielle) dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’anévrisme des artères cérébrales chez l’Homme. Ce modèle est connu, déjà utilisé dans d’autres centres. Il permet d’entrainer un apprenant à la prise en charge microchirurgicale d’un anévrisme.
Bénéfices attendus
En effet, afin reproduire les techniques chirurgicales en conditions réelles et pouvoir vérifier ces dernières, il est nécessaire d’avoir un organisme entier et vivant. Le choix du modèle rat est dû au fait que le calibre des vaisseaux du rat correspond au calibre des vaisseaux humains nécessitant des techniques de microchirurgie pour être appréhendés. Ainsi les chirurgiens peuvent s’entrainer sur les artères fémorales, l’aorte ou encore la carotide du rat. Pour cette formation, nous aurons deux types de procédures, une première afin de mettre au point le modèle anévrisme et une seconde pour le DU microchirurgie en général. Le modèle anévrisme est une nouveauté que nous souhaitons intégrer aux techniques déjà existantes du DU microchirurgie.
Procédures
Pour la mise au point du modèle anévrisme, les rats subiront une intervention chirurgicale afin de créer l'anévrisme. Le tout sous anesthésie et analgésie adaptée afin de réduire au maximum la souffrance de l'animal. Ceci concerne au maximum 60rats (procédure 1). La durée maximale de l'intervention est de 3h.
Impact sur les animaux
Aucune nuisances ou effets indésirables sont attendus sur les animaux pour ces procédures.
Devenir
A la finalité des deux procédures, les animaux seront euthanasié par surdosage anesthésique en intracardiaque.
Remplacement
Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. La pratique sur le vivant est indispensable pour acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie, nécessaires dans de nombreuses spécialités chirurgicales pour pouvoir ensuite, une fois le diplôme obtenu, les appliquer sur l‘humain. L'anatomie vasculaire du rat est un critère important afin de rendre la procédure la plus réaliste possible. Ces animaux sont opérés sous anesthésie générale.
Réduction
: Pour la mise au point du modèle anévrisme, nous prévoyons un total de 60 rats sur 5 ans. Nous procéderons par série afin de mettre au point ce modèle en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, si un nombre de rats inférieur à ce qui est prévu nous permet d’obtenir ce modèle anévrisme, nous utiliserons les animaux restants pour la formation au DU microchirurgie. Le nombre total d’animaux prévu pour le Diplôme d’Université est calculé sur 5 ans avec au maximum de 10 chirurgiens inscrits par an. Cette formation est composée de 25 séances d’entrainement par chirurgien par an. Soit pour 5 ans : 10x25x5 = 1250 rats. Ainsi un nombre total de 1310 rats au maximum seront utilisé pour ces deux procédures. Ceci a été calculé de sorte à réduire au maximum l’effectif tout en ayant un nombre suffisant d’étudiants pour ouvrir cette formation. Ce nombre sera revu à la baisse et uniquement à la baisse en fonction du nombre de chirurgiens inscrits. De plus, n’ayant pas de critère génétique, d’espèce ou de sexe (l’anatomie reste la même), nous utilisons au maximum des animaux de réforme, ayant servis pour d’autres recherches. Toujours dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, les chirurgiens peuvent réaliser plusieurs techniques sur un même rat anesthésié.
Raffinement
Les rats utilisés pour cette formation proviennent d’un éleveur agrée et sont hébergés par groupe social de quatre. Chaque cage dispose à minima d'un tunnel comme enrichissement. Lors de la chirurgie, les rats sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique adaptée. Ceci, dans le but de proscrire la souffrance et douleur de l’animal. En effet, du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie durant toute l’intervention. De plus, des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal lors des chirurgies et au réveil. Pour la procédure de création de l’anévrisme, l’animal est réveillé avec un suivi analgésique post-opératoire (analgésie, réhydratation…). A la fin du TP de microchirurgie l’animal n’est pas réveillé.
