Rats
Etude physiopathologique et évaluation du ciblage de la sénescence cellulaire dans deux modèles mini-invasifs de dégénérescence discale post-traumatique chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 640 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est enfoncée dans un disque intervertébral du dos ou de la queue pour y créer une lésion, opération de dix à quinze minutes, suivie trois semaines plus tard chez certains d'une seconde injection dans le disque abîmé, pour tester des molécules ciblant les cellules sénescentes. Le porteur décrit une douleur discale pouvant conduire l'animal à la prostration, à l'isolement et à l'arrêt du toilettage social, et une douleur nerveuse liée au passage de l'aiguille le long des racines spinales. Il conclut qu'il est "inévitable" de travailler sur des animaux et que le recours aux rongeurs est "nécessaire", les explants de disque de queue de bœuf restant réservés à l'étude de la diffusion des molécules.
Objectifs
La lombalgie chronique constitue la principale cause d’années de vie vécues en situation de handicap et affecte plus de 600 millions de patients dans le monde. Si elle peut avoir plusieurs causes, la Dégénérescence du Disque Intervertébral (DDIV) en représente le contributeur majeur. La physiopathologie de la DDIV associe la mort cellulaire, l'inflammation et la dégradation de la matrice extracellulaire, mais n'est pas encore totalement comprise. Bien qu'il existe des traitements symptomatiques pour limiter la douleur, il n'y a actuellement aucune stratégie thérapeutique permettant de freiner les mécanismes dégénératifs et d'atténuer l'inflammation à l'origine de la maladie. Parmi les acteurs centraux de l'apparition et de la progression de la DDIV, un mécanisme de survie aberrante des cellules discales, appelé « sénescence », semble directement impliqué et pourrait représenter une cible thérapeutique pertinente. L’objectif premier de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie de la DDIV en examinant la présence et l’activité des cellules sénescentes dans et autour du disque intervertébral, au cours du développement de la DDIV post-traumatique chez le rat, que ce soit dans le dos ou sur la queue. Le second objectif est d’évaluer la pertinence thérapeutique d’un ciblage spécifique de ces cellules sénescentes (élimination ou modulation). Ces deux modèles de dégénérescence discale post-traumatique sont induits chirurgicalement de manière mini-invasive afin de choisir le modèle avec les lésions les plus reproductibles et la dégénérescence la plus proche de la physiopathologie humaine, tout en limitant le risque de dommages liés à la procédure. Par la suite, des thérapies innovantes visant les cellules sénescentes, appelées 'sénothérapies' seront évaluées contre la DDIV du rat. Ces thérapies seront soit administrées à l’ensemble du corps, soit localement, dans le disque malade, à l’aide de gels injectables. L'évaluation se fera sur le modèle jugé le plus approprié, soit dans le bas du dos, soit dans la région de la queue.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comparer les deux modèles dégénérescence discale post-traumatiques mini-invasifs décrits chez le rat et d’évaluer l’expression de cibles thérapeutiques au cours du développement de la pathologie. La prise en charge des patients atteints de dégénérescence discale reste insuffisante, ne traitant que les symptômes, ce projet permettra également de réaliser une preuve de concept avant les essais cliniques, pour évaluer l'efficacité de thérapies innovantes contre la DDIV post-traumatique chez le rat. Ces thérapies seront distribuées sous formes libres à l'échelle du corps entier ou bien transportées dans des gels injectables afin d’être administrées localement dans le disque malade. Ce traitement adapté pour la clinique pourra à terme être proposé pour des essais cliniques vétérinaires chez le chien malade, puis des essais en clinique humaine.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à une chirurgie d’environ 10-15 minutes consistant à introduire une aiguille dans l’espace intervertébral afin de créer une lésion dans des disques intervertébraux au niveau dorsal ou dans la queue de l’animal. Certains animaux entrant dans un protocole de test de molécules thérapeutiques seront 3 semaines plus tard soumis à une deuxième intervention: soit à une seconde chirurgie mini-invasive unique d’environ 10-15 minutes permettant l'injection intra-discale de molécules thérapeutiques à effet prolongé ; soit à une injection systémique unique intra-péritonéale de quelques secondes de molécules thérapeutiques.
Impact sur les animaux
Des nuisances modérées pour les animaux sont à attendre des procédures mises en place dans ce projet. Lors du développement de la dégénérescence, de la douleur discale peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, diminuer son activité, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions, par exemple le toilettage social. L'intervention mini-invasive et percutanée minimise les risques d'infection au niveau des points de piqûre les rendant très peu probables. De plus, une douleur secondaire d’origine nerveuse (neuropathie), due au passage de l’aiguille le long des racines des nerfs spinaux pourrait être observée, n'allant pas au delà de 5 jours suivant la procédure dans le bas du dos de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Cette étude prend en considération la règle des 3R. Les expérimentations in vitro ne permettent pas à l’heure actuelle de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs tissulaires du disque intervertébral (noyaux pulpeux, anneau fibreux, plaques cartilagineuse, os vertébral…) et du système vasculaire. Il est ainsi inévitable de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors du développement de la maladie discale. Le recours aux rongeurs est ici nécessaire afin de valider le potentiel thérapeutique de nouvelles biothérapies. Il n’existe pas, pour le moment, de solution de remplacement in vitro complet, ni de modèles invertébrés.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les potentielles biothérapies seront testées et sélectionnées pour leur efficacité en amont, in vitro, sur les différents types cellulaires du disque intervertébral. Un modèle ex vivo d’explants de disque entier de queue de bœuf sera également utilisé pour étudier la biodistribution des biothérapies dans le tissu spécifique du disque intervertébral. In fine, uniquement les biothérapies les plus prometteuses seront utilisées dans cette étude in vivo. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au strict minimum. Ce nombre, fixé ici à 10 animaux par groupe expérimental, est calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative entre les groupes expérimentaux si celle-ci à un sens biologique dans le contexte spécifique de la maladie discale.
Raffinement
Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage avec de l’enrichissement physique (tubes en carton) pour stimuler leurs comportements naturels. Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. De façon générale, un suivi hebdomadaire des rats permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi postopératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 5 premiers jours pour s’assurer de la bonne cicatrisation et de l'absence de douleur, puis une fois par semaine. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptées, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Dans le cas de la dégénérescence discale, plusieurs modèles animaux post-traumatiques ont été développés, le rat restant la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette maladie, devant la souris, le lapin et la brebis. Le rat présentant le double avantage de présenter une taille de disques intervertébraux compatible avec une injection intra-discale et une voie d’abord accessible à l’échelle expérimentale, sans le recours à de gros animaux. Notre protocole débutera chez des rats arrivés à maturité squelettique et âgés de 12 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de la dégénérescence discale est possible et documentée dans des études précédentes.
