Rats

480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant jusqu'à douze séances hebdomadaires d'enregistrement cardiaque d'une heure, deux chirurgies et jusqu'à six séries d'injections. La première opération, de soixante minutes, sert à administrer un produit qui provoque l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cœur, et les injections répétées détruisent la fonction des nerfs vagues, ce dont le porteur affirme que cela reste sans impact sur l'état général des animaux dans les conditions de l'étude. La seconde chirurgie, de quatre-vingt-dix minutes, est menée sans réveil, tous les rats étant tués pour l'analyse histologique des cœurs et des cerveaux. L'effectif repose sur des groupes de 15 animaux, le porteur reconnaissant que la moitié pourrait suffire si aucune différence n'apparaît entre mâles et femelles à mi-parcours.

Objectifs

La maladie de Parkinson est liée à la dégénérescence de certains neurones dans le cerveau, associée à l’accumulation de la protéine alpha-synucléine. En plus des symptômes moteurs caractéristiques de la maladie, il existe de nombreux symptômes non-moteurs qui sont très invalidants. Parmi ces symptômes non-moteurs, l’hypotension orthostatique (baisse soudaine de la pression artérielle lors du passage d’une position couchée ou assise à une position debout) est fréquente chez les patients, provoquant des étourdissements et vertiges qui augmentent le risque de chute. On observe également une diminution de la variabilité de la fréquence cardiaque et d’autres troubles de la régulation du rythme cardiaque dont la fréquence et l’intensité varient d’un patient à l’autre. Cependant, il existe des preuves que l’accumulation d’alpha-synucléine ne se restreint pas au cerveau et touche également des organes périphériques dont le cœur. En effet, il existe des neurones situés dans le cœur qui constituent le système nerveux intracardiaque et qui jouent un rôle important dans la régulation de la fonction cardiaque. Les neurones cardiaques intègrent les informations en provenance des systèmes nerveux sympathique et parasympathique, permettant ainsi d’assurer le contrôle de l’activité du cœur. Ils pourraient être affectés dans la maladie de Parkinson et ainsi contribuer directement aux troubles cardiaques. Le rôle potentiel de ces neurones cardiaques dans la maladie de Parkinson reste inconnu à ce jour et c'est ce que nous cherchons à mettre en évidence dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques retrouvés dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alphasynucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent. L'évaluation des troubles cardiaques permettrait de mettre en évidence l'intérêt probable de modifier la prise en charge thérapeutique des patients en incluant de nouvelles molécules permettant de limiter ces dysfonctionnement.

Procédures

Tous les animaux (n=480) seront soumis à deux tests comportementaux moteurs (un spontané et un nécessitant une légère contention de quelques secondes) puis à une anesthésie gazeuse de moins de 10 minutes permettant de raser l'animal et de poser des électrodes au niveau du thorax pour mesurer pendant 1 heure l'activité cardiaque sur l'animal vigile. La mesure se fait par télémétrie ; l'animal est libre de ses mouvements pendant la mesure. Cette mesure est répétée une fois par semaine soit 6 fois pour la moitié des animaux et 12 fois pour les animaux restants. Une chirurgie d'une durée de 60 minutes sera réalisée sous anesthésie et couverture médicamenteuses anti-douleurs. Cette chirurgie permet d'administrer un produit qui provoque une accumulation d'alpha synucleine aun niveau cardiaque. Les animaux vigiles recevront une injection 1 fois par jour pendant 3 jours, à deux semaines d'intervalle (3 fois pour la moitié des animaux (n=240) et six fois pour la seconde moitié (n=240)) permettant la perte de fonction des nerfs vagues. Puis après six et/ou douze semaines, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux. 240 animaux seront soumis à une seconde chirurgie de 90 minutes permettant de faire des mesures de l'activité cardiaque et de la pression artérielle. Les animaux seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable (pour prélèvements). 240 animaux auront une seconde chirurgie sans réveil et sous couverture anesthésique et analgésique (pour d'autres prélèvements).

Impact sur les animaux

Léger stress transitoire lors des pesées, injections, inductions et réveil d'anesthésie, et tests comportementaux. Légère douleur transitoire lors des injections. Légère gêne pendant l'heure de port des électrodes. Léger inconfort transitoire lors du réveil après anesthésie. Pendant les jours suivant la chirurgie, douleur et inconfort minimisés par les antalgiques et légère perte de poids transitoire. Dans les conditions de vie des animaux dans ce projet, la perte de fonction des nerfs vagues n'a pas d'impact sur l'état général des animaux.

Devenir

Tous les animaux (n=480) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de plusieurs paramètres physiologiques tels que l'activité électrique du coeur et la pression artérielle, ainsi que la réalisation des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.