Choix des espèces
Le calibre des veines et des artères du rat est proche de celui des vaisseaux de petite taille chez l'homme. La carotide du rat est, par exemple, proche de l'artère digitale de l'homme, indispensable pour la chirurgie reconstructrice de la main (réimplantation de doigts). Dans l’idéal, nous utilisons des jeunes adultes de 300gr environ. Mais l’anatomie vasculaire étant presque similaire d’un jeune rat à un rat plus âgé, cela dépend plus principalement des rats de réforme qui nous sont proposés (nous avons déjà utilisé des rats plus mature pesant environ 700gr).
IRM à champ terrestre pour la détection directe d’activités enzymatiques dans des modèles inflammatoires murins
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en trois groupes, ils reçoivent des injections destinées à provoquer une pancréatite, une inflammation pulmonaire ou une inflammation rénale, puis un agent de contraste avant un passage à l'IRM, et sont euthanasiés sans réveil pour prélèvement des organes. Le porteur indique que ces modèles inflammatoires peuvent atteindre la respiration, la mobilité et l'alimentation, avec une mise à mort déclenchée dès une perte de poids de 15 pour cent. Il conclut qu'il est "indispensable" de recourir aux animaux, ces pathologies n'étant pas selon lui reproductibles in vitro.
Objectifs
Ce projet ouvre une nouvelle voie en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) en initiant le concept d’« imagerie enzymatique » in vivo pour une meilleure compréhension de la physiologie humaine, la détection précoce et le pronostic des maladies, et le suivi de traitements thérapeutiques. L'objectif principal est de dépasser les frontières actuelles en permettant de visualiser directement l'activité d'une enzyme dans un tissu pathologique.
Bénéfices attendus
1-De nouveaux agents de contraste possédant une forte spécificité d’action au niveau tumoral, seront développés et permettront de suivre l’activité enzymatique tumorale 2- Ceci permettra la détection de façon précoce de maladies inflammatoires chroniques pulmonaires : en effet par exemple actuellement les pathologies chroniques pulmonaires ne sont détectées que lorsque les destructions du tissu pulmonaire sont irréversibles (Bronchopneumopathie chronique obstructive (COPD), mucoviscidose). Pour les pancréatites chroniques, aucun test n’est fiable pour le moment. 3- Ce projet permettra aussi de valider l'utilité de l'IRM à champ terrestre, en termes de coût, de facilité de transport et de consommation énergétique.
Procédures
Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale. Cent vingt animaux recevront 10 injections (une par heure) d'une modécule pro-inlfammatoire pour créer une inflammation du pancréas (pancréatite) puis une injection d'agents de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés. Cent vingt animaux recevront une injection de membranes bactériennes pour créer une inflammation pulmonaire puis une injection d’un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés. Cent vingt animaux recevront une injection d'une molécule pro-inflammatoire pour créer une inflammation rénale puis une injection d'un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Des nouveaux agents de contrastes seront injectés dans les animaux. Du fait de leur haute spécificité d’action au niveau tumoral, ceux-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à leur présence. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. Cependant, les modèles inflammatoires peuvent atteindre le bien-être animal en terme de respiration, mobilité, alimentation. Il est important de noter que l’examen IRM n’a jamais montré de nuisance.
Devenir
Cette euthanasie est nécessaire pour extraire les organes et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence des neutrophiles dans les sites inflammatoires et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.
