Rats

Immunodéprimés par deux injections à cinq jours d'intervalle, habitués progressivement à la contention dans un tube d'aérosol de 2 à 10 minutes, puis infectés aux poumons par intubation sous anesthésie, 448 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids inférieure à 15 %, une prostration et une mobilité réduite pendant les 24 heures suivant l'infection, avec une antalgie morphinique toutes les six heures. Quarante-huit rats reçoivent l'antibiotique de référence par injection, les 384 autres par aérosol pendant dix minutes. Tous sont tués pour prélever les tissus et mesurer la prolifération bactérienne.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un problème mondial qui cause de nombreux décès chaque année, dont plus de 25 000 en Europe et 1,3 million dans le monde en 2019. Certaines bactéries sont particulièrement préoccupantes et reconnue par l’Organisation mondiale de la santé comme un danger prioritaire. Ces bactéries sont particulièrement problématiques, car elles peuvent survire longtemps sur les surfaces et développe facilement des résistances en échangeant des gènes avec d’autres bactéries. Elles causent souvent des infections graves dans les hôpitaux, surtout en soins intensifs. Pour combattre cette menace, un projet européen développe des versions inhalables d’un antibiotique actuellement testé en clinique par injection. Cinq formulations différentes de cet antibiotique sont à l’étude pour renforcer son efficacité contre ces infections graves. L’avantage de cet antibiotique est de provoquer moins de résistances que d’autres antibiotiques inhalés tout en étant plus efficace. En l’administrant directement dans les poumons, on atteint une forte concentration au niveau de l’infection, en limitant la diffusion dans le reste du corps et en réduisant ainsi les risques de toxicité. Les premiers tests en laboratoire sont encourageants. La prochaine étape consiste à tester ces formulations chez des rats infectés pour voir si cette administration directe est plus efficace qu’une injection.

Bénéfices attendus

Des tests in vitro de stabilité, d'aérosolisation, de toxicité pour les cellules humaines et d'efficacité antimicrobienne ont été réalisés dans un premier temps, avec des résultats prometteurs. La prochaine étape cruciale consiste à mener des expériences in vivo pour faire progresser le projet vers l'utilisation chez l'humain. Les études in vivo sont indispensables, car aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement l'ensemble complexe des facteurs influençant l'efficacité et la tolérance d'un antibiotique administré par inhalation. Les études in vivo sur des modèles animaux offrent une évaluation exhaustive de l'administration de médicaments par voie pulmonaire, englobant tant les considérations d'efficacité que de sécurité. Ces études permettent de vérifier la distribution du médicament dans les tissus et d'identifier d'éventuels effets secondaires ou toxicités non détectables in vitro, assurant ainsi une compréhension plus approfondie et une optimisation de la thérapie avant les essais cliniques sur l'homme.

Procédures

Tous les animaux vigiles recevront deux injections à 5 jours d’intervalle dans le cadre d’un traitement immunosuppresseur (durée : 30 secondes par injection). Ils participeront également à des séances d’habituation au maintien en contention dans le dispositif utilisé pour l’administration par aérosol. Ces séances, réalisées quotidiennement sur 5 jours, verront leur durée augmenter progressivement de 2 à 10 minutes maximum. Tous les rats seront soumis à une infection bactérienne pulmonaire induite par intubation sous anesthésie gazeuse, effectuée une seule fois (durée : 10 minutes). Une couverture antalgique sera administrée à tous les rats, soit par des injections en condition vigile toutes les 6 heures (1 à 4 administrations, durée : 30 secondes par injection), soit via l’eau de boisson. Une partie des rats vigiles (48 animaux) recevra un traitement antibiotique de référence par injection (durée : 5 minutes), tandis que les 384 autres recevront l’antibiotique par voie d’aérosol (durée : 10 minutes). Un lavage pulmonaire et un prélèvement sanguin seront réalisés sous anesthésie et antalgie à des moments définis. Chaque rat subira un seul prélèvement (durée : 2 minutes).

Impact sur les animaux

- Injections: légère douleur, brève et transitoire. - Induction et réveil de l’anesthésie : inconfort mineur et éphémère. - Injection de l'immunosuppresseur : perte de poids liée à une diminution de l'appétit et à des troubles gastro-intestinaux. - Induction de l’infection pulmonaire : inconfort modéré pendant et après l’induction, atténué par l’administration d’antalgiques. Une perte de poids inférieure à 15 % est attendue, accompagnée de prostration et d’une réduction de la mobilité pendant les 24 heures suivant l’infection. - Traitement : inconfort léger pendant les 10 minutes d’exposition au système d’inhalation, réduit grâce à une phase d’habituation progressive.