Différences sexuelles dans l’inflammation cutanée de la face induite par le CFA chez le rat mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injection sous la peau de la face d'un adjuvant qui déclenche une inflammation douloureuse, puis quatre jours de contentions au chiffon, jusqu'à trois par jour, le temps de photographier les grimaces : 12 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient six mâles et six femelles et se sert du côté non enflammé de leur face comme témoin, pour comparer expressions faciales et lésions selon le sexe. Il écrit ne pratiquer aucun test comportemental afin de limiter le stress lié à l'injection, et affirme que les résultats obtenus jusqu'ici ne montrent pas d'effets indésirables. Au quatrième jour, les rats sont profondément anesthésiés et mis à mort pour prélever les tissus.
Objectifs
Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer les différences sexuelles dans les expressions faciales et dans la lésion inflammatoire de la peau, avant et après l'induction de l'inflammation ; et 2) Évaluer les différences histologiques suite à l'induction d'un modèle de douleur inflammatoire au niveau de la peau de la face chez le mâle et la femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et d'améliorer sa mesure au laboratoire. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous-cutanée sous anesthésie générale (durée < 5 minutes). De brèves contentions à l'aide d'un chiffon seront réalisées (quelques secondes) pendant 4 jours, avec un maximum de 3 contentions par jour. Nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Le jour 4, ils recevront une injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique (durée de l'intervention < 1 minute ; durée de l’anesthésie = terminale). Les injections sont effectuées par du personnel compétent, conformément aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale.
Impact sur les animaux
Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse de la region injectée. Afin de diminuer le stress lié à cette injection, nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Les résultats obtenus jusqu'à present ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
A la fin de la procedure, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus afin de réaliser une analyse histologique.
Remplacement
L’intégration de la douleur suite à l'induction de l'inflammation implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.
Réduction
Le nombre de 6 rats /sexe est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif en sachant que nous utilison le cote de la face sans inflammation comme temoin. Egalment, afin de limiter le nombre d'animaux, l'etude observationel (photographique) et histologique est realisé sur les memes animaux.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 1 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée après une période d’adaptation. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation et seront mis à mort.
Choix des espèces
Le rat adulte est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les différents types de douleur inflammatoire sont majoritaires chez les adultes.
Evaluation d’éventuels changements neurologiques induits par un candidat médicament et sa pharmacocinétique chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 100 d'entre eux pouvant être réutilisés dans un autre projet après accord vétérinaire, les 400 autres tués pour des prélèvements d'organes et de fluides. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale, chaque jour pendant trois mois ou jusqu'à deux fois par jour pendant six mois, avec jusqu'à huit prises de sang par jour sur six jours. Ils passent deux tests de mémoire et un test d'anxiété que le porteur ne nomme pas, un test où ils doivent s'accrocher à un axe en rotation et huit séries d'observations neurologiques. Le but est de vérifier que des composés agissant sur certaines cellules du cerveau ne provoquent pas de troubles dégénératifs ou psychiatriques, avant un premier passage chez l'humain que le porteur décrit comme une étape "indispensable". Il range aussi parmi les bénéfices une amélioration des connaissances scientifiques "pour le rat", alors que 400 des 500 rats sont tués à l'issue.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur la mémoire, l’anxiété, le comportement général de l’animal, l’activité locomotrice, la coordination motrice, les différents réflexes neurologiques, sur la température corporelle et le poids chez le rat d’un candidat médicament induisant des modifications au niveau des cellules spécifiques du cerveau. Ces cellules fournissent un mécanisme contre les blessures et les infections, mais l'activation chronique ou excessive est considérée comme préjudiciable et a été impliquée dans de nombreux troubles dégénératifs et psychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de vérifier que des composés activant les cellules spécifiques du cerveau n’induisent pas de troubles dégénératifs et psychiatriques en fonction des expositions dans le sang.. Ce projet permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour le rat grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par voie orale (-2 min par administration généralement 1 administration / jour pendant 3 mois et jusqu’à 2 administrations par jour pendant 6 mois au maximum) puis auront 2 tests de mémoire d’une durée maximale de 40 min et 4 fois par test en 6 mois. Les animaux seront évalués d'un point de vue neurologique par une série d'observation pour une durée maximum d’1h et 8 fois en 6 mois. Enfin, l’anxiété sera évaluée pour une durée maximum de 5 minutes et 4 fois en 6 mois. Des prélèvements de sang sur animal vigile ou anesthésié pourront être effectués (2 minutes par prélèvement) avec un maximum de 8 prélèvements par jour et 6 jours non consécutifs sur 6 mois et des prélèvements de tissus pourront être réalisés sur animaux anesthésiés en fin d'expérience.
Impact sur les animaux
La manipulation lors du passage en cage d’hébergement aux arènes de test ou pour induire l’anesthésie ou lors de l’administration du composé à tester pourra induire un stress mineur de courte durée. Lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie, ainsi que lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. L'administration par voie orale qui se fera sur plusieurs mois pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L’anesthésie peut induire un stress à l’endormissement. Dans le test de coordiantion motrice, les animaux pourraient ressentir un léger stress par le fait de devoir s’accrocher à un axe en rotation. Ils pourront également resssentir un stress léger lié à la chute de l’axe ou de l'arène surélevée. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'établissement d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 60 (30 mâles et 30 femelles) / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (manipulation des animaux, habituation à la contention et habituation aux arènes expérimentales)• L'utilisation d'anesthésie adaptée associée à une analgésie pour la réalisation des prélèvements
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la mémoire, l'anxiété et les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central, la coordination motrice, l'activité locomotrice spontannée du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Neuroénergétique du nouveau-né et spécificités genre-dépendantes : vers de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les neuropathies pédiatriques. (BabyBrain)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés du cerveau le jour de leur naissance, soumis à sept jours de vie à une nouvelle chirurgie puis à deux heures d'hypoxie, gavés ou injectés les trois jours suivants, 576 ratons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils passent ensuite des IRM sous anesthésie à 7, 30 et 45 jours, dont une de deux heures, et des tests de réflexes à 8, 10 et 12 jours. À 55 jours, une privation de nourriture de 72 heures précède un test censé mesurer un état dépressif. Tous sont tués pour prélèvement d'organes, et ni ce test de dépression ni le test de mémoire employé à 45 jours ne sont nommés.
