Rats

434 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité étant tuée par prélèvement complet du sang sous anesthésie. Pendant quatre semaines, ils passent huit à seize heures par jour dans un dispositif d'hypoxie intermittente, pendant leur phase de sommeil, pour reproduire les apnées obstructives, avec un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire, une prise de sang en troisième semaine et une échographie de l'aorte sous anesthésie. Le porteur qualifie de "léger" ou "modéré" chacun des stress attendus, y compris le passage en hypoxie et le transport entre les deux établissements. Quinze rats échappent à la mise à mort et seront réutilisés dans d'autres projets, parmi lesquels ceux qui auront servi à former le personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

Placés un par compartiment dans une cage grillagée, 400 rats respirent pendant six heures un composé organique volatil à concentration contrôlée. Vingt-cinq composés industriels sont testés, seize rats chacun, huit mâles et huit femelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que somnolence, troubles de l'équilibre et pertes de coordination sont probables, et que l'exiguïté du compartiment peut provoquer du stress. La moitié des animaux est tuée à la sortie de la chambre d'exposition, l'autre 48 heures plus tard, pour doser la substance dans leur sang et leur cerveau.

Objectifs

Dans l’industrie, de nombreux Composés Organiques Volatils (COV) sont utilisés. Lorsqu’ils se dispersent dans l’air des ateliers, ils peuvent être inhalés par les travailleurs, passer dans le sang pour enfin s’accumuler dans certains organes, notamment le cerveau. Ce projet a deux objectifs principaux : 1) Mesurer la quantité de 25 COV différents dans le sang et le cerveau des rats après 6 heures d’inhalation. 2) Vérifier si ces substances sont complètement éliminées du sang et du cerveau 48 heures après la fin de l’exposition. Ces informations nous aideront à mieux comprendre comment ces substances se comportent dans le corps.

Bénéfices attendus

Les Composés Organiques Volatils (COV) sont des substances couramment utilisées dans l'industrie. Lorsqu’on les inhale, elles passent rapidement dans le sang et atteignent le cerveau. Ces produits peuvent provoquer des effets temporaires sur l’activité du cerveau comme la somnolence, une sensation d'ébriété ou des troubles de la concentration, ce qui peut augmenter les risques d'accidents au travail. Cependant, nous ne savons pas exactement à partir de quelle concentration ces effets apparaissent, car les études existantes se basent souvent sur des doses très élevées et mesurent les effets après l’exposition, pas pendant. Déterminer les seuils d’effet des COV sur l’activité du cerveau est donc notre objectif principal. Ainsi, en comparant les quantités de COV qui influencent l’activité cérébrale avec les limites d’exposition autorisées dans les environnements de travail, cette étude contribuera à mieux protéger les travailleurs en alertant le cas échant sur des dangers insoupçonnés. Cependant, cette étude nécessite une expérience préliminaire qui est le sujet du présent projet. Nous devons en effet vérifier en premier lieu que ces COV pénètrent bien dans le cerveau des rats mâle et femelle, et qu’ils sont complètement éliminés de l’organisme des en 48 heures.

Procédures

Pour chaque COV, 16 rats (8 mâles et 8 femelles) seront exposés pendant 6 heures à une concentration stable et contrôlée de la substance, dans des chambres spécialement conçues à cet effet. Les mâles et les femelles seront placés dans des chambres séparées. Après l’exposition, la moitié des rats (4 mâles et 4 femelles) sera mise à mort pour analyser la quantité de substance présente dans leur sang et leur cerveau. Les 8 autres rats seront observés pendant 48 heures avant d’être également mis à mort, afin de mesurer la quantité de substance encore présente dans ces mêmes tissus à ce moment-là.

Impact sur les animaux

Les substances étudiées ici peuvent affecter l’activité du cerveau. Il est donc probable qu’on observe des effets comme de la somnolence, des troubles de l'équilibre ou des problèmes de coordination. Ces effets, bien que réversibles, seront attentivement surveillés. Lors des expositions, les animaux seront placés dans des cages collectives en plastique grillagé divisée en 8 compartiments, à raison d‘un animal par compartiment. Il est possible que l’espace restreint du compartiment dans lequel les animaux seront placés puisse provoquer du stress chez eux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever les tissus nécessaires pour les analyses.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car, pour savoir comment les COV s'accumulent et sont éliminés, il faut un organisme avec un métabolisme fonctionnel. Les tests en laboratoire sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de répondre à ces questions.