Devenir

Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne

Remplacement

À ce jour, il est encore impossible de remplacer complètement l’utilisation des animaux pour cette étude, car les modèles de laboratoire (in vitro) ou informatiques (in silico) ne peuvent pas reproduire tous les paramètres nécessaires pour évaluer l’efficacité et la sécurité des antibiotiques administrés par inhalation. Cependant, des progrès importants ont été réalisés sans utiliser d’animaux vivants. Des tests en laboratoire ont démontré que le nouvel antibiotique est efficace contre de nombreuses souches bactériennes cliniques. De plus, des recherches ont permis d’identifier les meilleures formulations pour une administration par inhalation. Des expériences ont ensuite été menées sur des poumons de rat isolés et perfusés, en collaboration avec un laboratoire européen. Cette méthode, qui n’implique pas d’animaux vivants, a fourni des informations essentielles sur la capacité des formulations à garantir une exposition prolongée dans les poumons, réduisant ainsi le recours aux animaux vivants. La prochaine étape sera de confirmer ces résultats sur des animaux dans un modèle d’infection pulmonaire, une validation indispensable avant de passer à des études chez l’humain.

Réduction

Pour limiter l’utilisation d’animaux dans cette étude, une seule souche bactérienne sera testée. Cette souche a déjà été validée lors d’études précédentes sur des souris. La quantité de bactéries à administrer dans les poumons a été soigneusement déterminée et optimisée grâce à ce modèle, garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour détecter les différences entre les traitements. Les groupes témoins seront partagés entre les différentes formulations testées, ce qui contribuera également à réduire le nombre total d’animaux impliqués. En outre, les évaluations des différentes formulations, développées par plusieurs laboratoires européens, seront centralisées dans notre laboratoire. Cette centralisation permettra d’éviter la duplication des expériences, notamment pour les contrôles, et d’optimiser les ressources disponibles.

Raffinement

Les rats suivront une période d'acclimatation minimale de 8 jours et seront hébergés dans des cages standards installées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement comprenant de la sciure, des tunnels pour se cacher et des bâtonnets à ronger. Chaque cage sera limitée à deux animaux, et les groupes ne seront pas modifiés par la suite. Les rats vigiles évolueront dans un environnement ayant une température constante avec un taux d'humidité contrôlé, bénéficiant d’un accès libre à la nourriture et à l’eau. La luminosité sera régulée avec une alternance jour/nuit respectant leur cycle veille/sommeil. À partir du 9ᵉ jour, les rats seront progressivement acclimatés aux tubes de maintien du système de génération des aérosols médicamenteux. Le protocole commencera par une exposition de 2 minutes à un aérosol de solution physiologique, avec une augmentation progressive de la durée au cours des 5 jours suivants : 4 minutes au jour 10, 6 minutes au jour 11, et ainsi de suite jusqu’à 10 minutes au jour 13. Les conditions d'asepsie seront rigoureusement respectées pendant l’infection et les traitements. Les rats resteront dans leurs cages d’origine tout au long de l’étude pour éviter tout stress additionnel. Chaque animal sera surveillé au moins deux fois par jour, avec un suivi précis de son état à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir si nécessaire. Les rats seront anesthésiés et bénéficieront d’une couverture antalgique avec un dérivé morphinique tout au long des expérimentations

Choix des espèces

Les expériences seront menées chez les rats pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur système respiratoire présente des similitudes importantes avec celui des humains, tant par sa structure que par ses mécanismes de défense contre les infections respiratoires. Cela en fait un modèle pertinent pour étudier l’efficacité des traitements. Les rats de 7 semaines ou plus permettent également de prélever des quantités suffisantes de liquide de lavage pulmonaire, indispensable pour mesurer la concentration de l’antibiotique étudié dans les poumons. Ces mesures aident à comprendre comment le médicament agit dans les poumons et à évaluer son efficacité contre les infections. En outre, les méthodes utilisées, comme l’administration de médicaments par aérosols et le prélèvement de liquide pulmonaire, sont bien maîtrisées chez les rats.

600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque animal voyant son accès à l'eau réduit à une plage de trente minutes à quatre heures par jour, pendant cinq jours. Ils reçoivent les substances testées en une fois ou par perfusion lente, en administration unique ou répétée sur plusieurs semaines, puis leur aversion pour des solutions amères est mesurée. 900 sont tués parce que les effets à moyen et long terme des substances restent méconnus, les 300 animaux témoins pouvant être réutilisés après accord du vétérinaire. L'objet réel est d'ajuster le goût de candidats médicaments pour que les patients suivent mieux leur traitement, bénéfice formulé au conditionnel face à une soif imposée et à des substances qui peuvent provoquer, selon les termes du porteur, une gêne ou une sensation de mal-être.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de déterminer comment différentes molécules (candidats médicaments en cours de développement) ayant une potentielle interaction avec les récepteurs gustatifs et/ou les voies impliquées dans la perception gustative au niveau du SNC affectent les préférences et les aversions gustatives chez l’animal. La réponse gustative des animaux en présence de ces molécules sera analysée à travers des tests d'aversion (notamment pour des substances amères). En effet, de nombreux médicaments peuvent altérer le goût, influençant ainsi l'appétit et l'adhésion au traitement. En identifiant et en caractérisant ces effets dès les phases de développement, il est possible d'optimiser les formulations médicamenteuses pour minimiser les impacts négatifs sur le goût et le comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

En évaluant les effets des candidats médicaments ayant une potentielle interaction avec le goût, il devient possible de concevoir des traitements mieux tolérés, favorisant une meilleure adhésion des patients à leur régime thérapeutique. Une adhésion accrue mène généralement à une efficacité thérapeutique optimisée, améliorant ainsi les résultats de santé pour les patients.

