Rats
Impact de probiotiques sur les concentrations tissulaires de la L-Dopa chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Jusqu'à deux gavages par jour pendant vingt-huit jours, et dix prélèvements de sang au maximum sur la durée du protocole : 1 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des dosages sanguins et tissulaires. Certains subissent en fin de protocole un prélèvement intracardiaque sous sédation profonde. Il s'agit de mesurer si des probiotiques modifient la quantité de L-Dopa qui atteint les tissus, la L-Dopa étant le traitement de référence de la maladie de Parkinson. Le rat a été retenu plutôt que la souris parce qu'il fournit des volumes de sang plus importants.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative qui constitue un enjeu majeur de santé publique. Son diagnostic clinique repose sur des symptômes moteurs caractéristiques tels que la rigidité, les tremblements, l’altération des réflexes posturaux et la bradykinésie. Outre ces symptômes moteurs, la maladie s’accompagne de nombreuses complications, notamment des troubles cognitifs et sensoriels, des douleurs, ainsi que des troubles du sommeil. Par ailleurs, 80 % des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent également de troubles gastro-intestinaux. Ces troubles, qui précèdent généralement l’apparition des symptômes moteurs, tendent à s’aggraver avec la progression de la maladie. Le traitement de référence repose sur la L-dopa, un précurseur de la dopamine. La conversion de la L-dopa en dopamine est assurée par l’enzyme L-aromatic amino acid décarboxylase (AADC), permettant ainsi de compenser le déficit dopaminergique chez les patients. Contrairement à la dopamine, la L-dopa est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, sa conversion prématurée en dopamine avant de franchir la BHE diminue son efficacité et provoque de nombreux effets secondaires. Pour limiter sa conversion prématurée, la L-dopa est généralement administrée avec un inhibiteur de l’AADC. Des études ont montré que le microbiote intestinal peut réduire la biodisponibilité de la L-dopa. Par exemple, la tyrosine décarboxylase, produite principalement par la bactérie Enterococcus faecalis, peut convertir la L-dopa en dopamine au niveau de l’intestin. A l’inverse, des traitement probiotiques pourraient améliorer certains symptômes chez les patients Parkinsoniens. Toutefois, il est essentiel de vérifier que ces probiotiques n’altèrent pas les concentrations plasmatiques de L-dopa. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les concentrations de L-dopa (dans le plasma, l’intestin ou le cerveau) lors de l’administration combinée de L-dopa (avec ou sans inhibiteur de l’AADC) et de probiotiques.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson touche environ 1% de la population de plus de 60 ans et représente un problème majeur de santé publique, d’autant plus que son incidence croît en raison du vieillissement de la population. Les traitements actuels ont une efficacité qui ne perdure pas dans le temps alors qu’ils ont de nombreux effets secondaires, il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, telles que les traitements probiotiques, pour améliorer la biodisponibilité des traitements actuels.
Procédures
Les traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles (max 2/jour, environ 30 secondes par gavage). Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 28 jours maximum. Les animaux auront des prélèvements sanguins soit par ponction sublinguale sous anesthésie gazeuse (max 3 ponctions/24h, durée de la ponction environ 1 minute), soit par prélèvement au niveau de la veine caudale (max 2 ponctions/24h, durée de la ponction environ 1 minute). Ils auront un maximum de 10 prélèvements au cours du protocole, et jamais plus de 5 par période de 24h. En fin de protocole, certains auront un prélèvement sanguin intracardiaque sous sédation profonde.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : 1) un stress dû aux administrations répétées par voie orale 2) un stress et une douleur lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de sang ou d’organes pour dosages.
Remplacement
Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne reproduisent pas la complexité des interactions systémiques présentes dans un organisme vivant (le métabolisme de la L-dopa dépend de multiples organes) et ne permettent pas de modéliser les interactions entre L-dopa et le microbiote intestinal, ni de modéliser la barrière hémato-encéphalique.
Réduction
Le nombre d'animaux par condition expérimentale a été déterminé par une approche statistique afin de garantir la robustesse des résultats. En raison de la variabilité des réponses aux effets d’un traitement administré par voie orale chez le rongeur, une taille minimale de groupe de 10 animaux est nécessaire. Un effectif inférieur augmenterait le risque de ne pas atteindre une puissance statistique suffisante, pouvant ainsi nécessiter la répétition des expériences pour valider la fiabilité des données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les administrations par voie orale seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté, à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. Les prélèvements sanguins sublinguaux se feront sous anesthésie générale. L’état clinique des animaux sera évalué quotidiennement et attentivement en respectant les points limites mis en place et décrits dans les paragraphes 4.2.1 et 4.2.2. Ils seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Choix des espèces
Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs sont des modèles fréquemment décrits. Le rat sera choisi dans ce projet car les quantités de sang obtenues sont plus importantes que chez la souris. Etant donné que la maladie de Parkinson touche les adultes, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures décrites.
Rôle du métabolisme sur l’organisation structurale du cardiomyocyte de rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sept prélèvements de sang à la queue en deux heures, un gavage de glucose et une injection d'insuline, répétés à 20, 60 et 120 jours de vie, plus trois échocardiographies sous anesthésie : 1 350 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvements post-mortem. Les génitrices reçoivent un régime riche en graisses pendant quatre mois, et leur descendance le même régime jusqu'au sevrage, pour reproduire l'effet d'une obésité maternelle sur le cœur des petits. Le porteur indique que la manipulation des ratons peut conduire la mère à les rejeter ou à les mutiler, et que certains animaux ne survivent pas à l'anesthésie malgré l'intubation. Il évoque aussi une injection de vecteur viral pouvant provoquer une insuffisance cardiaque, sans la faire figurer parmi les procédures décrites.
Objectifs
L'obésité est un problème majeur de santé publique et sa prévalence croissante contribue à augmenter l’incidence de maladies cardiovasculaires. L'épidémie de surpoids touche les femmes enceintes et des études épidémiologiques rapportent que les enfants nés de mères obèses présentent un risque accru de cardiopathies congénitales et, à l’âge adulte, des taux plus élevés d'événements cardiovasculaires et de mortalité. Cependant, il existe une véritable lacune dans nos connaissances sur l’origine des mécanismes moléculaires conduisant au développement de ces pathologies cardiaques.Notre objectif est d’établir l’impact du dysmétabolisme périnatal sur le développement de l’insuffisance cardiaque d’origine congénitale. Nous proposons une étude longitudinale sur la descendance pour caractériser la chronologie des altérations cardiaques et les défauts d’organisation postnataux des cardiomyocytes. Nous étudierons les voies (moléculaires, métaboliques) impactées (précocement ou plus tardivement) par le dysmétabolisme maternel pouvant expliquer les altérations développementales du cœur et, pour in fine, identifier des signature spécifiques et biomarqueurs potentiels
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines d'intérêt identifiées au laboratoire dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.