Objectifs
Une meilleure compréhension du métabolisme énergétique cérébral chez le nouveau-né, en prenant en compte les différences liées au sexuel, pourrait permettre de définir de nouvelles pistes thérapeutiques dans un contexte de pathologies cérébrales pédiatriques caractérisées par un déficit énergétique. Les objectifs seront les suivants : - Décrypter les spécificités du métabolisme énergétique cérébral du nouveau-né en bonne santé, en fonction du sexe. - Mettre en évidence les spécificités sexo-dépendantes des altérations métaboliques périnatales dans le contexte de l’hypoxie-ischémie néonatale. - Développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte d’un déficit énergétique cérébral, en fonction du sexe.
Bénéfices attendus
Il est attendu de ce projet de combler une lacune dans le domaine de la neuroénergétique. Ce projet offrira une compréhension des mécanismes moléculaires et de la coopération cellulaire qui sous-tendent les différences entre le cerveau des nouveau-nés masculins et féminins, ainsi que des différences dans la manière dont le cerveau masculin et féminin peuvent être capables de répondre aux agressions neuronales et aux stratégies neuroprotectrices.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie afin de diminuer l'expression de certains transporteurs de substrats énergétiques cérébraux (1 fois, à la naissance, durée 15 min). Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie (1 fois, à l’âge de 7 jours, durée inférieure à 10 min) puis une hypoxie (1 fois, 30 min après la chirurgie, durée 2 h). Pour l'un des groupes, trois injection de substrat énergétique seront réalisées (juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivants, âge : 7, 8 et 9 jours de vie, durée : 2 s). Pour un des groupes, les ratons seront gavés avec des substrats énergétiques (gavage juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivants, âge : 7, 8 et 9 jours de vie, durée : 2 min). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (à l'âge de 7 et 30 jours ; durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléaire fonctionnelle sous anesthésie (1 fois, à 45 jours d'âge, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (réalisés à 8, 10 et 12 jours ; durée : 5 min) et de mémoire (évaluée à 45 jours ; durée 10 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (réalisé à 55 jours ; durée de la restriction : 72 h ; durée du test : 10 min).
Impact sur les animaux
Les modèles de répression de transporteurs utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Cependant, l'induction du modèle nécessite une chirurgie sous anesthésie générale par hypothermie maintenue tout le long de l’acte. Suite à l'opération, la plaie suturée peut s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser. La chirurgie nécessaire à l’induction de l’hypoxie-ischémie pourrait entraîner une perte de poids, une plaie et des douleurs postopératoires. L’administration de lactate sera réalisée par une injection intrapéritonéale, ce qui constitue une nuisance. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre. Dans de rares cas, des lésions cérébrales supérieures à 50 % pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Le test de restriction alimentaire pourrait entraîner chez certains animaux un stress.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 576). La répression de l'expression des différents transporteurs ainsi que l'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.
Remplacement
Des modèles d’organoïdes ainsi que des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative, prenant entre autre la dimension sexuée. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de comprendre le métabolisme cérébral en fonction du sexe et tester l'effet neuroprotecteur des molécules afin de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l'IRM est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences inter-groupes seront mises en évidence par des tests statistiques. Le nombre d'animaux considéré pour ce projet a été déterminé en prennant en concidération nos projets précédents et en utilisant un calculateur de taille d'échantillon.
Raffinement
Lors des chirurgies, avant anesthésie un antalgique sera administré. Le réveil des ratons et la récupération de la température corporelle s’effectueront dans un caisson ventilé. Les ratons seront surveillés plusieurs fois par jour pendant 3 j puis de manière hebdomadaire. La mise en place d’une grille de scorage et l’utilisation de points limites adaptés permettront la délivrance d’un antalgique si une douleur est constatée. La cicatrisation sera contrôlée ; en cas d’infection de la plaie un désinfectant et un antalgique seront administrés. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Une modification de rythme cardiaque ou du rythme respiratoire par rapport aux normes physiologiques, mise en évidence par un capteur placé sous l'animal entraînera l'arrêt de l'expérimentation. Du gel ophtalmique sera utilisé, pour éviter la sécheresse oculaire. Pour le gavage, une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal. Le volume administré, à température ambiante prendra en considération la corpulence de l'animal. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage et surveillé régulièrement pendant 1 heure. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l'animal représentera un point limite. Au niveau de l'hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton.
Choix des espèces
Le rat Wistar est plus gros que des modèles souris, ce qui est un atout pour les examens non-invasif par IRM. La taille de son cerveau facilitera aussi les chirurgies. Cette espèce est utilisée depuis plusieurs années dans le modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Les animaux recevront une injection cérébrale à la naissance (P0) afin de diminuer l'expression des différents transporteurs. Pour certains, une hypoxie-ischémie sera réalisée à 7 jours de vie. Ils seront ensuite suivis par IRM à 7, 30 et 45 jours de vie et par des tests de comportement, de 8 à 55 jours de vie, afin de pouvoir comprendre les différences du métabolisme énergétique cérébrale du nouveau-né mâle et femelle et évaluer les effets protecteurs des substitutions thérapeutiques à court et à long terme. Les tests de reflexes seront réalisés à 8, 10 et 12 jours de vie. Un test permettant de mettre en évidence les défaillances neurologiques sera réalisé à 24 jours de vie. L'anxiété sera évaluée à 28 jours de vie. Un test de mémoire sera réalisé à 45 jours de vie et l'état dépressif des animaux sera évalué à 55 jours de vie.
