Rats
Rôle de la vasopressine et de l’apeline dans la prééclampsie chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Livrées "supposées gestantes" au deuxième jour de gestation, 4 664 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour provoquer chez elles une prééclampsie, une hypertension de la grossesse, et tester sur elles des traitements. Elles subissent une chirurgie, la pose d'une pompe osmotique sous la peau ou la ligature des artères utérines, 18 heures en cage à urine, douze jours de mesures quotidiennes de la pression par brassard à la queue, une méthode que le porteur dit "légèrement stressante", et des injections sous-cutanées quotidiennes pendant quatre à douze jours ou une injection intraveineuse. Toutes sont tuées au CO2 dans le dernier tiers de leur gestation, pour récupérer leur sang par ponction cardiaque, leurs fœtus, leurs placentas et leurs reins. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d'un organisme entier", aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la prééclampsie.
Objectifs
La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rat. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 12 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rates gestantes, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rates gestantes jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.
Devenir
Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation par euthanasie gazeuse au CO2 à la fin de chacune des procédures expérimentales afin de récupérer du sang par ponction cardiaque et des tissus d’intérêts (fœtus, placentas, reins) pour des analyses complémentaires.
Remplacement
Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.
Réduction
Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rongeurs par condition différentes. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.
Choix des espèces
Le rat est une espèce pertinente pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.
Evaluation de la pharmacocinétique (absorption, distribution, métabolisme et élimination) de composés administrés à l’animal
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1000
7 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter veineux, des prélèvements sanguins répétés, un séjour en cage à métabolisme sur sol grillagé que le porteur reconnaît de dimensions inférieures à la réglementation, puis un prélèvement terminal sous anesthésie. Le projet sert à mesurer le devenir de médicaments candidats dans l'organisme, en partie dans un cadre de formation professionnelle. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode substitutive" aux études pharmacocinétiques in vivo.
Objectifs
Après une phase de sélection basée sur des modèles informatiques et des tests cellulaires, les molécules répondant aux critères des programmes de recherche en termes d’efficacité et de sélectivité par rapport aux cibles étudiées, sont évaluées en utilisant des modèles in vitro dérivés de cellules ou de tissus animaux. Les molécules retenues sont ensuite caractérisées in vivo pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques, dans un premier temps, dans les modèles utilisés en pharmacologie ou en toxicologie.
Bénéfices attendus
Les molécules retenues sont caractérisées in vivo pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques, dans les modèles utilisés en pharmacologie, puis au fur et à mesure de la progression de la molécule dans le développement et en fonction du type de molécules testées (molécules biologiques ou petites molécules chimiques), de l’activité pharmacologique du produit et des espèces animales qui seront utilisées en toxicologie
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : sang : 3 à 6 sur 24h ou bien 9 à 11 sur 28 jours dans le respect des volumes cumulés compatibles avec la pratique vétérinaire, urine-fécès : sur une durée de 24 à 168h maximum Procédure chirurgicale pour pose de cathéters veineux : environ 1h/animal Prélèvements terminaux sur animaux anesthésiés : sang, tissus, liquide céphalo-rachidien.
Impact sur les animaux
Les contraintes/douleurs attendues sont : - la mise à jeun : stress léger de courte durée suite à la mise à jeun. - l'implantation chirurgicale d’un cathéter veineux : douleur per et post opératoire et inconfort post-opératoire. l'administration du composé à tester : stress léger et inconfort transitoire. - le prélèvement urinaire en cage à métabolisme durée de 24 à 168h maximum : stress et inconfort lié à l’individualisation (rat uniquement), dimensions de la cage inférieures à la règlementation et sol grillagé. les prélèvements sanguins répétés : stress et inconfort de courte durée. - les prélèvements sous anesthésie terminale : douleur en cas de laparotomie. - le recueil biliaire après réception des animaux cathétérisés du fournisseur agrée sur 48h max : stress et inconfort car acclimatation réduite, dimensions de la cage inférieures à la règlementation et éventuellement sol grillagé. - le développement d’une pathologie (souris porteuses de tumeur, souris immunodéprimées, souris transgéniques ou non modèles de pathologie d’intérêt) : gêne lors de la croissance de la tumeur, infections opportunistes, impact sur le bien-être animal en fonction du modèle.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les tissus et fluides pour évaluer la diffusion du produit étudié dans l’organisme.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode substitutive aux études pharmacocinétiques in vivo. Les tests in vitro et in silico permettent d’étudier certains aspects de la pharmacocinétique (absorption, métabolisme) mais ne peuvent pas fournir l’ensemble des éléments caractérisant le devenir du médicament dans un organisme vivant depuis son absorption jusqu’à son élimination
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules testées in vivo sont sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires et informatiques. Le nombre d’animaux utilisés dans les études pharmacocinétiques est basé sur les lignes directrices ICH et se limite au strict nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique. Dans le cas des études non réglementaires, une analyse biostatistique réalisée par un expert interne permet d’optimiser les effectifs et les designs d’étude. Par ailleurs, le développement de méthodes de dosage adaptées à des micro-volumes de sang permet de réaliser des prélèvements répétés chez un même animal - souris ou rat - et d’utiliser ainsi moins de rongeurs dans ce projet. La manipulation, les techniques d’administration et de prélèvement sont réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Raffinement
Les conditions d’utilisation des animaux sont encadrées par des recommandations éthiques internes. Les animaux sont hébergés sur de la litière avec enrichissement du milieu. Aliment et eau sont distribués ad libitum et la pièce est éclairée selon un cycle 12h-12h. L’observation des animaux est faite quotidiennement par le personnel de l’animalerie et de l’étude dûment formé à la reconnaissance des signes cliniques en lien avec les services vétérinaires. Les prélèvements terminaux et au sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie et uniquement lorsqu’aucune autre voie de prélèvement est appropriée. Les cathétérisations sont réalisés sous anesthésie et analgésie adaptées et selon les techniques aseptiques. Les modèles transgéniques ou porteurs de tumeurs dont l’état général peut se dégrader sont suivis cliniquement avec l’application de point limites spécifiques
Choix des espèces
Concernant les études de pharmacocinétiques réglementaires, les espèces utilisées sont les mêmes que celles étudiées dans les études de pharmacologie de sécurité ou de toxicologies. Dans ce cadre, le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ICH, CHMP, FDA…) sur des bases scientifiques telles que : Les données de pharmacocinétique et métabolisme inter espèces Les résultats des études de toxicologie La cible thérapeutique visés Le(s) véhicule(s) envisagé(s) Dans le cas d’études non règlementaires, les études de pharmacocinétique sont effectuées pour caractériser des composés d’intérêt dans les modèles animaux en support de l’activité pharmacologique. Dans ce cadre, le choix de l’espèce dépend de la cible thérapeutique étudiée et des modèles pharmacologiques développés par les équipes de pharmacologie, à ce stade précoce essentiellement de souris ou des rats.
Recherche translationnelle préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1200
7 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés candidats et des agents inducteurs par diverses voies pendant deux semaines, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever des tissus. Le projet vise à cribler de nouvelles molécules anti-inflammatoires dans le cadre d'un programme de recherche pharmaceutique. Le porteur annonce peu de signes cliniques hormis des inflammations locales, et affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" une fois les molécules validées in vitro.