Remplacement

Des approches in silico ou in vitro ou des données obtenues chez les patients existent et donnent de l'information mais ces approches ont des limites et à ce stade d'avancée des connaissances, il est nécessaire de passer au modèle in vivo pour avoir un système entier et intégré.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance statistique. Ces critères prenent en compte le risque de possibles décès expérimentaux ou d'origine non contrôlée et impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par lot soit 480 rats mâles et femelles. Des analyses statistiques à plusieurs variables seront effectuées. Les deux sexes seront étudiés en parallèle. Après avoir expérimenté la moitié des animaux mâles et femelles, si une différence est mise en évidence, l'intégralité des animaux du projet seront nécessaires, en revanche si aucune différence n'apparait, nous pourrons grouper les résultats sur les deux sexes et ainsi n'utiliser que la moitié de l'effectif total des animaux de ce projet.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec contrôle de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale et sans délai de ceux-ci. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson puisque les réseaux neuronaux sont similaires à ceux de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment de la première chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.

Opérés du cerveau sous anesthésie générale pendant une heure à une heure trente, 350 rats enchaînent ensuite jusqu'à douze semaines d'entraînement, cinq jours sur sept, sous restriction alimentaire maintenue à 90 ou 95 % de leur poids de forme pour garantir leur motivation à obtenir une récompense. Tous sont tués à l'issue pour analyse des cerveaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce que cette étude servira surtout de pilote afin de cibler les régions cérébrales visées lors de "procédures plus lourdes et invasives" prévues ensuite. La tâche imposée aux rats n'est jamais décrite, désignée seulement comme un changement de règle spatiotemporelle et une tâche comportementale que le porteur juge non stressante en soi.

Objectifs

L’objectif général du projet est de déterminer les réseaux neuronaux mis en jeu lors d’une adaptation comportementale suite à des changements de règles spatiotemporelles. L’objectif premier est d’évaluer, par imagerie moléculaire, l’implication d’un réseau entre deux zones du cortex. Cette étude nous apportera des informations importantes et nouvelles sur le rôle de ces régions cérébrales dans la flexibilité comportementale, mais elle servira également de pilote pour pouvoir cibler précisément les régions cérébrales impliquées lors de procédures plus lourdes et invasives qui auront lieu dans une prochaine étude.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la flexibilité comportementale. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements préfrontaux et de flexibilité cognitive ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions).

Procédures

Dans ce projet, tous les rats subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée ~1h-1h30) pour une injection dans le cerveau et un entraînement comportemental, qui nécessite un apport de nourriture contrôlé pour une durée maximale de 12 semaines, à raison d'une séance d'au maximum 1h, à un rythme d'au minimum 5 jours sur 7.

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Le poids de l’animal est vérifié régulièrement et ne doit pas descendre en-dessous de 90-95% de son poids de forme théorique pour plus de deux jours consécutifs. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’injection cérébrale de composés est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un changement de règle spatiotemporelle nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise incorporation du traceur). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique classique dans le domaine sera utilisée.

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés au moins 2-3 jours avant la chirurgie, afin de les habituer à l’expérimentateur. Pour la procédure chirurgicale initiale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes, selon une grille de score et de suivi post-opératoire. Concernant la perfusion intracardiaque, nous utilisons une overdose d’euthanasiant et vérifions que les réflexes sont abolis avant de procéder à l’incision de la cage thoracique. En pilote, nous tentons une technique de raffinement (ajout d’un anesthésiant à l’euthanasiant, qui peut être douloureux au point d’injection) et vérifierons qu’elle ne compromet pas les résultats immunohistochimiques. Cette méthode pourra ensuite être généralisée. En pilote également, dans l'optique d'une future DAP avec des procédures plus invasives, nous évaluerons l'utilisation d'un équipement comportemental plus adapté pour des animaux porteurs d'implants cérébraux. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont en effet largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car ils sont grégaires, intelligents et présentent de nombreuses capacités comportementales similaires aux sujets humains. De plus, la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences, âge auquel les structures cérébrales sont matures.

Le bord de la paupière est incisé puis suturé sur un œil de ratons qui n'ont pas encore ouvert les yeux, intervention de dix minutes sous anesthésie gazeuse et analgésie oculaire locale. Douze rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour prélever le tissu cérébral. L'œil reste fermé quatre, sept ou dix jours pour reproduire l'amblyopie humaine, la mère tentant régulièrement d'arracher les points sur ses petits, ce qui conduit le porteur à prévoir 25 pour cent d'échec. Le stade choisi correspond aux jours 13 à 24 après la naissance, période où le fonctionnement du système visuel dépend le plus de l'expérience visuelle.

Objectifs

Notre projet est de comprendre la capacité de transformation (plasticité) des neurones lors de l’adaptation à une différence de vision entre les deux yeux dans l’enfance afin de mieux traiter l’amblyopie, une perte de vision d’un œil, l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, l’œil étant fonctionnel. Elle est due à une perte de la capacité des neurones à répondre aux signaux visuels en provenance de l’œil le plus faible ou déviant. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux. Pendant une période précoce, chez le petit enfant où la capacité du système nerveux à se modifier en fonction de l’expérience du monde environnant est la plus grande, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut de fonctionnement des neurones excités par les signaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires des transformations neuronales induites par des signaux visuels discordants entre les deux yeux au cours du développement neuronal en mimant l’amblyopie sur le jeune raton, par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux.

Bénéfices attendus

L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité, avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cerveau aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.