Procédures
Une partie des animaux seront mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les génitrices (2 mois avant la reproduction et pendant la durée de reproduction et lactation). Les géniteurs seront sous régime riche en gras uniquement pour la reproduction. Les petits seront sous le régime maternel correspondant (riche en gras ou contrôle) jusqu’au sevrage (20 jours de vie). Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront réalisées sur animaux vigiles. Le gavage de glucose, procédure très rapide (quelques secondes) sera réalisé à 3 stades : 20, 60 et 120 jours de vie pour tester la tolérance au glucose. Le test de tolérance à l'insuline sera réalisé par injection intrapéritonéale aux 3 stades (20, 60 et 120 jours de vie). Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue (quelques secondes) est effectué sur les animaux vigiles et permet de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte sera répété 7 fois en 2 heures pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le phénotypage cardiaque sera réalisé par échocardiographie (15 minutes), sous anesthésie gazeuse légère, pour d'obtenir de nombreux paramètres morphométriques et hémodynamiques. Les mesures seront effectuées aux 3 temps, 20, 60 et 120 jours de vie (soit 3 fois pour chaque animal). L’électrocardiogramme (ECG) de surface sera réalisé aux mêmes temps à 20, 60 et 120 jours de vie : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie (animaux vigiles) et sera réalisée dans la foule de l'échographie pour réduire le nombre d'interventions. Les animaux sont placés dans un tunnel en plexiglas aéré, les quatre pattes positionnées sur des plaques métalliques permettant de suivre le rythme cardiaque. Une seconde partie des animaux vigiles seront soumis à une injection de virus (AAV) par voie systémique à 1jour de vie (veine jugulaire facilement visible à ce stade). L'intervention est très rapide (quelques secondes). Ils seront phénotypes par ECG de surface et échographie, aux 3 stades (20, 60 et 120 jours de vie). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation. Les tests métaboliques peuvent induire : une sensation de faim lors de la mise à jeun des animaux, une irritation de l'oesophage lors des administrations per os, une légère douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales et des prélèvements de sang. Les prélèvements peuvent induire également une irritation de la queue de l'animal.
Devenir
A l'issue de cette étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem. Ces prélèvements sont nécessaires pour les analyses et pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux pour notre étude (1350) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 20 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.
Raffinement
Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablement frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont agrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, bâton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anesthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anesthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anesthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont très rapides et peu douloureux. Un analgésique est administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, déshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.
Choix des espèces
Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du cardiomyocyte, qui se fait en postnatal (d'où les stades 5, 20, 60 et 120 jours de vie). - Afin d'étudier le rôle de la protéine d’intérêt sur le développement myocardique (d'où l'injection à 1 jour postnatal). Les rats sont utilisés dès le premier jour après la naissance, et euthanasiés à 4 mois maximum. Ce stade correspond au stade suffisant du développement du remodelage cardiaque. C'est également le stade de maturité totale du myocarde.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.
Modèles pathologiques induits chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 11100
Cochons d'Inde : 900
Hamsters dorés : 2100
Arthrose, encéphalomyélite auto-immune, cancer, diabète, inflammations, infections bactériennes et morsures de tiques : ces pathologies sont induites chez 28 200 rongeurs pour tester, à la demande de clients de l'industrie pharmaceutique, l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux. 14 100 souris, 11 100 rats, 2 100 hamsters dorés et 900 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue pour analyses. Le porteur indique que l'encéphalomyélite induite peut provoquer une paralysie progressive de la queue puis des membres, accompagnée d'allodynie et de douleurs persistantes, et que le modèle d'arthrose peut conduire à de l'automutilation. La surveillance annoncée repose sur des scores de paralysie, sur l'observation des pattes et sur une pesée bihebdomadaire, sans qu'aucun seuil déclenchant la mise à mort ne soit chiffré.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux tel que l’arthrose, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le cancer, le diabète, l’inflammation, l’infection parasitaire et bactérienne. Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de ces pathologies.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour le modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs administrations d’une substance, de 2 à 5 administrations. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’administration d’une première substance, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’administration d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle de cancer, les animaux vigiles ou anesthésiés reçoivent une administration d’une solution de cellules cancéreuses. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’infection bactérienne, les animaux reçoivent une solution bactérienne. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation aiguë, les animaux reçoivent une solution d’une substance au niveau de la patte. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation chronique, les animaux reçoivent une solution d’une substance. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle anti parasitaire des tiques sont déposées sur la peau des animaux. La durée du dépot des tiques sera de 5 minutes maximum. Une substance test sera inoculée en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement de chaque modèle. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Pour le modèle du diabète, les animaux reçoivent une administration d’une substance. Une chirurgie sous anesthésie générale et avec un protocole d’analgésie adapté pourra être réalisée si la substance test est administrée dans un organe cible, dans ce cas, la chirurgie sera de 1h30 maxium.
Impact sur les animaux
Le modèle d'arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations à plus ou moins long terme. Les effets liés au développement du modèle peuvent aboutir à une baisse d'activité ainsi qu'un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, ...). Ces effets peuvent apparaître à partir du 21ème jour. Le modèle d'encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres à plus ou moins long terme. Cette paralysie peut s'accompagner d'une allodynie et/ou d'une douleur plus ou moins persistante au niveau des memebres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaître le 10ème jour avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Le modèle de développement de cancer peut provoquer des douleurs liées à l'apparition des masses tumorales. Les premiers signes cliniques peuvent survenir dès l'apparition visible de ces masses. Les animaux peuvent avoir des difficultés pour se déplacer. Le modèle d'infection bactérienne peut générer différents signes cliniques liés à l'infection. Ces signes cliniques peuvent être une perte de poids, des poils hérissés, une prostration de l'animal. Le modèle de diabète peut générer différents signes cliniques tels qu'une augmentation de la consommation d'eau, une augmentation des mictions, une déshydratation, une perte de poids et une distension abdominale. Les modèles d'inflammations aiguës et chroniques peuvent engendrer de la douleur au niveau du site de l'inflammation, des rougeurs, de la fièvre ainsi qu'une perte des fonctions physiques normales. Le modèle d'infection parasitaire peut engendrer de la douleur liés aux morsures de tiques, ainsi qu'une inflammation cutanée de lazone mordue, une faiblesse générale, de la fièvre ainsi qu'un manque d'apetit. Les effets liés à ces modèles peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d'activité, baisse de la prise alimentaire) et physique (perte de poids, abscence de réflexes, immobilité). Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l'abscence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Dans le cas de développement de cancer, il s’agit de l’apparition de tumeurs solides visibles ou sanguines (leucémie). Dans le cas d’activité antibactériennes, il s’agit d’une infection qui peut engendrer de la fièvre, une prostration de l’animal et des poils hérissés. Dans le cas du diabète il s’agit d’une perte de poids, une augmentation de la prise d’eau et des mictions, et d’une augmentation de la glycémie. Dans le cas d’inflammations aiguës et chroniques, il s’agit de rougeur et/ou de fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Dans le cas d’infection parasitaire, il s’agit de morsures de tiques entraînant des rougeurs, de la fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel. Il y aura environ 55 études par année (toutes procédures confondues).