Objectifs
On dénombre environ 80 maladies immuno-inflammatoires telles que le psoriasis, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. On estime que 5 à 8% de la population mondiale est touchée par une maladie auto-immune, caractérisée par une réponse inadaptée du système immunitaire qui se retourne contre les propres tissus du patient. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime est de pouvoir supprimer spécifiquement le mécanisme à l’origine d’une maladie auto-immune, sans impacter le bon fonctionnement du système immunitaire. Ces nouvelles molécules fourniront aux patients des thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices ciblées qui pourront grandement améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront des agents biologiques et composés par diffrentes voies d'administration définies par la réglementation. L'administration des composés (durée = 1 min/animal) se fera 1 à 2 fois par jour sur une durée de maximale de 2 semaines. L'induction avec des agents biologiques (durée = 1 min/animal) se ferra 1 à 2 fois au cours de l'étude de 2 semaines. Un à deux prélèvements sanguins seront également effectués sur animaux préalalement anesthésiés (durée = 2-3 min/animal) pour suivre la pharmacocinétique des composés testés sur l'ensemble de l'étude de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux ne développeront pas de signes cliniques notoires hormis des inflammations locales légères.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour collecte de tissus
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec du materiels de nidification. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé. Des analgésiques seront utilisées en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature.
Formation du personnel et des nouveaux entrants au sein de notre établissement à la mise en œuvre des méthodes de prélèvements sanguins
- Formation professionnelle
Rats : 500
750 animaux non-humains, 250 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil. Chaque animal enchaîne plusieurs techniques de prélèvement sanguin apprises par le personnel, de la queue à la veine sous-maxillaire puis au sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal au cœur ou à l'aorte sous anesthésie. Ce projet ne produit pas de connaissances mais entraîne les expérimentateurs, avec des animaux surnuméraires d'élevages. Le porteur présente cette formation comme un moyen de "participer au bien-être animal" et affirme que le remplacement par un modèle in vitro n'est pas possible.
Objectifs
Ce projet porte sur la formation technique et la formation continue du personnel amené à utiliser les animaux dans les procédures expérimentales, sur l’apprentissage de nouvelles techniques et la mise à niveau des techniciens déjà formés. Les formations utilisant les animaux visent à améliorer les méthodes expérimentales, à assurer la qualité scientifique et à réduire les dommages subis par les animaux. Toutes les techniques réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis avec le vétérinaire seront respectés. Les conditions suivantes devront être respectées : - Les animaux seront en bon état général - Ce sont les animaux non-utilisés dans des procédures (animaux surnuméraires provenant d’élevages non génétiquement modifiés).
Bénéfices attendus
L’expérimentation animale nécessite une maitrise de différentes techniques de prélèvements. Il est important que les expérimentateurs connaissent parfaitement les techniques et puissent effectuer les prélèvements de façon précise et rapide afin d’éviter tout stress et douleur à l’animal. La formation de toutes les personnes concernées par ces processus est cruciale Cette demande de projet est faite pour fournir des informations correctes, complètes, à jour et pertinentes, accompagnée d’instructions adéquates afin de former de la meilleure façon le personnel et donc participer au bien-être animal. Dans cette demande de projet nous détaillerons les différents prélèvements effectués au sein de notre animalerie. Ces procédures seront appliquées lors des séances de formation et enseignées aux utilisateurs de l’animalerie afin de s’assurer de la bonne formation des personnes et donc de s’assurer que les prélèvements seront faits correctement et n’entraineront pas de douleur ou de stress chez l’animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang en respect avec la réglementation animale. Toutes les souris seront intégrées à la procédure 1« prélèvement sanguin au bout de la queue chez la souris et le rat » , procédure légère sans anesthésie, 5 prélèvements à une semaine d'écart. Elles intégreront ensuite la procédure 2« prélèvement sanguin à la veine submandibulaire chez la souris » légère sans anesthésie, 2 prélèvements à une semaine d'intervalle, puis la procédure 3 " prélèvement sanguin au sinus rétro orbital chez la souris et le rat »modérée avec anesthésie, 4 prélèvements avec une semaine d'intervalle puis la procédure 4 « prélèvement sanguin intracardiaque chez la souris et le rat » sans réveil sous anesthésie, 1 prélèvement terminal. Un premier lot de 250 rats intègreront la procédure 2 «prélèvement sanguin à veine submandibulaire chez la souris » , modérée sous anesthésie et ensuite la procédure sans réveil 4 « prélèvement sanguin intracardiaque chez la souris et le rat »sous anesthésie, un deuxième lot de 250 rats intègreront la procédure 1« prélèvement sanguin au bout de la queue chez la souris et le rat » , légère sans anesthésie puis la procédure sans réveil 5 « prélèvement sanguin à l’aorte abdominale chez le rat » sous anesthésie, 1 prélèvement terminal. Les prélèvements décrits dans les procédures 1,2 et 3 sont des prélèvements courts d'environ 30 secondes par prélèvement. Les prélèvements dans les procédures 4 et 5 sont des prélèvements terminaux d'environ 1 minutes.
Impact sur les animaux
Afin de diminuer au maximum tout stress à l’animal, toutes les procédures sans réveil seront faite sous anesthésie générale faite par un une personne formée et validée (enseignant)
Devenir
Les animaux seront utilisés dans une des autres procédures du projet en premier et seront ensuite utilisés dans une des procédures de classe sans réveil du projet.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de former les utilisateurs aux différentes techniques de prélèvements. Le remplacement des animaux par un model in vitro n’est pas possible
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a était réduit au maximum pour qu’un utilisateur puisse maitriser une technique
Raffinement
Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ces formations. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (maximum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies. Toutes les manipulations sont effectuées dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Toutes les manipulations et anesthésies se font dans une pièce dédiée et non pas dans la pièce d’hébergement.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisés dans l’expérimentation animales et sont les deux seules espèces hébergés au sein des animalerie du CSGA Les animaux auront un âge différent selon les procédures effectuées. L’âges des animaux doit varier afin de former les utilisateurs aux manipulations et aux prélèvements sur des animaux de tailles, de poids et de morphologies différentes.
Étude des effets de la transplantation de « tissu adipeux centrifugé », après lésion médullaire chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière qui le prive de ses fonctions urinaires et motrices, avant d'être tué pour prélever la moelle et l'analyser. Le porteur suit la douleur avec une grille faciale et prévoit des massages vésicaux quotidiens et une antibiothérapie, la perte des fonctions vésicales étant importante. Il présente le projet comme la démonstration de la "véracité" d'une méthode déjà utilisée en Chine, avec l'espoir lointain de faire retrouver l'usage des jambes à des patients.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de montrer l'efficacité d'injection de cellule en provenance de "tissus adipeux", dans un modèle lésionnel de moelle épinière sur le rat. Cette étude vise à prouver l'intéret de cette méthode, déja utilisée en chine et à en démontrer toute la véracité.
Bénéfices attendus
les bénéfices pour les patients seraient de retrouver l'usage des membres inférieurs.
Procédures
Les animaux auront une intervention chirurgicale de lésion de moélle épinière, cette opération dure 20 minutes et est réalisée sous anesthésie générale et sous morphinique (buprecare). Des tests Locomoteurs sont également réalisés, les animaux sont entrainés et ne subissent aucune contrainte physique . Pour éviter tout stress, les tests sont réalisés par une personne qualifiée.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont mulitiples, l'animal perdra ses fonctions vésicales et fonctionnelles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés avec une dose léthale d'Euthoxin, associée à une injection de morphinique (Buprecare) en IP et ensuite, un prélevement de moelle épinière sera effectué, afin de faire une évaluation histologique.
Remplacement
Le rat est un modèle où les évènements cellulaires qui suivent la lésion médullaire miment ceux retrouvés chez l’Homme. En effet, chez le rat la lésion médullaire entraine la formation de cavités dépourvues de toute cellule. De plus, le rat ne présente pas de récupération spontanée. L'utilisation de ce modèle animal est absolument indispensable, afin d'établir, selon un cahier des charges de l'IRME, une étude sur une thérapie adopté chez l'homme ( voir les informations sur la justification).
Réduction
Nous avons utilisé un nombre minimal d'animaux, afin que l'étude sur des différents plans (histologique, statisitique) puisse se dérouler sans emconbres. Le nombre d’animaux a été évalué à partir des études précédentes, à savoir que les expériences histologiques seront effectuées avec 5 à 10 animaux par groupe et celles concernant la récupération fonctionnelle seront effectuées avec 10 à 20 animaux par groupe. C’est pourquoi nous comptons opérer 40 animaux. Des tests statistiques non paramétriques de type Mann Whitney seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=5 à 10 par groupe.