ONCO cerveau-chirurgie : mise en place d’une nouvelle méthode de traitement dans un modèle de tumeur cérébrale orthotopique permettant, après résection tumorale, l’administration « in situ », unique ou répétée, de composés thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester des candidats médicaments administrés directement dans le cerveau après retrait d'une tumeur, 1 426 rats vont être utilisés, dont 1 411 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun reçoit une irradiation, une greffe de gliome dans le cerveau d'environ une heure, puis une résection de la tumeur avec pose éventuelle d'une canule, ouvrant la voie à un maximum de douze traitements intracérébraux. Le porteur annonce des douleurs sévères liées aux chirurgies, des troubles neurologiques, des saignements et des infections possibles autour du dispositif implanté. Quinze rats sont utilisés sans réveil pour entraîner les techniciens à la pose de canule, après un premier apprentissage sur des cadavres, et tous les animaux sont tués à l'issue.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Les cancers du cerveau représentent toujours un enjeu de santé publique majeur. Par exemple, les gliomes de haut grade restent à ce jour un cancer pour lequel la prise en charge a peu évolué depuis 20 ans, avec une survie médiane après traitement de 24 mois environ. Le développement de nouvelles thérapies est de ce fait critique afin d’améliorer la survie et la rémission des patients. L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle orthotopique de cancer du cerveau chez les rongeurs reflétant la pathologie humaine afin d’évaluer de nouveaux candidats médicaments administrés de façon unique ou répétée (à l’aide d’une seringue ou d’un dispositif implantable) après résection de la tumeur. Ce modèle permet donc d’évaluer spécifiquement l’efficacité thérapeutique de composés d’intérêt dans le contexte de la présence de cellules cancéreuses résiduelles suite à une chirurgie de résection de tumeur du cerveau, chez l’homme (partie du traitement standard). La toxicité, la pharmacocinétique et de la biodistribution des candidats médicaments pourront aussi être étudiées dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Pour certaines applications thérapeutiques, de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs doivent être établis afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Irradiation après un court transport. Les animaux restent dans leur cage de stabulation. Durée totale < 30 minutes, hors transport (réalisé une fois). - Procédures chirurgicales, réalisées sous anesthésie et analgésie pré-, per et post-opératoire : o Greffe tumorale intra cérébrale (x1), durée = ± 1h o Résection de la tumeur +/- implantation de la canule (1x). La durée de la résection sera max. 1h. L’implantation de la canula peut rallonger la procédure de 30 minutes. - Pour quelques animaux le traitement avec la canule sera réalisé sous anesthésie (10 – 15 minutes/traitement, max 12 traitements) - Les animaux vigiles et sous contention pourront recevoir des traitements par voies intra-péritonéale (IP), intra-veineuse (IV), sous-cutanée (SC), (1 minute), - Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. - Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. - Au moment de l’euthanasie, lorsque le prélèvement des organes nécessitera un flush préalable par perfusion afin d’obtenir des organes avec des vaisseaux sanguins ne contenant pas de sang, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés.
Impact sur les animaux
Stress léger et de durée intermédiaire (moins de 4 heures) induit par : - Le transport (pour irradiation avant greffe des tumeurs). - La manipulation pour les suivis de poids (le stress lié pouvant très probablement diminuer avec l’habituation). Stress modéré (durant quelques heures, mais pas plus de 48 heures) : - Réorganisation des groupes sociaux au moment de la randomisation. Pertes de poids : - En lien avec le développement de la tumeur. - Suite aux procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur). Douleur légère à sévère : - En lien avec le développement de la tumeur. - Liée à la présence du dispositif implantable. - En lien l’injection de solutions directement dans le cerveau. Douleur sévère : - Procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur, mise en place du dispositif implantable). Troubles neurologiques : - Procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur). - En lien avec le développement de la tumeur. - En lien avec l’injection de solutions directement dans le cerveau. Saignement et/ou infection : - Procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur). - Liée à la présence du dispositif implantable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires sera utilisé afin de plus facilement constituer des groupes homogènes au moment de l’initiation de l’étude. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Tout d’abord, les techniciens s’entraineront pour la pose de canule sur des cadavres de rongeurs, avec évaluation macroscopique des lésions générées sur le cerveau. Une fois que la pose de canule sera réalisée sans causer de lésions au niveau de la zone d’implantation, un entrainement sera fait sur animaux vivant (dans le cadre d’une procédure sans réveil). Les coordonnées de l’induction tumorale dans le cerveau seront déterminées au moyen d’un atlas pour limiter le risque de déficit neurologique. Les animaux sont placés sur un cadre de stéréotaxie pour les procédures chirurgicales. Toutes les procédures chirurgicales (implantation et exérèse de la tumeur, puis mise en place du dispositif implantable) seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées (selon doses et voie d’administrations validées par la structure pour le bien-être des animaux de notre société et le vétérinaire). Les traitements intracérébraux seront faits sous anesthésie. Les animaux bénéficieront de soins pré- et post opératoires (tels qu’hydratation, utilisation d’un plan thermostaté pour maintien de la température corporelle). Les expérimentateurs sont formés pour évaluer spécifiquement l’état de souffrance des animaux. Une grille d’évaluation est utilisée pour apprécier finement l’état de santé des animaux et guider la réponse à apporter en cas de détresse (soins spécifiques ou euthanasie). De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.
Choix des espèces
Les rats, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Ils présentent aussi l’avantage de pouvoir développer des cancers, et notamment des cancers du cerveau (par exemple des gliomes), après implantation de cellules tumorales issues d’un cancer s’étant préalablement développé chez un rat de la même souche. De plus, diverses souches de rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau des coordonnées souhaités. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau des coordonnées souhaitées, ceci pouvant donc induire des effets neurologiques néfastes.
Impact de la déficience en PRDM16 sur le développement de l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour savoir si la déficience d'une protéine aggrave l'hypertension artérielle pulmonaire, 320 rats Wistar vont être utilisés, dont 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection sous-cutanée de monocrotaline leur provoque une hypertension pulmonaire, certains subissant en plus une ligature de l'artère pulmonaire droite sous anesthésie, puis dix jours d'injections quotidiennes. La mesure finale passe par un cathétérisme lors d'une chirurgie thoracique sans réveil, et tous sont tués pour prélever les poumons et le cœur. Le porteur qualifie les nuisances de "modérées" alors que 192 rats relèvent d'un niveau de souffrance sévère déclaré.
Objectifs
Le système vasculaire comporte deux boucles : la circulation systémique, qui distribue le sang riche en oxygène à tous les organes, et la circulation pulmonaire, qui réoxygène le sang provenant de ces organes. Ces deux boucles ont des caractéristiques fondamentalement différentes et on ne sait toujours pas si les cellules endothéliales qui tapissent l'intérieur de la circulation pulmonaire ont une réaction unique aux maladies vasculaires. L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) affecte spécifiquement la circulation artérielle pulmonaire ; l'augmentation de la résistance vasculaire entraînant un remodelage et une dysfonction du ventricule cardiaque droit et, en l'absence de traitement, la mort. Des résultats précédents ont révélé que la déficience d'une protéine spécifique compromettait la récupération du flux artériel dans la circulation systémique, mais nous ne savons pas si et comment cette déficience affecte la survenue de l'HTAP. Notre objectif est d'approfondir notre compréhension des implications de la déficience en cette protéine sur le développement et l'évolution de l'HTAP, en utilisant des modèles animaux de la maladie. Nous cherchons à déterminer si cette déficience peut aggraver le remodelage vasculaire pulmonaire initial ou adaptatif responsable de l’HTAP. De plus, nous souhaitons étudier l'effet d'agents thérapeutiques potentiellement bénéfiques, connus pour activer cette protéine.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à élucider le rôle de la déficience en une protéine spécifique dans le remodelage vasculaire pulmonaire et cardiaque, ainsi que ses implications hémodynamiques, en utilisant le rat comme modèle, une espèce pertinente pour l'étude de l'hypertension artérielle pulmonaire. En cas de confirmation de son influence négative sur la pathologie, nous envisageons d'évaluer l'efficacité d'agents thérapeutiques potentiellement bénéfiques,connus pour activer cette protéine. A moyen/long terme, cette approche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour cette maladie rare et actuellement incurable. L’hypertension artérielle pulmonaire est une cause de handicap, d’insuffisance cardiaque et de mort. Ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
Exposition à la monocrotaline : injection unique en sous-cutané de la monocrotaline ou de son solvant (sérum physiologique). Ligature de l’artère pulmonaire droite ou incision : opération unique realisée sous anesthésie et analgésie (durée estimée à 20minutes). Mesures des paramètres de la circulation sanguine par mise en place de cathéters pendant chirurgie thoracique sans réveil, sous anesthésie et analgésie (environ 1h). Injections quotidiennes du traitement ou d'un controle (serum physiologique) pendant 10 jours. Les animaux seront surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaine après leur entrée dans le protocole.