Procédures

La principale intervention subie par les animaux est la préhension des animaux et l'administration des substances d'essais en bolus d'une durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes.. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou quelques semaines en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux ont un accès à l'eau limité de 30 minutes à 4 heures par jour pour une période maximale de 5 jours.

Impact sur les animaux

L'accès à l'eau est limité à une période journalière définie (sessions d'habituation et de test) ce qui peut entrainer une sensation de soif et un stress temporaire. Les manipulations/contentions réalisées notamment pendant les phases d'administration ou de prélèvements peuvent également entrainer un léger stress. Par ailleurs, certaines substances testées peuvent provoquer une gêne ou une sensation de mal-être.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que le traitement expérimental n’induira pas d’effet délétère sur l’animal. Les animaux contrôles peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal, ce qui constitue un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire. En vue de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, seules seront testées les molécules qui ont montré un impact potentiel sur la sensibilité gustative.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer les effets de candidats médicaments sur la sensibilité gustative. Les procédures utilisées sont largement décrites dans la littérature. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature.

570 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 tués et 120 transférés vers un autre projet après accord du vétérinaire. Ils reçoivent le candidat médicament par voie orale, une à deux fois par jour pendant six mois, passent deux tests de mémoire, huit séries d'observations neurologiques, des évaluations d'anxiété et des tests de réflexes auditifs deux fois par semaine pendant six semaines, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins dans une même journée. La molécule agit sur des cellules du cerveau dont l'activation excessive est associée à des troubles dégénératifs et psychiatriques, et le porteur reconnaît que ses effets indésirables ne sont pas prévisibles au départ. Parmi les bénéfices attendus, il inscrit une amélioration des connaissances scientifiques "pour le rat", et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'être humain.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur la mémoire, l’anxiété, le comportement général de l’animal, l’activité locomotrice, la coordination motrice, les différents réflexes neurologiques, sur la température corporelle et le poids chez le rat d’un candidat médicament induisant des modifications au niveau des cellules spécifiques du cerveau. Ces cellules fournissent un mécanisme contre les blessures et les infections, mais l'activation chronique ou excessive est considérée comme préjudiciable et a été impliquée dans de nombreux troubles dégénératifs et psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de vérifier que des composés activant les cellules spécifiques du cerveau n’induisent pas de troubles dégénératifs et psychiatriques en fonction des expositions dans le sang. Ce projet permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour le rat grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par voie orale (-2 min par administration généralement 1 administration / jour pendant 3 mois et jusqu’à 2 administrations par jour pendant 6 mois au maximum) puis auront 2 tests de mémoire d’une durée maximale de 40 min et 4 fois par test en 6 mois. Les animaux seront évalués d'un point de vue neurologique par une série d'observation pour une durée maximum d’1h et 8 fois en 6 mois. L’anxiété sera évaluée pour une durée maximum de 5 minutes et 4 fois en 6 mois. Enfin, des reflexes auditifs seront évalués pour une durée maximum de 30 minutes et 2 fois/semaine sur 6 semaines. Des prélèvements de sang sur animal vigile ou anesthésié pourront être effectués (2 minutes par prélèvement) avec un maximum de 8 prélèvements par jour et 6 jours non consécutifs sur 6 mois et des prélèvements de tissus pourront être réalisés sur animaux anesthésiés en fin d'expérience.

Impact sur les animaux

La manipulation lors du passage en cage d’hébergement aux arènes de test ou pour induire l’anesthésie ou lors de l’administration du composé à tester pourra induire un stress mineur de courte durée. Lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie, ainsi que lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. L'administration par voie orale qui se fera sur plusieurs mois pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L'administration sous cutanée sur plusieurs jours pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L’anesthésie peut induire un stress à l’endormissement. Dans le test de coordination motrice, les animaux pourraient ressentir un léger stress par le fait de devoir s’accrocher à un axe en rotation. Ils pourront également resssentir un stress léger lié à la chute de l’axe ou de l'arène surélevée. Dans le test de stimulation auditive, les animaux pourraient ressentir un stress par la contrainte de l'espace disponible et les stimulations auditives.Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'établissement d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 60 (30 mâles et 30 femelles) / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (manipulation des animaux, habituation à la contention et habituation aux arènes expérimentales)• L'utilisation d'anesthésie adaptée associée à une analgésie pour la réalisation des prélèvements

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la mémoire, l'anxiété et les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central, la coordination motrice, l'activité locomotrice spontannée du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