Raffinement
De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Pour le modèle de cancer, les tumeurs sont mesurées afin de suivre leurs évolutions. Pour le modèle de diabète, la glycémie est analysée régulièrement afin de suivre l’évolution du diabète. Pour le modèle antiparasitaire, le nombre et le poids des tiques détachés des animaux sont comptés. Pour le modèle d’inflammation aiguë, l’inflammation au niveau de la patte est mesurée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Pour la procédure d'arthrose, le choix du modèle dépend du volume et du mode d'administration. Pour la procédure d’encéphalomyélite auto-immune, le choix du modèle est la souris car uniquement celui-ci fonctionne sur ce modèle. Pour le modèle de cancer, le choix dépend du modèle de tumeur et du mode et du volume d'administration. Pour le modèle d'infection bactérienne, le choix dépend de l'agent pathogène. Pour le modèle de diabète le choix du modèle dépend de l'historique de la substance à tester et du volume d'administration. Pour le modèle d'inflammation aigüe, chronique et d'infection parasitaire le choix du modèle est fait selon le volume d'administration de la substance à tester. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Enseignement de travaux pratiques en expérimentation animale : Conception et réalisation de procédures sur rongeurs
- Formation professionnelle
Manipulés, gavés puis injectés dans l'abdomen par des apprenants dont certains n'ont jamais tenu un rongeur, 40 rats vont être utilisés deux jours de suite dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Tous seront tués une semaine après les travaux pratiques, pour prélèvement d'organes. Ces séances ne produisent aucune connaissance, elles valident un diplôme universitaire qui autorisera ensuite les participants à concevoir eux-mêmes des procédures. Le porteur écrit que les rats "ne subiront donc aucun stress lors de la manipulation par les apprenants", après avoir indiqué quelques lignes plus haut que cette manipulation peut engendrer un stress léger, précisément parce que les apprenants sont inexpérimentés.
Objectifs
L'objectif de ce projet s'inscrit dans le cadre d'une formation qui s'adresse à des apprenants qui vont être amenés à utiliser des animaux de laboratoire (rongeurs) dans le cadre de leur recherche. Le rat est une espèce largement utilisée en expérimentation animale. Ainsi, le but est de les familiariser avec les gestes de base couramment réalisés et de les sensibiliser au bien-être animal. Ils vont donc apprendre à tenir un rat en toute sécurité pour l'animal et l'apprenant, à réaliser des contentions permettant l'administration de substance. Si l'examen à l'issue de la formation est favorable, ils seront autorisés à manipuler des animaux de laboratoire en toute autonomie. Cette formation est donc essentielle et indispensable pour acquérir les gestes de base à l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de cette formation est que chaque apprenant puisse utiliser l'expérimentation animale à des fins scientifiques de la façon la plus éthique possible, de les familiariser avec les animaux de laboratoire (rongeurs), de leur montrer les bons gestes et surtout de leur faire prendre conscience que tout doit être réalisé en tenant compte du bien-être animal.
Procédures
Chaque animal subira une préhension/contention (1 minute maximum), un gavage (quelques secondes) et une injection intra-péritonéale (quelques secondes) par jour (sur 2 jours consécutifs).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux seront transitoires. Les animaux ressentiront une contrainte légère liée à l'administration Per Os ainsi qu'une douleur équivalente à la piqure d'une aiguille lors des injectipns intra-périronéales (douleur légère de courte durée). Chaque animal subira une préhension/contention, pouvant également engendrer un léger stress pour l'animal étant donné que les apprenants sont non-expérimentés sur animaux vivants.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés une semaine après la fin des 4 TPs et différents organes seront prélevés pour la réalisation d'analyses.
Remplacement
L'objectif de cet enseignement est de sensibiliser les apprenants aux gestes simples d'expérimentation animale sur rongeurs en respectant l'éthique et le bien-être animal. Les enseignements de TP suivis par les apprenants sont progressifs et s'inscrivent dans la démarche "jamais la première fois sur l'animal". Ainsi, après l'apprentissages des gestes simples d'expérimentation animale sur des modèles virtuels (rats et souris en peluche), le projet présenté dans le cadre de cette demande intervient en dernière position et vise à expérimenter sur des animaux vivants (rats). La théorie et la réglementation ainsi que la manipulation sur modèles virtuels ne peuvent malheureusement pas remplacer les gestes sur animaux vivants, surtout pour des apprenants,qui n'ont pour certains, jamais manipulé de rongeurs. Cet enseignement s'avère donc essentiel et indispensable pour la délivrance d'un DU en expérimentation animale niveau concepteur, qui autorise la réalisation de procédures en expérimentation animale de façon autonome.
Réduction
Chaque année, 8 animaux, séparés en 2 groupes de 4 rats seront utilisés (40 annimaux au total sur 5 ans). Chaque année, quatre groupes d'apprenants (de 4 personnes maximum / groupe) sont prévus au maximum et sont répartis sur 4 demi-journées consécutives. Ainsi, 4 animaux seront prévus par groupe, de façon à ne manipuler les animaux qu'une seule fois par jour.
Raffinement
Durant la phase de stabulation, les animaux auront été habitués quotidiennement à être manipulés. Ce sont également des animaux jeunes, donc plus facilement manipulables et non agressifs. Ils ne subiront donc aucun stress lors de la manipulation par les apprenants. Des personnes expérimentées encadreront le TP et veilleront tout au long de la procédure au bien-être animal. Les gavages seront uniquement montrés aux apprenants par une personne expérimentée. Les injections intra-péritonéales seront réalisées à deux personnes, en binôme avec un encadrant. Chaque animal ne subira qu'une seule injection par jour (l'injection intra-pérotonéale). Les autres types d'injection seront montrés sous forme de vidéo de façon à supprimer au maximum le stress et la souffrance. Si les animaux sont trop agités par le nombre de personnes présentes dans la pièce, une pause sera effectuée jusqu'à à ce qu'ils se calment.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisé en expérimentation animale. Les animaux seront livrés par un fournisseur agrée à l'âge de 6 semaines et auront une semaine d'acclimatation. Ils seront donc manipulés par les apprenants à l'âge de 7 semaines. Il s'agit d'un bon compromis pour une manipulation optimale des animaux (dociles et conditionnés de façon positive). Il n'y a aucune influence du genre. Ainsi, 4 rats mâle et 4 rats femelle seront utilisés chaque année, ce qui permettra de rappeler aux apprenants l'importance de planifier ses expérimentations en amont et de bien réfléchir aux animaux dont ils ont besoin.
Chocs septiques stériles et modèles d’exploration rapide de l’inflammation aigue systémique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1230
Le laboratoire provoque une inflammation générale par injection de lipopolysaccharide, pour qualifier ses lots de réactifs biologiques et évaluer des composés en développement. 1 230 rats et 1 230 souris vont être utilisés, tous mis à mort à l'issue, dont 2 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent l'agent inflammatoire à l'état vigile, puis le composé à tester en quelques secondes ou sur plusieurs minutes, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur juge le recours à l'animal vivant "incontournable" à ce stade préclinique. Il s'attend, dans les cas extrêmes, à des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, ces signes constituant eux-mêmes les points limites qui déclenchent l'arrêt anticipé.