Raffinement
Nous utilisons le score du Grimace scale: Une observation quotidienne sera effectué, afin d'oberver les animaux et d'utiliser cet outil de diagnostic , basé sur l'observation de l'animal. Définition de l'indice grimace faciale ou grimace scale; il est basé sur l'observation de 4 caratéristiques faciales marquant la souffrance , à savoir le resserrement orbital, le renflement du nez ou le renflement des joues, la position des oreilles et le changement des vibrisses. chaque signe clinique établi un score, voici le tableau définissant la méthode: 0-aucun signe De 1 à 3 : signes modérés, a ce stade, l'administrtion de morphinque sera réalisé (Buprecare), afin de limitre la souffrance. A partir de 4: ces signes évidents de caractéristiques de la souffrance, nous conduisent à l'euthnasie del'animal ( une injection d'une dose léthale d'Euthoxin sera réalisé en IP). De plus, les animaux seront hébergés aux normes requises et un enrichissement (plaques de cellulose vierge et "loft" en carton) est mis en place. Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux qui seront observés régulièrement durant toute la durée du protocole expérimental. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire permettra de contrôler l’absence de souffrance. De même, l’examen de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales et de changement de comportement (agitation, prostration, grimace) seront minutieusement surveillés. La perte des fonctions vésicales est importante, les animaux seront tous massés plusieurs par jour et une antibiothérapie sera mis en place d'une façon systématiquement , afin d'éviter tous risques d'infection urinaire.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le rat, afin de poursuivre les études et la thématique , réalisées au sein du laboratoire. Ceux-ci, dans le but de connaitre les effets de la transplantation de Tissus Adipeux centrifugé et de connaitre et d'observer l'impact sur la récupération fonctionnelle et la régénération tissulaire, dans un modèle, mimant ceux retrouvés chez l’homme. Les animaux seront utilisés lorsqu’ils seront jeunes (âgés de 8 à 10 semaines) dans le but de se rapprocher des cas observés chez l’homme.
Etude de l’effet d’expositions aux radiofréquences du téléphone portable sur la neurogenèse par la technique 5- bromo-2’-deoxyuridine
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
98 rats, dont 14 femelles gestantes et 84 ratons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes sont exposées aux radiofréquences du téléphone portable de la gestation au sevrage, puis mères et descendants reçoivent une injection de BrdU et sont mis à mort deux heures après pour prélever le cerveau et mesurer la neurogenèse. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, réflexes néonataux, activité exploratoire en open-field et test de retournement, pour évaluer l'effet de l'exposition sur la maturation cérébrale. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro et in silico ne peuvent pas répondre à la question sur un organisme en interaction avec son environnement et conclut à la nécessité du recours au rat.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de préciser l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques (CEM) des télécommunications (comme le téléphone portable) sur la neurogenèse. Ce projet sera réalisé sur 98 rats Sprague-Dawley (14 femelles gestantes et 84 ratons, en considérant que 6 ratons/portée seront obtenus) répartis en deux groupes expérimentaux, exposés ou non aux CEM (cf. ANNEXE 1). Une procédure est considérée dans le cadre de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions développementales aux champs électromagnétiques avec le minimum de rats pour le projet.
Procédures
Aucune intervention de type prélèvement sur animal vigile ou chirurgie n'est prévue. Deux heures avant leur mise à mort, les rats recevront une seule injection intrapéritonéale de BrdU (150 mg/kg pour les mères et 50 mg/kg pour les descendants à PND9, 21 et 44 dans un volume maximum injecté de 6 ml/kg pour les animaux traités à PND9 et de 10 ml/kg aux autres âges). Préalablement à leur sacrifice, le cas échéant (en cas d'atteinte de point limite nécessitant la mise à mort après l’âge de PND15), les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital (EXAGON, 400 mg/kg, ou traitement équivalent recommandé par le vétérinaire référent). Préalablement à leur mise à mort, les rats seront sédatés par inhalation d’isoflurane. Au bout de quelques minutes, l'anesthésie profonde sera vérifiée et les rats seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Nous n'attendons pas de nuisance ou d'effet indésirable sur les animaux suite à la réalisation de la procédure n°1 de ce projet. Néanmoins, des signes critiques et les actions correctives qui seront menées en conséquence sont envisagés afin d’être en mesure de pallier toute manifestation inopinée de souffrance des animaux hébergés dans notre animalerie même si sa cause n’est pas prévisible et est indépendante des actions de la procédure n°1.
Devenir
Tous les rats seront mis à mort aux temps de sacrifices définis pour effectuer des prélèvements biologiques post-mortem qui permettront de réaliser des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux.
Remplacement
Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre au questionnement concernant l’impact des expositions aux CEM-RF sur le positionnement et la morphologie des nouveaux neurones sur un organisme en interaction sensorielle avec son environnement et doué de thermorégulation, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.
Réduction
Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les coupes de cerveau qui seront réalisées ex vivo seront exploitées pour l’analyse de plusieurs marqueurs (marquage du BrdU, marqueurs neurotrophiques, de l’inflammation et du stress oxydant) fortement questionnés dans les effets in vivo des CEM. Les variables quantitatives (marqueurs ex vivo, poids, …), seront analysées par 4-ways ANOVA ou 3-ways ANOVA suivi d’un test post-hoc avec la correction de Bonferroni, en fonction de paramètres inter-sujet (sexe, niveau de champs électromagnétique, âge) et intra-sujet (le temps pour les variables mesurées plusieurs fois chez un même rat (poids, tranches de 5 minutes pour l’activité locomotrice,…)). Les variables de rang (mesure du délai de retournement dans le « surface righting » sur un maximum de 60 secondes, …) seront analysées par le test du log Rank.
Raffinement
Concernant le raffinement, chaque animal sera observé quotidiennement et pesé tous les 2 jours. Des feuilles d’observation permettront de consigner les signes anormaux concernant l’apparence, le comportement, les signes cliniques, etc. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. L’état de santé des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de scores (cf. ANNEXE 2) qui indiquera l’action à mener de prise en charge de la douleur. De plus, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées seules puis avec leur portée. A partir du sevrage, tous les rats seront hébergés par sexe par groupe à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, et éventuellement des bâtons en bois à ronger, seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Une sédation par inhalation d’isoflurane sera pratiquée préalablement à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. L’UMR PériTox possède une expertise en recherche en toxicologie expérimentale. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer nos résultats avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des CEM sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi la même espèce. De plus, le personnel qui sera en charge des expérimentations est formé et possède une expérience reconnue pour l’entretien et l’observation des rats. Les femelles gestantes arriveront à l’animalerie au jour gestationnel (G) 3 et seront exposées à partir de G8 aux CEM-RF jusqu’au sevrage de la descendance, au jour postnatal (PND) 21, soit approximativement durant 35 jours. Elles seront sacrifiées à PND21 pour évaluer les effets de l’exposition sur leur neurogenèse. Les effets de l’exposition sur la mise en place de la fonction cérébrale seront évalués sur la descendance au stade néonatal (réflexes néonataux évalués de PND3 à 10), au stade juvénile et à l’adolescence (activité exploratoire évaluée dans l’open-field respectivement entre PND17 et 19, et entre PND41 et 43). Les femelles gestantes recevront une injection de BrdU à PND21 et la descendance aux stades néonatal (PND9), juvénile (PND21) et adolescent (PND44), et seront mis à mort 2h après pour examiner la neurogenèse. Cette analyse permettra d’identifier le stade développemental le plus sensible aux expositions aux CEM-RF et les effets à court/long terme et transitoire/permanent sur la neurogenèse et la fonction cérébrale tout au long de la maturation cérébrale.