Procédures

Le bord des paupières d’un œil de l’animal seront suturés avant l’ouverture des yeux. Le raton sera disposé sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Avant de procéder aux points de suture, une incision devra être faite sur le bord de la paupière pour permettre aux deux paupières de se coller l’une à l’autre durant le processus de cicatrisation. Après le réveil le raton sera remis à la mère. Durée totale de l’intervention : 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture des paupières, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture. Dans ces deux cas, l’animal sera écarté pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Devenir

Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.

Réduction

• Les structures cérébrales étudiées ne présentant pas de différences entre mâles et femelles, nous utiliserons les animaux des deux sexes ce qui limitera le nombre d'animaux à euthanasier. • Le temps de suture de 10 jours est le plus délicat à obtenir sans ouverture de l’œil, car il est connu que les sutures se relâchent au bout de quelques jours et que la mère des ratons tente d’enlever les points sur les petits non sevrés. Le travail étroit avec un vétérinaire qui interviendra et formera le personnel permettra de réduire le nombre d’essais et donc de réduire le nombre d’animaux. Notamment l'incision du bord de la paupière qui sera entrepris permettra une fermeture pérenne de la paupière supérieure avec la paupière inferieure et donc une diminution du taux d’échec et du nombre d’animaux. • L'analyse de l'expression des gènes nécessitera peu de tissu animal. A partir d’un cerveau de rat congelé, une quarantaine de coupes fines seront obtenues. Nous aurons besoin pour atteindre une significativité statistique pour chaque temps de privation monoculaire de lumière de 3 rats suturés pour chacune des 3 durées de suture. Nous prévoyons d’après notre expérience passée 25 % d’échec du maintien de la fermeture de l’œil. Nombre de rat = 3 rats suturés pour chacune des 3 durées (4, 7, et 10 jours) = (3 x 3) + 25 % = 12 rats

Raffinement

Pendant la suture de la paupière, les ratons seront maintenus sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Les ratons seront remis sous la mère immédiatement après le réveil post-anesthésie, et surveillé quotidiennement par un personnel expérimenté. Vérification sera faite que la mère les reprendra bien en charge lors du change des cages. Ils seront observés quotidiennement pour vérifier qu’ils sont bien nourris, que les sutures sont en place et bien tolérées. Nous utiliserons des morceaux de papier ciselé comme matériaux de nidification, des bûchettes en peuplier pour répondre aux besoins naturels des rongeurs ainsi que des tunnels en cartons pour réduire l‘ennui et diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité aux animaux. Les animaux auront libre accès à la nourriture et à l’eau, seront maintenus à une température et une hygrométrie ambiante contrôlées avec un cycle lumière/obscurité artificielle de 12 h. En cas de problème lié à la suture (par exemple une infection) l’animal sera écarté du lot pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus utilisé comme décrit actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de la plasticité du système visuel. Entre les jours 13 et 24 postnataux, pendant la période critique de développement au cours de laquelle le fonctionnement du système visuel est particulièrement dépendant de la qualité de l’expérience visuelle dont bénéficie le sujet.

Le nerf sciatique droit de 75 rats est sectionné puis suturé sous anesthésie générale, opération de quarante minutes qui leur fait perdre la motricité et la sensibilité de la patte arrière. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et s'achèvent sans réveil, le nerf étant prélevé pour compter les fibres myélinisées et mesurer la gaine de myéline. Le porteur prévoit des difficultés de déplacement, une atrophie possible du membre, des douleurs après l'opération et des automutilations dont il ne peut estimer la durée, et fait courir les animaux vingt minutes par séance sur un tapis roulant pour les limiter. Il écrit par ailleurs que cette opération est "très bien tolérée" par les animaux.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse périphérique. La stratégie de réparation des nerfs périphériques considérée comme le gold-standard est la suture microchirurgicale directe sans tension, avec l’utilisation de greffe nerveuse d’interposition en cas de perte de substance nerveuse. Dans le cadre des lésions des nerfs périphériques dont la réparation par une suture directe sans tension est possible, différents types d’enveloppement nerveux ont été utilisés dans le but d’améliorer les résultats cliniques des réparations. Un enveloppement nerveux est l’utilisation d’un matériel (biologique ou de bio-ingénierie) sous la forme d’un tube placé autour des moignons nerveux, qu’ils soient suturés ou non. L’objectif principal de notre étude pré-clinique sur modèle murin est de comparer les effets de la protection de la suture nerveuse par une enveloppe graisseuse autologue sur la récupération fonctionnelle motrice et sensitive, par rapport à la protection par un manchonnage veineux. L’objectif secondaire est de comparer les caractéristiques histologiques de la cicatrisation nerveuse lors de la protection de la suture par une enveloppe graisseuse, par rapport à la protection par un manchonnage veineux.