Objectifs
Les phénomènes inflammatoires sont des réactions normales des organismes mis en action en réponse à une agression tels que les traumas qui induisent des lésions, ou plus généralement consécutive à une infection par un hôte étranger. Au cours des maladies chroniques hépatiques telles que la cirrhose, des phénomènes inflammatoires peuvent être induits par un franchissement de la barrière intestinale à la perméabilité dégradée par de microorganismes issu du microbiote. L’inflammation présente donc un intérêt dans nos travaux. Par ailleurs, des modèles expérimentaux basés sur le pouvoir d’activation de l’inflammation de certains composants de la paroi de bactérie (LPS ou Lipopolysaccharide) sont très amplement utilisés au laboratoire pour l’étude de l’inflammation et des évaluations de propriétés pharmacologiques sur la voie de l’inflammation de composé en développement. Ce projet propose donc des procédures simplifiées de mise en œuvre de modèles inflammation systémique chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
L’utilisation de bio réactifs au cours de procédures longues, complexes et qui engagent un nombre significatif d’animaux comporte un part de risque d’échec. Il peut s'agir par exemple d'une induction trop faible en raison d'animaux qui ne réagissent pas correctement au stimulus ou au contraire qui montrent une réaction exhacerbée qui produit des pertes d’animaux. La qualification préalable des lots de bioréactifs nécessite l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux et permet à terme de réaliser des expériences en limitant les risques d’échec Cela contribue donc à la réalisation d’expérimentation plus fiables et reproductibles, et qui nécessitent moins de répétitions.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales pour la réalisation de la phase d’induction du processus inflammatoires, les animaux à l'état vigiles subiront l'action de l'agent d'induction de l'inflammation. Pour la réalisation de l’évaluation des propriétés des composés à tester, nous pourrons traiter les animaux dans un état vigile, soit de manière aigue dite " en bolus", et dans cette situation l'administration ne dire que quelques secondes ( 5 à 10 secondes), soit de manière lente et sur une plus longue durée ( plusieurs minutes ) Ils seront anesthésiés et subiront un prélèvement sanguin terminal puis seront mis à mort sans réveil.
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure, on s’attend à observer dans les cas extrêmes des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, mais ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé.
Devenir
Les analyses biochimiques réalisées pour les mesures de niveaux de cytokines sont rélaisées sur des prélèvements terminaux. Les animaux sont mis à mort en vue de recueil de leurs organes pour l'exploration de l'expression des proteines de la phase aigue de l'inflammation notamment d'origine hépatique.
Remplacement
Disposer d’un modèle animal translationnel qui puisse permettre d’évaluer les effets de composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre cette maladie. Nous disposons de modèles in vitro qui permettent d’évaluer les propriétés anti inflammatoires de composés, cette démarche est préalable à tout expérimentation chez l’animal L’utilisation de ces méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s s’impose. Cependant, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs, et d'activer toutes les voies de signalisation qui constituent les caractéristiques de ce modèle est incontournable. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques. La contrainte est de synchroniser les évènements. La réduction du nombre d'animaux engagés dans l'expérimentation consiste en premiers lieux d'estimer correctement le nombre des animaux nécessaires.. Cette estimation est faite à priori sur la base de données expérimantales déjà connues (étude pilote) ou sur la base de données publiées dans la literature. La détermination de la taille des effectifs est basée sur la connaissance de la variabilité d'un paramètre prioritaire étudié, , et sur le niveau de signification attendu (généralement p=0.05 ce qui signifie que nous admettrons que 5% des effets observés peuvent être dus au hasard). Enfin, nous accordons aussi l’importance à la puissance statistique, généralement entre 80 et 90%, ce paramètre exprime la probabilité de détecter un effet s’il existe. Plus la puissance sera élevée, et plus le nombre d’animaux devra être important. L’effectif théorique est donc calculé à partir de ces paramètres statistiques, il permet à l’expérimentateur d’ajuster son effectif en fonction de l’importance du paramètre qu’il étudie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant leur période d’acclimatation ou d’hébergement dans l’animalerie. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Au cours de la phase aigue de l'expérience, des critères cliniques observables définissent des points limites très spécifiques au modèle, ils sont prédictifs de l'issue de l'expérience et de l'atteinte proche d'un seuil de douleur à ne pas dépasser. Ils sont appliqués pour mettre un terme rapide à l'expérience et limiter ainsi les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Nos travaux de recherche (développement de modèles d’évaluation de propriétés thérapeutiques de médicaments, protocoles de pharmacologie etc ) sont réalisés chez les rongeurs (rat et souris). Ces espèces sont largement employées dans notre domaine d’étude qui concerne les troubles métaboliques car elles sont bonnes répondeuses à des stimuli et à des actions pharmacologiques. La nécessité d’avoir accès à des échantillons biologiques frais de ces mêmes espèces est donc évidente. Les animaux utilisés seront des anaimaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.
Complément à l’évaluation des mécanismes de neuroprotection de la barrière sang-cerveau dans un modèle de pathologie périnatale avec inflammation chez le rat en développement (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les ratons utilisés naissent avec un retard de croissance provoqué, leurs mères ayant été nourries pendant les 22 jours de gestation avec un régime pauvre en protéines. 244 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 216 ratons analysés entre le premier et le vingt-huitième jour de vie. Après la naissance, ils reçoivent sous anesthésie gazeuse une injection intrapéritonéale de lipopeptide puis passent deux heures en atmosphère appauvrie en oxygène, ce qui réduit de moitié leur prise de poids sur les 24 premières heures. Les ratons sont tués à différents âges pour prélever leurs tissus, les mères après le sevrage, celles qui ont échappé au régime carencé pouvant servir jusqu'à cinq reproductions.
Objectifs
Le cerveau est un organe privilégié au sein de l’organisme, notamment du fait de l’existence de barrières sang-cerveau qui protègent l cerveau et contribuent aux besoins de celui-ci. Ces barrières sont de deux types : la barrière hématoencéphalique (entre le sang et le tissu cérébral) et la barrière sang-liquide céphalorachidien (entre le sang et le liquide qui entoure le cerveau). Au cours de la période périnatale, le cerveau par l’intermédiaire de ces barrières sang-cerveau peut être soumis à des traumatismes multiples : inflammation, hypoxie (manque d’oxygène) ou autres facteurs de risque tel que le retard de croissance intra-utérin (RCIU). Ces traumatismes, surtout lorsqu’ils sont associés, peuvent être responsables de déficiences sévères à long terme. En France, on estime que la moitié des déficiences sévères constatées chez l’enfant de 7 à 8 ans est d’origine périnatale. L’objectif de notre projet qui sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs EU1 et EU2 , est d’évaluer les lésions induites par l’inflammation sur le cerveau en développement à l’aide de différents modèles. Nous souhaitons comprendre le lien entre les lésions cérébrales et l’altération des barrières sang-cerveau. Notre projet permettra de mieux comprendre comment et pourquoi surviennent des lésions cérébrales sévères en période périnatale. Nous avons également pour objectif de mieux prendre en charge ces lésions sévères en testant l’efficacité d’une molécule neuroprotectrice pour prévenir ou diminuer ces déficiences.
Bénéfices attendus
Nous estimons que ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodévelopement. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables que dans le cadre d’un stress inflammatoire seul. Par exemple des différences de signal pourraient être visualisés en micro-IRM chez les animaux ayant subis une inflammation et une hypoxie. Par ailleurs nos premiers résultats montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions multiples à court terme. Les consequences à long terme doivent donc être caractérisées. Enfin ce projet ouvrira une perspective therapeutique interesante qui sera etayées par des données mécanistiques.