Remplacement
Nous avons déjà réalisé des tests de validation de la méthode in vitro où seulement l’enzyme et l’agent de contraste étaient présents. Il est désormais indispensable d’utiliser des animaux, car nous souhaitons détecter une activité enzymatique, liée à une inflammation ou une pancréatite, dans un système complexe. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent soit un système immunitaire complet soit un organe fonctionnel dans lequel une situation pathologique doit être provoquée. De plus, nous souhaitons évaluer l’efficacité de détection de nouveaux agents de contraste, qui dépend de leur bio-distribution, du temps de demi-vie dans le sang, de la localisation de l’inflammation, de la voie d’injection, etc.. Ceci ne peut être évalué qu’en condition in vivo. Cette étude ne peut pas être réalisée chez l’homme car la technologie nécessaire à la fabrication d’une IRM à champs terrestre n’existe pas pour des études humaines. De plus, les agents de contrastes sont encore expérimentaux et donc ne peuvent pas être injectés directement chez l’homme.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées en amont, pour étudier l'effet des agents de contraste sur des neutrophiles en culture. De plus la méthode a été déjà évaluée à 0.2 tesla. Le nombre d'animaux a été évalué à 10 rats par agent de contraste, afin d'avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Ces résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, coton, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésie gazeuse, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les procédures permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. Du gel olphtalmique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Pour limiter la souffrance des animaux développant les modèles inflammatoires, ils seront euthanasiés dès que l’examen IRM sera terminé, sans réveil préalable. Entre la mise en place des modèles inflammatoires et l’examen IRM, des points limites terminaux ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux : modification de la respiration (respiration orale/abdominale, respiration difficile/pénible et de forte amplitude), atteinte de la mobilité (marche sur la pointe des pieds, titubation, léthargie), gonflement abdominal, perte de poids de plus de 15% en 2-3 jours (pour le modèle inflammatoire rénal). Pour cela, les animaux seront pesés tous les jours. De la nourriture sous forme de gel sera déposée dans la cage si les animaux sont affaiblis ou si une perte de poids de 10% en 2-3 jours est constatée (pour les modèles inflammatoires rénaux). Lors du développement de la pancréatite, les animaux seront pris en charge par un analgésique (en pré- et post-injection), et ce, jusqu’à la fin du protocole. Pour les autres pathologies, dès les premiers signes de souffrance détectée par des signes cliniques (poil hérissé, prostration, difficulté respiratoire..), les animaux recevront un analgésique. Si les signes perdurent plus de 12h dans le cas de l’inflammation pulmonaire ou 2 jours pour l’inflammation rénale, les animaux seront immédiatement transférés pour un examen IRM avant leur euthanasie. Les animaux seront surveillés au minimum 1 fois par jour par le porteur du projet, ou le zootechnicien ou les doctorants et post-doctorants formés.
Choix des espèces
Nous débuterons le projet sur des rats car leur taille est plus importante que les souris et permet donc d'obtenir plus de signal. L’IRM à champs terrestre est en effet beaucoup moins sensible que l’IRM à hauts champs. De plus, le développement instrumental est moins difficile pour des rats que pour des souris. De plus, de nombreuses pathologies bien connues dans la littérature inflammatoires pourront y être développées. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), car le développement des organes est terminé. De plus, plus les animaux sont gros, plus la sensibilité de l’IRM augmente. Cependant, les rats ne seront utilisés que jusqu’à 4 mois (environ 300g), car ensuite ils deviennent trop imposants pour rentrer dans l’antenne sans être trop serrés et le vieillissement pourrait interférer avec les résultats.
Effets in vivo des inhibiteurs de DYRK1A sur la prolifération des cellules bêta du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 rats, dont des rats rendus diabétiques, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant quatre semaines un inhibiteur par injection, voie orale ou patch, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires par section du bout de la queue et des tests métaboliques, avant d'être tués pour analyse du pancréas. Le projet vise une "preuve de concept" pour une molécule candidate contre le diabète. Le porteur n'attend "aucun effet indésirable" hormis la douleur des piqûres et des coupures de queue, et affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement".