Impact sur les animaux
Nuisances classées "modérées": injection en sous-cutané d'un médicament induisant une hypertension artérielle pulmonaire. Risque léger d'irritation suite à l'intubation.Une douleur peut suivre les chirurgies. Les animaux seront surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaine après leur entrée dans le protocole, et des injections seront réalisées, ce qui peut être source de stress.
Devenir
L'ensemble des animaux des 3 procédures seront mis à mort. L'explantation des poumons et du coeur à la fin de l'étude est nécessaire afin d'effectuer des analyses histologiques, immunohistochimiques et de biologie moléculaire des zones pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque, la modification des vaisseaux, l'anatomie pulmonaire dans un contexte sain et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une HTAP puis d'une altération cardiaque droite chez l'humain qui est un processus complexe.
Réduction
Lorsque les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme pour évaluer leur fonction cardiaque et vasculaire, les tissus prélevés seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, avec partage possible, afin d’éviter de refaire les expériences. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Des calculs statistiques ont été effectués afin de réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude
Raffinement
Une période d'acclimatation de 5 jours minimum sera respectée à l'arrivée des animaux dans l'animalerie. Les animaux seront hébergés en binome par cage dans lesquelles de l'enrichissement sera ajouté (dome, tunnel, lanièresou frisures de papier kraft, buchettes à macher, billes de peuplier naturel). Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel compétent et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie et utilisation d'analgésiques avec tapis chauffant et gel de protection oculaire. Des points limites spécifiques ont également été mis en place.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés comme modèles pour étudier les maladies cardiovasculaires en raison de leur anatomie vasculaire pulmonaire similaire à celle de l'homme et de leurs caractéristiques hémodynamiques comparables. Un des collaborateur du projet est spécialisé dans les modèles murins d'hypertension artérielle pulmonaire. Il possède l'expertise nécessaire ainsi que le matériel adapté pour mener des recherches avec succès sur des rats. Nous avons choisi d'utiliser des rats de souche Wistar, réputés pour leur sensibilité accrue au développement de l'hypertension artérielle pulmonaire par rapport aux rats Sprague Dawley. Nous utiliserons des rats adultes pour reproduire les caractéristiques démographiques de l’hypertension artérielle pulmonaire chez l'Homme (âge moyen 50 ans). Nous veillerons également à sélectionner des rats ayant un poids adéquat (250-350g), permettant ainsi le cathétérisme et la chirurgie, tout en minimisant les risques de mortalité associés à ces procédures, qui peuvent être plus délicates sur des sujets de petite taille.
Modèles de neuropathie pour évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 3780
La stimulation tactile ou thermique d'une patte douloureuse s'arrête au moment où l'animal retire sa patte. 1 552 souris et 3 780 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 4 872 d'entre eux, modéré pour 460. Une neuropathie leur est provoquée par jusqu'à dix injections d'un réactif ou par une chirurgie nerveuse, puis ils reçoivent des substances candidates une à deux fois par jour pendant une à six semaines avant d'être soumis aux tests de douleur. 5 232 seront tués parce que leurs lésions nerveuses "affecteront leur maintien en vie dans de bonnes conditions", 100 témoins non lésés étant réutilisés, sans que l'effectif total de 5 332 animaux soit justifié autrement que par la puissance statistique attendue de chaque test.
Objectifs
La douleur neuropathique ne résulte pas d'une stimulation des récepteurs de la douleur, mais d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ainsi, les douleurs neuropathiques, dont souffrent 7 % de la population générale, doivent conduire à l’emploi d’un arsenal thérapeutique différent de celui des douleurs nociceptives. Le traitement repose souvent sur les adjuvants plutôt que sur les antalgiques (p. ex., antidépresseurs, antiépileptiques, baclofène, médicaments topiques) ou sur des traitements non médicamenteux (p. ex., kinésithérapie, neuromodulation). Les causes de ces douleurs sont multiples, et incluent des polyneuropathies périphériques (notamment celles du diabète), des lésions nerveuses traumatiques (par exemple après une fracture), des lésions de la moelle osseuse, des AVC, ou encore la sciatique. Des douleurs neuropathiques séquellaires faisant suite à une intervention chirurgicale peuvent également exister. Il n'existe à ce jour pas de traitement 100% efficace des douleurs neuropathiques, dont la prise en charge peut s'avérer complexe (douleurs chroniques, très durables dans le temps, d'où l'impossibilité de donner des antalgiques puissants tels que les opioïdes du fait de leurs effects secondaires), avec un accès inégal de la population aux spécialistes adaptés à la prise en charge de ces pathologies. Ce projet permettra de tester, dans des modèles de douleur neuropathique chez le rongeur, des candidats traitements permettant de diminuer les signes de douleur.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour pas de traitement permettant de soigner l'ensemble des douleurs neuropathiques, dont la prise en charge peut s'avérer complexe (douleurs chroniques, durables dans le temps), avec un accès inégal de la population aux spécialistes adaptés à la prise en charge de ces pathologies. Ce projet permettra de tester, dans des modèles de douleur neuropathique chez le rongeur, des candidats traitements permettant de diminuer les signes de douleur, dans le but de développer de nouvelles thérapies présentant une bonne efficacité dans la prise en charge de la douleur et l'amélioration de la qualité de vie des patients, le tout sans effet secondaire marqué .