Modulation de la tVTA dans les troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 40 et sévère pour 560. Après implantation de canules par chirurgie, ils subissent un modèle de dépression fondé sur des chocs électriques inéluctables et imprévisibles, puis des tests d'évitement avec 30 chocs, de nage forcée et de champ ouvert. Le porteur attend l'apparition de symptômes dépressifs chez au moins 30 % des animaux et teste une molécule censée les prévenir. Il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro ne répond à cette question.
Objectifs
Ce projet concerne la caractérisation et la manipulation de mécanismes impliqués dans le développement de symptômes dépressifs induits par le stress chronique. Notre but est de déterminer si les symptômes dépressifs observés peuvent découler de la modification de récepteurs neuronaux. Notre premier objectif est de confirmer les résultats obtenus par analyse moléculaire (PCR) et de vérifier si ces modifications se produisent également chez des rats ne présentant pas de symptômes de type dépressifs malgré avoir également subi un stress chronique. Ensuite nous souhaitons bloquer pharmacologiquement ces récepteurs par approche préventive (avant le stress) et curative (après le stress) pour voir si cela suffit à empêcher l’expression de ces symptômes de type dépressifs.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous pourrons mieux comprendre le rôle de la tVTA, une structure du cerveau récemment découverte et impliquée dans le développement de symptômes de type dépressifs induits par le stress. Nous pourrons également vérifier si le blocage des récepteurs des neurones de la tVTA permet de diminuer ou de prévenir l'apparition des troubles dépressifs. Si tel est le cas, ces récepteurs pourraient être la cible de futurs traitements plus spécifiques de la dépression.
Procédures
Implantation des canules : (520 rats maximum). La durée de la chirurgie ne dépassera pas 2h. Les animaux subiront le modèle de stress consistant en 2 séances de stress de 50 min (jour 1 et 2) où les rats seront soumis à des chocs électriques non échappables et non prédictibles (séances de 10 sec avec un intervalle moyen de 5-30 secondes) et le test comportemental d'une durée de 15 min visant à évaluer les conséquences dépressives du modèle et qui consiste en l’application de 30 chocs électriques, que l’animal peut éviter en changeant de compartiment dans la chambre de test. Les animaux subiront également le test comportemental de nage d'une durée de 15 min nous permettant de voir si l’animal montre également des signes de dépression en utilisant un autre test comportemental dans un environnement nouveau pour l’animal et le test comportemental du champ ouvert d'une durée de 15 min consistant à laisser le rat explorer un nouvel environnement.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie d'implantation de canules, les rats devront s'habituer au dispositif sur leur tête. Dans le modèle utilisé, les rats sont soumis un stress intense lors de l'établissement du modèle. Ce stress est attendu et nécessaire à l'expérience. Nous nous attendons à l'apparition de symptômes de type dépressifs pour au moins 30% des animaux dans le modèle étudié. Néanmoins, les animaux seront traités avec une molécule permettant d'inhiber une structure cérébrale qui serait en partie responsable du développement de la dépression, notre hypothèse étant que ce traitement permettrait d'empêcher le développement de la dépression chez ces animaux.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux sont mis à mort afin de prélever leur cerveau pour procéder aux analyses biologiques.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chronique chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, est un processus intégré et repose sur l’observation du comportement de l’animal vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum afin d'obtenir un nombre d'échantillons statistiquement significatif, compte tenu du taux de succès de la chirurgie (60-90%), du modèle qui génère seulement 30% d'animaux susceptibles ainsi que de la qualité de prélèvement des structures cérébrales et le succès des analyses moléculaires. Pour optimiser l'expérience et réduire le nombre final d'animaux utilisés, les expériences seront également menées par petits lots d'animaux jusqu'à ce que suffisamment d'échantillons de qualité adéquate aient pu être obtenus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collective afin de respecter leurs besoins sociaux. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie (sans que l'animal ne ressente de la douleur) et durant toute la chirurgie, l'animal est maintenu au chaud à l'aide d'un tapis chauffant. En post-chirurgie, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de contrôler leur bien-être et de mettre en place une analgésie si besoin. A chaque étape de l'étude, nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La tVTA (structure cérébrale étudiée) a été initialement décrite chez le rat, puis chez le singe. Chez la souris, cette structure est présente mais moins bien définie que chez le rat. Le projet utilise donc l'espèce chez laquelle le plus d’informations sont présentes. Pour ce projet, des rats adultes ( poids>200g à la chirurgie) seront utilisés puisque l’étude nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.
Effet de la spiruline sur la dégradation des processus cognitifs liés à un régime hypercalorique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures classées légères. Soumis à un régime hypercalorique de type "cafétéria" pendant plusieurs mois, ils reçoivent chaque jour de la spiruline par gavage, puis passent des tests de reconnaissance d'objets et de mémoire spatiale. Le porteur teste l'hypothèse que la spiruline limiterait les déficits cognitifs liés à l'obésité et annonce comme bénéfice l'ouverture de pistes cliniques. Il affirme que l'évaluation des capacités cognitives ne peut se faire que sur l'animal entier.
Objectifs
L'obésité est une maladie complexe, multifactorielle, qui affecte plus d'un tiers de la population mondiale. Elle est devenue la première maladie « inflammatoire » non infectieuse et concerne aussi bien l'enfant et l'adolescent que l'adulte dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement. L'Organisation Mondiale de la Santé définit l'obésité comme une surcharge pondérale par excès de masse grasse qui a des conséquences néfastes pour la santé, dans ses trois dimensions, somatique, psychique et sociale. Selon les dernières estimations de l'OMS, 1,6 milliards d'adultes de plus de 15 ans seraient en surpoids, et 400 millions seraient obèses. En France, selon la dernière enquête épidémiologique on estime que 31,9% des français de plus de 18 ans sont en surpoids, et 14,5% sont obèses. Outre les conséquences sociales et psychologiques qu'engendre cette pathologie, elle représente un risque majeur de développement des maladies cardiovasculaires et d’altération des fonctions cognitives. Au cours des dernières décennies, de nombreux efforts ont été consacrés à l'étude de différentes espèces végétales en raison de leurs activités pharmacologiques puissantes, de leurs effets secondaires moindres et de leur coût relativement faible. En particulier, la spiruline (Spirulina platensis) une algue microscopique suscite un intérêt important et un certain nombre de travaux indique qu’elle pourrait avoir un effet anti-obésogène. Le projet a pour objectif d’étudier l'impact de la spiruline à la fois sur l'installation de l'obésité induite par un régime hypercalorique et sur les perturbations cognitives de cette obésité. En effet, de nombreuses études montrent que l’obésité affecte les capacités d’apprentissage et de mémoire dépendantes de l’hippocampe chez les animaux et l’homme. Plus spécifiquement nous étudierons les effets de l’obésité induite par un régime « cafétéria » sur la reconnaissance d’objets et la mémoire spatiale dans une tâche d’exploration d’objets, ainsi que les effets de la prise de spiruline pendant le régime cafétéria sur ces mêmes processus mnésiques. L'hypothèse du projet est que la prise de spiruline empêche également l’installation des déficits cognitifs induits par l’obésité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’apporter des connaissances fondamentales sur les effets de la spiruline sur l’obésité, et d’ouvrir des pistes cliniques de traitement préventif de l’obésité. En effet, les hypothèses du projet sont que la spiruline empêche l’installation des mécanismes physiologiques de l’obésité (prise de poids) et contrecarre les effets délétères de l’obésité sur la cognition et la mémoire.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure de gavage pour administrer la spiruline. L'intervention pour le gavage dure de 5 à 7 s. Le gavage aura lieu une fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (2 mois + la durée des tests comportementaux c'est -à-dire au total 3 mois environ).