Procédures
Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagnée ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse, et à un environement hypoxique modèré pendant 2 heures. Les analyses sont ensuite effectuées entre 1 et 28 jours (216 animaux) . Certains animaux sont soumis à une IRM au plus tard 21 jours après la naissance, qui s'effectue également sous anesthése gazeuse (18 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l' établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Les ratrons soumis à l'hypoxie à l'exposition au lipopetide se nourissent moins pendant les premières 24h (augmentation de poid réduite d'environ 50 % par rapport aux controles), difference qui disparait ensuite.
Devenir
Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à differents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) protectrices existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des differentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance fetal. Par ailleurs, le role reconnu de la circulation du liquide cérébrospinal dans les processus neuroinflammatoire , en particulier comme vecteur de cellules immune et de cytokines, ne peut être reproduit in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
- Les rates gestantes ne bénéficiant pas d’un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle). - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin d’assurer la fiabilité statistique des données générées. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée. Enfin les données obtenues dans le cadre d’une étude précédente seront incorporées, ce qui limite fortement le nombre d'animaux inclus dans cette présente demande.
Raffinement
- Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - La methode du régime pauvre en protéine est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). Le poids des rates gestantes bénéficiant d’un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction - Les ratons issus du modèle RCIU seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral régulier. - Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport qui présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront transportés avec leurs mères dans des conditions de température controlée. La proximité des deux lieux géographiques (500 mètres) permet de minimiser le temps de transport. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans les études précédentes. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les dnnées déjà acquisent l'ont été avec ce modèle. LLes prélèvements et mesure de perméabilité seront effectué chez le raton après la naissance, puis chez l’animal agé de 30 jours. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU et de l'hypoxie associés ou non à l'inflammation sur l'integrité des interfaces sang-cerveau au cours du déveopement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermée (Impact sur la programmation foetale, P30).
Conséquences d’une lésion de la moelle épinière sur les fonctions érectile et éjaculatoire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Les mises au point chirurgicales ont d'abord été faites sur des cadavres de rats sortis d'expérimentations menées par d'autres équipes. 128 rats vont maintenant être opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, le temps d'implanter des électrodes et de léser la moelle épinière en moins de trente minutes, puis de stimuler les circuits nerveux de l'érection et de l'éjaculation. Lors des premiers essais, un même animal est utilisé toute la journée pour "maximiser les données", une seule stimulation par animal étant prévue ensuite. Aucune raison n'est donnée à la mise à mort des rats, le passage qui devrait l'expliquer reprenant mot pour mot celui des effets indésirables.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastrointestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur le fonctionnement de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.
Procédures
Les animaux resteront endormis durant toute la procédure, sans réveil. Les interventions, comme l’implantation d’électrodes ou la lésion de la moelle épinière, seront courtes (moins de 30 minutes). Lors des tests initiaux, un animal sera utilisé toute la journée pour maximiser les données. Une fois les paramètres de stimulation définis, chaque expérience sera plus brève, avec une seule stimulation par animal.
Impact sur les animaux
Les injections d’analgésiques/anesthésiques peuvent induire un léger stress transitoire. S'agissant de procédures sans réveil, les animaux ne subiront pas d’autres nuisances ou effets indésirables.
Devenir
Les injections d’analgésiques/anesthésiques peuvent induire un léger stress transitoire. S'agissant de procédures sans réveil, les animaux ne subiront pas d’autres nuisances ou effets indésirables.
Remplacement
La fonction sexuelle est possible grâce à l'interaction du multiples systèmes (hormonal, sensoriel, autonome et moteur), l'étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet. S'agissant d'un nouveau projet, nous avons besoin d'apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. C'est pour cela que nous avons fait des mises au point méthodologiques sur des cadavres de rats sortant d'expérimentation d'autres équipes, afin de maitriser au mieux les méthodes. La suite logique, que nous développons dans ce projet, est de passer sur animaux vivants avec des procédures sans réveil afin de récolter des données, tout en continuant de maitriser les méthodes sans risquer de douleurs pour l'animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans cette saisine, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faite sur les mêmes animaux : tests de plusieurs molécules sur le même animal... De plus, le nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques.
Raffinement
Les chirurgies ont été mise au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d'autres chercheurs. Cette formation a été faite sous la tutelle de notre vétérinaire. De plus, nous avons prévu une analgésie 30 minutes avant l’anesthésie. S'agissant d'un nouveau projet, nous commençons par des procédures sans réveil afin de ne pas infliger de douleurs dues à l'apprentissage aux animaux, tout en récoltant les données dont nous avons besoin. Les animaux seront hébergés en groupes de 2, avec de l’enrichissement. L’eau et l’alimentation sont à volonté. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou de douleur.
Choix des espèces
Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation de la moelle épinière après lésion. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement développés et actifs (6 à 8 semaines).
Prélèvements sanguins non terminaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 408
Jusqu'à 21 prélèvements sanguins caudaux au cours de la vie d'un même animal, à raison de deux par semaine ou de trois par jour, tous sur animal non anesthésié. 408 rats et 306 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire et important" de mettre en place des méthodes de prélèvement minimisant le stress, et le projet consiste à répéter ces ponctions sur des animaux réformés d'autres protocoles pour former les techniciens de l'animalerie et maintenir leurs compétences. Tous sont mis à mort à l'issue, sans qu'aucune raison en soit donnée.
Objectifs
Il est nécessaire et important de mettre en place des méthodes de prélèvements sanguins minimisant le stress pour les animaux. De ce fait il parait important d’adapter les méthodes de prélèvement et de former le personnel dans cet optique. Chaque technicien embauché suit une formation interne allant de l’entrée à l’animalerie jusqu’aux compétences les plus techniques à réaliser. Pour toutes les formations impliquant une manipulation d’animaux, un maintien de compétence est nécessaire. Ce genre de formation se fera sur des animaux d’étude réformées (DAP déjà présentes, réutilisation) n’ayant pas reçu toutes les manipulations possibles proposées dans la procédure dans laquelle ils sont passés ;
Bénéfices attendus
Cette procédure permettra d'anticiper l'évolution de la réglementation en termes de bien-être animal (avec objectif principal de réduire au maximum le stress des animaux lors de prélèvements de sang) et d’avoir un personnel qualifié aux procédures internes, permettant ainsi une homogénéité de performance dans nos techniques et notre suivi du bien-être des animaux quel que soit le personnel présent.
Procédures
Prélèvement sanguin : sur toute la vie de l’animal : jusqu’à 21 prélèvements caudaux (animaux non anesthésiés), - à une fréquence de 2 prélèvements caudaux par semaine (quelques minutes), - ou 3 prélèvements par jour avec un repos de 7 jours entre 2 phase de prélèvement (quelques minutes). Les autres modes de prélèvements seront faits à 1 semaine d’intervalle chacun (avoir au moins 1 semaine de repos entre 2 prélèvements) sur animaux non anesthésiés (quelques minutes)
Impact sur les animaux
Le stress dû à la prise de sang, l’anesthésie et la contetion.
Devenir
A l’issu de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle a pour but de former des personnes à la manipulation des animaux. Le remplacement du modèle animal est donc impossible.