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). En cas de nécessité d'implanter un cathéter, la chirurgie dure environ 30 à 60 minutes. L'induction de la neuropathie sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie; fréquence dépendante du réactif : de 1 à 10 injections en standard) ou par chirurgie (5 à 10 minutes, sous anesthésie). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Chaque test sera, en général, limité à 1 à 3 occurrences par jour. En standard un produit étudié pour ses effets aigus sera évalué sur 1 journée. Un produit étudié pour ses effets chroniques sera étudié maximum 3 fois/semaine (en général 1/semaine), le plus souvent sur 1 à 2 semaines. Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les animaux dans ce projet (à l'exception des animaux témoins, sans induction de pathologie) vont développer une neuropathie, qui peut se manifester par une hypersensibilité à la douleur ou une douleur spontanée, de manière chronique. Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Malgré les soins péri-opératoires (incluant un analgésique), il est possible que la chirurgie (le cas échéant) entraîne une douleur post-opératoire au site concerné. Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone potentiellement douloureuse peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal).
Devenir
Les animaux présentant une neuropathie seront euthanasiés, car ils présenteront des lésions nerveuses qui affecteront leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Les animaux témoins, sans lésion, pourront être maintenus en vie pour réutilisation s'ils ont bien récupéré des tests (observation par un vétérinaire et par le personnel compétent), et s'ils n'ont pas été soumis à des prélèvements de tissus pour analyse de biomarqueurs notamment (par exemple, prélèvement de structures nerveuses, ce qui rendrait impossible leur maintien en vie).
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ces modèles car les lésions nerveuses induites entraînent des effets à différents niveaux de 'organisme, avec notamment une intégration centrale, et induisent des douleurs aussi bien au niveau de la zone lésée, qu'à l'extérieur de cette zone. Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité des traitements (analgésiques, notamment) nécessite l'utilisation d'animaux présentant une douleur neuropathique. Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites spécifiques clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Si pertinent, une anesthésie légère sera appliquée pour certaines administrations ou prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des modèles largement employés pour étudier une grande variété de douleurs neuropathiques, que ce soit des modèles de lésion, de neuropathie consécutive à une maladie, ou encore à un traitement par chimiothérapie. Principalement rongeurs sevrés (à partir de 21 jours, jusqu'à l'âge adulte) car les douleurs neuropathiques étudiés dans ce projet ne sont pas des maladies pédiatriques.
Evaluation de nouveau médicament dans le contexte de la schizophrenie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 4500
Hébergés seuls pendant deux à six mois à partir du sevrage, et rationnés à 80 ou 90 % de leur nourriture pendant six semaines, 2 400 souris et 4 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart, modéré pour 450 d'entre eux. Ils reçoivent des substances une à deux fois par jour pendant jusqu'à dix semaines, des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant cinq mois, et des produits destinés à provoquer hyperactivité et mouvements stéréotypés censés imiter certains symptômes de la schizophrénie. 5 750 seront tués, 1 150 réutilisés dans d'autres projets. Le porteur justifie la mise à mort par le risque que les traitements induisent des effets délétères incompatibles avec un maintien en vie "dans de bonnes conditions de santé".
Objectifs
La schizophrénie est une maladie mentale chronique et grave avec un large éventail de manifestations cliniques et biologiques. La prévalence de la schizophrénie dans la population est d'environ 1 % mais varie considérablement selon les lieux et les groupes sociaux. Les premiers symptômes de la maladie se manifestent à la fin de l'adolescence ou au début de l'âge adulte et les caractéristiques, l'évolution, le pronostic et l'issue du traitement peuvent différer d'un individu à l'autre. Dans la schizophrénie, on distingue généralement trois groupes de symptômes : les symptômes positifs (hallucinations et certaines formes d’excitation ou d’hyperactivité), les symptômes négatifs (retrait social et anhédonie) et les troubles cognitifs (fonctions exécutives, mémoire et attention). Les médicaments antipsychotiques actuellement utilisés ne répondent pas complètement aux attentes des médecins et des patients, jusqu'à 40 % des patients ne répondent pas correctement aux traitements antipsychotiques. De plus, les médicaments antipsychotiques présentent de forts effets secondaires (extrapyramidaux ou métaboliques). Il est donc important de continuer de développer des modèles animaux de la schizophrénie robustes et fiables qui mettent en évidence les symptomes positifs, négatifs et cognitifs et fournissent une meilleure approche prédictive pour développer de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra développer de nouveaux traitements à la fois plus efficaces pour réduire les différents symptômes liés aux maladies psychiatriques et en particulier la schizophrénie mais aussi avec moins d'effets secondaires, afin d'améliorer la qualité de vie des patients et de favoriser le suivi du traitement.
Procédures
Les principales interventions subies par les animaux sont la préhension pour le placement et le retrait dans les différents dispositifs de mesures comportementales et l’administration des traitements. Chaque préhension dure maximum 1 minute. Les administrations de substances pourront être réalisées 1 à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration) et la la durée du traitement peut aller jusqu’à 10 semaines. Les tests sont généralement effectués une seule fois et leur durée varie de 5 à 45 minutes environ. Pour le modèle neurodévellopemental, l'hébergement individuel durera au minimum 2 mois et pourra s'etendre à 6 mois en cas d'évaluation à un âge adulte plus avancé. les tests permettant d'évaluer les fonctions cognitives dureront de 2 à 6 semaines (séances journalières de 15 minutes maximum). Pour certaines procédures les animaux auront un accès limité à la nourriture (80-90% de la ration quotidienne) sur une durée de 6 semaines environ. Les administrations de substances pourront être réalisées 1 à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration) et la la durée du traitement peut aller jusqu’à 10 semaines. Des prélèvements de sang (max 1 mL, durée max 2 min) terminaux ou répétés (une fois par semaine, maximum 5 mois) pourront être réalisés pour les besoins de l'étude.
Impact sur les animaux
Les manipulations/contentions des animaux réalisées au cours des procédures peuvent engendrer un stress de courte durée. L'injection des différents traitements pourra entraîner une douleur légère de courte durée. L'administration de réactifs ayant pour but de mimer certains comportements specifiques de la schizophrénie entrainera une modification de comportement (hyperactivité locomotrice, mouvements stéréotypés.) observé pendant toute la durée des tests (durée maximum 3 heures). Dans le modèle neurodeveloppemental, les animaux seont hébergés individuellement à partir du sevrage et jusqu'à la fin de l'étude entrainant un stress des animaux (maixmum 5 mois). Pour les tests de conditionnement opérant, un rationnement en nourriture pourra causer une légère sensation de faim pendant toute la durée de la phase expérimentale (6 semaines maximum).
Devenir
Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus ou les réactifs utilisés pour induire des comportements associés à la schizophrénie seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que les traitements n’induiront pas d’effets délétères sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc du nombre d’animaux utilisés. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux troubles psychotiques ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 10 -15 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité ou de leur inocuité en clinique. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris sauf pour le modèle neuro-développemental qui implique le traitement de rongeurs en période néonatale et l'évaluation des animaux se poursuit à l'âge adulte.