Impact sur les animaux
L'effet indésirable principal est lié à la réalisation du gavage pour l'administration de la spiruline. L’expérimentateur maitrise la technique de gavage chez les rats car elle la pratique depuis plusieurs années. Si des difficultés surviennent dans la mise en œuvre de cette technique, ce qui peut se manifester par une résistance à l’insertion de la canule d’administration, des traces de sang sur la canule, un comportement anormal (halètement), l’opération de gavage sera suspendue pendant plusieurs jours. Un autre effet indésirable potentiel sur la physiologie est la prise de poids liée au régime hypercalorique. Cependant, il est à noter que bien que le régime cafétéria induise une hyperphagie et aboutit à une prise de poids plus rapide que les animaux contrôles, le poids des animaux en surpoids reste dans une gamme de poids "normale" pour ces animaux. La courbe de poids provenant d'études réalisées par l’expérimentateur et d’autres études (en annexe 3) montre qu'après 3 mois de régime cafétéria, les animaux pèsent aux alentours de 350-400 g. Ainsi cette prise de poids, si elle est rapide ne sera pas, dans l’absolu, d'une ampleur telle qu’elle aurait un effet délétère sur la motricité par exemple. Cependant, l’expérimentateur sera vigilant sur l’état général de l’animal qui sera vérifié quotidiennement selon la grille de score approuvée par la SBEA.
Devenir
A l'issue les animaux seront mis-à-mort afin de prélever le cerveau pour mesurer les marqueurs du stress oxydant et des défenses anti-oxydantes.
Remplacement
Ce projet repose sur un modèle rongeur de l’obésité qui permet une induction rapide de l’obésité et qui permet de tester les effets de traitements potentiellement efficaces contre l’obésité. L’évaluation des capacités cognitives et mnésiques ne peut se faire que chez l’animal entier, et non avec des études in vitro ou de la modélisation.
Réduction
Le régime cafétéria induit une obésité chez tous les animaux. Le nombre d’animaux minimum nécessaires pour les tâches de reconnaissance est de 8 par groupe. Ce nombre permet d’obtenir des données qui peuvent être analysées statistiquement soit par des test paramétriques (dans le cas d’une distribution normale des données) ou non paramétriques.
Raffinement
Les régimes alimentaires seront contrôlés mais la nourriture sera fournie ad libitum. Dès leur arrivée, chaque animal sera quotidiennement manipulé par l’expérimentateur afin de diminuer leur stress pendant toute la durée de l’étude. Les tests comportementaux impliquent une exploration libre de l’environnement et reposent sur l’attrait de la nouveauté et la réaction naturelle et spontanée de l’animal à la détection de la nouveauté. Il n’y a donc pas de contrainte pouvant induire un mal être. L’état général des animaux sera observé. Il est par exemple possible que, dans une cage, les animaux dominants blessent les animaux dominés. Ces critères seront évalués selon une grille de score, adaptée de Morton et Griffiths 1985, approuvée par la SBEA, ce qui permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille repose sur des critères liés à l’apparence des animaux, à leur prise alimentaire/poids corporel, à certains signes cliniques (fréquence respiratoire) ainsi qu’à leur comportement général (activité, vocalisation) et permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. Le score obtenu dicte les dispositions éventuelles à considérer pour l’animal : De 0 à 4 : Etat normal ; De 4 à 9 : observation quotidienne, analgésie envisagée (buprénorphine 0,05 mg/kg ; s.c. 0,1 ml/10g) ; ≥ 10 : souffrance sévère avérée, arrêt de l'expérimentation par mise à mort de l'animal. Les animaux seront observés à chaque pesée bi-hebdomadaire. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.
Choix des espèces
Du fait de l'existence de modèles bien connu d'obésité innée ou acquise par l'exposition à des régimes hypercaloriques, le rat est une espèce particulièrement pertinente pour la réalisation du projet. En particuler le modèle d'obésité induite par un régime cafétéria est un modèle pertinent de l'obésité chez l'homme. Ce seront des rats adultes. L'étude considère l'obésité induite par un régime hypercalorique chez l'adulte.
Mesure de la pharmacocinétique de produits pharmacologiques perfusés chez le rat par prélèvements répétés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenus sous anesthésie gazeuse jusqu'à deux heures et demie, ils reçoivent un candidat-médicament par cathéter dans la veine caudale et subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang sur 24 heures avant d'être tués pour récolter les échantillons. Le porteur décrit ces micro-prélèvements comme indolores mais reconnaît un stress possible, et signale un risque d'hypothermie ou d'arythmie en cas de défaillance du matériel. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'ensemble des phénomènes d'absorption et d'élimination et juge l'approche animale "indispensable".
Objectifs
Le développement de nouveaux médicaments requiert d'étudier le devenir de la substance active dans l’organisme afin de déterminer sa distribution, son métabolisme et son élimination. Ces propriétés influencent la posologie du médicament : dose et fréquence d'administration. L’objectif de ce projet est de mesurer la concentration sanguine de candidats-médicaments en fonction du temps afin de déterminer le volume de distribution, la concentration maximale observée, le temps de demi-vie, la clairance et la valeur d’exposition des candidats-médicaments chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de sélectionner les candidats présentant une concentration élevée et durable dans le sang, alliée à un métabolisme lent et une faible élimination. Ces caractéristiques sont indispensables pour garantir la distribution du candidat-médicament à sa cible et une bonne efficacité. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Cela permettra de réduire drastiquement le nombre d'études nécessaires pour ne mesurer ensuite que l’activité des candidats-médicaments les plus prometteurs et épargnera la vie de centaine d'animaux, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament efficace pour le traitement des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse durant plusieurs dizaines de minutes (maximum de 2h30), l'insertion d'un cathéter avec aiguille dans la veine caudale (sous anesthésie, l’aiguille est ensuite éliminée) et des micro-prélèvements de sang répétés à l'extrémité de la queue (maximum 10 prélèvements). La procédure durera un maximum de 24h puis les animaux seront mis à mort afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant la perfusion intraveineuse des candidats-médicaments dans la veine caudale et les premiers prélèvements de sang (maximum de 2h30). En cas de défaillance du matériel, une hypothermie ou une arythmie pourrait survenir si elles ne sont pas détectées à temps. Les derniers micro-prélèvements de sang sont réalisés dans la veine caudale, à l’extrémité de la queue, sur les animaux vigiles et non contraints. Ces micro-prélèvements, d’une durée de 1 à 2min, sont indolores mais peuvent être stressant pour quelques animaux qui peuvent manifester leur impatience ou inconfort. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée maximum de 24h. D’autre part, une toxicité imprévue d’un candidat-médicament pourrait être mise en évidence et entrainer l’arrêt immédiat de la procédure.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.
Remplacement
Les candidats médicaments auront été sélectionnés préalablement lors des tests in vitro pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un médicament car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animal reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la concentration sanguine en fonction du temps sera réalisée chez le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.
Réduction
La procédure développée et validée permet la réalisation de micro-prélèvements de sang répétés chez un même animal. Cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour la détermination de la pharmacocinétique. Elle est effectuée par un technicien rompu à ces manipulations, ce qui garantit une excellente reproductibilité et de limiter encore le nombre d’animaux engager dans les études. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace de la pharmacocinétique d’un candidat-médicament à l’aide de trois animaux pour un candidat médicament.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Le rat étant un animal social, les rats seront maintenues par groupes sociaux dans des cages enrichies de tubes en carton et de bâtonnets à ronger. Une période d'aclimatation et d'habituation d'une semaine sera respéctée. Les rats seront anesthésiés le temps de la perfusion pour éviter tous risque de blessure et assurer une perfusion efficace et parfaitement repoductible. Le rat sera placée sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés sur les animaux vigiles et non contraints a même de signifier librement tout manquement à leur bien-être. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour visualiser tous signes de toxicité imprévue qui seraient immédiatement suivi de l’arrêt de la procédure.
Choix des espèces
Les rats permettent l’étude des cibles thérapeutiques et des candidats-médicaments et sont suffisamment gros pour qu'une perfusion soit réalisée avec des volumes et des débits comparables à ceux utilisés chez les patients en clinique (0,25 à 2ml/kg/h). Les rats auront minimum 6 semaines, stade adulte, pour débuter les protocoles, car les systèmes immunitaires, nerveux et circulatoires sont matures.