750 souris et 1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans le canal biliaire, parfois complétée d'un cathéter dans le duodénum et d'un autre dans la veine fémorale, jusqu'à deux heures d'opération, puis vingt-quatre heures d'isolement en cage à métabolisme avec privation d'eau ou de nourriture. Le porteur indique que certains animaux sont tués parce que l'isolement de vingt-quatre heures rend difficile leur retour dans un groupe social. Il présente comme bénéfice pour les rats et les souris eux-mêmes une "amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée", et l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané, intraveineux ou intrapéritonéal d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être effectuée au maximum 1 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation). La mesure de la diurèse sur 16h pourra être répétée au maximum 2 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la mise à jeun. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

200 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ovariectomie de trente minutes sous anesthésie générale, toutes reçoivent une injection de produit inflammatoire dans la face, puis passent chaque jour des tests censés mesurer leur douleur. Le porteur attend de l'injection une hypersensibilité douloureuse, et de l'ablation des ovaires une douleur post-opératoire, un risque d'infection, un risque d'hémorragie et des modifications de l'appétit et du comportement social. Les retombées annoncées se limitent à la recherche préclinique elle-même, au conditionnel, et les tests comportementaux quotidiens ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans le développement d’une hypersensiblité douloureuse lors d’une stimulation tactile normalement non-douloureuse 2) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans l’inflammation faciale et la réactivité cellulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et le développement de douleur chronique faciale. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.

Procédures

Groupe 1: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 2: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 3: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale Groupe 4: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les opérations chirurgicales d'ovariectomie chez la rate peuvent entraîner plusieurs nuisances : - douleur et inconfort (modéré): Comme pour toute intervention chirurgicale, l'ovariectomie peut provoquer une douleur post-opératoire. Les animaux peuvent montrer des signes d'inconfort, tels que des vocalisations, une agitation ou une diminution de l'activité. -infection (modéré) : Il existe un risque d'infection au site chirurgical, ce qui peut entraîner des complications supplémentaires. Les signes d'infection incluent une rougeur, un gonflement, une chaleur ou un écoulement au niveau de l'incision. -hémorragie (modéré) : Des saignements peuvent survenir pendant ou après l'opération, ce qui peut nécessiter des interventions supplémentaires pour contrôler l'hémorragie. -changements hormonaux (modéré) : L'ovariectomie entraîne une diminution des hormones sexuelles, ce qui peut affecter le comportement et le métabolisme de l'animal. Cela peut se traduire par des changements d'appétit, de comportement social ou d'activité. Suite à l’injection du produit inflammatoire (sujet de l'étude), nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse (modéré).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections, comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.

Une biopsie de la queue est pratiquée sur chaque raton âgé de huit à dix jours, sous anesthésie locale, pour lire son génotype. 1 250 rats issus de ce programme de reproduction vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 250 étant gardés comme reproducteurs et les autres tués dès les résultats connus s'ils n'entrent dans aucun projet. Maintenir cette lignée porteuse de la mutation de la maladie de Stargardt, qu'aucun fournisseur ne propose, permet de la mettre à disposition d'équipes académiques et privées. Le porteur qualifie la biopsie d'indolore à cet âge, tout en décrivant des vocalisations possibles, un défaut de reptation, un isolement du reste de la portée et un retard à la tétée dans les jours qui suivent.

Objectifs

La maladie de Stargardt (STGD1) est une maladie des yeux qui touche environ 1 personne sur 8 000 à 10 000, affectant surtout la macula, la partie de l'œil responsable de la vision de jour. La perte des cellules visuelles appelées cônes dans cette région peut mener à la cécité. Les photopigments, formés par la vitamine A et une protéine appelée opsine, rendent les photorécepteurs sensibles à la lumière. Cependant, le processus de détection de la lumière crée des sous-produits toxiques. La protéine ABCA4 aide à transporter ces toxines pour qu'elles soient éliminées. Des mutations dans le gène ABCA4 empêchent ce transport, causant l'accumulation de toxines et la mort des photorécepteurs et d'autres cellules oculaires. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour cette maladie. Les modèles animaux actuels pour la STGD1 sont principalement des souris modifiées génétiquement, mais elles ne montrent que peu de symptômes de la maladie. Pour cette raison, nous avons décidé de créer un rat transgénique portant la mutation la plus fréquente dans la maladie de Stargardt. Utiliser des rats présente plusieurs avantages par rapport aux souris. Lors des injections dans l'œil des souris, il est difficile de contrôler la quantité de liquide injecté sans qu'il s’échappe vers d'autres parties de l'œil. Les rats ont des membranes oculaires plus robustes, ce qui permet un meilleur contrôle des injections et réduit le risque de fuite. De plus, lors de longues anesthésies, les souris peuvent développer une opacité du cristallin (semblable à une cataracte) qui complique les examens oculaires. Ce problème est beaucoup moins fréquent chez les rats. Le modèle de rat que nous avons créé reflète bien la maladie humaine sans affecter significativement le rat lui-même. Les changements observés chez ces rats sont similaires à ceux de la maladie STGD1 chez l'humain. Notre projet consiste à maintenir une colonie de rats STGD en utilisant des mâles et des femelles porteurs de la mutation (hétérozygotes, HE, ou homozygotes, KO). Les rats STGD et les rats sains issus de la même portée (appelés WT) seront utilisés pour de futures études de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique. Certains rats HE et KO seront également utilisés pour la reproduction.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est la caractérisation génétique, par une méthode invasive, d’animaux génétiquement modifiés représentant un modèle de la dégénérescence maculaire ou de la maladie de Stargardt (rats STGD) dont la physiopathologie est similaire à celle observée en humaine. Cette caractérisation permettra d’optimiser la gestion d’élevage de cette colonie. Ce projet assurera ainsi le maintien de cette lignée, qui n’est proposée par aucun fournisseur à ce jour, et mettra à la disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la STGD1. Ce modèle animal servira de support pour les futures études et projets scientifiques associées.