Réduction
Pour ce projet, nous utiliserons des animaux de réforme afin de limiter l’utilisation d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet a pour but d'améliorer les méthodes de prélèvements présentes au sein de l’entreprise. En effet certaines techniques sont de plus en plus discutée par les institutions. Nous devons donc trouver d’autres moyens pour remplacer cette méthode. Du fait de sa raison éducative, cette procédure sera réalisée sous tutelle d’une personne experte et compétente, connaissant les risques liés aux techniques réalisées et aux solutions pour les résoudre. Cela fait aussi partie de l’apprentissage du formé d’apprendre les mesures prises afin de réduire au maximum les nuisances sur les animaux. L’observation et le suivi du bien-être de ces animaux sera précis et adapté à ce qu’ils auront subi afin de mettre en lumière le plus rapidement possible un effet indésirable et de le traiter au mieux. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et des points limites adaptés. Une éventuelle analgésie pourra être effectuée si cela est nécessaire.
Choix des espèces
Nous travaillons avec ces deux espèces (rat et souris), il est primordial que le personnel soit formé à l’ensemble des techniques utilisant ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade adulte, comme pour nos études.
Complément à l’évaluation des mécanismes de neuroprotection de la barrière sang-cerveau dans un modèle de pathologie périnatale avec inflammation chez le rat en développement (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des rates gestantes et leurs ratons nouveau-nés composent les 244 rats de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et tous mis à mort. Dix femelles sont mises à la reproduction pour une nuit, contrôlées par frottis vaginal sans anesthésie, puis soumises pendant les vingt-deux jours de gestation à un régime pauvre en protéines qui peut les rendre inactives et leur faire perdre du poids. Leurs petits reçoivent après la naissance une injection intrapéritonéale de lipopeptide sous anesthésie gazeuse et passent deux heures en atmosphère appauvrie en oxygène, ce qui divise par deux leur prise de poids dans les vingt-quatre heures suivantes, et dix-huit d'entre eux subissent en plus une IRM dans un second établissement. Les ratons sont tués à différents âges pour prélèvement des tissus, les mères après le sevrage.
Objectifs
Le cerveau est un organe privilégié au sein de l’organisme, notamment du fait de l’existence de barrières sang-cerveau qui protègent l cerveau et contribuent aux besoins de celui-ci. Ces barrières sont de deux types : la barrière hématoencéphalique (entre le sang et le tissu cérébral) et la barrière sang-liquide céphalorachidien (entre le sang et le liquide qui entoure le cerveau). Au cours de la période périnatale, le cerveau par l’intermédiaire de ces barrières sang-cerveau peut être soumis à des traumatismes multiples : inflammation, hypoxie (manque d’oxygène) ou autres facteurs de risque tel que le retard de croissance intra-utérin (RCIU). Ces traumatismes, surtout lorsqu’ils sont associés, peuvent être responsables de déficiences sévères à long terme. En France, on estime que la moitié des déficiences sévères constatées chez l’enfant de 7 à 8 ans est d’origine périnatale. L’objectif de notre projet qui sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs EU1 et EU2 , est d’évaluer les lésions induites par l’inflammation sur le cerveau en développement à l’aide de différents modèles. Nous souhaitons comprendre le lien entre les lésions cérébrales et l’altération des barrières sang-cerveau. Notre projet permettra de mieux comprendre comment et pourquoi surviennent des lésions cérébrales sévères en période périnatale. Nous avons également pour objectif de mieux prendre en charge ces lésions sévères en testant l’efficacité d’une molécule neuroprotectrice pour prévenir ou diminuer ces déficiences.
Bénéfices attendus
Nous estimons que ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodévelopement. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables que dans le cadre d’un stress inflammatoire seul. Par exemple des différences de signal pourraient être visualisés en micro-IRM chez les animaux ayant subis une inflammation et une hypoxie. Par ailleurs nos premiers résultats montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions multiples à court terme. Les consequences à long terme doivent donc être caractérisées. Enfin ce projet ouvrira une perspective therapeutique interesante qui sera etayées par des données mécanistiques.
Procédures
Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagnée ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse, et à un environement hypoxique modèré pendant 2 heures. Les analyses sont ensuite effectuées entre 1 et 28 jours (216 animaux) . Certains animaux sont soumis à une IRM au plus tard 21 jours après la naissance, qui s'effectue également sous anesthése gazeuse (18 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l' établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Les ratrons soumis à l'hypoxie à l'exposition au lipopetide se nourissent moins pendant les premières 24h (augmentation de poid réduite d'environ 50 % par rapport aux controles), difference qui disparait ensuite.
Devenir
Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à differents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) protectrices existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des differentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance fetal. Par ailleurs, le role reconnu de la circulation du liquide cérébrospinal dans les processus neuroinflammatoire , en particulier comme vecteur de cellules immune et de cytokines, ne peut être reproduit in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
- Les rates gestantes ne bénéficiant pas d’un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle). - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin d’assurer la fiabilité statistique des données générées. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée. Enfin les données obtenues dans le cadre d’une étude précédente seront incorporées, ce qui limite fortement le nombre d'animaux inclus dans cette présente demande.
Raffinement
- Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - La methode du régime pauvre en protéine est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). Le poids des rates gestantes bénéficiant d’un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction - Les ratons issus du modèle RCIU seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral régulier. - Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport qui présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront transportés avec leurs mères dans des conditions de température controlée. La proximité des deux lieux géographiques (500 mètres) permet de minimiser le temps de transport. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans les études précédentes. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les dnnées déjà acquisent l'ont été avec ce modèle. LLes prélèvements et mesure de perméabilité seront effectué chez le raton après la naissance, puis chez l’animal agé de 30 jours. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU et de l'hypoxie associés ou non à l'inflammation sur l'integrité des interfaces sang-cerveau au cours du déveopement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermée (Impact sur la programmation foetale, P30).
Travaux pratiques sur le modèle « rat »
- Formation professionnelle
Réformés à neuf mois puis proposés à l'adoption, sauf trente par an tués pour des dissections de BTS, 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit jusqu'à vingt administrations par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse ou orale au cours de l'année scolaire, et jusqu'à cinq prises de sang à la queue, à la saphène ou à la jugulaire, cette dernière sous anesthésie gazeuse. Les gestes sont faits par des apprentis, avec douleurs éventuelles et hématomes au point de ponction, chaque rat étant manipulé au maximum une fois par jour ouvré. Le porteur présente ces séances comme un moyen de fournir aux entreprises des techniciens "compétents techniquement et opérationnels réglementairement dès leur entrée", et met en avant une animalerie pédagogique rénovée cette année.