Intérêt des facteurs de croissance hépatocytaires à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral chez le rat (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
92 rats vont être utilisés dans des procédures légères puis modérées, 62 tués à 24 heures pour prélèvement du cerveau et du cœur et 30 réutilisés dans d'autres projets. Une chirurgie occlut une artère cérébrale par un filament pendant 90 minutes avant reperfusion, avec examens IRM sous anesthésie et injection d'une protéine, le facteur de croissance hépatocytaire, censée limiter les dégâts. Le porteur rappelle qu'aucun traitement de neuroprotection n'a démontré d'efficacité chez l'humain et renvoie un éventuel essai clinique au conditionnel. Il indique que le mécanisme d'action testé n'est pas reproductible in vitro.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aigüe d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. Cette reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi aux séquelles de l’AVC. L’un des enjeux du développement de nouvelles approches thérapeutique dans l’AVC, en complément des traitements actuels, serait de combattre les dommages liés à la reperfusion. L’objectif de ce projet est de déterminer si une protéine d’intérêt appelé Hepatocyte Growth Factor (HGF) permet de diminuer la taille et les conséquences de l’AVC. Il s’agit d’un élément majeur en santé publique car la taille de l’AVC est directement reliée au handicap et à la mortalité. Les données de la littérature sont croissantes depuis une dizaine d’année. Notre hypothèse est en faveur d’une diminution de la taille de l’infarctus et une amélioration de la fonction cérébrale lorsque HGF est utilisé dans l’AVC.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Ce projet de recherche a pour objectif de tester un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC liée à l’occlusion d’une artère cérébrale. La molécule testée a déjà montré des bénéfices dans l’attaque cardiaque. Si notre étude apporte des preuves d’efficacité, un essai clinique pourrait être mis en place rapidement pour évaluer cette nouvelle approche thérapeutique chez les patients. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour pouvoir concevoir correctement de futurs essais cliniques.
Procédures
Ce projet multisite se découpera en 2 procédures : 1) Etude pharmacologique de N Acetyl Heparin sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane - classe légère : La veine caudale est cathétérisée puis le produit est injecté par voie intraveineuse à différentes posologies, soit uniquement en bolus, soit par bolus puis perfusion continue pendant une heure (anesthésie de 10 minutes pour les injections en bolus seul, de 1h10 pour les injections en bolus puis anesthésie). Les animaux auront des prises de sang régulières, par voie caudale, de 50 μL : avant injection de NAH, à 10 minutes, à 1h puis à 24h (le prélèvement réalisé à une heure chez les animaux ayant uniquement un bolus intraveineux et celui réalisé à 24h seront réalisés après anesthésie locale caudale). 2) induction chirurgicale de l’AVC et administration des traitements - classe modérée : - (H0) Induction chirurgicale de l’AVC - (H1) Examen IRM basal afin de vérifier la bonne efficacité de la ligature artérielle - (H1,5) : le filament est laissé en place pendant 90 minutes (ischémie), après quoi il est retiré (reperfusion), et l’animal peut être définitivement suturé à l’aide de fils stériles. Le traitement est administré par voie intraveineuse (cathéter caudal) 5 minutes avant la reperfusion (HGF, NAH ou NaCl). Les animaux sont anesthésiés pendant 1h30. La durée de la chirurgie en elle-même est d’environ 30 minutes. - (H23) Examen fonctionnel : Evaluation du Neuroscore - (H24) Examen IRM final : imagerie IRM à 24h sous anesthésie générale. Les animaux sont anesthésiés une quinzaine de minutes pour l’acquisition des différentes séquences.
Impact sur les animaux
L’induction d’un AVC ischémique chez le rat nécessite une procédure de classe modérée avec une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients, le parenchyme cérébral étant dépourvu d’innervation). Une des complications, rare, est l’œdème cérébral malin. Par ailleurs, le modèle animal induit des déficits sensoriels et moteurs reproduisant la physiopathologie humaine. Les cerveaux et les cœurs seront prélevés en fin de procédure afin d’évaluer les mécanismes d’action du traitement sur le cerveau et, à distance, sur le coeur. Un nombre total de 92 rats au maximum seront utilisés au cours de ce projet (phase 1 + phase 2), afin de disposer d’une étude statistique robuste.
Devenir
Les animaux issus de la phase 1, utilisés pour l’étude pharmacologique de N Acetyl Heparin, pourront être réutilisés dans d’autres projets de recherche utilisant des rats. Les animaux issus de la phase 2 seront mis à mort à 24h afin de pouvoir analyser les mécanismes d’action en jeux. Les différentes techniques d’analyse nécessitent d’utiliser le cerveau et le coeur des rats après sacrifice des animaux pour analyses en laboratoire.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données expérimentales déjà publiées. En effet l’activation des cellules cérébrales par la protéine HGF les protégeraient de la mort cellulaire. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie « in vivo » dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme ; et d’autre part le mécanisme d’action de NAH qui n’est pas reproductible « in vitro ».
Réduction
Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. L’imagerie « in vivo » permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Tous les animaux utilisés lors de la phase 1 seront réutilisés dans d’autres projets. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé par un biostatisticien. Nous avons utilisé un test satistique spécifique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. Les animaux sont surveillés de façon rapprochée avec utilisation de grilles de score pour évaluer le bien-être et prise de poids quotidienne (même en l’absence de chirurgie). Ils ont un accès facilité à la nourriture et à l’eau en période post-opératoire.
Choix des espèces
Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Il s'agira de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre. Cette fourchette de poids est par ailleurs celle utilisée dans les études antérieures et sur lesquelles s’appuient notre retour d’expérience et nos statistiques.
Evaluation de l’efficacité de composés dans le traitement de la décompensation aigue de la cirrhose hépatique. Utilisation d’un modèle rongeur induit par l’association du tétrachlorure de carbone, du phénobarbital et du lipopolysaccharide.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 320 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés puis sévères pour 1 040 d'entre eux. Ils reçoivent du tétrachlorure de carbone par voie orale pendant vingt semaines, du phénobarbital, puis une injection de lipopolysaccharide dans l'abdomen destinée à déclencher une défaillance aiguë de plusieurs organes, le protocole mesurant la durée de survie avant la mise à mort. Le porteur teste des composés censés réduire cette mortalité et renvoie les retombées pour les patients cirrhotiques au conditionnel. Sur le remplacement, il indique ne disposer d'aucun modèle in vitro équivalent et conclut à la nécessité d'un système biologique complexe et "global".
Objectifs
Notre projet consiste à reproduire dans un modèle expérimental murin (rat), un épisode aigu de défaillance multiorganes appelé « acute on chronic liver failure » (ACLF), et d’évaluer les effets de composés sur le traitement ou la protection qu’ils pourraient avoir dans cette pathologie. La cirrhose hépatique est une pathologie caractérisée par une fibrose diffuse, une perturbation sévère du flux artériel et veineux intrahépatique, une hypertension portale et évoluant vers une insuffisance hépatique. La cirrhose a classiquement été catégorisée en deux états : compensée et décompensée. La décompensation aiguë est définie par l’apparition récente d’ascite, un épisode d’encéphalopathie hépatique, une hémorragie digestive, et un épisode infectieux ou n’importe quelle combinaison de ces critères. Il y a deux catégories de décompensation aiguë: la première dite traditionnelle, de bon pronostic à court terme et la seconde, appelée ACLF plus complexe, associée à des défaillances multiples d’organe et de mauvais pronostic. L’ACLF est un syndrome fulminant déclenché par un événement précipitant produisant la défaillance de multiples organes. Il apparait donc que cette phase d’emballement de la réaction immunitaire et inflammatoire soit déterminante lorsque l’ACLF survient chez des patients cirrhotiques qui présentent des lésions hépatiques. Ils ont souvent une endotoxémie importante et une augmentation des taux de cytokines inflammatoires plasmatiques qui sont des facteurs prédisposants. Le modèle d’étude de cette pathologie sera reproduit chez le rat Sprague Dawley par administration orale chronique de tétrachlorure de carbone (CCl4). Afin de potentialiser l'effet du CCl4, les animaux seront préalablement exposés au phénobarbital (activateur des cytochromes de détoxification hépatique). A un stade avancé de la cirrhose, nous administrerons du lipopolysaccharide afin de mimer le facteur infectieux retrouvé dans la pathologie humaine, Les effets des composés testés seront évalués sur leur capacité à réduire l’orage cytokiniques et à prolonger la survie des animaux après un épisode d’ACLF.