Etude des mécanismes d’action de la colchicine dans un modèle de myocardite auto-immune chez le rat : EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
79 rats vont être utilisés, dont 64 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant une prise orale sous contention chaque jour pendant 31 jours, quatre poses de cathéter suivies d'une heure d'IRM sous anesthésie profonde, et trois échocardiographies. Une injection unique dans la patte leur provoque une myocardite auto-immune, inflammation du muscle cardiaque qui peut entraîner fatigue, essoufflement à l'effort et parfois la mort. Quinze rats partiront vers d'autres projets, les 64 autres seront tués pour prélever le cœur et les organes d'intérêt. Le porteur affirme que le mode d'action de la colchicine "au niveau de l'organisme entier" n'est pas reproductible in vitro, et renvoie l'application chez le patient à ce qu'il faudrait "envisager".
Objectifs
La myocardite est une inflammation du tissu musculaire du cœur, le myocarde, qui affaiblit la fonction de contraction de cœur. Elle représente ainsi la 3ème cause de mort cardiaque subite chez le jeune. L’analyse d’un prélèvement du myocarde pour effectuer le diagnostic tend à être remplacée de nos jours par l’imagerie moins invasive, avec la nécessité de développer de nouveaux outils d’imagerie. Pour l’instant, il n’existe pas de traitement spécifique de la myocardite. Récemment, la colchicine, un médicament anti-inflammatoire, a montré un effet bénéfique pour des patients souffrant d’autres maladies inflammatoires du cœur. Objectifs concrets : Nous souhaitons déterminer l’effet d’un traitement à la colchicine sur l’inflammation au niveau sanguin et au niveau du myocarde chez des animaux souffrant de myocardite, en utilisant un nouvel outil d’imagerie. Le projet se déroule dans deux Etablissement Utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront d’une part d’identifier le mode d’action de la colchicine au cours de la myocardite, et d’autre part de valider une nouvelle mesure d’imagerie médicale plus précise de l’inflammation du cœur, afin d’envisager une application chez le patient.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes sur une durée de 45 jours : Mise en place d'un modèle de myocardite par injection unique d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min / EU1), Prise orale quotidienne avec contention pour donner le traitement anti-inflammatoire ou le placebo (durée : environ 3min / EU1) pendant 7 jours (détermination de la posologie efficace) ou 31 jours, Pesée journalière (durée : inférieure à 2 min / EU1) pendant 31 jours, Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde avec prélèvement sanguin (durée : environ 15min / EU2) suivie d’une imagerie IRM avec injection de produit de contraste via le cathéter posé (durée : environ 1h / EU2) au 14ème, 21ème, 28ème et 42ème jour, Echocardiographie sous anesthésie profonde (durée : 20min / EU1) au 17ème, 31ème et 45ème jourjour
Impact sur les animaux
Le modèle de myocardite auto-immune par immunisation peut induire une légère douleur de courte durée au moment de l’injection du produit induisant l’inflammation au niveau de la patte des animaux. Ce modèle induit une dysfonction du cœur dû au développement de la pathologie, pouvant mener à une fatigue et un essoufflement à l’effort, et parfois à la mort ou euthanasie de l’animal. Lors des protocoles d’imagerie non invasive, un léger inconfort/stress de courte durée peut apparaitre à l’induction de l’anesthésie et au réveil ; de même qu’un stress léger de courte durée lors des manipulations/contentions.
Devenir
Une partie des animaux (15) seront réutilisés pour d’autres projets. Les autres animaux seront mis à mort afin de récupérer et analyser les différents organes d'intérêt (cœur en particulier), permettant ainsi de confirmer et compléter les résultats obtenus in vivo (imagerie) en identifiant les mécanismes impliqués.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie in vivo dans la caractérisation du modèle de myocardite et de l’imagerie de l’inflammation pour le diagnostic. Le mécanisme d’action de la colchicine au niveau de l’organisme entier n’est actuellement pas reproductible in vitro (notamment sur des modèles cellulaires).
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 79 animaux sur 3 ans. Le suivi longitudinal par imagerie évite de mettre à mort des animaux à chaque point temporel d’intérêt pour récolter les informations.
Raffinement
Les animaux auront un temps d'acclimatation et un enrichissement de leur milieu. Une attention particulière sera accordée à l'évolution de la masse corporelle afin de vérifier que les animaux s'alimentent correctement. La douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les différents temps d'études par une analgésie. Les prélèvements sanguins ont été mutualisés avec les examens d’imagerie pour limiter le nombre d’anesthésie et utiliser la même voie que le cathéter utilisé pour l’injection du produit de contraste lors de l’imagerie. Différents point limites ont été définis afin de ne pas poursuivre l'étude si les animaux présentent des signes de souffrance ou de douleur. La durée du transport inter-établissement des animaux est inférieure à 5mn (distance d'environ 200m). Il est réalisé à l'aide d'une cage de transport prévue à cette effet (nourriture, eau gélifiée, enrichissement classique, groupes sociaux initiaux) avec maintien constant de la température (le trajet n'est pas soumis aux aléas climatiques).
Choix des espèces
Le rat est l'espèce animale la plus utilisée dans ce modèle de myocardite expérimentale auto-immune et parmi les espèces animales, celle qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine du rat sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement pertinente pour étudier les pathologies inflammatoires.
Evaluation préclinique de produits de santé pour l’orthopédie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 540
Chiens : 240
Chèvres : 330
Moutons : 660
Le nombre de moutons, chèvres, chiens, lapins, rats et cobayes opérés dépend des études signées avec des donneurs d'ordre, pour tester des dispositifs médicaux orthopédiques avant leur mise sur le marché. 2 100 animaux non-humains vont être utilisés, 660 moutons, 330 chèvres, 240 chiens, 540 lapins, 210 rats et 120 cobayes, tous tués à l'issue pour examiner les tissus autour du dispositif, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sévère. Chacun subit une chirurgie de trente minutes à trois heures pour recevoir l'implant, certains une seconde pour le retirer, avec des prises de sang et jusqu'à trois séances d'imagerie sur des études qui peuvent durer plusieurs années, et le porteur cite parmi les risques une infection et un déficit moteur des membres postérieurs. Il affirme que leur utilisation "est requise dans la réglementation", et indique que lapins, cobayes et rats sont aussi choisis "pour des raisons économiques et éthiques", par exemple pour des études de faisabilité menées sur des individus venus d'études précédentes.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en orthopédie . Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en orthopédie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 0h30 et 3h00). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie . Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 00h30 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (nuisance modérée). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours (nuisance légère)- risque infectieux lié à la chirurgie (nuisance modérée à sévère)- hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur (exemple : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs) (Nuisance légère à modérée).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale ). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en orthopédie.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal. Le nombre d’études sur 5 ans est donc estimé à 36 (3 x 12 procédures expérimentales ; pour 660 ovins ; 330 caprins ; 240 chiens ; 540 lapins ; 210 Rats ; 120 cobayes).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques (structure des os, épaisseur du cartilage...), poids, propriétés mécaniques et régénération osseuse des ovins/caprins et des chiens - Caractéristiques anatomiques et mécaniques des lapins, des cobayes et des rats. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) - Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires.
