Rats
Evaluation de l’efficacité de nouveaux traitements dans des modèles neurotoxique de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une neurotoxine injectée dans le cerveau, une heure d'intervention, puis vingt et un jours d'injections du traitement de référence qui déclenche des mouvements involontaires anormaux : 2 050 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués et leurs cerveaux prélevés. Les rotations et les stéréotypies ainsi provoquées irritent la peau au frottement de la litière, ce que le porteur compte limiter par une litière en cellulose. Le projet relève d'une activité de service préclinique pour des tiers, et les bénéfices annoncés tiennent en deux phrases, l'identification de "nouveaux outils thérapeutiques". Les mesures du comportement moteur durent jusqu'à trois heures et se répètent deux à quatre fois, sans qu'aucune précision soit donnée sur leur contenu.
Objectifs
La maladie de Parkinson se définit par un dysfonctionnement du système nerveux. Elle touche un nombre important de personnes dans le monde. L'origine de cette maladie est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Ils permettent l'amélioration des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson mais s'accompagne toutefois d'effets secondaires délétères caractérisés par des mouvements involontaires anormaux chez 90% des patients. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de modèles rongeur de la maladie de Parkinson qui permettent d’en reproduire les symptômes, afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l’identification de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux vont subir une injection intracérébrale (1 heure), une injection d'un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson (21 jours, durée de l'injection : 30 secondes), une administration de traitement dans le corps (1 à 2 mois/1 min) ou une chirurgie (1 chirurgie/30 min), des prélèvements de sang (1 à 4 fois/5 min) et des mesures du comportement moteur (2 à 4 fois/3 heures).
Impact sur les animaux
L’injection de neurotoxine peut entraîner une perte de poids. Les mouvements involontaires anormaux induits par les injections répétées de traitement de référence de la maladie de Parkinson provoquent des rotations et des stéréotypies pouvant induire des irritations suite aux frottements sur la litière. Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : Per os : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. Injections sous-cutané et intrapéritonéale : l'injection peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. Intranasal : elle peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Intradermique : certains animaux peuvent développer des réactions cutanées locales. L’administration du traitement par injection stéréotaxique ou intrathécale pourra entrainer des douleurs postopératoires qui devraient durer 2 jours en moyenne. La chirurgie entraine également un léger risque d’hémorragie ou d’infection au niveau du site opératoire.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme ce qui rend ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf pour les études invasives). -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R.
Raffinement
Avant toute manipulation, nous respecterons une période d'acclimatation des animaux de deux semaines. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (2 par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (tunnel, bâton de bois à ronger). Pour les dyskinésies, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante afin d’éviter d’éventuels irritation aux pattes et à la queue. Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée par un suivi visuel journalier (weekend et jours fériés inclus) et une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d'un analgésique et d'un anesthésique local permettant de réduire la douleur des animaux. Le lendemain de la chirurgie, les animaux reçoivent une injection d'un analgésique. Un suivi post opératoire spécifique de 3 jours est mis en place. Le bien être est scoré via l’observation de différents critères de bien-être. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de neurotoxine est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge. En effet à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.
Détermination préliminaire de la tolérabilité ou du profil de sécurité/toxicocinétique de candidats médicaments ou de candidats véhicules administrés par voie intrathécale chez le Rat pour le traitement de maladies neurologiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
3 660 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir une chirurgie du dos de trente minutes pour une injection entre les méninges, six prélèvements de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à dix-sept heures en cage à métabolisme. Avant la mise à mort, une aiguille traverse la peau à la base du crâne pour ponctionner le liquide céphalorachidien. L'objet est de mesurer la toxicité de candidats médicaments administrés par voie intrathécale, en amont d'études réglementaires qui utiliseront davantage d'animaux non-humains. Le porteur indique que 183 rats pourront être réutilisés dans un autre projet, ceux ayant subi un premier geste invasif sans avoir reçu de traitement, les 3 477 autres étant tués pour prélèvement de sang, de liquide céphalorachidien et d'organes.