Bénéfices attendus
Il est attendu que les composés que nous allons tester exercent des effets multiples, c'est à dire qu'ils puissent agir sur plusieurs cibles en même temps. Par exemple si ces produits réduisent à la fois le processus inflammatoire, l’infection, et améliorent le fonctionnement du foie , nous pensons réduire de manière significative les effets aigus de l'épisode d’ACLF chez les patients cirrhotiques.
Procédures
Au cours de la première phase au cours de laquelle va s’installer la pathologie du foie qui durera 20 semaines au maximum, les animaux subiront des traitements par voie orale à raison de de deux fois par semaine. Cette administration sera pratiquée par une personne expérimentée et ne représente pas une action invasive traumatisante. Il y aura donc 40 administrations par voie orale au maximum. A l'issue de cette phase 1, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin, sous anesthésie gazeuse de courte durée. Au cours de la seconde phase sera déclenché l'épisode aigu d’ACLF, les rats recevront une seule administration par injection dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Pour les animaux qui survivront au-delà de 24h, un prélèvement sanguin terminal sera réalisé au moment de leur mise à mort, ils seront alors sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le modèle est réalisé en deux phases : 1) La première phase est longue (de 10 à 20 sem max ) , elle permet le développement de la pathologie hépatique , les traitements pour l’induire sont doux (voie orale), il n'y a pas de souffrance ni inconfort manifeste. 2) La seconde phase qui correspond à la précipitation de l'ACLF par injection du composé qui mime un infection bactérienne majeure (LPS) est par définition aigue. Elle génère rapidement des signes de stress et d'inconfort chez le rat (trouble de l'homéothermie, prostration, pâleur des muqueuses etc). Ces effets sont évalués et scorés à la fois dans le but de grader la sévérité ce qui reflète aussi un effet pharmacologique du produit testé, et pour évaluer les points d'arrêts anticipés ou points limites. Deux approches expérimentales sont envisagées, 1) : l'étude de survie à 24h qui permettra d'évaluer la protection éventuelle de notre composé en comparaison à un groupe d'animaux contrôles ou 2) : évaluation dans un temps précoce juste après l'induction des paramètres hémodynamiques et biochimiques (enzymes, cytokines), cela permet également une approche mécanistique par le biais de l'expression de gènes de régulation des processus inflammatoires ou métaboliques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale les animaux seront observés au cours d'une période de 24heures maximum après le déclenchement de la phase aigue de la défaillance multi organe. Cette phase d'observation se traduira soit pas la mort de l'animal (avec mesure de la durée de survie = étude de survie) soit par une mise à mort pour les animaux survivants. La jsutification repsoe sur l'objectif de ce projet qui consiste à évaluer les effets de composés sencés réduire la mortalité lors de défaillance aigue de l'organisme. les animaux qui survivent seront mis à mort et seront nécropsiés.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles un outil translationnel très pertinent. Nous ne disposons pas actuellement de modèles in vitro ayant des caractéristiques permettant d'évaluer les propriétés de composé sur l'ACLF. Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, et même sur des modèles de tyoe organoïdes contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global ».
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La chimie des médicaments peut produire des familles de composés chimiques très importante, la stratégie de sélection de produits intéressants à l’aide de tests in vitro exclue une très grande majorité des produits et diminue donc drastiquement le nombre de tests à réaliser chez l’animal.
Raffinement
L'ACLF qui par définition est chez l'homme une pathologie qui entraine le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés . Le modèle d'étude expérimetal est lui aussi sévère , la précipitation de la décompensation est subite , nous avons établi des grilles de scoring et une surveillance accrue des animaux de manière à ne pas conserver un animal qui aurait atteint les points d'arrêt anticipés.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Rats juvéniles en période post sevrage au début des études expérimentales (environ 21-28 jours), le poids optimal des rats est de 100 grammes dans la littérature scientifique.
Etude en IRM de l’effet d’un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines sur la formation de l’œdème cérébral chez le rat en cas d’ischémie cérébrale transitoire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
31 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, 26 dans des procédures classées sévères et 5 tués sans réveil comme témoins. Chez les 26 premiers, un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivie de deux passages en IRM, pour étudier l'œdème cérébral et un candidat-médicament. Le porteur indique un taux d'échec de 30 %, dont 25 % de mortalité, et cite parmi les atteintes l'hypothermie, des difficultés à se nourrir et une douleur liée à l'œdème. Il revendique un modèle in vivo "indispensable", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui les mécanismes entre cerveau et sang.
Objectifs
La World Stroke Organization rapporte 13.7 millions d'Accidents Vasculaires Cérébraux chaque année, dont 5.5 millions sont fatales. 80% des AVC sont d’origine ischémique (AIC) et sont causés par l’obstruction d’un vaisseau sanguin cérébral. Cette interruption de la circulation sanguine bloque l’apport d’oxygène et de glucose nécessaire à l’activité cérébrale, endommageant progressivement les cellules et formant un œdème cérébral avec une composante cellulaire et une composante vasculaire. Les premières heures qui suivent un AIC sont déterminantes quant à ses conséquences, mais les approches thérapeutiques actuelles sont limitées dans le temps et ne peuvent contrer l’œdème qui ne peut être soulagé que par une chirurgie décompressive invasive : l’hémicrâniectomie. L’objectif aujourd’hui pour la recherche est de proposer un traitement neuroprotecteur permettant d’élargir cette fenêtre thérapeutique en protégeant les cellules et en limitant l’œdème cérébral. Notre équipe travaille sur un candidat médicament répondant à ces attentes. C'est un inhibiteur de kinases cyclines dépendantes dont les effets neuroprotecteurs et anti-œdémateux à 24 et 48h post-AVC ont été montrés dans différentes études indépendantes dans un modèle d’ischémie cérébrale focale transitoire chez le rat. Nos résultats histologiques préliminaires indiquent un effet potentiel de notre molécule sur l'œdème cellulaire. D'autre part, les biomarqueurs de pathologie neurodégénératives constituent un axe de recherche aux enjeux majeurs, cependant ils ne sont pas encore appliqués aux AVC. De plus en plus de recherches suggèrent que certaines molécules anormalement présentes dans le sang en cas d'AVC pourraient être utilisées pour le diagnostic et le suivi de cette pathologie. Parmi environ 150 candidats, nous avons sélectionné l'aquaporine-4, un canal perméable à l'eau situé à l'interface entre le sang et le cerveau particulièrement impliqué dans l'œdème cérébral et dont la présence dans le sang a récemment été rapportée dans une étude pilote chez l'homme. Cette étude a 2 objectifs : 1) évaluer l'effet de notre candidat médicament sur la formation de l’œdème cellulaire cérébral à un stade précoce de l’AVC en imagerie par IRM ; 2) identifier un potentiel marqueur sanguin de l’AVC chez le rat.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra dans un premier temps d’étudier l'effet de notre candidat médicament sur l'œdème cérébral en cas d'AVC ischémique en IRM. L’impact de notre molécule sur l’œdème n’a jamais été mesurée par cette technique. Dans un second temps, la comparaison des taux d’aquaporine 4 dans le sang des différents groupes nous permettra d’identifier un potentiel marqueur de l’AVC et d’investiguer l’effet de notre traitement sur ce marqueur. A terme, ce projet pourrait mener au développement d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement des AVC.