Bénéfices attendus

Bien que la chirurgie réparatrice des nerfs périphériques soit aujourd’hui réalisée de manière quotidienne, les résultats ne sont pas excellents. Sur l’ensemble des procédures de chirurgie nerveuse réalisée, seuls 40 à 50% des patients présentent une récupération fonctionnelle satisfaisante. Une régénération nerveuse incomplète peut entrainer une mauvaise récupération motrice, par dénervation musculaire, ainsi qu’une mauvaise récupération sensitive et des douleurs chroniques. Les lésions traumatiques des nerfs périphériques ont des coûts socio-économiques importants, et les résultats concernant la douleur, la durée de récupération, l’impact psychologique et le retour à une fonction de base sont mauvais. Nous espérons que les différents tests réalisés sur la récupération fonctionnelle montreront une différence significative entre les groupes suture avec enveloppement par manchon ou par graisse autologue versus suture seule. Nous espérons également montrer au moins une absence de différence significative entre les groupes manchonnage veineux et manchonnage graisseux. Nous espérons évaluer histologiquement la présence ou non d’un micro-environnement favorable à la régénération nerveuse en cas d’enveloppement nerveux par graisse autologue. Une meilleure récupération fonctionnelle avec l’utilisation de graisse autologue dans cette étude pré-clinique, en comparaison au gold standard de la réparation nerveuse (suture directe microchirurgicale sans tension) permettrait d’appuyer la réalisation d’étude clinique, en particulier dans le cadre des lésions nerveuses périphériques traumatiques. L’utilisation de graisse autologue entourant une suture nerveuse directe serait une amélioration technique simple et peu couteuse du gold-standard. En effet, la disponibilité de graisse autologue est constante sur le site opératoire d’une chirurgie nerveuse périphérique. De plus, une récupération fonctionnelle meilleure ou équivalente avec l’enveloppement de graisse autologue en comparaison au manchonnage veineux dans cette étude permettrait également d’appuyer la réalisation d’études cliniques.

Procédures

Il y a 4 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique. Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale, sous ventilation et durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond à l’entrainement physique sur animal vigile (tapis roulant horizontal) qui permettra une meilleure récupération du positionnement de la patte lésée ; chaque test durera 20 minutes et cela dès J+1 semaine de l’intervention jusqu’à la fin du protocole. – La troisième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (3,6 et 9 semaines post-opératoire), chaque test durera environ 20 minutes. -La quatrième intervention est le prélèvement du nerf sciatique, réalisé sous anesthésie générale afin de procéder, par la suite, à l’analyse histologique. Cette dernière étape est sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux. Le prélèvement de la veine jugulaire externe, malgré son rôle majoritaire de drainage veineux cervico-facial chez le rat, n’est pas décrit comme à risque de nuisance chez le rat. Son prélèvement nécessite une incision supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

La réparation des nerfs périphériques comporte des mécanismes physiopathologiques hautement intégrés qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifères ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (chirurgie de la main par exemple).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à l’outil BiostaTGV avec un test bilatéral et une analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8) qui montre que l’effectif théorique de 15 rats par groupe permettra de mettre en évidence des différences significatives. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. Avant chaque procédure, nous réaliserons du "Handling" afin de diminuer le stress de l'animal. L’entrainement physique doux (tapis roulant horizontal) permettra aux animaux de limiter toute automutilation rencontrée lors de nos précédents protocoles. Cette nouvelle technique de raffinement permettra aux animaux d’avoir un membre plus fonctionnel. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chez l'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature et à celles de notre laboratoire. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

Un rat dont la température corporelle chute durablement sous 33,5 °C sort du protocole, et peut y être réintroduit après avoir été réchauffé. 580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolés en cage individuelle pendant 19 à 26 jours, ils subissent une prise de température rectale chaque jour, et 204 d'entre eux vivent à 4-6 °C jour et nuit durant deux à trois semaines, avec des frissons possibles les premiers jours. L'objectif est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur. Le bénéfice reste au conditionnel, un système qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" contre l'obésité, alors que l'isolement touche tous les rats dès le premier jour.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire).

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, effet de la température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) seront mis en place. Afin de limiter leur stress, les rats seront placés en armoire ventilée 5 jours avant le début de l'exposition au froid ou à la neutralité thermique). Ils seront en cage individuelle, mais ils pourront se voir et se sentir. Puis après 5 jours d'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée, les rats seront exposés à la température étudiée (4-6°C ou 28°C). Durant la phase d'adaptation au froid, décrite pour durer quelques jours, une surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux est prévue. Des points limites seront définis et permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C. L'animal pourra être réchauffé et réintroduit ou pas dans le protocole selon sa récupération. Si l'acclimatation au froid s'avérait trop difficile, la mise en place d'un protocole d'exposition progressif au froid serait envisagée. Cela ne sera très probablement pas nécessaire car des études similaires ne décrivent pas d'inconfort majeur lié à l'exposition au froid. En effet, les rats, dont la neutralité thermique est autour de 28°C, présentent déjà une certaine adaptation de leur tissu adipeux brun au froid, lorsqu'ils sont hébergés à 22°C. Afin de limiter l'impact de l'isolement et du froid et d'améliorer le bien-être des animaux, leur milieu de vie sera enrichi durant toute la période de stabulation, et, notamment les 4 premiers jours d'exposition, par du matériel de nidation limitant l'impact du froid. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