Procédures

Une biopsie de queue sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie de Stargardt (STGD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Un génotypage sera effectué par biopsie de la queue chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, une procédure considérée comme modérée. Une anesthésie locale est prévue lors de l'intervention. Bien que peu fréquents, certains signes de douleur pourraient apparaître dans les heures ou jours suivants, tels qu'un défaut de reptation, des vocalisations, un isolement du reste de la portée ou un retard dans la reprise de la tétée après le retour au nid.

Devenir

Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats KO et WT seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des rats (environ un à deux par portée) obtenus seront conservés en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux constitue, à ce jour, l'unique approche pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine, une structure complexe formée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières, avant de passer à des études précliniques ou cliniques chez l’homme. Cette lignée de rats permettra, dans le cadre de futurs projets, d’évaluer l’effet d’un traitement à la fois dans un contexte malade (rats KO) et dans un contexte sain (rats WT), justifiant ainsi la nécessité du génotypage. Actuellement, le génotypage invasif reste une méthode simple, rapide, bien maîtrisée et capable de fournir des résultats fiables pour la caractérisation génétique des rats. Réalisée chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, cette technique est indolore. À l’inverse, le génotypage par prélèvement salivaire, bien que moins invasif, n’est pas recommandé en raison de la complexité de sa mise en œuvre (taille inadaptée des swabs par rapport à la petite bouche des ratons à cet âge) et de la faible fiabilité des résultats obtenus. Un génotypage basé sur la collecte de bulbes pileux est actuellement en cours de validation. Cette méthode, non invasive, sera adoptée au sein de notre centre une fois sa mise en œuvre finalisée, incluant la formation du personnel à cette technique et la mise au point du génotypage à partir de bulbes de poils dans notre laboratoire.

Réduction

La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat STGD. Dans ce projet, afin de générer au maximum 200 rats STGD KO et 50 rats WT par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 50 couples par an, soit un total de 250 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 1250 rats STGD et WT. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard (Cf. schéma d’accouplement en Annexe). Les accouplements seront optimisés afin de maximiser le nombre de rats KO et d'éviter les portées de rats WT uniquement. Cette optimisation privilégiera les reproductions suivantes : KO x KOet HE x HE. Une reproduction KO x KO nous permettra d’obtenir 100% d’animaux KO, une reproduction HE x HE nous permettra d’obtenir théoriquement 50% d’animaux HE, 25% d’animaux KO et 25% d’animaux WT. Il est important de noter que cette lignée a déjà été cryopréservée. Elle est conservée tant que des projets sont en cours de planification, mais son maintien sera interrompu en l'absence de nouveaux projets.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation et un suivi régulier des animaux, assuré par les techniciens animaliers (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 2. Les biopsies de la queue destinées au génotypage seront effectuées par des techniciens compétents et spécialement formés à ces procédures rigoureuses. Cette méthode de génotypage, bien établie, rapide et standardisée dans notre centre, permet de minimiser le stress des animaux. Une analgésie sera assurée à l'aide d'un anesthésique local (comme le TRONOTHANE ou l'EMLA). La cicatrisation sera également surveillée dans les jours suivant l'intervention afin de garantir une bonne cicatrisation. En cas de besoin, une injection sous-cutanée de Buprénorphine peut être administrée à une raison de 0.05 mg/kg. 3. Afin d’améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (Cf. annexe de la saisine).

Choix des espèces

Le rat est un bon modèle pour tester les traitements de thérapie génique des yeux. Son œil est assez grand pour permettre une distribution uniforme des fluides sous la rétine, avec moins de risque de fuite par rapport à la souris. De plus, lors de longues anesthésies, les rats ont moins de problèmes d'opacité du cristallin, qui peut compliquer les examens oculaires. Ce problème, qui ressemble à une cataracte, est courant chez les souris et est causé par le dessèchement de la cornée. La lignée de rats que nous avons développée imite bien la maladie de Stargardt chez l'humain sans nuire aux rats eux-mêmes. Les changements observés chez ces rats reflètent fidèlement ceux de la maladie humaine. Pour nos expériences, nous aurons besoin de jeunes rats adultes âgés de 2.5 mois pour la reproduction, ainsi que de rats adultes. Les rats modifiés génétiquement (KO) et les rats normaux (WT) seront généralement utilisés dans les expériences dès le sevrage. Selon les projets, les rats seront utilisés à différents âges, avec des justifications spécifiques pour chaque étude.