Objectifs
Ce projet consiste à former des personnes travaillant au sein d’établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques en tant qu’applicateur de procédures expérimentales sur l’espèce rat. Le but est d’acquérir les techniques de manipulations classiques pour administrer ou prélever des substances en évitant toute souffrance pour l’animal et en garantissant la sécurité de l’opérateur et de l’animal. En parallèle, avec l’utilisation de l’animalerie pédagogique, les apprenants avec encadrement sont initiés aux différentes techniques de base en matière d’hébergement, élevage , techniques d’anesthésie, soins pré/post opératoires et observations des animaux dans le respect du bien être animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux pratiques font partie intégrante de la formation des techniciens applicateur de procédures utilisant des animaux à des fins scientifiques. L’obtention de leur diplôme ou habilitation leur donne la possibilité de travailler dans le cadre de projets scientifiques sur animaux vivants et permet aux employeurs de bénéficier de techniciens compétents techniquement et opérationnels réglementairement dès leur entrée dans l’entreprise. La méthode d’apprentissage basée sur les règles de bien être permet d’acquérir les bons gestes afin de garantir sécurité et respect éthique de l’animal. L’animalerie pédagogique permet aux apprenants d’acquérir d’autres notions importantes tel que le maintien des ces animaux en milieu confiné, l’observation quotidienne, l’élevage, l’hygiène et la prophylaxie. L’acquisition des ces compétences théoriques et pratiques démontre l’importance d’avoir des animaux hébergés dans de bonnes conditions et une approche des règles de bien être facilite leur manipulation. Les entreprises sont à la recherche de personnel formé et autonome rapidement. Notre établissement est très réputé dans la formation de techniciens applicateurs grâce à notre expertise de formateurs techniques reconnus depuis de nombreuses années et un outil pédagogique tel que l’animalerie complètement rénovée cette année.
Procédures
Toutes les administrations et prélèvements seront réalisées sur animaux vigiles sauf le prélèvements sanguin à la veine « jugulaire » qui est effectué sous anesthésie gazeuse. Le nombre d’administrations et de prélèvements sanguins pour chaque animal est inférieur à 20 pour une année scolaire.Les différentes voies d'administrations sont la voie sous cutanée, intra péritonéale, intra musculaire, intra veineuse et orale. L'animal est soumis à 2 administrations maximum par semaine et la durée d'administration est inférieure à 1 minute. Le nombre d'administrations pour un animal est inférieur à 20. Les prélèvements sanguins sont effectués à la veine caudale, saphène ou jugulaire 1 fois par semaine maximum. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute. Le nombre de prélèvements pour un animal est inférieur à 5. Pour l'anesthésie gazeuse, l'induction et la durée d'anesthésie est inférieure à 5 minutes. A la suite du prélèvement le réveil de l'animal est inférieur à 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces séances de travaux pratiques sont faiblement invasives. Les nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation et aux douleurs éventuelles associées aux injections effectuées par des étudiants en apprentissage. La prise de sang peut également engendrer un hématome au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux sont conservés à l'issue de cette procédure sauf 30 animaux maximum par an (les plus âgés) utilisés dans le cadre du programme de BTS pour des dissections. Le reste des animaux est maintenu dans l'animalerie et sert aux apprenants pour l'acquisitions de compétences comme l'observation, l'entretien, ou la manipulation. Ces animaux sont proposés à l'adoption à l'âge de 9 mois.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau applicateur), il est nécessaire que les personnes pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (intramusculaire,sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse et voie orale sur animal vigile ou anesthésié) pour les maîtriser au mieux et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations sans animal ou avec « peluche »). La réalisation d’interventions directes sur l’animal, avec encadrement professionnel, est incontournable et reste l’objectif principal de ces formations professionnelles. Le but étant de permettre aux futurs applicateurs d’acquérir les bons gestes en évitant stress et souffrance aux animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des personnes (voir annexe 3). Ce calcul est fonction du nombre de sesssions réalisées pendant une semaine en tenant compte du nombre maximum d'apprenants. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont aussi utilisés pour des travaux pratiques hors projet comme le sexage, la préhension, les contentions,les activités zootechniques. Cette double utilisation permet de réduire le nombre d'animaux. Le nombre de rats utilisés au maximum sur 1 semaine est de soit 56 cages. Cependant afin de réduire le nombre d'animaux utilisés tout en maintenant des phases de repos nécessaires au bien être de nos rats, les sessions de travaux pratiques sont réparties tout au long de la semaine en alternant travaux pratiques "projet" avec des travaux pratiques "hors projet". Le rat est utilisée 1 fois par jour ouvré au maximum avec 2 administrations différentes par semaine ou 1 prélèvement sanguin par semaine. Cette organisation nous permet de diminuer le nombre de rats à 120 par an soit une diminution de 30%. Ce nombre sera adapté chaque année scolaire en fonction du nombre d'apprenants. Les sessions de formation courtes "applicateurs" sont placées lors des congés scolaires afin d'utiliser les mêmes animaux.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés en groupe socialement harmonieux de 2 ou 3 animaux par cage. Les animaux bénéficient d’un programme d’enrichissement alternatif et évolutif (Exemple: couche épaisse de copeaux au dessus des micro plaquettes, des tunnels et des bâtons à ronger). Tous les animaux sont entraînés en début d’année scolaire par les apprenants en classe de terminale bac pro TEA lors des premières séances de travaux pratiques. Les classes de seconde ou les premières années de BPTAUE débutent par l'habituation puis la préhension au contact applicateur/animal. Une attention particulière est portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. Les élèves peuvent également proposer des mesures de raffinement observées pendant leur période de stage en entreprise comme une nouvelle technique de contention. Après chaque procédure d'administration ou de prélèvement, les apprenants effectuent un acte de renforcement positif (récompense alimentaire, caressing). Tous les animaux sont suivis avant, pendant et après les manipulations avec mise en place d'un suivi clinique avec points limites et utilisation d'analgésiques le cas échéant
Choix des espèces
Le rat est une des espèces nécessaires à l’apprentissage du futur technicien applicateur de procédures expérimentales sur animaux. La rat fait parti des espèces les plus utilisées en recherche (4ème au classement en 2022 avec environ 7,76%). Les rats sont âgés au minimum de 4 semaines en début de projet et seront mis en réforme à 9 mois d’âge pour une adoption éventuelle. Cette période correspond globalement à une année scolaire permettant au apprenants de manipuler des animaux tout juste sevrés et des animaux plus vieux et donc plus gros en fin de cycle. L’âge de réforme et la proposition à l’adoption se fait en fin d’année scolaire généralement. Avec des animaux de 9 mois, l’espérance de vie pour les adoptants reste intéressante.
Approches thérapeutiques pour améliorer les capacités ventilatoires et locomotrices suite à un trauma cervical sur des modèles précliniques murins : combinaisons innovantes en neurostimulation
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 966
966 rats et 924 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant d'abord une contusion ou une laminectomie de la moelle épinière cervicale de moins de quarante minutes. La lésion paralyse d'un côté les pattes avant et arrière et coupe la conduction nerveuse vers l'hémidiaphragme correspondant, réduisant la capacité respiratoire de l'animal. Suivent, cinq fois par semaine pendant deux à trois semaines, des séances de stimulation musculaire de trente minutes sous anesthésie et de stimulation médullaire de dix minutes sur animal éveillé, plus des injections sous-cutanées et l'injection d'un matériau végétal dans la moelle. Tous sont tués pour analyses histologiques, le porteur situant son objectif au stade de la preuve de concept tout en écrivant que "trouver une solution est indispensable" pour les patients dépendants d'un respirateur.