Du chocolat administré au début de la phase de sommeil pour empêcher 90 souris de dormir, des électrodes qui détruisent au courant électrique les neurones du noyau suprachiasmatique : 674 souris et 284 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les interventions chirurgicales durent de trente minutes à une heure et se répètent, avec pose d'un cathéter dans la veine du cou, injections de virus dans le cerveau, tests de comportement et de sommeil à 3, 6 et 12 mois. Certains animaux passent deux semaines isolés pour mesurer la perturbation de leurs rythmes, dans des cages transparentes voisines qui leur permettent de voir leurs congénères. Le porteur retient souris et rats pour comparer deux physiologies, garde les animaux jusqu'à 18 mois après le début des expériences et n'en laisse survivre aucun, y compris dans les groupes témoins.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées dont la prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et qui touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Comprendre le développement de la maladie est donc primordial. Cette démence se caractérise en partie par une accumulation et une agrégation d'une protéine, la protéine Tau, provoquant la dégénérescence des neurones touchés. Les atteintes cérébrales sont variées : hippocampe, cortex, … mais également l’hypothalamus et en particulier les neurones du Noyau Supra-Chiasmatique (NSC) impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens (rythme biologique qui régule l'alternance veille/sommeil). Les troubles du sommeil représenteraient un marqueur précoce de la maladie avant l’apparition des troubles cognitifs mais également un facteur de risque. Notamment, il a été montré qu’une privation de sommeil chez l’animal et chez l’Homme conduit à une élévation des protéines Tau toxiques dans le liquide céphalorachidien. De plus, le travail de nuit, occasionnel ou habituel, qui concerne environ 15% des salariés en France soit 3,5 millions de personnes, constitue une préoccupation majeure de santé publique du fait des effets sanitaires divers qui lui sont associés, en particulier des troubles cognitifs et d’une augmentation du risque de démences. En outre, il a été montré récemment que les cellules bordant le troisième ventricule du cerveau, nommées les tanycytes, étaient également dégradées dans la maladie d’Alzheimer. Or, ces tanycytes pourraient être impliquées dans la clairance de la protéine Tau contenue dans le liquide céphalorachidien. De plus, il a été récemment suggéré que les neurones du NSC pourraient communiquer avec les tanycytes pour réguler certaines fonctions circadiennes.

Bénéfices attendus

Le projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’arrivée de la maladie d’Alzheimer. Les résultats de ces recherches pourraient permettre d’évaluer l’impact des troubles du sommeil ou les horaires de travail décalés sur le développement de la maladie d’Alzheimer et également d’autres démences, et ainsi aider les autorités sanitaires à mettre en place des actions afin de limiter ces facteurs de risques. D’autre part, la dégradation des tanycytes et le manque de nettoyage du liquide céphalorachidien au cours des phases de sommeil profond par ces cellules spécialisées, les tanycytes, pourraient être à l’origine d’autres pathologies et ouvre la voie à de nouvelles recherches. En effet, l’accumulation d’autres protéines dans le liquide céphalorachidien, tel que l’Orexine, pourrait être responsable de troubles métaboliques observés chez les personnes ayant des troubles du sommeil ou en travail posté.

Procédures

Un premier groupe d'animaux (100 souris/100 rats) sera nécessaire pour étudier les changements des tanycytes induits par une lésion des NSC. Une chirurgie cérébrale détruira les neurones des NSC par l’introduction d’électrodes qui envoient un courant électrique. Ces animaux subiront une deuxième chirurgie 2 semaines après afin d'injecter dans le cerveau une protéine Tau fluorescente et un cathéter sera placé dans la veine du cou afin d'effectuer des prélèvements de sang réguliers. Les animaux seront euthanasiés 10 jours après, soit au total 24 jours après le début des expériences afin de prélever les cerveaux et étudier leurs morphologies. Un deuxième groupe d'animaux sera utilisé pour vérifier l'impact d'une perturbation du rythme circadien (travail posté, mauvais sommeil) sur les fonctions cognitives des souris soit par lésions des NSC, soit par une manipulation environnementale. Un premier sous-groupe de 240 souris (90 souris sauvages, 90 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et 60 souris contrôles) subiront une chirurgie de lésion cérébrale des NSC; un deuxième sous-groupe (90 souris avec chocolat en phase de sommeil et 60 souris contrôles avec chocolat en phase de veille) se verra administrer un aliment appétant (chocolat) au début de la phase de sommeil afin de les empêcher de dormir. Toutes ces souris seront testées 3, 6 et 12 mois après par des tests de comportements et par des tests du sommeil. Un troisième groupe d'animaux sera utilisé pour étudier un changement des gènes dans les tanycytes à court et à long terme induit par une lésion des NSC sur 80 souris et 80 rats. Les animaux subiront une lésion des NSC puis après 1, 3, 6, 12 et 18 mois, une chirurgie cérébrale permettra l'injection d'un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Ces animaux seront euthanasiés 2 semaines après l'injection du virus pour des expériences de transcriptomique. Un quatrième groupe d'animaux permettra de voir l'impact de l'activation ou l'inhibition des neurones des NSC à la fois sur la morphologie et sur la modification des gènes des tanycytes. Deux sous-groupes (52 souris et 52 rats chacun) auront une injection cérébrale de virus permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones des NSC et un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Deux semaines après l’injection cérébrale, les animaux seront mis à mort 30min après l’activation ou l’inhibition des neurones. Chacune des interventions chirurgicales durera entre 30 minutes et 1 heure.