Jusqu'à 15 % d'animaux en plus sont inclus dans chaque étude pour former des groupes homogènes après la chirurgie. 2 800 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée directement dans la prostate sous anesthésie générale, une partie des animaux étant castrée lors d'une seconde intervention, avant des IRM d'une heure sous anesthésie et des traitements répétés par injection ou par voie orale. La société qui porte le projet se présente comme prestataire de services en recherche préclinique et affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité d'un candidat médicament, les reconstructions de tumeurs en 3D restant selon elle "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer de la prostate est le deuxième plus mortel (environ 398 000 décès en 2022 pour environ 1,5 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer de prostate greffés directement au niveau de la prostate, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

La greffe de la tumeur est faite sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). La castration des animaux sera réalisée sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min) L’IRM est réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités par injection (intraveineuse ou intrapéritonéale) ou par voie orale. Les traitements seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane), mais les animaux pourront être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si l’anesthésie est contre-indiquée. Les animaux seront immobilisés par une contention douce pour mesurer la taille des tumeurs (inférieur à 30 secondes) Les prélèvements de sang (1 minute) seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane) mais les animaux pourront également être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si le geste est rapide (inférieur à 30 secondes) et génère moins de stress à l’animal que l’anesthésie générale elle-même.

Impact sur les animaux

- La castration pourra entrainer une douleur et une gêne modérée pendant 1 ou 2 jours - L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur lié une gêne, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs, du poids et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. -A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger de 1 à 2 jours. -Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. L’injection intraveineuse, intrapéritonéale ou per os pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Sachant que les animaux sont porteurs de tumeurs, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera deux groupes avec tumeur, un groupe contrôle (non traité ou traité avec le véhicule) et un groupe traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 5 à 15 animaux. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).

Raffinement

Les animaux sont pesés et le volume tumorale est estimé 2 fois/semaine minimum. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond des cages après les chirurgies et dès l’observation d’une perte de poids >10%. Une réhydration sera mis en place par perfusion sous cutanées et/ou alimentation humide pour les souris si necessaire. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Les chirurgies sont réalisées sur matelas chauffants jusqu’au réveil de l’animal. La greffe est réalisée en condition aseptique sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé 30 min avant et un anesthétique local. Les animaux reçoivent une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien en pré-opératoire et post-opératire et des soins adaptés.. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Certaines administrations sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations de la SBEA. Dans le cas de chirurgie sans réveil une anesthésie profonde est réalisée avec administration d’un analgésique local (lidocaïne et bupivacaïne), d’un alpha2 agoniste et d’un opiacé débutée 30min avant la chirurgie. Les principaux points limites sont listés en détail dans les procédures. Si des signes cliniques sont observés, l’animal est mis en observation et un traitement est mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.