Objectifs
De nos jours, une proportion très importante des pathologies pouvant être décrites atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, difficiles à traiter, sont très invalidantes, voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En effet, en 2021, il était estimé que près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. De même, le nombre de cancers atteignant le système nerveux représente une proportion non négligeable du nombre total de cancers, avec de même une difficulté de traitement du fait de leur localisation. Dans ce contexte, l’objectif principal de la R&D (recherche et développement) pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques afin de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies touchant le système nerveux. Pour beaucoup de ces maladies, un dérèglement de la production de protéines ou une accumulation de celles-ci au niveau cérébral est en cause. Il est possible aujourd’hui de cibler l’ARN d’une protéine du cerveau au fonctionnement anormal pour l’éliminer. Cela nécessite la mise en œuvre de candidats médicaments qui doivent atteindre les cellules du système nerveux. Le passage de la barrière hématoencéphalique (BHE) étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par administration dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité puis le profil de sécurité complet de candidats médicaments et/ou véhicules (agents de transport du principe actif) administrés par voie IT chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme.. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Ainsi, après sélection par screening in vitro puis in vivo des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, les études préliminaires vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet vont permettre de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (en comparant la dose toxique à la dose efficace). Les données d’efficacité et de sécurité permettent conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament.
Bénéfices attendus
Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies affectant le système nerveux et notamment neurodégénératives est administré par voie intrathécale, permettant le passage de la barrière hémato-encephalique et l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient et le candidat médicament peut, au cours de son développement, être confronté à des problèmes de tolérabilité, de distribution et de dégradation précoce. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet également de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés au total pour un projet thérapeutique.
Procédures
- A l’administration (unique à 1 fois toutes les 3 semaines maximum) de composés par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique – durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling sur animal vigile (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude – contention de 30 secondes environ et prélèvement durant 10 secondes environ - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien réalisé par voie transcutanée (ponction avec une aiguille au travers de la peau) via la cisterna magna (cavité située en bas de la boîte crânienne) sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère de 2 minutes environ au maximum 2 fois par étude
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’administration (moins de 10s) de la douleur (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité léger) • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de sang ou autre liquide biologique, liquide céphalo-rachidien (LCR), préalable à l’euthanasie etc) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques (modifications de la prise de poids, baisse d’activité locomotrice par exemple) et peut provoquer une nuisance pour l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide cephalo-rachidien (LCR) pour analyse (biologie clinique, biomarqueurs) et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer la tolérabilité puis d’établir un profil de sécurité de candidats médicaments à visée neurologique. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet pour juger du passage de la barrière hématoencéphalique ainsi que la tolérabilité et le profil de sécurité de ces candidats médicaments. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les candidats médicaments ou véhicules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.
Réduction
Une sélection des candidats médicaments les plus prometteurs est réalisée à l’aide de screening vitro et/ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 8 animaux/dose avec une mixité selon la procédure conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures, pour générer de la donnée consolidée pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible Le choix de ce nombre est basé sur la littérature (recommandations sur les bonnes pratiques d’études de sécurité non clinique) et sur l’expérience interne. Les études de ce projet sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (efficacité, engagement de la cible) avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études d’efficacité pharmacologique, le développement de la molécule peut être arrêtée évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Selon la procédure, les études permettent de mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire dans ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal et sans chauffage préalable pour provoquer la dilatation des vaisseaux. En cas de protocole particulier (exemple : besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être mis à contribution pour définir le design expérimental le plus optimal.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peuvent être mis en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont régulièrement manipulés et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures, recueil urinaire n’excédant pas 17 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.
Effet analgésique d’un traitement dans des modèles de douleur induits chez la souris ou le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Rats : 6992
Le nombre d'études dépend des partenaires et des molécules en développement, et 303 études sont annoncées, mobilisant 10 924 souris et 6 992 rats, soit 17 916 animaux non-humains, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des injections chimiques leur provoquent une douleur qui dure de sept jours à plusieurs semaines, avec hyperalgésie au chaud ou au froid, allodynie mécanique et parfois œdème. Les tests mesurent la sensibilité à un filament, à la chaleur et au froid sur les pattes arrière, et par immersion de la queue jusqu'à quinze secondes, deux fois par semaine. Le porteur écrit que "tout est mis en œuvre pour éviter une douleur excessive", et précise plus loin que les animaux ne sont ni anesthésiés ni analgésiés afin de ne pas interférer avec les résultats.