Procédures
Au total, 31 rats mâles Sprague-Dawley adultes (6-8 semaines) seront utilisés dans cette étude, et inclus dans une procédure 1 intitulée « Etude de l’oedème cérébral en IRM après induction d’une ischémie cérébrale transitoire chez le rat ». Cette procédure comprend l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) permettant de reproduire un AVC ischémique (~30min), l’administration en aveugle du traitement ou de son placebo (~15min), deux passages à l’IRM (~30min chaque) à 6h et 24h post-AVC et la mise à mort des rats. Trois groupes de rats seront distingués au cours de cette procédure : un premier groupe de 13 rats recevra le traitement, un second groupe de 13 rats recevra le placebo, et un troisième groupe de 5 rats sera seulement mis à mort pour constituer un groupe contrôle sans AVC ni traitement. Ces rats contrôles ne passeront pas d’IRM. Par ailleurs, l’atteinte d’un point limite au cours du protocole entrainera la mise à mort immédiate de l’animal.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales ont été conçues de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. La procédure a un taux d’échec de 30% : la chirurgie du modèle d’ischémie cérébrale par occlusion temporaire de l’artère cérébrale moyenne via l’insertion d’un filament dans l’artère carotide externe est un modèle complexe qui a un taux de mortalité de 25% et un risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique de 5%. Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) Une hypothermie : au cours de la chirurgie, le risque d’hypothermie est strictement monitoré à l’aide d’une sonde rectale et d’un tapis chauffant, cependant certains rats peuvent avoir du mal à réguler leur température corporelle après la chirurgie, c’est pourquoi des mesures seront prises pour prévenir tout risque d’hypothermie jusqu’à la mise à mort des animaux. (2) Une diminution de leur capacité à se nourrir et à s'abreuver : la zone d’opération se trouvant au niveau des muscles mandibulaires, les rats peuvent avoir du mal à mastiquer et à se redresser pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau. (3) Une douleur céphalée conséquente à l’œdème cérébral apparait dans les premières heures après la chirurgie. L’intensité de cette douleur dépend du degré de sévérité de l’AVC et est évaluée lors du test de suspension par la queue. Cette douleur peut également gêner le redressement pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau, malgré l’analgésie mise en place post-chirurgie. (4) Une gêne pour se déplacer : une paralysie de la patte avant droite apparait au cours des premières heures après la chirurgie. Cette atteinte est plus ou moins importante selon le degré de sévérité de l’AVC et est mesurée dans le neuroscore via le test de rotation. (5) Un stress au cours au transport : 5h et 24h après la chirurgie, les animaux seront transportés vigiles à l’aller et au retour dans une cage de transport entre l'animalerie et l'IRM. Ces quatre trajets de 10-15 minutes en voiture peuvent engendrer un stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente selon une méthode de mise à mort réglementaire et les informations sont conservés pour les contrôles de la SBEA, du vétérinaire référent de l'établissement ou des services vétérinaires départementaux.
Remplacement
S’il existe des modèles alternatifs in vitro recréant des conditions ischémiques sur des cultures de cellules cérébrales, ils ne permettent pas d’étudier les mécanismes inflammatoires complexes et coordonnés entre différents tissus (cerveau-sang), formés de multiples types cellulaires, ni le développement de l’oedème cérébral et sont donc inappropriés à notre étude. De plus, ce projet s’inscrivant dans la continuité de notre étude de l’effet du traitement test sur le cerveau du rat en cas d’AVC, il est indispensable d’utiliser le même modèle expérimental pour intégrer et comparer nos résultats. Cependant, en accord avec les exigences de remplacement et de réduction, des tests in vitro ont préalablement permis de sélectionner la molécule traitement parmi plusieurs candidats médicaments et de définir une gamme étroite de concentrations efficace in vivo.
Réduction
Un test sur un rat mort récupéré de notre précédent projet a été effectué au préalable pour vérifier la faisabilité de l’expérience et mettre au point les paramètres de l'IRM, évitant l'inclusion de rats supplémentaires dans l'étude pour le réglage de l'IRM. La procédure n°1 d’étude de l’effet du traitement sur l’oedème est réalisée sur le nombre d’animaux minimal tout en permettant d’accomplir son objectif. D’après nos précédentes études et en se basant sur la méthode statistique d'estimation développée par Noordzij et al. (2010), un effet sur l’oedème cérébral est observable et significatif à partir de 8 rats par groupes. L’induction de l’ischémie cérébrale a un taux d’échec d’environ 30%, comprenant la mortalité (25%) et le risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique (5%), c’est pourquoi nous prévoyons 13 rats par groupes. Nous estimons que 5 rats non ischémiés seront suffisants à l’acquisition de données de « contrôle » étant donné qu’il n’y a aucun risque de perte. Les tests statistiques utilisés par la suite seront Student ou ANOVA (données paramétriques), ou Mann Whitney ou Kruskal-Wallis (données non paramétriques).
Raffinement
Pour limiter leur stress et selon les mesures de raffinement, une période d’acclimatation de 1-2 semaines sera respectée à leur arrivée. Les rats opérés seront gardés par 2 pour réduire leur stress avant et après chirurgie. Le transport en voiture entre l’animalerie et l’IRM pouvant engendrer un stress chez l’animal, un temps de calme de 20-30min sur tapis chauffant sera respecté avant toute manipulation de l'animal à l’aller et au retour. Au cours de la chirurgie, l’hypothermie est compensée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermostaté à 37°C relié à une sonde rectale et par une couverture de survie. Après la chirurgie, la cage des rats sera posée sur un tapis chauffant à l’animalerie et à l’IRM pendant les phases de calme et de réveil de l’anesthésie. Un pack de gel chauffé à 30-37°C sera placé dans le fond de leur cage pendant leur transport et sous leur ventre pendant les 30 minutes d’IRM. Pour contrer les difficultés à se nourrir et à s’abreuver après la chirurgie, des pipettes à tige longue seront mises à leur disposition et des croquettes humidifiées (pellets mélangés à de l’eau) seront placées dans le fond de leur cage. L’option des DietGels a été écartée puisqu’ils contiennent du glucose, composé influençant le volume de l’œdème ; les alternatives sans glucoses ont été testées mais les animaux ne s’y intéressent pas. En accord avec le vétérinaire référent, une stratégie d'analgésie par injection sous-cutanée de lurocaïne 0,5% (7mg/kg) préopératoire sur le site d’incision associée à la buprénorphine post-opératoire (0,03-0,05mg/kg 2x/jour) a été privilégiée. Du gel ophtalmique sera également appliqué avant la chirurgie afin de protéger les yeux des animaux. Ils bénéficieront d'un soin adapté par l'utilisation d'anesthésique et analgésique avant l’IRM et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 6-8 semaines, pesant 320g +/- 40g, notre étude principale portant sur des pathologies principalement observées chez l’adulte et visant à traiter les patients victimes d’un AVC. Nous avons choisi la même espèce de rat pour cette étude pilote que pour nos études sur l'AVC puisqu'il s'agit d'une mise au point propre à l'espèce. Nous travaillons sur un modèle d'ischémie focale transitoire chez le rat, espèce que nous avons sélectionnée pour son système vasculaire cérébral très similaire à celui de l’homme, en faisant un modèle de choix pour reproduire un AIC. De plus, ce type d’ischémie cérébrale est déjà bien décrit chez le rat et de nombreuses données sont disponibles, nous permettant d’anticiper et de comparer nos résultats. Le rat est également l’espèce de référence dans les études de pharmacologie et les études précliniques. L’utilisation du rat évite de mettre en place de nouvelles études préliminaires pour valider le modèle, et donc d’augmenter le nombre d’animaux nécessaire.