Greffés d'une tumeur sous la peau, dans la peau ou dans le coussinet graisseux mammaire, gavés jusqu'à cinq fois par jour et saignés jusqu'à quatre fois par jour à la veine saphène, 88 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme réduire le nombre de manipulations au strict nécessaire, dans un projet dimensionné pour environ 170 études par an pendant cinq ans, à la demande de clients. Les animaux dont la tumeur ne pousse pas sont utilisés pour entraîner le personnel au gavage et aux prélèvements sanguins, ou tués pour fournir des organes témoins. Ceux qui passent d'une procédure à la suivante sont tués à la fin de la seconde, les autres à la fin de la leur.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements dans des modèles ectopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses à un site ne correspondant pas à celui de la tumeur d’origine) chez la souris ou le rat pour les cancers dont les besoins sont non satisfaits. Ce projet comprend quatre procédures : -Développement de modèles ectopiques - Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie (PK/PD) d’une molécule d’intérêt chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de la tolérabilité d’une molécule d’intérêt après administration unique ou répétée chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de l’efficacité d’une molécule d’intérêt sur des modèles ectopiques chez le rongeur. La première étape qui permettra par la suite d’évaluer une nouvelle molécule d’intérêt thérapeutique est le développement de modèles ectopiques. La greffe sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour des cellules tumorales d’origine humaine (xénogreffe) ou sur des animaux immunocompétents de même espèce que la lignée tumorale (modèles syngéniques). En fonction des cellules injectées, les greffes seront réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire. Trois types d’études pourront ensuite être réalisées sur ces souris/rats porteurs de tumeurs décrites ci-dessous. L’évaluation de la PK/PD est réalisée en analysant les concentrations sanguines et/ou tissulaires d’un composé ainsi que les niveaux d’expression/activation de biomarqueurs associés après administration unique ou répétée du composé. Le modèle PK/PD établi est indispensable pour la détermination des doses et fréquence à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et il permet également de prédire les doses à administrer lors des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’Homme. L’évaluation de la tolérabilité d’un composé est réalisée à des doses thérapeutiques déterminées par des études de pharmacocinétique sur souris naïves et des études PK/PD effectuées en amont. Elle consiste en l’administration unique ou répétée d’un composé et à l’observation de signes cliniques des animaux pour déterminer la/les doses et/ou la fréquence d’administration qui pourront être utilisées dans les études consécutives.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie. A long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. Dans le cas de l’utilisation d’un trocart, sous anesthésie gazeuse : durée 30 sec 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs : o Avec le pied à coulisse : durée 30 secondes 2 à 3 fois par semaine sur animaux vigiles. o Avec l’appareil de bioluminescence : durée 10 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour), intratumorale (1 injection/jour), ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irraidation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence o par voie intrapéritonéale (max3xsemaine) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine caudale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) o via amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront injectés avec des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (sévérité légère) et tatoués (sévérité légère). Certains modèles tumoraux peuvent nécroser, d’où l’intérêt de choisir un site d’injection de cellules tumorales adapté (voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire) grâce à la procédure de développement de modèles pour éviter ces nuisances aux animaux. Pour les procédures de PK/PD, de tolérabilité et d'efficacité, les animaux sont traités avec des molécules pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées notamment durant les études de tolérabilité (dose du composé importante) et d’efficacité (traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour la procédure de développement de modèles peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou de tolérabilité puis seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de tolérabilité peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou d'efficacité et seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Pour les procédures de PK/PD et d'efficacité, ainsi que pour les animaux des procédures développement de modèles et de tolérabilité non-réutilisés, les animaux seront mis à mort à l’issue de leur procédure respective. Quelque soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, ils ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme) sans recours à l’animal. En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’études prévues pour ce projet se base sur l’analyse rétrospective des trois dernières années, nous estimons que pour les 5 ans de ce projet, 170 études environ seront conduites par an. Les données de mise en place des modèles obtenus dans la procédure développement de modèle" permettront de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de PK/PD, de tolérabilité ou d'efficacité. Une analyse de puissance statistique sera appliquée pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée. Les animaux qui sont exclus des études pour des raisons de taille tumorale trop petite ou trop grande sont toujours utilisés pour permettre d’avoir soit des tissus témoins pour la détermination du pourcentage de liaison aspécifique ou de la concentration des molécules d’intérêt dans les tumeurs. Si des tumeurs n’ont pas du tout poussé, les animaux pourront être utilisés pour des entraînements à différents gestes techniques tels que le gavage ou les prélèvements sanguins ou pour récupérer des matrices blanches (organes, sang, plasma). De plus les procédures sont interconnectées et les animaux peuvent être utilisés pour plusieurs procédures limitant de ce fait l’utilisation d’animaux. Les animaux de la procédure "développement de modèle" peuvent être inclus dans une procédure de PK/PD ou de tolérabilité. Les animaux inclus dans une procédure de tolérabilité pourront également être inclus dans une étude de PK/PD ou d’efficacité.

Raffinement

Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée des procédures. En cas d’apparition de signe de douleur, une injection unique en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Une fiche de suivi des signes cliniques sera mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées et d’appliquer des points d’arrêt anticipés les plus précoces possibles. Ainsi, à partir d’un total de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seront prises telles qu’aliment humide au sol ou ajout d’enrichissement, et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer, nous utiliserons donc des animaux adultes.

96 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant 41 jours en cage individuelle et quatre heures par jour sans accès à la nourriture. Ils sont pesés neuf fois, observés chaque jour, et soumis à des tests de dix minutes portant sur la réactivité émotionnelle en environnement nouveau, la reconnaissance d'objets et la mémoire. Le projet évalue si varier les odeurs de leur cage et de leur aliment change leur comportement, leur cognition et leur neurobiologie. Le porteur annonce des retombées pour les élevages de rongeurs puis, plus loin, pour les bovins et les ovins, alors que les rats sont isolés puis tués pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Les rats sont des animaux qui utilisent énormément leur odorat. Pourtant, ils sont le plus souvent élevés dans des cages monotones et peu variés d'un point de vue des stimulations olfactives. Si on considère plus particulièrement leur alimentation, ils sont le plus souvent nourris avec un seul aliment complet, sous forme de granulés ou de poudre, ce qui correspond à un environnement alimentaire monotone (même aliment tous les jours) et sans variété (un seul aliment complet offert). Les rats sont pourtant des animaux omnivores opportunistes et leur comportement alimentaire naturel incorpore divers types d'aliments, variant dans le temps et l'espace. Ainsi, dans la nature, les rats passent une grande partie de leur temps à rechercher des aliments, en utilisant leur odorat. L'objectif de ce projet est de proposer une diversité sensorielle dans l'environnement des rats (sur l'aliment ou dans la cage) et d'en évaluer les conséquences comportementales (comportement alimentaire, comportement d'exploration olfactive, réactivité émotionnelle), cognitives (mémoire, reconnaissance d’objets) et neurobiologiques (notamment système de la récompense).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une meilleure connaissance des réponses comportementales et neurobiologiques des animaux se voyant proposer une diversité sensorielle dans un milieu d'élevage classiquement monotone. Il s'agit d'acquérir des connaissances fondamentales qui pourront être appliquées dans les élevages de rongeurs, et être potentiellement transposées à des animaux d'intérêt agronomique (bovins, ovins, ...).