Objectifs
Dans le cadre de programmes de maturation, nous développons au stade préclinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité sont réalisées. Ce projet concerne les études d’efficacité et a pour but d’étudier l’effet analgésique de différents traitements dans différents modèles de douleur chez la souris ou chez le rat. Le développement de molécules analgésiques et antalgiques pour traiter les douleurs (neuropathiques, chroniques ou aigues) est particulièrement important pour le confort des patients. Pour ce projet nous pensons effectuer 303 études avec pour chaque étude, l’utilisation de 10924 souris et 6992 rats, soit 17 916 animaux sur 5 ans. Toutefois, cela reste des estimations car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement interne ainsi que du choix du modèle translationnel pour aller en clinique
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la douleur. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’Homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes
Procédures
Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Les modèles seront induits par l’injection de molécules chimiques : la dose et la posologie seront déterminées à l’aide de la littérature existante et/ou d’études pilotes (varie entre 1 injection unique à plusieurs injections par semaine pendant plusieurs semaines). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés en fin de procédure (phase terminale). Les animaux recevront les administrations des traitements soit par voie intrapéritonéale, orale ou topique, jusqu’à 7 jours par semaine pendant la durée de l’étude. Des tests de comportement seront effectués jusqu’à 2 fois par semaine pendant la durée de l’étude : soit en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation soit un test durant 15 minutes en tout), la sensibilité au chaud ou au froid au niveau des pattes arrières (30 sec ou 50 sec maximum, respectivement, en test unique) ou au niveau de la queue (immersion pendant 15 sec maximum avec 3 tests séparés de 5minutes). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.
Impact sur les animaux
Du fait de l’induction du modèle, l’animal va développer une douleur transitoire ou chronique (généralement d’une durée supérieure à 7 jours après l’induction du modèle expérimental et jusqu’à plusieurs semaines) avec hyperalgésie à la chaleur ou au froid et une allodynie mécanique ; l’animal peut également développer un œdème. Les modèles chroniques que nous utilisons sont conçus pour induire des douleurs d'intensité modérée, mimant la douleur chronique humaine, mais tout est mis en œuvre pour éviter une douleur excessive. L'intensité de la douleur est régulièrement évaluée à l’aide de tests comportementaux afin de s'assurer que les animaux ne souffrent pas inutilement. Nous anticipons une douleur chronique modérée et contrôlée, et les protocoles incluent des évaluations fréquentes pour s'assurer que celle-ci ne dépasse pas un seuil tolérable. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) en dehors de celle induite par la piqure. De plus, les prélèvements de sang éventuels se feront en phase terminale sous anesthésie générale. Pour le modèle de neuropathie diabétique, des petits prélèvements de sang seront réalisés régulièrement (1 goutte) pour mesurer la glycémie à l’aide d’un glucomètre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car certains tissus devront être prélevés pour réaliser des analyses complémentaires indispensables à l'évaluation scientifique des expérimentations menées. Nous prévoyons de collecter différents tissus (comme le cerveau, la moelle épinière, les ganglions nerveux, ou encore des tissus périphériques) afin de réaliser des analyses d'expression génique ou histologique pour évaluer les éventuels changements morphologiques ou dégénératifs. Ces analyses sont essentielles pour valider les résultats comportementaux et physiopathologiques observés durant les expériences, en apportant des preuves complémentaires au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Notre projet se focalise sur l’induction de modèles expérimentaux de de douleur nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. En effet, ce sont des modèles qui étudient principalement le comportement de l’animal. La douleur transitoire ou chronique est un sujet d’étude complexe nécessitant des expériences à l’échelle de l’organisme entier. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales alternatives n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.