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. En particulier, les expériences de chirurgie ou de prélèvements de sang sont faites sous anesthésie générale avec l'administration d'analgésique pour éviter toute douleur à l'animal lors de son réveil. Afin d’évaluer la perturbation des rythmes circadiens, il sera nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant 2 semaines (évaluation du poids, de l’absorption d’eau et d’aliments, expériences d’optogénétique). Cet isolement reste limité et sera effectué dans des cages transparentes à coté les unes des autres afin de permettre à chaque souris/rat de voir ses congénères. La lignée de souris transgéniques est une lignée de souris mimant la maladie d'Alzheimer. Ce modèle murin développe une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de l’âge de 3 mois, avérée à 6-7 mois et maximale à 12 mois. Ces animaux n'ont pas de problème de déplacement et ne souffriront pas de cette pathologie. D’autres manipulations seront effectuées sur les animaux vigiles : des tests de comportement (sur 390 souris) consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives. Ces expériences n’entraînent aucune douleur, mais peuvent générer du stress suite aux manipulations; les expériences seront réalisées par le même manipulateur et une habituation est effectué avant chaque test. Les molécules (anesthésiques, analgésiques, activateur/inhibiteur) devront parfois être injectés dans le péritoine de l’animal et nécessiteront la contention et l’injection de l’animal; un analgésique local peut être utilisé pour limiter la douleur de l'injection.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans chacune des procédures sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôles. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de 18 mois. Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude pour faire des analyses de transcriptomique ou étudier la morphologie des populations cellulaires, par l’injection d'une euthanasiant chimique.

Remplacement

Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3R. L’étude des communications entre différentes régions cérébrales nécessite, en particulier au niveau du cerveau, d’utiliser des organismes entiers. Aucun système cellulaire n’est capable à l’heure actuelle de mimer toutes les interactions entre différentes régions cérébrales et les influences périphériques. Les tanycytes de l’éminence médiane sont des cellules placées au cœur d’une région cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions endocrines et préserver l’influence des différentes parties de l’organisme sur cette communication cérébrale est indispensable pour notre projet. Les modèles de rongeurs rats et souris sont donc pertinents pour ce type d’étude et permettront une étude comparée des deux espèces ayant des physiologies différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est calculé de façon à avoir un nombre minimal et homogène d’animaux et que ce nombre soit suffisant pour une analyse statistique. Le calcul du nombre d’animaux est basé sur un calcul statistique d’effectif (seuil de significativité de 5%, puissance égale à 85%, différence entre les moyennes de 15 et écart-type de 10) pour une comparaison entre deux lots et un test statistique bilatéral. Ce calcul évalue le nombre minimum de souris par groupe entre 6 et 10.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. * Les animaux sont manipulés individuellement, et dans le calme, afin de limiter tout stress des animaux non manipulés. Ils seront également habitués à la manipulation. * Les manipulations (administrations et sacrifices) s'effectuent à distance des autres animaux. * Les hébergements seront enrichis. * Pour les prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés dès que possible par anesthésie gazeuse. *Une surveillance quotidienne est effectuée afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle souffrance (suite à l’infection). En cas de signes cliniques défavorables et/ou si une perte de poids supérieure à 20% survenait, les animaux concernés seront mis à mort par un euthanasiant chimique. La souffrance, la détresse, l’inconfort des animaux de laboratoire seront évalués en se basant sur les cinq paramètres suivants : 1. variation du poids de l’animal 2. apparence physique externe (horripilation, accélération de la respiration, tremblements, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen) 3. signes cliniques mesurables (hypothermie) 4. changement du comportement (diminution des soins, animal prostré) 5. réponses comportementales aux stimuli externes (réaction violente de douleur associée à des vocalisations) Un stress momentané est possible suite aux manipulations mais celui-ci sera réduit grâce aux bonnes pratiques de la préhension des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle rongeur est essentielle pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie d’Alzheimer. La communication entre différentes populations cérébrales impliquées nécessite l’utilisation de l’animal entier. Par ailleurs, la possibilité d’utiliser des souris transgéniques THY-Tau22 mimant le déclin cognitif est un plus et nécessite l’utilisation de souris transgéniques et wild-type. L’utilisation des technologies DREADD et d’optogénétique nécessite également l’utilisation de souris et de rats, technologies aujourd’hui indispensables pour moduler des populations neuronales et en déduire leurs fonctions. La physiologie des souris et des rats étant différente, il nous parait nécessaire d'étudier dès que possible ces 2 espèces afin de permettre leur comparaison. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes de 8 semaines à 21 mois. Toutes les expériences démarreront à l’âge de 8 semaines et se poursuivront sur 14 ou 24 jours pour les études à court-terme, ou sur 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois pour les études sur le long-terme (au maximum, les animaux seront âgés de 20,5 mois).

Tués à la fin des procédures pour vérifier l'emplacement des marqueurs dans leur cerveau, 576 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure trente, puis une tâche comportementale d'une heure par jour pendant trois mois, sous rationnement alimentaire maintenu pendant la même durée pour le garder à 90 ou 95 % de son poids. Le porteur qualifie l'impact de ce rationnement de très faible, une "légère sensation de faim" qui garantit la motivation à obtenir une récompense. L'objectif déclaré est de comprendre les circuits neuronaux de la décision entre choix familiers et choix nouveaux, et le porteur conclut que ces fonctions cognitives ne s'étudient que sur des "organismes entiers".

Objectifs

Tous les jours nous prenons des décisions qui peuvent être familières ou non. Les décisions familières sont celles qui ont déjà été prises auparavant et dont l’issue est prévisible. Au contraire, les décisions non familières sont celles auxquelles on n’a jamais fait face auparavant et pour lesquelles on a peu ou pas d’expérience. Lorsque l’on fait face à une décision non familière, il faut alors utiliser nos expériences de choix passées pour guider nos actions, par exemple on peut admettre une proposition en raison de son lien avec une proposition préalablement tenue pour vraie. Ainsi, lorsque l’on a déjà pris une décision dans laquelle A>B et C>D, on peut se référer à cette situation passée lorsque l’on fait face à une nouvelle décision non familière entre B et C. Le but de ce projet est de comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent la prise de décision en particulier entre les situations de choix familières versus les choix nouveaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les processus de prise de décision. De nombreuses maladies neuropsychiatriques sont caractérisées par des déficits cognitifs et notamment des troubles de la prise de décision. Ainsi ce projet va permettre une meilleure connaissance fondamentale de ces processus cognitifs complexes mais également aider à mieux comprendre certains troubles neuropsychiatriques impliquant un déficit de prise de décision.

Procédures

Tous les animaux subiront une tâche comportementale de 1h max/jour pendant 3 mois maximum ainsi qu’un rationnement alimentaire léger pendant 3 mois maximum. Les animaux subiront une chirurgie cérébrale d’environ une heure trente.

Impact sur les animaux

Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire) mais peut entrainer du stress. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peuvent, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales. Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 3 jours pour s’assurer de la récupération complète des animaux. Des points limites généraux et spécifiques, des mesures conservatoires ainsi que des critères d’arrêt ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.

Six gestes d'administration et trois gestes de prélèvement sanguin sont répétés sur les mêmes individus, quotidiennement pendant deux semaines pour les administrations. 320 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le seul but d'habiliter des expérimentateurs et d'entretenir leurs compétences. Le porteur affirme que cette formation améliore le bien-être des animaux non-humains et réduit le nombre d'animaux utilisés, et qualifie le recours à des animaux vivants d'"indispensable" puisque simulateurs et mannequins "ne reproduisent pas les conditions réelles". Il annonce réutiliser autant que possible des animaux venant d'études précédentes, qui subissent donc ces gestes après en avoir déjà subi d'autres.

Objectifs

Pour assurer le bien-être des animaux, la réussite des projets et la qualité des résultats scientifiques, il est crucial que les expérimentateurs soient compétents dans l’exécution des gestes techniques. Cela signifie qu'ils doivent être formés et maintenir leurs compétences au fil du temps, que ce soit pour les employés actuels ou les nouveaux arrivants. Un bon encadrement par un personnel qualifié permet de former les expérimentateurs et d'améliorer le bien-être des animaux en réduisant les erreurs et en augmentant la rapidité des gestes, ce qui limite le stress et la douleur des animaux. Cela garantit également des études fiables et solides, avec suffisamment de données pour les analyses, réduisant ainsi les risques de remettre en question les résultats et d'avoir à faire des études complémentaires, ce qui diminue le nombre d'animaux utilisés.

Bénéfices attendus

L’habilitation des expérimentateurs aux gestes techniques améliorera la qualité et la fiabilité des procédures expérimentales et des résultats, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour les études. Cela permettra d'avoir suffisamment de données pour les analyses, réduisant ainsi les risques de remettre en question les résultats et d'avoir à faire des études complémentaires.

Procédures

Durant ce projet, 6 gestes techniques d’administration et 3 gestes techniques de prélèvement sanguin seront effectués. Les gestes techniques d’administration effectués quotidiennement pendant 2 semaines se feront sur animaux vigiles, les animaux étant si nécessaire maintenus en contention par du personnel qualifié pour limiter les mouvements lors de l’exécution des gestes. Certains gestes techniques d’administration et de prélèvement sanguin seront effectués 1 seule fois sous anesthésie gazeuse. Le temps passé à effectuer un geste technique d’administration ou de prélèvement sur un animal sera de 1 minute maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront temporaires et principalement dues aux administrations répétées et aux prélèvements sanguins effectués. Les animaux ressentiront une légère gêne, ainsi qu'une douleur similaire à une piqûre d'aiguille lors de certains gestes techniques d’administration et de prélèvement. Les animaux vigiles maintenus immobiles pour la réalisation de ces gestes pourront également ressentir un stress léger mais temporaire.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés à l’issu de la procédure expérimentale pour la réalisation d’analyses.