Réduction

Le protocole a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour chaque COV, 8 animaux (4 mâles et 4 femelles) seront utilisés pour mesurer les quantités présentes immédiatement après l’exposition, et 8 autres (4 mâles et 4 femelles) seront utilisés pour mesurer les quantités 48 heures après l’exposition.

Raffinement

Les animaux seront manipulés avec soin par du personnel qualifié. Ils seront surveillés chaque jour pour évaluer leur état de santé et leur comportement. Ils seront hébergés par deux dans un environnement enrichi avec des accessoires comme des tunnels en carton, des blocs à ronger ou des matériaux de nidification. Ils auront un accès illimité à la nourriture et à l’eau, sauf pendant les périodes d’exposition. Avant les tests, pour réduire le stress lié au fait de rester 8 heures dans des cages pendant les expositions, les rats seront progressivement habitués à ces conditions. Les cages seront équipées de grilles permettant aux animaux de voir et de sentir leurs congénères, ce qui les aidera à se sentir moins isolés. Pendant les heures d’exposition ainsi qu’après l’exposition, les rats seront attentivement surveillés, et tous les signes observés seront notés dans des tableaux prévus pour évaluer leur état général. En cas de problème, un barème permettra de décider des actions à prendre, comme l’arrêt de l’exposition ou, en cas de souffrance, la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des rats car leur métabolisme des COV est proche de celui des humains. En travaillant avec des mâles et des femelles, nous pourrons également étudier d’éventuelles différences dans la façon dont les substances sont transformées dans le corps en fonction du sexe.

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent le composé à tester par injection ou par une pompe implantée sous la peau pendant six mois, subissent des prélèvements sanguins une à deux fois par semaine, un isolement pour recueillir les urines, et une heure de mesure de tension par jour pendant deux semaines. La souche retenue développe spontanément une hypertension, ce que le porteur présente comme un avantage sur la souris et comme un moyen de limiter le recours aux chiens. Il conclut qu'avant de proposer un antihypertenseur aux humains, "il est indispensable" de vérifier chez un animal qu'il est efficace et sans danger.

Objectifs

L’hypertension artérielle est la maladie chronique la plus fréquente en France. Elle est responsable d’environ la moitié des décès liés aux accidents vasculaires cérébraux et aux maladies cardiaques. Chaque année, elle cause environ 9,4 millions de décès dans le monde selon l'organisation mondiale de la santé. Les objectifs du projet sont de : 1- Développer de nouveaux traitements : Trouver des médicaments efficaces pour traiter l’hypertension artérielle et prévenir les complications graves. 2- Evaluer la sécurité des traitements : Vérifier qu’un nouveau traitement n’a pas d’effets indésirables sur la pression artérielle avant de passer aux essais cliniques chez l’humain.

Bénéfices attendus

L’hypertension est une maladie chronique très répandue qui nécessite souvent un traitement à vie. Bien que les médicaments actuels soient généralement efficaces, ils présentent des limites : - Effets secondaires parfois importants. - Difficulté pour certains patients à suivre leur traitement sur le long terme. - Variabilité de l’efficacité selon les individus. Ce projet vise à évaluer de nouveaux traitements contre l’hypertension, qui pourraient offrir des améliorations significatives : -Efficacité accrue : Réduction de la pression artérielle de manière plus rapide et durable. -Moins d’effets secondaires : Rendre les traitements plus tolérables pour améliorer le confort des patients. -Prise simplifiée : Développer des médicaments à libération prolongée, nécessitant moins de prises quotidiennes. -Traitement des cas résistants : Proposer des solutions pour les patients dont l’hypertension ne répond pas aux traitements actuels. -Bénéfices pour le cœur : Réduire les risques de complications graves comme les crises cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux consistent à : - Administrer le traitement à tester, soit par injection, soit en utilisant une petite pompe implantée nécéssitant une chirurgie légère d'implantation de la pompe sous la peau de l'animal (le traitement dure généralement moins de 6 mois). - Collecter des échantillons d'urine sur animal vigile sur une période de moins de 24 heures. - Collecter des échantillons de sang 1 à 2 fois par semaine en moyenne sur la durée de l’étude. Selon le volume de sang nécessaire, l’animal sera soit vigile, soit anesthésié. - Mesurer la tension artérielle pendant environ 1 heure par jour sur une durée de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Du stress ou une légère douleur causés par l’administration du traitement ou par l’implantation d’une petite pompe, ce qui peut nécessiter de les maintenir immobiles pendant un moment. - Du stress lié à l’isolement temporaire pour collecter l’urine ou lors des prélèvements sanguins.

Devenir

A la fin de l’expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés. Pour cela, l’animal toujours anesthésié sera euthanasié par un surdosage d'anesthésiant chimique. L'euthanasie des animaux est réalisée par le personnel compétent, tutoré et habilité.

Remplacement

Malheureusement, il n'existe pas encore de méthode capable de remplacer totalement les tests sur les animaux pour évaluer les traitements contre l'hypertension. Cette maladie complexe résulte de plusieurs facteurs (génétiques, environnementaux) et touche différents organes comme le cœur, les vaisseaux, les reins et le système nerveux. Les tests en laboratoire sur des cellules sont utiles pour comprendre certains aspects, mais ils ne suffisent pas à prouver l’efficacité d’un traitement. Avant de proposer un médicament contre l’hypertension aux humains, il est indispensable de vérifier qu’il est efficace et sans danger dans un modèle animal pertinent.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été calculé avec soin pour en utiliser le moins possible, tout en garantissant des résultats fiables. Le modèle et le protocole choisis réduisent les différences entre les animaux, ce qui limite leur nombre nécessaire. De plus, nous prévoyons de tester plusieurs doses en même temps quand cela est possible, afin d’éviter de répéter les tests sur les mêmes groupes, comme ceux qui ne reçoivent pas de traitement ou un traitement de référence

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour réduire la douleur, la souffrance et le stress des animaux : - Les rats sont hébergés par deux ou plus par cage pour encourager les interactions sociales et diminuer leur stress. Leur environnement est enrichi avec des matériaux comme de la frisure de papier pour qu’ils puissent construire des nids. - Les zootechniciens vérifient quotidiennement leur comportement, leur santé générale et l’hygiène de leur cage. - Les manipulations sont effectuées avec douceur par du personnel formé pour qu’elles soient aussi rapides et stressantes que possible. En cas d’implantation de pompes osmotiques, les rats reçoivent une anesthésie, des antidouleurs et des antibiotiques pour prévenir tout inconfort ou problème. Des critères stricts (appelés points limites) permettent d’intervenir rapidement si un animal montre des signes de souffrance, avec des soins adaptés ou l’arrêt du traitement si nécessaire.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est essentielle pour étudier les maladies cardiovasculaires et métaboliques, qui sont complexes et impliquent plusieurs problèmes de santé en même temps. Nous utilisons un nombre minimum d’animaux, en choisissant ceux qui sont les moins sensibles au niveau nerveux et qui offrent les meilleures chances d’obtenir des résultats utiles. Les rongeurs, notamment les rats, sont privilégiés, ce qui limite l’utilisation d’autres animaux comme les chiens. Les rats sont un modèle idéal car leur hypertension ressemble beaucoup à celle de l’homme. De plus, il existe des rats qui développent naturellement une hypertension, ce qui les rend plus adaptés que les souris. Certaines souches de rats présentent également d’autres pathologies, comme le diabète, qui peuvent être liées à l’hypertension. Nous utilisons uniquement des rats adultes (âgés de 8 semaines ou plus), conformément aux données scientifiques disponibles.

1 225 rats vont être utilisés dans ce projet, chacun recevant un fil de suture serré autour d'un globe oculaire pour faire monter la pression, puis une anesthésie par semaine pendant un mois et jusqu'à huit instillations de gouttes par jour. Tous sont tués à l'issue pour l'analyse des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit les examens ophtalmiques comme "totalement indolores et non invasifs" parce qu'ils se pratiquent aussi en cabinet chez l'humain, et reconnaît ailleurs que la pose du fil peut causer une douleur légère à modérée pendant les premières heures. Les bénéfices annoncés, identifier des cibles thérapeutiques et fournir des données précliniques avant les essais humains, restent au futur, la mise en place du modèle étant l'objet immédiat du projet.

Objectifs

Le glaucome est une maladie oculaire chronique caractérisée par des lésions progressives du nerf optique, souvent associées à une élévation de la pression intra-oculaire (PIO). Cette pression élevée résulte généralement d’un déséquilibre entre la production et le drainage de l’humeur aqueuse, un liquide clair à l’intérieur de l’œil. Le glaucome peut entraîner une perte de vision irréversible si elle n’est pas traitée. Il existe plusieurs types de glaucome, mais le plus courant est le glaucome à angle ouvert, où le système de drainage de l’œil est partiellement obstrué. Les symptômes peuvent inclure une vision floue, des douleurs oculaires et une perte progressive du champ visuel. Le glaucome touche environ 1 à 2 % de la population mondiale de plus de 40 ans, avec une prévalence qui augmente avec l’âge. En France, environ 800 000 personnes sont traitées pour le glaucome, mais on estime que 400 000 à 500 000 personnes supplémentaires pourraient être atteintes sans le savoir. Malgré les traitements disponibles, certains patients peuvent ne pas répondre adéquatement aux thérapies conventionnelles, ce qui peut conduire à une progression de la maladie. Les traitements actuels visent principalement à réduire la PIO, mais ils ne sont pas toujours efficaces pour tous les patients. La recherche sur le glaucome est donc cruciale pour développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement. Comprendre les mécanismes sous-jacents de l’élévation de la PIO et des lésions du nerf optique peut conduire à des thérapies plus efficaces et à une meilleure prévention de la cécité liée au glaucome.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental chez l'animal sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la maladie. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’intervention : 1. L’établissement du modèle est réalisé avec la mise en place d’un fils de suture autour du globe oculaire. 1 seule fois par animal, le jour de l’induction. Cette étape ne devrait pas durer plus de 5 à 10 minutes sans compter l’anesthésie et le réveil de l’animal. Un seul œil est concerné. 2. Les anesthésies qui ne devraient pas durer plus d’une vingtaine de minutes, le temps du réveil. Ces anesthésies seront réalisées 1 fois pour l’induction et lors d’examens pour maintenir l’animal immobile soit 1 fois par semaine et durant 1 mois. 3. Les examens ophtalmiques (lampe à fente, tomographie, électrorétinogramme) qui sont réalisées soit quotidiennement la première semaine pour la tonométrie et la lampe à fente soit 1 fois par semaine. Ces examens ne durent pas plus de 5 minutes par animal. Les animaux seront anesthésiés afin de faciliter l’évaluation et maintenir l’animal immobile. Tous ces examens sont pratiqués chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation et également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ils sont totalement indolores et non invasifs. 4. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures durent moins d’une minute. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

La mise en place d’un fil de suture autour du globe oculaire est un acte chirurgical sans difficulté́ technique pouvant entrainer pour l’animal un léger inconfort notamment à cause de la pression exercée et des frottements. Les pesées hebdomadaires, les contentions quotidiennes et répétées nécessaires pour les observations, le suivi ou les administrations des produits peuvent induire chez l’animal un stress non négligeable bien que ces actes qui ne durent tout au plus que quelques dizaines de secondes soient réalisés par un personnel sensibilisé et formé au bien-être. Il en va de même pour les piqures réalisées notamment pour l’anesthésie des animaux. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un inconfort et un stress supplémentaire est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de lampes ou d'armoires chauffantes. L’administration des produits pourraient entrainer l’apparition de signes d’irritation comme des rougeurs et un inconfort. Bien que les travaux publiés ne montrent pas de changement de comportement, d'effet secondaires ou de manifestations de douleur, on ne peut pas exclure que l'affection recherchée, soit l’élévation modérée de la pression intraoculaire, entraine une douleur légère à modérée durant les premières heures qui suivent la mise en place des fils de sutures.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Les animaux, hébergés par deux au minimum, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, tunnel) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de minimiser au maximum le stress des animaux, le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des animaux tout comme le suivi sanitaire quotidien. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum tout comme l'administation si nécessaire d'un analgésique. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Ce modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis 2015 et est bien caractérisé chez le rongeur. Ce modèle, chez la souris et le rat est relativement facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité, une bonne fiabilité et relativement peu de nuisances ou d'effets indésirables. De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée.

Une lésion de la cornée pratiquée sur un œil, des gouttes instillées jusqu'à huit fois par jour, des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical, des examens sous anesthésie légère. 2 240 lapins et 2 280 rats vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, au service à la fois de la recherche, de tests d'efficacité réglementaires et de la formation professionnelle. Le porteur rappelle que la cornée est un tissu "richement innervé et sensible" et attend une gêne ou une douleur de quelques heures après l'induction de la lésion. Tous les animaux ayant suivi la procédure complète sont tués pour les évaluations histologiques et le dosage des produits.