Raffinement
Pour minimiser les impacts négatifs sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront réalisées, permettant la réussite d'une étude plus large. Cela implique de tester l'étude sur un petit nombre d'animaux. Les études pilotes permettent la mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. En dehors des tests de comportement, les animaux feront l’objet d’un suivi 3 fois par semaine afin de détecter les potentiels critères d’arrêt de souffrance. Enfin, les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation afin de réaliser des analyses supplémentaires. Les études sur la douleur impliquent que les animaux ne soient pas anesthésiés ni analgésiés afin de ne pas interférer avec les résultats des expériences. Les expériences de comportement seront effectuées sur des temps très courts (jusqu’à 15 minutes) afin de limiter le temps de souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, ils sont appropriés pour les études comportementales et pour l’étude de la douleur. Les modèles que nous allons utiliser ont été spécialement développés afin de modéliser de manière simple la douleur et d’étudier l’effet de médicaments sur celle-ci. L’utilisation des souris et des rats est reconnue pour ces modèles. Ils développent des symptômes de douleur, décrits dans la littérature et présentés dans la partie « Nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux ». Pour comprendre l’efficacité potentielle des médicaments testés, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles avec différents mécanismes d’induction de la douleur. L’utilisation de l’espèce souris ou rat se fera en fonction de l’avancée du projet : continuité du modèle pour valider les résultats dans un contexte laboratoire indépendant ou changement d’espèce pour valider les résultats dans un modèle indépendant. Le choix de l’espèce dépendra de l’efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s’avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèce indépendante. Les animaux seront âgés de 7-10 semaines au début de l’étude en accord avec la littérature existante ce qui correspond à un stade de développement de jeune adulte.
Evaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle rat de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une activité préclinique de service, menée sur des composés thérapeutiques pour le compte de tiers : 2 160 rats vont être utilisés dans ce cadre, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un virus est injecté dans leur cerveau pour détruire les neurones dopaminergiques, en une heure, avant des traitements administrés sur un à deux mois, des prélèvements sanguins et des mesures du comportement moteur pouvant durer trois heures, deux à quatre fois. Le porteur liste les atteintes possibles selon la voie d'administration, fausse route et irritation des muqueuses nasales, réactions cutanées, douleurs postopératoires de deux jours en moyenne, hémorragie ou infection au site opératoire. Leurs cerveaux sont prélevés après la mise à mort, et le porteur annonce qu'un modèle animal reproduisant toutes les caractéristiques motrices et cognitives de la maladie reste l'objectif à terme de cette prestation.
Objectifs
La maladie de Parkinson se définit par un dysfonctionnement du système nerveux central et périphérique. La maladie de Parkinson touche un nombre important de personnes dans le monde. L'origine de cette maladie est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel.Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de modèles rongeur de la maladie de Parkinson qui permettent d’en reproduire les symptômes, afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l’identification de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux vont subir une injection intracérébrale (1 heure), une administration de traitement dans le corps (1 à 2 mois/1 min) ou une chirurgie (1 chirurgie/30 min), des prélèvements de sang (1 à 4 fois/5 min) et des mesures du comportement moteur (2 à 4 fois/3 heures).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : Per os : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. SC et IP : l'injection peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. Intranasal : elle peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Intradermique : certains animaux peuvent développer des réactions cutanées locales. L’administration du traitement par injection stéréotaxique ou intrathécale pourra entrainer des douleurs postopératoires qui devraient durer 2 jours en moyenne. La chirurgie entraine également un léger risque d’hémorragie ou d’infection au niveau du site opératoire.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme ce qui rend ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf pour les études invasives). -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (2 par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (tunnel, bâton de bois à ronger). Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée par un suivi visuel journalier (weekend et jours fériés inclus) et une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d'un analgésique et d'un anesthésique local permettant de réduire la douleur des animaux. Le lendemain de la chirurgie, les animaux reçoivent une injection d'un analgésique. Un suivi post opératoire spécifique de 3 jours est mis en place. Le bien être est scoré via l’observation de différents critères de bien-être. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Les procédures sont réalisées par un personnel compétent.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de virus est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge.