Remplacement

L’utilisation d'animaux pour l’acquisition et la maîtrise des gestes techniques par les expérimentateurs est indispensable et ne peut être remplacée par d’autres méthodes. Les simulateurs ou mannequin peuvent compléter la formation de base, mais ne reproduisent pas les conditions réelles nécessaires à l’acquisition des gestes techniques sur des animaux vivants. De tels gestes nécessitent une pratique directe pour observer et appréhender le comportement spécifique à chaque espèce, afin d’assurer la précision de leur réalisation. Selon la réglementation, l’habilitation implique d’acquérir et de valider les compétences sur des animaux, garantissant la qualité des procédures et l’amélioration du bien-être animal. Utiliser des animaux dans un cadre contrôlé minimise les risques de souffrance tout en assurant la maîtrise des gestes techniques avant de les appliquer en recherche.

Réduction

Des animaux utilisés dans des études précédentes seront réutilisés autant que possible, afin de réduire le nombre d’animaux commandés spécifiquement pour la réalisation de ce projet de tutorat et d’habilitation. Cela permettra d’utiliser au maximum les animaux disponibles. Pour ce projet, le nombre minimum de souris et de rats a été choisi pour que les expérimentateurs à habiliter puissent se former, un animal étant utilisé pour la réalisation de plusieurs gestes techniques.

Raffinement

Chaque expérimentateur sera supervisé par un personnel qualifié (tuteur) maîtrisant parfaitement les gestes techniques auxquels les expérimentateurs devront être habilités. L’objectif est de garantir une exécution correcte des procédures expérimentales, minimisant ainsi le stress et les erreurs potentielles d’exécution des gestes sur les animaux. Les animaux seront observés 2 fois par jour en semaine par du personnel qualifié, avant et après l’exécution d’un geste technique, et 1 fois par jour le week-end et jours fériés inclus. Pour gérer la douleur de certains gestes techniques, une anesthésie gazeuse sera utilisée. De plus, un suivi de poids avec au moins 2 pesées par semaine sera réalisé au cours du projet. Si l’atteinte d’un point limite est constaté, l’animal sera euthanasié dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Le rat et la souris étant les deux espèces utilisées dans notre établissement, il est donc primordial que le personnel soit habilité à effectuer les gestes techniques sur ces deux espèces. Nous allons réutiliser autant que possible les animaux d’études précédentes menées dans notre établissement. Les animaux réutilisés seront âgés d’au moins 10 semaines.

Tués pour prélèvement d'organes, 3 750 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-quatre injections d'un agent inducteur, une tous les trois jours pendant huit semaines, leur provoquent une fibrose du foie, avant l'administration des composés à tester pendant quatre à huit semaines. S'y ajoutent des prélèvements de sang sur animaux vigiles, jusqu'à trois dans la même journée. Le porteur qualifie la fibrose hépatique de pathologie silencieuse qui ne déclenche aucun signe clinique douloureux, et conclut que le modèle rat est "incontournable".

Objectifs

La fibrose hépatique représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre. Cette dernière est une maladie complexe qui résulte d’une augmentation de la fibrose du foie dont l'évolution conduit à la greffe d'organe ou à la létalité. Ce projet vise à tester des composés dans un modèle de fibrose hépatique chez le rat, modèle très proche de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de fibrose hépatique.

Procédures

1) l’injection d’agent inducteur tous les 3 jours pendant 8 semaines (24 injections de 1ml en moins de 10 sec) 2) Un prélèvement de sang de 200 µL (moins de 30 secondes) pourra également être réalisé après 4 semaines afin de pouvoir randomiser les animaux sur leurs taux de transaminase. 3) Afin de relier l’efficacité des composés à leurs taux sériques, une pharmacocinétique pourra être effectuée une fois par étude. Ainsi, au maximum 3 prélèvements d’environ 30μL de sang par rat (en moins de 30 secondes) seront réalisés pendant la même journée ou étalés sur 2 journées. Le volume total de ces prélèvements n’excédera pas 10% du volume sanguin du rat et les prélèvements seront effectués sur animaux vigiles. 4) Les composés et leurs solvants seront administrés pendant 4 à 8 semaines maximum : moins d’une minute à chaque administration, sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité de la procédure expérimentale dans laquelle sont inclus les animaux est modéré. La fibrose hépatique est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux chez l’Homme ou l’animal. Les injections et les prélèvements sanguins induisent une douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie ou lors de l’administration par gavage ou lors des injections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques et fibrotiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes cellulaires complexes intervenant dans la physiopathologie de la fibrose hépatique. Le rat représente un modèle très performant et hautement informatif car la fibrose ressemble beaucoup à la fibrose observée chez l’Homme. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle rat est incontournable.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de rat utilisé par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique.

Raffinement

La fibrose hépatique est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux chez l’Homme ou l’animal. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur de courte durée de ce fait, un analgésique local pourra être ajouté avant la réalisation des prochaines. Les points limites pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des rats, cette grille de points limites sera appliquée tout au long du projet. De plus, Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets adaptés à l’espèce. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs.

Choix des espèces

L'utilisation de rat est basée sur une littérature abondante décrivant les différents modèles de fibrose hépatique chez le rat, cette dernière étant très proche de celle observée chez l’Homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt sur un organe mature.