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique associée à une diminution de la masse des cellules β du pancréas qui sécrètent l’insuline. La régénération des cellules béta est désormais considérée comme une stratégie thérapeutique de premier plan. Au cours des dernières décennies, des études ont été menée pour identifier les cibles moléculaires pouvant être modulées afin de restaurer la masse β cellulaire et parmi elles l'enzyme DYRK1A. Nous proposons d’étudier, in vivo, un nouvel inhibiteur de DYRK1A, plus puissant et plus spécifique que ceux actuellement disponibles pour la recherche et ayant comme particularité d’être actif sous différentes voies d’administration ( intra-péritonéale, transdermique et orale). Durant 4 semaines nous administrerons, selon ces trois voies, deux doses de cet inhibiteur à deux modèles animaux, le rat Wistar non diabèrique et le rat Goto Kakizaki ( GK) diabétique. Nous analyserons par des tests in vivo l'évolution de la glycémie et de l’Insulinémie. Enfin, à l’issue des traitements, les animaux seront sacrifiés et une étude par des approches d'immunohistochimie sera menée pour analyser les aspects structurels et fonctionnels du pancréas .
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera la livraison d'une preuve de concept solide indiquant que l’inhibiteur EMD92 est un candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée sur les patients diabétiques. En plus de construire une meilleure connaissance de l'implication de DYRK1A dans la régulation de la croissance des cellules β au cours du diabète, des résultats positifs sur les rats diabétiques GK nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique « curative », capable de prévenir la progression du diabète, grâce à la restauration d'une masse cellulaire β fonctionnelle
Procédures
Dans ce projet des rats mâles Wistar et GK âgés de 8 semaines recevront les molécules d'intérêt selon 3 voies d’administration et durant 4 semaines : -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront une injections intrapéritonéales (IP) 1 jour sur 2, -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront par voie orale (dans l’eau de boisson) -32 rats wistar et 32 rats GK recevront par diffusion transdermique (par patch). Un prelèvement de sang de 10 microlitres sera réalisé une fois par semaine jusqu'a la fin du traitement. A l'issue du traitement tous les animaux ( 96 rats wistar et 96 rats GK) subiront des tests métaboliques durant lesquels il recevront une injection soit de glucose pour mesurer la tolérance à cette molécule, soit d'insuline pour etudier leur sensiblité à cette hormone. Au cours du test de tolerance au glucose 4 prélèvements de sang seront faient de chacun 10 microlitres.
Impact sur les animaux
Les molécules étudiées ne sont pas censé induire de toxicité, aucun effet indésirable n’est donc attendu sur les animaux. De plus, ces molécules ne pouvant pas traverser la barrière hémato-encéphalique, aucune neurotoxicité ne devrait être observée. Par contre de legers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure d'aiguille lors de l'injection en intrapéritonéale des molécules, du glucose et de l'insuline pendant les tests in vivo ainsi qu'à la coupure de l'extrémité de la queue lors des prelèvements de sang.
Devenir
Aprés le traitement à l'EMD tous les animaux sont gardés en vie. Aprés les tests métaboliques les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Pour ce projet il n'existe pas de méthode de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d'appréhender les paramètres structurels du pancréas, à savoir les interactions entre les cellules bêta et les cellules acinaires/canalaires qui entrent dans la constitution du pancréas. Le choix du rat Wistar et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'il présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme
Réduction
Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur. Les résultats seront analysés et validés par des tests statistiques adaptés : Mann-Whitney, Wilcoxon ou Anova (différences significatives P
Raffinement
Pour le traitement nécessitant une injection ainsi que pour les tests in vivo, les animaux sont préparés à la contention par les expérimentateurs. La douleur liée à l'injection est celle du niveau d'une piqure de l'aiguille. Ces méthodes sont en accord avec la classe lègère des procédures.
Choix des espèces
Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge, les rats GK développent le diabète et les cellules béta du pancréas sont altérées. Le traitement à l’EMD92 a pour but de rétablir cette défection en augmentant la masse béta cellulaire. Pour les rats Wistar, le traitement à l’EMD92 indiquera l’effet de la molécule sur les cellules béta d’un pancréas sain.