Modèles pathologiques induits chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2500
Cochons d'Inde : 1500
Hamsters dorés : 1500
Paralysie partielle ou totale des membres, douleurs articulaires, automutilation possible : 10000 rongeurs subissent l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune ou d'une arthrose, puis reçoivent des substances à tester, parfois chaque jour jusqu'à leur mise à mort. 4500 souris, 2500 rats, 1500 cochons d'Inde et 1500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des analyses in vitro et ex vivo. Les maladies sont provoquées par des injections répétées sur des rongeurs éveillés, sous la peau puis dans la cavité abdominale pour l'encéphalomyélite, afin d'évaluer l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux pour l'industrie pharmaceutique et les "clients" de l'établissement. Le porteur justifie le choix des rongeurs par leur petite taille, un organisme "similaire à l'Homme" et le fait qu'ils sont "faciles à héberger". Il affirme aussi que les traitements testés "minimiseront les nuisances", alors que l'objectif inclut d'en évaluer la toxicité.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux, l’arthrose et l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de pathologies, soit l’arthrose et la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour le développement du modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs injections d’une substance en sous-cutané, de 2 à 5 injections. Ensuite, une substance sera inoculée en dose unique ou répétée après le développement de l’arthrose. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intra-articulaire ou orale. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’injection d’une première substance en sous-cutanée, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’injection en intrapéritonéale d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. Une substance test peut ensuite être injectée par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. A l’issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Impact sur les animaux
Le modèle de développement d’arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations. Les effets liés au développement de modèle peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, …). Les traitements testés minimiseront les nuisances. Le modèle de développement d’encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres. Cette paralysie peut s’accompagner d’une allodynie et/ou d’une douleur plus ou moins persistante au niveau des membres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaitre avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Les effets liés au développement de ce modèle peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d’activité, baisse de la prise alimentaire) et physiques (perte de poids, absence de réflexes, immobilité). Les traitements testés minimiseront les nuisances.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 4, comme décrit dans les procédures internes.
Raffinement
De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Recherche d’un effet analgésique de différents produits chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1200
1 200 souris et 1 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La voûte plantaire d'une patte arrière est incisée sous anesthésie générale, ou un produit inflammatoire y est injecté, puis les seuils de douleur sont mesurés le lendemain. La douleur est ici l'effet indésirable attendu et le paramètre étudié, le projet visant à mesurer l'effet antalgique propre de produits déjà utilisés en clinique. Le porteur affirme que l'étude de la douleur exige un "organisme entier", pose douze animaux par condition comme un minimum, et indique que la seconde espèce ne sera pas utilisée si la première donne des résultats satisfaisants.
Objectifs
Le but du projet est de rechercher des produits efficaces pour diminuer ou supprimer une douleur aiguë, notamment les douleurs postopératoires qui sont caractérisées par une hypersensibilité tactile. La douleur est définie comme une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, liée à une lésion tissulaire existante ou potentielle. Elle peut être aiguë ou chronique, spontanée ou provoquée, discrète ou intense, mais elle est avant tout personnelle, subjective, émotionnelle et comportementale. La douleur postopératoire aiguë est causée par un geste chirurgical et elle est présente immédiatement après l'opération, provoquée par des lésions induites par la chirurgie ainsi que par un processus inflammatoire qui entraine un excès de sensibilité à la douleur (nociception). Quand la douleur postopératoire est mal traitée, une douleur postopératoire chronique peut persister pendant plusieurs semaines ou mois. Si elle persiste, elle risque de ralentir le rétablissement et de devenir chronique. Elle est alors plus difficile à traiter. Notre projet permet de déterminer l’effet antalgique propre d’un produit.