Objectifs
Chaque année, près de 500 000 personnes dans le monde subissent des lésions de la moelle épinière, que ce soit à la suite d'un accident ou d'une autre cause. La plupart de ces blessures touchent la région cervicale, ce qui entraîne non seulement une paralysie des muscles, mais aussi une réduction importante de la capacité pulmonaire, ce qui peut entraîner des difficultés respiratoires graves. De nombreuses personnes tétraplégiques (paralysées des quatre membres) ont besoin d’une assistance respiratoire, parfois à vie, ce qui a un fort impact sur leur qualité de vie et sur la société en général. Nos recherches visent à trouver des solutions alternatives à l’utilisation permanente de la ventilation mécanique. Dans ce cadre, nous travaillons sur des stratégies de réparation des réseaux neuronaux et des fonctions musculaires, en combinant des approches de stimulation neuromusculaire et nerveuse et des agents pharmacologiques. Pour tester nos idées, nous utilisons des modèles animaux bien établis dans la recherche scientifique. L'objectif de notre projet est de combiner ces différentes techniques pour maximiser la réparation après une lésion de la moelle épinière. Nous utilisons principalement des souris et des rats pour nos expérimentations, car ce sont des modèles qui ont fait leurs preuves. Par exemple, nous provoquons une lésion de la moelle épinière au niveau du cou, ce qui entraîne une paralysie des muscles respiratoires et des membres d’un côté (atteinte unilatérale). Cependant, ces animaux gardent une certaine capacité à respirer et à bouger, car certains circuits nerveux restent intacts. Enfin, nous avons pour objectif de tester de nouvelles techniques de réparation en combinant la stimulation neuromusculaire et l’ingénierie tissulaire. Nous veillons à respecter les principes éthiques de la recherche, notamment la règle des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner l'utilisation des animaux dans les expériences
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est d’apporter des preuves de concept de la récupération de l’activité ventilatoire partielle ou totale après une lésion médullaire cervicale, et ce par la combinaison d’approches thérapeutiques. De plus, nous attendons un effet de ces thérapeutiques sur la récupération de l'utilisation de membres supérieurs par les memes phénomènes de neuroplasticité induit par nos approches. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Notre projet de recherche préclinique visera à démontrer qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Certains patients restent dépendants à vie d’un respirateur, les coupant d’une vie sociale et des centres de rééducation, et diminuant par conséquent leur espérance de vie. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie qui consiste en une contusion ou une laminectomie (durée inferieure à 40 min) réalisée sous anesthésie et analgésie. Il s’agit du modèle de référence pour simuler une lésion de la moelle épinière qui est l’objet du projet de recherche. Par la suite les animaux seront impliqués dans différents traitements seuls ou combinés tels que la stimulation des muscle (30 min, 5 fois par semaine pendant 2 à 3 semaines sous anesthésie), la stimulation de la moelle épinière (10 min, 5 fois par semaine pendant 2 à 3 semaines, animal vigile), l’agent pharmacologique par voie sous-cutanée (injection de quelques secondes, 5 fois par semaine pendant 2 semaines, animal vigile), ou encore de l’ingénierie tissulaire (une injection unique sous anesthésie et analgésie). Ce dernier consiste en une injection d’un matériau végétal visant la régénération de la moelle épinière. Tous les animaux seront également impliqués dans des tests fonctionnels (déplacements libres dans un cylindre ou un espace libre mais restreint, filmé pendant 5 à 10min, à raison d’une fois par semaine).
Impact sur les animaux
Les nuisances principales attendues sur les animaux sont celles induites par la chirurgie de lésion médullaire. Lors de l’anesthésie, il y a un risque d’hypothermie et de douleur au réveil. La lésion entraine également un inconfort dû à la perte sensori-motrice des pattes postérieures et antérieures correspondant au côté lésé, ainsi qu’une réduction de la capacité respiratoire liée à l’atteinte de la conduction nerveuse vers l’hémi diaphragme correspondant au côté lésé de la moelle épinière. Ces atteintes sont cependant unilatérales, de fait qu’elle permette à l’animal de se mouvoir, de se nourrir et de respirer mais cela peut entrainer un inconfort du fait de ne pas se mouvoir complètement librement. Une hypoventilation (diminution du volume respiratoire) est possible les premiers jours mais compensée par une augmentation de la fréquence respiratoire. Il peut aussi exister un risque de soif et de malnutrition si les animaux n’arrivent pas à se nourrir et boire suffisamment les jours après la chirurgie. Les injections par voie sous-cutanée sont faites sans anesthésie donc cela peut entrainer un stress au moment de la préhension. Lors des tests fonctionnels, les animaux pourront ressentir du stress lié à la découverte d’un nouvel environnement et à la limitation de leur liberté d’expression physique pour les tests en enceinte de taille restreinte. Enfin, les traitements n’entrainent pas d’effets secondaires connus mais ils peuvent engendrer un stress lors de la préhension et du positionnement dans un environnement limité (notamment pour s’assurer que l’animal est bien dans le champ de la stimulation par exemple).
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'y a pas de modèle expérimental clinique autre que les sujets humains ou animaux pour étudier les réponses physiologiques intégrées. Ce projet a pour but de développer des preuves de concept de réparation d’une neuropathologie pour laquelle aucune thérapie n’est proposée aux patients. Nous ne serions pas en mesure d'effectuer les manipulations nécessaires chez l'homme (par exemple, une intervention pharmacologique dans les systèmes de neurotransmetteurs, des tests neurochimiques, des prélèvements de moëlle épinière), et nous devons donc recourir à l'expérimentation sur les espèces de mammifères non humains. Les connectivités neuronales de ces systèmes intégrés nécessaires pour mener "des études de modélisation" ne sont pas disponibles, ou encore, aucun comportement suite à un traitement innovant ne peut être prédit, et il n'existe actuellement aucun substitut à l'expérimentation animale. Les concepts qui ont guidé cette recherche sont nouveaux dans le domaine et, à ce titre, doivent être soigneusement étudiés dans des situations biologiquement significatives.
Réduction
Dans ce projet, le nombre total d’animaux impliqués sera de 1890. Les mêmes animaux sont utilisés pour diverses études (fonction, biochimie, anatomie). Nous analysons plusieurs paramètres sur un même animal, la localisation ou l'expression de certains antigènes en immunohistochimie. Les données sont comparées avec des tests statistiques adaptés et la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Il nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Toutes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie et analgésique. Les animaux auront bénéficié d’une acclimatation après réception pendant 1 à 2 semaines. Les animaux sont maintenus de 2 à 4 par cage après la chirurgie pour conserver les liens sociaux et hiérarchiques dans la cage. Ils sont regroupés au plus tard lendemain de la chirurgie pour limiter la période d’isolement. Ils sont réhydratés en post-opératoire avec une injection sous-cutanée de sérum physiologique et nous utilisation de plaques chauffantes au cours et après l’anesthésie, jusqu’à 2h après le réveil (période de surveillance post-chirurgicale). Un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (ajout de briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Nous réalisons un changement de la litière deux fois par semaine et une surveillance des animaux tous les jours (prise en compte du comportement et des expressions faciales des animaux), ainsi qu’un traitement si présence de plaies (pommade grasse si eczéma ou irritation...) Ces contrôles enregistrés et validés par la structure locale chargée du Bien Être des Animaux, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie. Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre structure locale chargée du Bien Être des Animaux et en interagissant avec le vétérinaire référant.
Choix des espèces
Rats et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche préclinique sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez la souris et le rat et de nombreux tests sensorimoteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion (notamment par immunomarquages). Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère, l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit en moyenne 20 à 30g et 250-300g, respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes.