Rats
Evaluation de polymères à visée thérapeutique dans la prévention du névrome chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
373 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Chacun subit une opération d'environ une heure portant sur ses deux pattes arrière, avec section puis réparation d'un nerf d'un côté et fixation d'un implant sur le muscle de l'autre, plus trois séances de stimulation électrique des nerfs de vingt à quarante minutes sous anesthésie. Le projet teste jusqu'à dix colles et implants chirurgicaux censés éviter les névromes après une amputation chez l'humain. Le porteur écrit que les deux pattes sont utilisées simultanément pour diminuer le nombre de rats, et que la tolérance de ces dispositifs a déjà été étudiée "sans dommages observés sur l'animal".
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation des tissus et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales ont été développés pour différentes applications dont la réparation des nerfs périphériques et ont démontré une nette efficacité lors de précédentes études. Le but de ce présent projet est d’élargir l’indication de ces systèmes de réparation à des scénarios cliniques très spécifiques comme le traitement et la prévention de névrome notamment dans le cadre d’amputations. L’amputation concerne plus d’un million de patient par an à l’échelle mondiale, qu’elle soit liée à des traumatismes ou à des maladies chroniques comme le diabète ou le cancer. Après une amputation, il est fréquent que les nerfs sectionnés soient à l’origine : 1) du phénomène de douleur du membre fantôme qui correspond à des douleurs ressenties dans la partie du corps amputée. Ce phénomène affecte 95 pour cent des patients en postopératoire immédiat avec une persistance au long cours chez la moitié d’entre eux. 2) de la formation d’un névrome (48,7 pour cent des patients). Il s’agit de d’une tumeur bégnine formée par des fibres nerveuses qui se sont développées de façon anarchique. Un névrome s’accompagne de douleurs fulgurantes et peut nécessiter une nouvelle intervention chirurgicale pour le retirer. En clinique, les chirurgiens utilisent la réinnervation musculaire ciblée ou TMR pour traiter les nerfs lors d’une amputation pour prévenir l’apparition de névromes. Le but de ce projet est de valider in vivo l’efficacité de nos systèmes de réparation sur les nerfs dans un modèle de réinnervation musculaire ciblée chez le rat. 10 systèmes de réparation différents pourront être testés dans cette étude.
Bénéfices attendus
Si la régénération nerveuse est confirmée avec nos systèmes de réparation, une solution atraumatique pourra être proposée aux chirurgiens pour éviter l’apparition de névromes post-amputation sans créer de traumatismes supplémentaires aux tissus.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie bilatérale (transection/réparation nerveuse au niveau de la patte droite/ fixation atraumatique du système sur le muscle au niveau de la patte gauche) d’une durée d’une heure environ. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale gazeuse et locale associée à une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. Nous évaluerons à trois reprises (avant, pendant et après la chirurgie) la conduction nerveuse par électrophysiologie (stimulation électrique des nerfs) sous anesthésie générale pour une durée de 20 à 40 minutes. A la fin de la période de maintien prévue, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
La procédure nécessite un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’électrophysiologie est également réalisée sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Au cours de la chirurgie, des nerfs vont être sectionnés ce qui va impacter la mobilité de l’animal au niveau de la patte opérée. Le muscle n’étant que partiellement dénervé au cours de la chirurgie, l’impact sur la mobilité sera limité. La tolérance/bicompatibilité du système a été étudiée dans de précédentes études, sans dommages observés sur l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer l’efficacité de nos systèmes de réparation sur la régénération nerveuse.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères et les designs les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet doit nous permettre d’évaluer une régénération nerveuse ce qui ne peut être fait que dans un individu intégré et autonome.
Réduction
Au maximum, 373 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres designs ou des temps de suivi tardifs. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (10 à 11 animaux par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique. Les deux pattes des animaux seront utilisées pour étudier simultanément différentes problématiques en diminuant le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats par cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale de 5 jours sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée avant la chirurgie puis 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal puis 1 fois par semaine. Un complément gélifié ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites. Le scoring sera effectué 1 fois par semaine et servira de support au suivi quotidien des animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin, d’autant plus que nous travaillerons sur des nerfs. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 5 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est très important pour les temps de suivi tardifs de notre étude. Les animaux seront bagués au niveau de l’oreille à leur arrivée dans l’animalerie.
Rôle de l’inflammation dans la comorbidité entre le Trouble de Déficit d’Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH) et Douleur Chronique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 330
Une injection dans la plante d'une patte arrière déclenche une douleur qui peut durer jusqu'à six semaines, accompagnée d'évitement, d'anxiété, d'anhédonie, de perte de poids et de troubles du sommeil. 330 souris et 330 rats vont être utilisés sur cette base, dans des procédures classées en gravité sévère. La sensibilité douloureuse est ensuite mesurée sur une plaque dont la température varie de 5 à 55 °C, puis par des filaments appliqués six à huit secondes sur la patte blessée jusqu'au retrait vif, pendant que la grille de surveillance annoncée cote les vocalisations spontanées, l'automutilation et les contractions du visage. Tous les animaux sont tués à la fin, le résumé donnant pour seule raison des "études ex-vivo".
Objectifs
Le Trouble de Déficit d’Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH) est un trouble du neurodéveloppement qui survient dès l’enfance et perdure dans la plupart des cas à l’âge adulte. Il est caractérisé par la présence de troubles de l’attention, d’impulsivité et d’hyperactivité, et par la présence de nombreux troubles comorbides complexifiant à la fois son diagnostic et sa prise en charge. La douleur chronique est un de ces troubles comorbides avec des études rapportant une prévalence pour la douleur chronique de 80% chez les sujets avec TDAH, et à l’inverse, des travaux qui montrent que 73% des sujets avec douleurs chroniques présenteraient un TDAH. L’objectif général de ce projet est de mieux comprendre les bases neurobiologiques de la comorbidité entre TDAH et douleur chronique en testant l’hypothèse de l’implication de la neuroinflammation. Dans de précédentes études, il a été montré qu’un modèle de souris de TDAH bien caractérisé sur le plan comportemental présente une sensibilisation à la nociception suite à l’induction d’un modèle de douleur chronique impliquant une inflammation périphérique. L’objectif spécifique de ce projet est d’explorer le rôle de la neuroinflammation dans ces mécanismes de sensibilisation à la nociception par imagerie non invasive et métabolomique dans deux modèles animaux de TDAH et d’évaluer l’impact d’un traitement utilisé chez le patient TDAH, le méthylphénidate.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet vont permettre de mieux comprendre les différences d’activité et de connectivité cérébrale pouvant être à l’origine de troubles attentionnels, d’impulsivité et d’hyperactivité, de tester l’hypothèse du rôle de la neuroinflammation dans la comorbidité TDAH / douleur chronique comme supporté par des données acquises in vitro, et d’évaluer et comprendre un potentiel effet du méthylphénidate dans ce contexte. Ces effets seront évalués en parallèle sur le plan comportemental par collaboration avec un autre institut. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’affiner nos connaissances sur cette pathologie et peut d’être d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge des patients.
Procédures
2 injections en intrapéritonéale de 30 secondes du radiotraceur. Deux inductions d'1min d'anesthésie gazeuse pour l'induction et 2 imageries de 30 min sous anesthésie gazeuse. 1 injection intraplantaire 30 secondes. Tests comportementaux : 2 à 4 jours après injection intraplantaire pendant 30 min. 1 injection intraplantaire 30 secondes. Tests comportementaux : 2 à 4 jours après injection intraplantaire pendant 30 min. Deux inductions d'1min d'anesthésie gazeuse pour l'induction, deux poses de cathéther de 10min pour injection intra-veineuse . 2 injections en intraveineuse de 30 secondes du radiotraceur.
Impact sur les animaux
La manipulation avant l'anesthésie entraine un léger stress chez l'animal. La mise à jeun de l'animal (inférieur à 15h) peut engendrer du stress. La contention nécessaire à l'induction de l'anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Une douleur au point d'injection du radiotraceur peut être ressentie. Un hématome au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre. Une injection intraptéritonéale peut provoquer de la douleur. La nuisance liée à cette souche de rat est une augmentation de l’élévation de la pression artérielle chez ces animaux. Le modèle de douleur chronique induit de fait une douleur sur la plante du pied d’une patte arrière qui peut durer jusqu’à 6 semaines. Des répercussions sont possibles sur le comportement des rongeurs : Augmentation des comportements d’évitement et anxieux, anthédonie, perte de poids, troubles du sommeil. Nuisances de l’injection du méthylphénidate : une douleur au point d’injection en intrapéritonéal peut être ressentie quelques heures. Nuisance des tests comportementaux : les animaux sont placés sur une plaque dont la température n’induit initialement aucune nociception. Nous ferons varier progressivement la température de cette plaque avec des valeurs comprises entre 5°C et 55°C. Pour le second test, les animaux sont placés dans une cage dont le plancher est muni d’un filet métallique maillé. Une série de monofilaments, avec des forces croissantes allant de 0.04g à 4g sont utilisés pour délivrer une pression mécanique sur la patte postérieure. Chaque filament est appliqué pendant 6 à 8 secondes. La réponse douloureuse est caractérisée par un retrait vif de la patte.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour des études ex-vivo.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro ni in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée. En effet, notre étude vise à étudier l’organisme vivant dans son intégralité. Seules les études chez l’animal peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité.
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle. L’imagerie permet d’utiliser un même animal pour différentes conditions optimisant la quantité d’animaux nécessaire pour l’étude. Nous utiliserons 2 espèces animales, avec un total 660 animaux sur 5 ans soit 330 souris et 330 rats pour répondre à nos objectifs.
Raffinement
Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Les animaux seront hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Ils seront observés quotidiennement. Des habituations à l’imagerie seront réalisées au minimum 3 jours avant la réalisation du protocole d’imagerie afin d’habituer les animaux à la salle d’expérimentation et son environnement. Il en sera de même pour les expériences de comportements. Une surveillance accrue d’une semaine sera réalisée pour suivre chaque animal. Les expérimentateurs donneront une récompense à l'animal après les injections. Les imageries seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Durant toutes les expérimentations d’imagerie, les animaux seront maintenus dans un lit thermorégulé et un monitoring de la température corporelle sera réalisé à l’aide d’une sonde mise en place sous le ventre de l’animal. De plus, un monitoring respiratoire sera opéré à l’aide d’un capteur relevant la fréquence respiratoire. Une protection oculaire sera appliquée. Des points limites gradés seront évalués, 4 facteurs seront estimés au cour de la surveillance des animaux: 1/ la posture sera mesurés; normal (score 0), manque de toilettage (score 1), pelage terne (score 2), dos arrondi (score 3); 2/ l'alimentation: normal (score 0), perte de poids inférieure à 5% (score 1), perte de poids de 0-15% (score 2), perte de poids supérieure à 15% (score 3); 3/ comportement naturel: normal (score 0), légères modifications (score 1), moins mobile et attentif, isolé (score 2), vocalisations spontanées, automutilation, animal agité, ou immobile (score 3); 4/ expression faciale: contraction orbitaire (score 0 à 2) , gonflement du nez (score 0 à 2), gonflement des joues (score 0 à 2), position des oreilles (score 0 à 2), changement des moustaches (score de 0 à 2).
Choix des espèces
Le choix de la souris et du rat est conditionné par les modèles utilisés dans cette étude. Les souris seront étudiées à l’âge adulte. Les rats seront étudiés avant 10 semaines pour éviter le développement d’une hypertension artérielle décrite entre 8 et 10 semaines chez ces rats et qui est un facteur confondant à l’étude.
La metformine peut elle promouvoir B. faecichinchillae, espèce commensale du microbiote intestinal humain possèdant des propriétés anti-diabétiques équivalentes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Un gavage orogastrique quotidien de metformine, un prélèvement de selles par semaine et trois minutes de contention dans un tube de PVC pour mesurer la composition corporelle : 192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont nés sans flore intestinale, puis colonisés par gavage avec le microbiote fécal d'un donneur humain volontaire. L'enjeu déclaré est de savoir si la metformine favorise une bactérie intestinale aux propriétés antidiabétiques, qui pourrait ensuite être proposée comme probiotique. Le porteur écarte l'anesthésie pendant les gavages pour éviter les fausses routes, et écarte les antalgiques au motif qu'ils modifieraient les métabolismes étudiés.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la metformine, traitement thérapeutique du diabète de type II, peut promouvoir la population bactérienne d'intérêt, Bacteroides Faecichinchillae, possédant également des propriétés anti-diabétiques, dont les effets sur la santé seront évalués, en particulier au niveau tissulaire.
Bénéfices attendus
Si le traitement à la metformine permet de promouvoir l’espèce commensale d’intérêt, B. faecichinchillaeae, l’utilisation de cette bactérie sera proposée comme probiotique chez l’homme soit en remplacement de la metformine soit en association avec la metformine. L’administration de la souche permettrait en effet de limiter les effets secondaires observés chez l’homme suite à la prise de ce médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, et enfin 3) une supplémentation quotidienne de Metformine par un gavage oro gastrique (200mg/kg de poids corporel) pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. Plus de 60 ans d'utilisation de la metformine en santé humaine ont démontré l'efficacité et l'inocuité de ce médicament, toutefois, selon les doses prescrites, des effets secondaires sont observés chez près de 25 % des patients en particuliers des intolérances gastrique et nausées. Si dans la bibliographie, ces symptômes ne sont pas mentionnés dans les éudes in vivo, une attention particulière sera, cependant, portée sur une apparition potentielle de ces symptômes lors de l'observation quotidienne des animaux. Le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact de la metformine sur le microbiote nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ce produit sur le rôle de la paroi intestinale (perméabilité, immunité) et sur les métabolismes hépatiques (céramides, voies métaboliques de l'insuline, etc...) chez l’homme. De plus, ceci nécessite une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques ainsi que les prélèvements de selles. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvements de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. l'anesthésie ne sera pas utilisée, il est nécessaire que les animaux restent vigils pour éviter les fausses routes qui pourraient être provoquées par son absence de consience. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement. Pas d'utilisation d'antalgiques qui pourraient modifier les métabolismes ciblés dans le projet et rendent incomparables les résultats.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 10 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 10 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.
Evaluation comportementale des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur la mémoire de rongeurs en conditions pathologiques ou physiologiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1440
4 800 souris et 1 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, un même groupe passant jusqu'à trois des cinq protocoles, et les souris modèles de trisomie 21, de syndrome de l'X fragile ou de narcolepsie les cinq, parce qu'elles sont disponibles en quantités limitées. Souris et rats sont placés dans le labyrinthe de Barnes, le labyrinthe en Y, le test de reconnaissance de nouvel objet, le rotarod et le test des trois chambres, avec pour une version une restriction alimentaire sur huit jours et, pour une autre, une lumière et un bruit forts destinés à les pousser vers un refuge. Des candidats médicaments leur sont administrés à différents moments du protocole. 1 320 animaux contrôles pourront être réutilisés dans d'autres projets, les autres sont tués, à commencer par ceux dont le traitement risquerait d'interférer avec une expérience ultérieure.
Objectifs
Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.
Bénéfices attendus
A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouvelles entités pharmacologiques, ce projet permettra de caractériser l’effet de ces entités sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale et sociale, mémoire à court ou long terme, flexibilité cognitive, mémoire procédurale). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des composés présentant des effets pro-mémoire intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits mnésiques (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Où à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus trois modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21, syndrome de l’X Fragile et narcolepsie), qui permettront de tester l’effet de nos nouvelles entités pharmacologiques sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments.
Procédures
Ce projet comporte 5 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, un même groupe de souris pourra être testé au maximum dans 3 des 5 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 3 modèles souris de la trisomie 21, du syndrome de l’X Fragile et de la narcolepsie, les mêmes souris seront soumises aux 5 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déroulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes ; la seconde version impliquera une restriction alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes ; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Le quatrième protocole est le test de rotarod qui comporte 2 à 5 jours d’apprentissage comportant 1 à 4 essais par jour, avec un test de rappel composé de 1 à 4 essais 2 à 7 jours plus tard. La durée de chaque essai sera inférieure à 5 minutes. Le cinquième et dernier protocole est celui du test des 3 chambres, qui comporte 3 phases de 10 minutes, avec un délai entre les deux dernières phases allant de 1 min à 24h. Pour chacun des 5 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d’attention fonctionnelles.
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent une batterie de tests entre douze et vingt semaines d'âge, activité locomotrice et anxiété pendant trente minutes, coordination, force musculaire, comportement compulsif, apprentissage et mémoire sur huit jours, plus trois nuits d'isolement en cage individuelle pour évaluer un état dépressif. La mise à mort sert à prélever les organes pour des analyses histologiques et protéomiques. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de comprendre cette maladie neurodéveloppementale rare par un modèle animal, et conclut que seul l'animal permet d'en caractériser les symptômes, les approches in vitro se limitant selon lui aux mécanismes.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT-1 - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT-1 - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT-1 - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT-1 - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine. AMENDEMENT-2: Le prélèvement et fixation des organes sera réalisé sous anesthésie profonde.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT-1 - L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Implication du microbiote intestinal dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde chez le rat – stratégies thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Dès le premier symptôme d'arthrite, sept jours sont comptés avant de décider du sort de l'animal, délai que le porteur justifie par le temps nécessaire pour que les quatre membres soient potentiellement atteints et que le score maximum soit obtenu. 768 rats vont être utilisés, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués et autopsiés à l'issue. Nés sans aucune flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de donneurs humains, puis deux injections de collagène sous la peau de la base de la queue pour déclencher la maladie, et pour certains un gavage quotidien de probiotique. Le porteur écrit que l'atteinte articulaire va "inévitablement" générer une douleur chronique modérée à sévère, quand les bénéfices annoncés se limitent à l'identification de groupes bactériens et, "à terme", à des stratégies de modulation du microbiote.
Objectifs
L'objectif du projet est de développer un modèle expérimental pour l'étude mécanistique de la Polyarthrite Rhumatoïde (PR), pour la description de la physiopathologie générale de la PR dans une situation de déséquilibre du microbiote (dysbiose) et de proposer des solutions innovantes de prise en charge de la pathologie (développement de nouveaux pré- et probiotiques, d'aliments fonctionnels et de nouveaux antalgiques ciblant les moécules identifiées).
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de mettre en évidence les groupes bactériens susceptibles d'être impliqués dans le processus d'inflammation chez les personnes souffrant de polyarthrite rhumatoïde, et à terme, de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à moduler le microbiote intestinal.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions au cours de projet 1)des gavages orogastriques pour 1a) l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 1b) pour l'administration d'une bactérie probiotique, cette intervention sera quotidienne dès l'apparition du 1er symptôme post injection, pratiquée en moins d'une minute par des zootechniciens formés. 2) ils subiront également 2 injections espacées de 7 jours, en intra-dermiques à la base de la queue, sous anesthésie générale, espacées de 7 jours, d'une solution permettant l'induction de la polyarthrite rhumatoïde. 3) Des prelèvements de fecès seront réalisés avant implantation du microbiote, 15 après l'implantation, et de façon hebdomadaire pendant les 4 semaines maximum d'observation post injection (1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute)
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. En ce qui concerne l'induction de la polyarthrite rhumatoïde, les premiers signes visibles liés à l'apparition de la pathologie induite devraient survenir entre 7 et 10 jours après l'injection de collagène de type II. Les symptômes sont habituellement maximaux 15 jours post injection avant de se stabiliser voir, de régresser légèrement. L'atteinte articulaire va inévitablement générer une douleur chronique modérée à sévère et un stress important pour les animaux. En fonction du stade de la pathologie, apprécié par une grille d'évaluation, les déplacements des animaux pourront être réduits et l'état général affecté.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’étude du phénotype arthritique, de l’implication du microbiote intestinal dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde et de l'effet d'une stratégie thérapeutique par administration d'une bactérie probiotique, ne peut être évaluée que sur un organisme vivant pris dans sa globalité,les méthodes non animales ne permettront pas de répondre à la question de la relation hôte-microbiote dans le cadre d'une pathologie extra digestive induite.
Réduction
Pour le respect de la règle des 3Rs, le nombre de chaque groupe d’animaux et le nombre de répétition de chaque procédure (6 expériementations correspondant à 6 microbiotes différents) a été réduit au minimum nécessaire, grâce au précédent projet qui a permis de déterminer un nombre d'animaux pour discriminer un effet statistiquement significatif entre les traitements et également. Ainsi quatre lots de 16 rats seront utilisés pour chaque expérience et ils correspondent à des inocula microbiens et des traitements différents : -un lot de rats à microbiote humain issu d’un patient souffrant de polyarthrite rhumatoïde, qui recevront une injection pour induire la polyarthrite - un lot de rats à microbiote humain issu d’un patient souffrant de polyarthrite rhumatoïde, qui recevront une injection de sérum physiologique (injection contrôle) -un lot de rats à microbiote humain issu d’un volontaire sain (microbiote contrôle), qui recevront une injection pour induire la polyarthrite - un lot de rats à microbiote humain issu d’un volontaire sain (microbiote contrôle), qui recevront une injection de sérum physiologique (injection contrôle).
Raffinement
Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne pour, tout d'abord, déterminer le score clinique évalué selon les critères définis comme l'aspect visuel des articulations, la mesure de l'épaisseur des chevilles à l'aide d'un pied à coulisse et/ou du volume de la patte à l’aide d’un pléthysmomètre, mais également pour détecter tout autre signe d'inconfort, de douleur, de détresse ou d'angoisse pour le réduire, le soulager, le supprimer. Dès l'apparition de ces signes, l'arbre décisionnel sera suivi. L'évaluation retrospective du précédent projet a entrainé une modification des points limites. En effet, dès le développement du 1er symptôme défini par la fiche de scoring, 7 jours sont comptabilisés pour observer la poursuite ou non du développement de la pathologie. Ce délai correspond au temps nécessaire pour que potentiellement les 4 membres soient atteints et donne ainsi le score maximum. Au terme de cette période, les animaux sont soit mis à mort et les prélèvements réalisés selon la procédure décrite dans la DAP, si la pathologie reste établie sur au moins un des quatre membres, soit resteront inclus dans le projet si la pathologie réverse (effet traitement ou inflammation transitoire/pathologie non établie). Pendant cette période, l'accès à l'alimentation et la boisson sera facilité pour les animaux developpant la pathologie (croquettes humidifiées dans la cage, gels nutritifs, tétines de biberons rallongées).
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats femelles et mâles fischer 344 nés axéniques âgés de 6 à 7 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 à 9 semaines au moment de l'injection de collagène de type II. Ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour permettre une bonne reproductibilité de l'induction de l'arthrite rhumatoïde par le collagène de type II. Ainsi ils auront environ 6 semaines au moment de la transplantation fécale.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle d’embolie pulmonaire (EP) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Un cathéter implanté par chirurgie dans la veine jugulaire, puis l'injection de caillots fabriqués à partir de leur propre sang pour boucher leurs artères pulmonaires : 1 615 rats vont être utilisés ainsi, dont 1 445 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'obstruction provoque une douleur et une détresse respiratoire plus ou moins marquée selon la zone touchée, suivie d'une baisse de mobilité, d'une perte d'appétit et d'une perte de poids. Il s'agit de mettre au point le modèle, puis d'y tester des candidats médicaments censés dissoudre les caillots. Tous les rats sont tués en fin de protocole, après une chirurgie qui expose le cœur et une mesure de pression dans le ventricule droit que le porteur juge "trop invasives pour envisager un réveil des animaux".
Objectifs
L'embolie pulmonaire est une pathologie cardiovasculaire résultant de l'obstruction d'une artère pulmonaire par un caillot de sang s'étant formé dans un vaisseau sanguin (appelé thrombose) éloigné, provenant généralement des veines des membres inférieurs. L'embolie pulmonaire est le 3ème syndrome cardiovasculaire aigu le plus fréquent dans le monde. Les facteurs de risques sont nombreux et incluent entre autres l’âge, les pilules contraceptives, l’insuffisance cardiaque, l’immobilisation, l’obésité, le tabagisme… La mortalité à la suite de l’embolie pulmonaire varie entre 2,5 et 30% selon les études. La plupart des décès par embolie pulmonaire surviennent quelques heures après l’événement, avant-même que le diagnostic ne soit réalisé dans 59% des cas. La prise en charge de la phase aigüe de l’embolie pulmonaire consiste à administrer des traitements qui vont venir dissoudre le caillot et rétablir la circulation dans l’artère pulmonaire obstruée tels que des anticoagulants, ou encore à effectuer le retrait du caillot par chirurgie. Cependant, cette dernière est réservée pour les cas les plus graves d'embolie pulmonaire et est une technique invasive alors que l'administration d'agent anticoagulant présentent des limites d'efficacité entre les individus et des effets secondaires tels que des risques d'hémorragie. L’objectif de ce projet est donc d'établir un modèle d’embolie pulmonaire chez le rat et de tester l’efficacité de nouveaux traitements pouvant dissoudre le caillot pour cette indication thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur le modèle rongeur d’embolie pulmonaire en agissant sur les paramètres des flux sanguins au niveau cardiaque (e.g., pression artérielle dans les cavités cardiaques ou vaisseaux sanguin pulmonaires) et anatomique/tissulaire. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d’embolie pulmonaire.
Procédures
Les animaux vigiles sont d'abord soumis à un prélèvement de sang au niveau de la veine caudale de la queue (durée 5min) entre 2 et 24h avant l'injection des caillots. Ensuite, les animaux sont anesthésiés quelques heures plus tard puis une chirurgie est réalisée pour implanter un cathéter dans la veine jugulaire, localisée au niveau du cou afin d'injecter des mini caillots dans la circulation sanguine en direction des petites artères pulmonaires et ainsi induire une embolie pulmonaire (durée de l'intervention environ 30min). Un composé de référence ou un candidat médicament peut être administré sur animal éveillé par voie intraveineuse au niveau de la queue. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage soit directement avec leur congénère soit de manière individualisée (au maximum 10h) lorsqu'ils devront être traités avec un candidat médicament afin d'éviter qu'ils ne s'arrachent le cathéter veineux (permettant l'administation du composé) entre eux. Quelques heures plus tard, les animaux sont à nouveau anesthésiés (une à plusieurs fois) avant d'être soumis aux imageries cardiaques (environ 20 min pour chaque passage) pour contrôler les répercussions et l'évolution de l'embolie pulmonaire ou pour évaluer l'efficacité du traitement. A la fin de la procédure, une chirurgie est effecutée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le ventricule droit et dans l'artère pulmonaire puis pourront être soumis à un prélèvement sanguin par ponction directe dans le coeur avant d'être mis à mort par surdose d'euthanasiant (durée 15min). En parallèle, ces animaux pourront subir un prélèvement sanguin par ponction directe de la veine jugulaire réalisée sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de sang sur rat vigile, permettant de créer les caillots sanguins, nécessite une contention de l’animal pouvant être source de stress, ainsi qu’une ponction avec une aiguille de la veine de la queue pouvant générer une douleur. L’induction de l'obstruction des vaisseaux sanguins pulmonaires par l’administration de caillots (provenant du sang prélevé sur le même animal), se réalise sous anesthésie gazeuse, après l’ouverture chirurgicale de la peau au niveau du cou et peut donc provoquer des douleurs au réveil. L’obstruction des vaisseaux pulmonaires en elle-même engendre une douleur et provoque une détresse respiratoire plus ou moins sévère en fonction de la localisation et de de la taille de la zone obstruée. Dans les heures qui suivent l’obstruction des vaisseaux pulmonaires, une baisse de la mobilité peut être observée ainsi qu’une perte d’appétit et une baisse de l’hydratation entrainant une perte de poids. L’administration des composés dans le système veineux nécessite l'insertion d'un petit tube dans la veine de la queue pouvant être à l’origine de douleur et d’inconfort. Par ailleurs, ce tube peut être arraché par l’animal et entrainer un saignement plus ou moins abondant. Une nouvelle anesthésie générale sera nécessaire à chaque fois qu'une échographie cardiaque (pour suivre l'évolution de la pathologie) devra être réalisée (4 au maximum sur 24h toutes les 2h, avant et après l'occlusion des vaisseaux) ou pour réaliser des prélèvements sanguins à la veine jugulaire. De même, en fin de protocole, des mesures de la pression sanguine dans le coeur et le poumon seront effectuées sur animal anesthésié après exposition du coeur par chirurgie et pouvant être suivi par un prélèvement de sang. Les prélèvements de sang (sans excéder les 20% du volume total sanguin) entrainent une diminution du volume sanguin ainsi qu'une déshydratation accompagnée d'une sensation d'inconfort et de stress plus ou moins marquées en fonction du volume de sang prélevé. Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du médicament à tester : un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (coeurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du coeur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux.
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet des composés sur l’évolution des paramètres de flux sanguin cardiaques et anatomique/tissulaire après l’embolie pulmonaire, le recours à un modèle animal est nécessaire, ce que ne peut pas reproduire le modèle in vitro.
Réduction
Ce projet débute par une étude pilote pour mettre au point le modèle d’embolie pulmonaire. L’induction de l’embolie pulmonaire sera évaluée par un suivi sur plusieurs heures de la réponse des flux sanguins au niveau cardiaque par échographie, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. Une fois la technique d’induction maîtrisée, un groupe d’animaux induits sera comparé à un groupe contrôle afin de valider statistiquement l’induction du modèle et les variabilités observées. Dans un second temps, 2 composés de références seront testés à 3 temps différents, afin de définir la fenêtre thérapeutique à laquelle l’administration de traitement permettant de dissoudre les caillots est efficace pour avoir des effets bénéfiques. Ces 6 groupes expérimentaux seront comparés à un groupe contrôle sain et à un groupe induit avec l'embolie pulmonaire et non traité afin de sélectionner le temps d’administration des composés le plus efficace et de limiter le nombre de groupes expérimentaux nécessaires pour tester ensuite l’efficacité de candidats médicaments. Les animaux seront répartis de manière aléatoire après l’induction de l’embolie pulmonaire à partir des mesures de flux sanguins par échographie cardiaque, permettant ainsi d’homogénéiser les différents groupes et de diminuer la variabilité entre ces derniers.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 6 jour est respectée. Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné, habitué à de la microchirurgie vasculaire. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2 par cage. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection d’anesthésiques chimiques, d’analgésiques ou de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses et volume adaptées en fonction des voies d’administration comme la voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée ou voie intraveineuse). Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. La chirurgie pour induire l’embolie pulmonaire consistant à administrer des caillots de sang au niveau de la veine jugulaire sera réalisée sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue en phase post-opératoire jusqu’à la fin du protocole (24h maximum). De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Les échographies cardiaques seront également réalisées sous anesthésie (i.e., gazeuse). Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et maintenus et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux.
Choix des espèces
Le rat, classiquement utilisé en laboratoire, présente des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie pulmonaire, vasculaire et cardiaque. La réponse pathophysiologique du rat dans les modèles d’embolie pulmonaire est comparable à celle des humains notamment en termes de modifications des flux sanguins et de réponse inflammatoire. Des rats de 5 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Mise en oeuvre des études pharmacocinétiques/pharmacodynamies chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 300
Tester des "éléments d'essais" à visée anti-inflammatoire, antibiotique, anticancéreuse ou neurologique et en suivre le passage dans le sang : 4 000 souris et 300 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal reçoit le produit à l'état vigile, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées peuvent provoquer douleur et lésions internes, et présente le micro-prélèvement de 30 µL comme une mesure de réduction, puisqu'il permet de tirer neuf points de mesure du même animal. Sur le remplacement, il renvoie la décision au responsable de chaque étude et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne reproduit la diffusion d'un produit à l'échelle de l'"organisme entier", ce qui rendrait "indispensable" le recours à l'animal entier.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essais seront testés (classe thérapeutique anti-inflammatoire, anti-néoplasique, antibiotique, neurologique principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront par la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de pharmacocinétiques (PK) simples: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/sérum principalement. Il peut s'agir de conduire des études pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) : suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/sérum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments testés en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments testés peuvent être suivis dans les fécès.
Bénéfices attendus
L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essais sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humains ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK et/ou PD) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés afin de déterminer les relations dose/effet.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : -Premier cas: administration de l'élément testé. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé afin d'éviter tout stress à l'animal, - Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale, les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats, 9 prélèvements maximum sur 24h. Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement est inférieure à la minute. La collecte de fécès pourra se faire dans les cages d'hébergements de manière collective par groupe de molécules testées. Deuxième cas: les animaux placés sous anesthésie générale ( anesthésique gazeux) seront soumis à un prélèvement sanguin terminal. Durée du prélèvement de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, cependant il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté et formé afin d'éviter au maximum toutes ces nuisances.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.
Réduction
Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 300 rats, 4000 souris sur une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple, en utilisant la technique du micro sampling (prélèvement de 30 µL de sang par animal), cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de prélèvements pourront être réalisés sur le même animal.
Raffinement
Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Les animaux hébergés en groupe auront, dans leurs hébergements, la présence d'enrichissements variés et renouvelés (buchettes et balles en bois, cachettes, tunnels ...). Les animaux seront observés au minimum une fois par jour pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvements au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum. Des points limites ont été défini. Les animaux seront observés quotidiennement et pourront être suivi par le vétérinaire désigné si necessaire.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée pour les essais de produits pharmaceutiques. Jeunes, adultes ( environ 7 à 12 semaines) Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres laboratoires, gardés pour un usage interne ou mis à mort selon les besoins de l'élevage, 901 000 souris et 3 000 rats immunodéficients vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur seule procédure décrite est une biopsie sur animal vigile pour le génotypage, l'essentiel de l'activité étant la reproduction, la fécondation in vitro et la cryoconservation des gamètes sur deux établissements. Ces rongeurs sont dépourvus de défenses immunitaires pour accepter sans les rejeter des greffes de tumeurs ou de cellules humaines, ce qui les rend sensibles à la moindre contamination et impose un élevage sous barrière sanitaire. Le porteur écrit avoir calculé les effectifs sur son savoir-faire et ses données historiques, et précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions sanitaires élevées afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Optimisation et test d’un inhibiteur d’une kinase sur plusieurs modèles de douleur orofaciale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
540 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 80 d'entre eux étant opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Ils reçoivent une injection dans la citerne cérébrale ou sous la peau d'un produit inflammatoire qui provoque une allodynie tactile, un gavage, parfois cinq injections intrapéritonéales, puis sept mesures comportementales de la douleur en une heure trente ou deux heures trente. Le porteur affirme que ces tests n'entraînent pas de stress parce que les animaux y ont été habitués, et fixe la mise à mort à 20 % de perte de poids. Il conclut qu'aucune méthode ne peut remplacer ce protocole, l'installation de l'allodynie après injection d'un produit inflammatoire devant selon lui être observée chez l'animal vivant.
Objectifs
Parmi une série de composés chimiques synthétisés, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire ?
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'améliorer la compréhension du mécanisme d'action du composé ainsi que d'évaluer son efficacité sur plusieurs modèles de douleurs orofaciale et par d'autre voie d'administration.
Procédures
Groupe1: injection intracisternale (1 par animal: 3min) ou voie orale ((1 par animal: 3min) + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous sédation + tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 1h30)+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale). Groupe 2: injection intra péritonéale ( 1 ou 5 par animal : 2min) + voie orale (1 par animal : 3 min) sous sédation+ tests de mesure de la douleur en comportement(7 fois en 1h30)+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale). Groupe3 : injection voie orale (1 par animal: 2min) sous sédation+ tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 2h30)+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale). Groupe 4: injection intracisternale (1 par animal: 3min) + tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 2h30). Groupe 5: injection voie orale (1 par animal: 3min) + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous sédation+ stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale) Groupe 6: injection par voie orale (1 par animal: 3min) +prélèvement sanguin (2 par animal d'environ 2min espacé de minimum 4h) sous sédation
Impact sur les animaux
La piqûre d’aiguille lors de l’injection intracisternale (1 par animal : 3min sous sédation) entraine une douleur légère de courte durée et le produit injecté ne doit pas produire d’effet indésirable. Le gavage par voie orale ((1 par animal : 3min sous sédation) entraine une irritation légère de courte durée et le produit injecté ne doit pas produire d’effet indésirable. La piqûre d’aiguille lors de l’injection sous-cutanée (1 par animal :2min sous sédation) sous sédation entraine une douleur légère de courte durée et le produit injecté provoque une irritation de courte durée puis une allodynie tactile. Les tests de mesure de la douleur en comportement (7 fois en 1h30) n’entraînent pas de stress car les animaux ont été habitués aux tests : ils sont habitués à être isolés pour ces tests. La stimulation non nociceptive (10 min sous anesthésie générale et procédure sans réveil) n’entraîne pas de stress car les animaux sont sous anesthésie générale. La piqûre d’aiguille lors de l’injection intra péritonéale ( 1 ou 5 par animal : 2min) entraine une douleur légère de courte durée et le produit injecté ne doit pas produire d’effet indésirable. Le prélèvement sanguin (2 par animal d'environ 2min espacé de minimum 4h) sous sédation entraine une douleur légère de courte durée au niveau du prélèvement.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections, comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire au niveau de la patte, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Le poids est mesuré quotidiennement. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Si la perte de poids excède 20% du poids initial, les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique avec sédation préalable. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaines (125g à 300g). Les différentes études sur la douleur sont réalisées sur des animaux adultes. Les différents types de douleur trigéminale est majoritaire chez les personnes adultes. L'utilisation de rats dans les études comportementales sur la douleur est largement répandue et justifiée par plusieurs facteurs scientifiques et éthiques. Les rats partagent des similitudes biologiques et physiopathologiques avec les humains, en particulier dans le système nerveux et la réponse à la douleur. Leur système nociceptif (responsable de la détection de la douleur) est comparable à celui des humains, ce qui permet d'étudier des mécanismes de la douleur qui peuvent être extrapolés à l'homme.
Effets de l’hypoxie intermittente sur les enzymes et transporteurs impliqués dans la métabolisation des médicaments et ses conséquences sur la pharmacocinétique et la réponse médicamenteuse chez le rat 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Placés quatre semaines dans un caisson d'hypoxie intermittente, huit à seize heures par jour pendant leur phase de sommeil, 434 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire chaque jour, une prise de sang entre le dix-huitième et le vingt-et-unième jour, puis une échographie de l'aorte sous anesthésie gazeuse après un transport entre deux établissements. Presque tous sont tués par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale pour récupérer leurs organes, quinze rats écartés en cours d'étude pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur justifie l'effectif en indiquant que le nombre d'animaux a été fixé à douze, sans dire comment on passe de ce chiffre aux 434 rats déclarés.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.
Bénéfices attendus
Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.
Procédures
Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.
Devenir
Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.
Remplacement
L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.
Réduction
Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.
Choix des espèces
Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.
Physiopathologie et évaluation de nouvelles molécules thérapeutiques dans des modèles de rétinopathies chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Jusqu'à six injections dans l'œil par animal, à raison de trois par semaine, et vingt-quatre heures d'exposition en cage individuelle à une lumière d'intensité comparable à une journée ensoleillée, pour détruire la rétine. 4 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever les rétines et les fonds d'œil. L'objet déclaré est de comprendre la dégénérescence maculaire et la rétinopathie diabétique, et de tester des molécules neuroprotectrices, sur des rats spontanément diabétiques suivis entre huit et dix-huit mois. Le porteur présente comme une réduction le fait de mutualiser un groupe témoin, ce qui économise 560 animaux sur les 4 600 prévus.
Objectifs
Les rétinopathies telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) font partie des principales causes de cécité chez l’Homme adulte avec une incidence croissante. Ces pathologies multifactorielles évolutives et invalidantes ne bénéficient pas de traitement efficace pour tous les patients face à la perte des cellules de la rétine. L'étude de la physiopathologie des rétinopathies ainsi que la recherche de nouvelles molécules pour les traiter, revêt un intérêt majeur dans le domaine de la santé et de la recherche médicale. Cette étude a pour but d’une part de mieux comprendre les mécanismes biologiques, cellulaires et moléculaires sous-jacents qui conduisent au développement de ces différentes maladies oculaires. Une connaissance plus approfondie de la physiopathologie des maladies oculaires nous permettra de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ainsi que des marqueurs spécifiques aux différentes rétinopathies afin de rendre possible un diagnostic des pathologies à un stade précoce et ainsi favoriser une prise en charge plus efficace. D’autre part, la recherche de nouvelles molécules thérapeutiques s'inscrit dans la perspective de développer des traitements plus efficaces qui ciblent spécifiquement les voies biologiques impliquées, minimisant ainsi les effets de la maladie et maximisant l'efficacité du traitement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont importants pour plusieurs raisons. Les rétinopathies telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge sont des pathologies évolutives et invalidantes pouvant aller jusqu’à la cécité touchant respectivement 103 et 196 millions de personnes dans le monde. Leur prise en charge vise à lutter contre les complications tardives des pathologies, mais encore beaucoup de patients répondent peu voire pas du tout aux traitements. Ce projet ouvre des perspectives pour des études translationnelles visant à lutter contre le handicap visuel lié aux principales rétinopathies de l’homme adulte. Les avantages à court terme sont d’évaluer le potentiel neuroprotecteur de diverses molécules thérapeutiques afin, à moyen terme, de permettre des études cliniques chez l’homme. Les avantages à long terme comprennent la réduction du handicap visuel lié aux rétinopathies et des coûts directs et indirects socio-économiques qui en découlent.
Procédures
Les animaux seront soumis à des examens et injections oculaires similaires à ceux pratiqués chez l’homme sous anesthésie locale. Les animaux seront sous anesthésie générale et locale et ne subiront pas plus de 2 examens oculaires (d'une durée de 20 minutes maximum) par animal espacés d’au moins 10 jours. Les traitements par injections oculaires (d'une durée de 5 minutes maximum) sont également réalisés sous anesthésie générale et locale allant de 1 à 6 injections maximum par animal (à la fréquence maximale de 3 fois par semaine). L'unique prélèvement sur animal vivant sera une goutte de sang prélevée sur la queue de l'animal sous anesthésie générale. Le modèle de dégénérescence par la lumière est induit par l'exposition des animaux à une lumière d’assez forte intensité (correspondant à une journée ensoleillée) pendant 24 heures maximum dans une cage adaptée en présence de nourriture et d'eau à volonté.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : une augmentation du volume urinaire des animaux diabétiques ; un éventuel stress lié à l’isolement de 24 heures maximum des animaux du modèle de dégénérescence induit par la lumière ; à la suite de l’anesthésie générale, de possibles douleurs lors de l’injection et/ou irritation dans la zone injectée, inflammation, hallucination à l'endormissement et au réveil de l’anesthésie et hypothermie ; une éventuelle irritation et/ou inflammation liée à l’exploration in vivo des yeux et l’administration des molécules dans l’oeil.
Devenir
Les analyses seront effectuées sur les rétines et fonds d'yeux ce qui nécessite de prélever les tissus en post-mortem. Cela implique que tous les animaux devront être euthanasiés par une méthode réglementaire afin d'effectuer ces prélèvements tissulaires.
Remplacement
La rétine est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires qui fonctionnent en réseau, et interagissent en permanence avec les autres tissus oculaires et avec la circulation (vaisseaux rétiniens et choroïdiens). C’est pourquoi les études in vitro (culture cellulaire ou d’organoïdes) seules ne permettent pas de prendre en compte la multiplicité des interactions dans l'œil, ni la physiopathologie complexe des rétinopathies. Elles ne permettent pas non plus l’évaluation des différentes voies d’administration des nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, des études in vivo dans des modèles animaux mimant les rétinopathies telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge sont nécessaires dans ce projet translationnel visant à établir une preuve de concept thérapeutique. Au préalable, des études in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (organo-culture) sur les caractéristiques physico-chimiques (solubilité, demi-vie, efficacité du principe actif) et la toxicité des molécules thérapeutiques ont été réalisées par les partenaires.
Réduction
Notre protocole expérimental a été validé scientifiquement par nos institutions, partenaires et financeurs. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum, sans toutefois grever la possibilité d’obtenir des résultats exploitables. Par nos expériences passées sur ces modèles animaux et les différences phénotypiques observées avec les animaux contrôles, il est estimé que des groupes de 20 yeux (soit 10 animaux) par condition sont suffisants pour une analyse statistique significative. Nous utiliserons donc pour chaque expérience un effectif de 10 animaux par groupe (soit n = 20 yeux par groupe). La réduction du nombre d’animaux passera par des analyses longitudinales non invasives, non douloureuses d’exploration structurale de l'œil par imagerie (angiographie en fluorescence et tomographie en cohérence) sous anesthésie générale et locale, remplaçant les analyses immunohistologiques sur des tissus prélevés nécessitant plus d’animaux. De plus, le nombre d’animaux sera réduit en combinant le maximum d’analyses biologiques (protéines et ARN) sur les mêmes échantillons de rétine (rétines coupées en deux). Enfin pour réduire le nombre d’animaux, le même groupe d’animaux contrôles (naïfs) sera utilisé pour l’analyse de l’efficacité des différentes molécules thérapeutiques, dans chacun de nos modèles de rétinopathie. On utilisera donc 180 animaux naïfs au lieu de 740 animaux (soit une réduction de 560) parmi les 4600 rats du projet.
Raffinement
Les animaux sont accoutumés à l’animalerie 8 jours avant la date des expérimentations. L’animalerie a mis en place un programme d’enrichissement qui consiste à placer des nids végétaux, des tunnels en cartons, des bâtons en bois ou des abris dans les cages. Les animaux diabétiques urinant plus souvent, le change des litières est ajusté pour conserver les cages propres. Pour éviter stress, angoisse et douleur aux animaux, nous réalisons systématiquement tous les examens sous anesthésie générale et locale. Les interventions qui seront réalisées dans le cadre de ce projet sont également pratiquées chez l’homme sous anesthésie topique (gouttes anesthésiques) seule, sans douleur particulière. Afin de minimiser les risques liés à l’anesthésie générale, la dose d’anesthésiant est adaptée au poids de chaque animal, et les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour limiter le stress thermique. La surveillance des animaux sera assurée jusqu’à leur réveil par les expérimentateurs; puis quotidiennement par les animaliers et 1 fois par semaine minimum par les expérimentateurs. En cas de détérioration de l'état général de l'animal (diminution des déplacements, perte d'appétit, perte de poids, changement d’aspect physique, hypothermie, isolement), nous prendrons les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance (arrêt des essais, antalgiques quand l’expérience le permet, nourriture enrichie,..), l'euthanasie étant le dernier recours. L’ensemble du matériel utilisé pour les procédures (injections et prélèvements) sont stériles et à usage unique et les gestes sont réalisés par des expérimentateurs compétents.
Choix des espèces
La rétine est un tissu vasculaire et nerveux très complexe qui ne peut être reproduit en culture. Les études cliniques chez l’Homme nécessitent une phase pré-clinique dans un modèle animal. En dépit de l’absence de macula, le rat est une espèce de choix, combinant une structure et une physiologie oculaire similaires à l’Homme. Nous avons choisi d'utiliser un rat spontanément diabètique de type 2. Il développe avec le temps des lésions de rétinopathie diabétique typiques et bien décrites dans la littérature, à partir de 8 mois et jusqu’à 18 mois. Nous les utilisons donc entre 8 et 18 mois de façon à inclure au maximum tous les animaux de l’élevage. Des animaux de la même souche non diabétiques seront utilisés aux mêmes âges (entre 8 à 18 mois) comme contrôles. Les rats albinos et pigmentés seront utilisés à un stade jeune adulte (6-8 semaines) pour nos modèles de dégénérescence de la rétine par excitotoxicité des neurones ou par la lumière comme décrits dans la littérature. Il est nécessaire de coupler des analyses sur des animaux albinos et pigmentés, afin d’évaluer de possible différence de biodisponibilité oculaire du principe actif, comme cela s’observe souvent en pharmacologie oculaire.