Bénéfices attendus
Une douleur postopératoire mal traitée peut entrainer des douleurs chroniques qui persistent à distance de la chirurgie pendant plusieurs semaines ou mois. Celle-ci est fréquente et peut se retrouver chez 40% des patients. Elle est associée à une hypersensibilité tactile diffuse autour de la chirurgie et qui est assez difficile à bien prévenir et ensuite à bien traiter quand elle s'est développée. La prise en charge rapide et efficace de la douleur postopératoire est importante pour assurer un confort postopératoire et une réhabilitation précoce, et pour éviter le développement de douleurs prolongées ou chroniques. Ce projet permet de déterminer précisément l'effet antalgique de produits utilisés en condition clinique, notamment sur la prévention d'une hypersensibilité tactile.
Procédures
Une chirurgie avec incision de la voute plantaire d'une patte arrière est réalisée sous anesthésie générale, en 10 minutes au maximum, la veille des tests, avec une durée maximale de 2 jours. Une administration d'un produit inflammatoire dans une patte arrière, et les tests sont réalisés le jour même avec une durée maximale d'une journée. L'objectif des procédures est de déterminer l'efficacité de molécules antinociceptives en réalisant des mesures des seuils de douleur.
Impact sur les animaux
L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie se font sous anesthésie générale à l'isoflurane afin de réduire le stress de la manipulation. Cependant, les effets indésirables attendus de ces 2 protocoles sont une douleur qui est le principal paramètre étudié. Des effets indésirables peuvent survenir après la chirurgie. Une inflammation au niveau de la cicatrice peut survenir nécessitant une désinfection.
Devenir
Les procédures étant classées "sévère", les animaux ne seront pas réutilisés dans un autre projet. A la fin de chaque expérimentation, après recueil des paramètres prévus, les animaux seront euthanasiés quand la procédure est terminée. Aucun prélèvement de sang ou d’organe n’est prévu dans le projet.
Remplacement
L'étude de la douleur chez l'animal implique l'utilisation d'animaux entiers. La sensibilité à la douleur est complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. L'utilisation de modèle avec des organes isolés ne permet pas d'évaluer l'influence de différents produits sur la sensibilité à la douleur. Des résultats obtenus lors de précédentes études et des données de la littérature permettent de sélectionner les produits à étudier (doses, voies d'administration, volumes). Des alternatives non animales ne peuvent être envisagées pour rechercher l'ensemble des objectifs prévus. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de la douleur, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.
Réduction
La variabilité des réponses aux effets d’un traitement chez le rongeur justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance. En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté. En cas de trop petit nombre d'animaux, il faudrait refaire une étude pour confirmer les effets et observer des différences significatives entre les groupes. En cas de faible ou non efficacité d'un produit, son étude sera arrêtée. Si une étude réalisée chez une espèce donne des résultats antalgiques satisfaisants, la deuxième espèce ne sera pas utilisée.
Raffinement
Une surveillance attentive des animaux est réalisée. Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels et/ou du Sizzle dry et des aliments directement dans les cages (dans les copeaux). Les administrations des différents produits sont effectuées par du personnel expérimenté. L'administration par voie orale se fera à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie (animaux placés sur une plaque chauffante pour limiter le refroidissement) se feront sous anesthésie générale. Un produit protecteur est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites. Ils seront euthanasiés en cas d'atteinte des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Choix des espèces
Après recherche bibliographique, le rat et la souris sont apparus parmi les modèles animaux les plus fréquemment décrits, et les plus appropriés pour ce projet. Les animaux utilisés sont des adultes conformément aux publications de référence.
Etude de la plasticité différentielle des néo-neurones matures et des neurones développementaux du gyrus dentelé chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La moitié des rats subit une chirurgie terminale, l'autre moitié deux chirurgies du cerveau espacées de huit semaines, suivies d'une procédure terminale trois jours après la seconde. 384 rats vont être utilisés ainsi, tous tués pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objet déclaré est de vérifier une hypothèse sur la plasticité de trois populations de neurones de l'hippocampe apparues à trois âges différents, dont des ratons opérés au troisième jour après la naissance. Le porteur annonce que sa priorité est le confort des animaux, tout en plaçant les rats opérés en cage individuelle une semaine après la première chirurgie puis trois jours après la seconde, pour éviter que le compagnon de cage ne morde les points de suture.