Etudes exploratoires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1500
Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).
Objectifs
Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).
Bénéfices attendus
Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue
Devenir
Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.
Remplacement
Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.
Choix des espèces
Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.
Mise en place d’un modèle expérimental d’occlusion veineuse rétinienne.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1425
Trois à quatre veines de la rétine sont obstruées au laser après injection d'un colorant photosensible, sur souris et rats anesthésiés. 1 425 souris et 1 425 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, tous tués en fin de protocole pour analyse des tissus. Le protocole teste des traitements contre l'occlusion veineuse rétinienne dans un cadre réglementaire d'évaluation d'efficacité et de tolérance, avec des gouttes oculaires jusqu'à huit fois par jour, des injections quotidiennes et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine. Le porteur écrit que l'affection recherchée n'induit pas de douleur et que les examens sont "totalement indolores et non invasifs", alors que le protocole détruit délibérément une partie de la vision de 2 850 animaux.
Objectifs
Les occlusions veineuses rétiniennes (OVR) représentent une pathologie fréquente de la rétine, marquée par l'obstruction des veines rétiniennes, entraînant une perturbation significative de la circulation sanguine au niveau de la rétine. En termes de fréquence, l'OVR est la deuxième maladie vasculaire rétinienne la plus courante après la rétinopathie diabétique, affectant principalement les personnes âgées de plus de 50 ans. L'incidence globale est estimée à environ 0,5 % à 1,2 % de la population générale, avec une prévalence plus élevée chez les individus présentant des facteurs de risque cardiovasculaires. Les mécanismes d'apparition impliquent généralement une thrombose ou un blocage de la veine rétinienne, souvent lié à des altérations de la paroi vasculaire, à une stase sanguine ou à des anomalies de la coagulation. Ces obstructions entraînent une augmentation de la pression veineuse, une fuite de fluide, et des hémorragies rétiniennes, perturbant ainsi la fonction rétinienne. Les causes des OVR sont variées et incluent principalement des facteurs systémiques tels que l'hypertension artérielle, le diabète, l'hyperlipidémie et les maladies cardiovasculaires, des facteurs oculaires ou des facteurs hématologiques. Sans traitement, les patients peuvent développer des complications sévères comme l'œdème maculaire, des néovascularisations et, dans certains cas, une perte sévère de la vision. Les traitements des OVR visent à réduire l'œdème rétinien, à prévenir les complications et à améliorer la fonction visuelle. Les options thérapeutiques incluent les injections intravitréennes de composés anti-angiogéniques pour réduire l'œdème maculaire, les injections de corticostéroïdes pour leurs effets anti-inflammatoires et les traitements au laser pour gérer les néovascularisations. Si de nombreux traitement peuvent être proposés, nous ne savons toujours pas comment désobstruer la veine et aucun traitement n’a, à ce jour, fait la preuve certaine de son efficacité pour améliorer l’acuité visuelle. En conclusion, la reconnaissance précoce et la prise en charge appropriée des occlusions veineuses rétiniennes sont essentielles pour minimiser les complications visuelles et améliorer le pronostic des patients affectés. Les recherches sur ces traitements et de nouveaux se poursuivent donc.
Bénéfices attendus
Le modèle expérimental d’occlusions veineuses rétiniennes chez le rongeur consiste à obstruer par photocoagulation 3 à 4 veines rétiniennes. Cette étape essentielle est réalisée sur animal anesthésié à l’aide d’un biomicroscope et d’un laser après injection d’un traceur photosensible comme du Rose Bengal. Après cette étape des animaux seront suivis et examinés quotidiennement la première semaine puis toutes les semaines pendant un mois à l’aide d’appareils permettant d’évaluer l’état du fond d’œil et de la rétine en particulier. Durant cette période, certains animaux suivront un traitement visant à réduire les complications de ces occlusions veineuses.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’intervention : 1. L’établissement du modèle est dû à une obstruction par photo coagulation laser de veines rétiniennes après injection d’un composé photosensible sous anesthésie. Cette étape clef sera réalisée 1 seule fois par animal, le jour de l’induction. Cette étape ne devrait pas durée plus de 5 à 10 minutes sans compter l’anesthésie et le réveil de l’animal. 2. Les anesthésies qui ne devraient pas durer plus d’une vingtaine de minutes, le temps du réveil. Ces anesthésie seront réalisées 1 fois pour l’induction et lors d’examens pour maintenir l’animal immobile soit 1 fois par semaine et durant 1 mois. 3. Les examens ophtalmiques (lampe à fente, angiographie, tomographie, électrorétinogramme) qui sont réalisées soit quotidiennement la première semaine pour la lampe à fente soit 1 fois par semaine. Ces examens ne durent pas plus de 5 minutes par animal. Les animaux seront anesthésiés afin de faciliter l’évaluation et maintenir l’animal immobile. Tous ces examens sont pratiqués chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation et également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ils sont totalement indolores et non invasifs. 4. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures durent moins d’une minute. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés à leur manipulation et à l’administration des produits. L'affection recherchée – les occlusions veineuses rétiniennes - n'induit pas de douleur chez l'animal. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet secondaire en dehors d'une dégradation de la vision. Des hémorragies rétiniennes indolores et transitoires peuvent survenir lors de la mise en place du modèle. La manipulation des animaux sera limitée au maximum et sera réalisée par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection.
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus.
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement et l'effectif sera évalué à l'aide d'outils statistiques avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Les animaux, hébergés par deux au minimum, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, tunnel) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des animaux tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. Dans le cas où des signes de douleur sont manifestés, un analgésique sera administré. Cette administration sera renouvelée au tant que nécessaire. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis 2017. Il est bien caractérisé chez le rongeur. Ce modèle, chez la souris et le rat est relativement facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité, une bonne fiabilité et relativement peu de nuisances ou d'effets indésirables. De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 6 à 12 semaines à leur arrivée dans notre animalerie conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.