Objectifs

Le but de ce projet est d'utiliser un modèle expérimental de cicatrisation cornéenne consécutif à une lésion de la cornée chez le lapin et le rat. Ce modèle contribuera à participer au développement de substances thérapeutiques qui amélioreront la cicatrisation en luttant contre l’apparition de la fibrose et des opacités. Un modèle expérimental de cicatrisation cornéenne de l’épithélium seul ou de l’épithélium et du stroma a déjà été mis en place dans notre établissement. Le but de cette demande est de pouvoir à nouveau utiliser ces modèles afin de tester l’efficacité de substances thérapeutiques sur l’amélioration de la cicatrisation cornéenne. Les traumatismes de la cornée sont un problème de santé majeur dans le monde et un des principaux motifs de consultation aux urgences ophtalmiques. Les opacités cornéennes sont la quatrième cause de cécité dans le monde. La cornée est le tissu transparent et avasculaire, ne contient pas de vaisseaux sanguins ou lymphatiques, situé en avant de l’œil, elle est finement structurée en trois couches : épithélium séparé par une membrane basale du stroma et un endothélium coté interne. L'organisation des fibres du stroma et l'absence de vaisseaux garantissent la transparence de la cornée. L'épithéllium est en contact avec le film lacrymal et l'endothélium avec l'humeur aqueuse (liquide présent dans la partie antérieure de l'œil entre la cornée et l'iris). La transparence de la cornée, élément crucial pour notre vision, est altérée lors d’une lésion qui peut avoir des origines multiples : infections, traumatismes physique ou chimique, greffes de cornée, complications de chirurgie réfractive au laser pour corriger les défauts de la vision (myopie, hypermétropie, astigmatisme…) ou dystrophies cornéennes (maladies héréditaires entraînant des malformations de la cornée). L’atteinte des différentes couches de la cornée peut aboutir à des réactions cicatricielles au niveau de l’épithélium ou du stroma selon la profondeur de l’atteint, entrainant des apparitions de vaisseaux, des opacités cornéennes permanentes jusqu'à la cécité. Le stroma contient les kératocytes qui secrètent les constituants de la matrice extracellulaire, les kératocytes quiescents se différencient en myofibroblastes activés lors de blessure. L’activation excessive des kératocytes et la présence de fibre de stress dans les myofibroblastes, sont responsables d’une cicatrisation fibreuse générant des opacités.

Bénéfices attendus

Les pathologies de la cornée sont un réel handicap et un problème majeur de santé publique puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements réparateurs pour rétablir la transparence de la cornée après un traumatisme.

Procédures

La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, le modèle induit une lésion de la cornée. La cornée est un tissu richement innervé et sensible, un seul œil sera induit. L’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

Les modèles in vitro existants ne permettent pas de recréer un environnement approprié pour conserver simultanément l’épithélium et l’endothélium, les durées de conservation sont limitées, il n’existe pas de modèle de cornée reconstituée complète permettant d’observer la cicatrisation, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétrique ou non paramétrique suivant la distribution des données. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Les modèles in vitro existants ne permettent pas de recréer un environnement approprié pour conserver simultanément l’épithélium et l’endothélium, les durées de conservation sont limitées, il n’existe pas de modèle de cornée reconstituée complète permettant d’observer la cicatrisation, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Une analgésie sera mise en place lors des procédures d'induction. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Isolés en cage individuelle et placés en cycle inversé, des rats sont conduits à boire de l'alcool au fil d'environ 80 sessions de trente minutes. Après une soixantaine de sessions d'habituation, six sessions associent la recherche d'alcool à des stimuli aversifs, pour séparer ceux qui continuent malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent. Vient ensuite une chirurgie cérébrale d'au plus quarante minutes sous anesthésie et analgésie, puis trois semaines d'attente avant l'analyse. 376 rats sont engagés dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 276 sont tués pour prélever leur cerveau, et les 100 autres, ceux qui n'ont pas assez d'appétence pour l'alcool, sont proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale.

Objectifs

Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones produisant de la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).

Bénéfices attendus

Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces qui sont inéxistantes à ce jour.

Procédures

La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.

Impact sur les animaux

L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’hebergement individuel des animaux pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la chirurgie d’injection et aux des stimuli négatifs lors der derniers jours de consommation d'alcool. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.

Devenir

Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux soit pour analyse des tissues, soit pour analyse de l'activité des neurones après la mort. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt à cinquante pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).

Réduction

Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base d'expériences similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cycle inversé et seront isolé pour répondre aux besoins experimentaux du projet. Cependant, les grilles des cages ainsi que les portoirs seront ouverts, et les cages seront proches les unes des autres, permettant le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. De plus ils recevront un enrichissement supplémentaire pour pallier cette individualisation. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées quotidiennes des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des expériences.