Procédures

Tous les animaux sont soumis à des observations comportementales quotidiennes dans leur milieu de vie. Ils sont tous soumis à des pesées hebdomadaires (9 pesées par animal au total ; durée maximale de la pesée = 1 min ; durée maximale des manipulations pour la pesée, incluant la pesée = 3 min). Tous les animaux sont soumis à des tests comportementaux individuels visant à évaluer leur réactivité émotionnelle face à un environnement nouveau (une seule fois, 10 min), leurs apprentissages pour des objets nouveaux dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), leur mémoire dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), ainsi qu'un aliment odorisé nouveau dans leur cage de vie (deux fois, 1h - 30 min).

Impact sur les animaux

Les animaux rencontreront des situations pouvant être perçues comme stressantes au cours de ce projet, notamment : - Ce projet implique une légère restriction alimentaire (4h/j). Avant d'être habitués à ce rythme d'alimentation, les animaux peuvent ressentir une légère faim et/ou une frustration modérée. - Le suivi des consommations alimentaires à l'échelle individuelle implique une vie en cage individuelle, impliquant un isolement social partiel (j11-j52) pouvant impacter négativement et modérément le bien-être de l'animal. - Certains tests comportementaux sont mis en place pour évaluer la réactivité émotionnelle des animaux ; ils induisent donc un stress modéré. - Les pesées hebdomadaires nécessitent une manipulation douce de l'animal et le passage dans une cage de pesée (litière propre) sur une courte durée (

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le rat est le modèle d'intérêt de cette problématique scientifique, cherchant à étudier l’influence d’une diversité sensorielle sur ses comportements alimentaires, sa cognition et sa neurobiologie, il ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Aux vues des variabilités inter-individuelles généralement observées dans le cas de mesures comportementales et d'analyses des structures et stimulations cérébrales, un effectif de 16 individus par groupe et par sexe (soit 96 animaux au total), divisé en deux sous-groupes pour les analyses des structures et stimulations cérébrales, est recommandé pour conduire cette expérimentation et permettre une analyse statistique fiable des données récoltées.

Raffinement

Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par la présence de bâtons de bois pouvant être grignotés, de matériel de nidification, d'objet à manipuler (boule à thé), et la présence de stimulations olfactives variées pour 2 groupes sur 3. Le raffinement des procédures expérimentales se traduit par la mise en place de phase d'acclimatation à l'environnement de vie, d'habituation aux procédures expérimentales, et de familiarisation progressive aux odeurs. La restriction alimentaire 4h/j est spécifiquement mise en place en fin de phase diurne, quand les animaux sont au repos et consomment pas (ou très peu) d'aliment pour réduire les effets négatifs potentiels. La période de vie en cage individuelle est réduite autant que possible au regard des objectifs scientifiques du projet. L'isolement social n'est pas total puisque des communications olfactives, visuelles et auditives sont possibles dans l'élevage. Une feuille de papier, type sopalin, est ajoutée en tant qu’enrichissement occupationnel, pouvant aussi servir de matériel de nidification, pendant les périodes d'isolement social partiel des animaux. De plus, lors de ces périodes, un enrichissement social est mis en place avec des animaux réunis en paires stables (toujours les mêmes animaux réunis ensemble), dans une cage d'hébergement standard dédiée, 1h/j, 6j/7. Lors du changement de litière dans les cages de vie, une partie du nid des animaux est transféré dans la nouvelle litière pour permettre une continuité olfactive et limiter le stress potentiellement induit par la modification sensorielle de leur environnement de vie.

Choix des espèces

Les rats représentent 8% des animaux utilisés à des fins scientifiques et ils sont élevés dans des conditions olfactives qui peuvent ne pas répondre à leurs besoins naturels et comportementaux. En effet, ce sont des animaux curieux, olfactifs, omnivores opportunistes qui sont pourtant élevés dans des environnements olfactifs et alimentaires plutôt monotones. La question de la diversité sensorielle et de son influence potentielle sur les comportements alimentaires, la cognition et la neurobiologie est donc tout à fait pertinente chez cette espèce. Les animaux étudiés sont âgés de 4 semaines (stade juvénile) à 11 semaines (début de la phase adulte). Cette période correspond à une période de maturation du système olfactif chez les rats, ce qui rend donc cette période pertinente pour répondre à nos questions de recherches.