Objectifs
Le but de notre projet est de caractériser le degré avec lequel les différentes "couches" de neurones situés dans une région du cerveau appelée l'hippocampe sont capables de manifester des phénomènes de plasticité synaptique, c'est-à-dire de renforcer leurs connexions avec le reste du cerveau. Les "couches" qui nous intéressent sont celles qui apparaissent soit au tout début du développement de l'animal (3 jours après sa naissance, que nous appelons la couche Dev), soit lors de son adolescence (21 jours chez le rat, couche Adolescente), soit au début de leur âge adulte (à 2 mois, couche Adu). Plusieurs données comportementales suggèrent que ces "couches" pourraient présenter une réactivité différentielle à la plasticité, avec un gradient croissant en fonction de l'age d'apparition: Adu serait plus réactives que Adolescente, elle-même plus réactive que Dev. Toutefois, aucune donnée fonctionnelle n'est disponible pour confirmer cette théorie. Nous nous proposons ici de mettre à profit notre connaissance, à la fois des protocoles de mise enévidence de plasticité dans le cerveau, et des processus entourant la génèse des différentes "couches", pour tenter de démontrer cette hypothèse.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de mieux connaître les fonctions des différentes populations de neurones qui composent l'hippocampe, une région du cerveau qui joue un rôle majeur dans les processus de mémoire, mais aussi dans l'apparition de troubles de l'humeur tels que la dépression. En effet, dans l'une de ses sous-structures (appelée le gyrus dentelé), l'hippocampe connaît un phénomène de synthèse de nouveaux neurones tout au long dela vie de l'individu, ce qui constitue une exception dans le cerveau des mammifères. Comprendre les rôles respectifs de ces "couches" successives de nouveaux neurones donnera de nouvelles clés pour décrypter les mécanismes par lesquels les différents types de mémoire et d'apprentissage se mettent en place, avec une complexité croissante en fonction du développement de l'individu. Une des premières étapes consiste à déterminer ce qui différencie ces différentes populations quant à leur réactivité à un stimulus de plasticité, comme proposé dans le présent projet.
Procédures
Dasns ce projet, nous prévoyons d'utiliser 384 animaux en chirurgie. La moitié d'entre eux (192) subiront une procédure chirurgicale terminale, l'autre moitié connaîtra 2 chirurgies espacées de 8 semaines, suivie d'une procédure terminale 3 jours après la seconde chrirugie.
Impact sur les animaux
1. Une partie des animaux ne subiront que des procédures chirurgicales terminales, c'est-à-dire qu'ils seront euthanasiés à la fin de la chirurgie par une surdose d'anesthésique. Avant cela, les seules manipulations effectuées seront des injections aiguës (de 1 à 3 jours consécutifs selon les groupes expérimentaux) d'un composé sans effet sur leur métabolisme. Dans ce cas, la seule nuisance sera une douleur légère et de courte durée, due à la piqure de l'aiguille d'injection. 2. D'autres expériences nécessiteront de procéder à des micro-injections de marqueurs morphologiques dans des régions très précises du cerveau, avant d'utiliser à nouveau les animaux pour une seconde chirurgie, elle-même suivie 3 jours après d'une procédure terminale. Après les chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement afin de déceler le moindre signe de stress ou d'inconfort. Les risques de nuisance seront de type post-opératoire: infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie. Durant une semaine après la première chrirugie, et pendant les 3 jours qui suivront la seconde, les rats seront en isolement (stabulation en en cages individuelles), afin d'éviter les morsures du compagnon de cage au niveau des points de suture.
Devenir
Il sera nécessaire de prélever le cerveau de tous les animaux utilisés. En effet, que ces derniers subissent une seule procédure terminale, ou bien deux chirurgies suivies d'une procédure terminale, il s'agit dans les deux cas de visualiser des "marqueurs" moprhologiques dans l'hippocampe des rats. Nous étudions comment ces marqueurs réagissent dans les différentes "couches" de neurones, dans des conditions où on permet à l'hippocampe de mettre en place un renforcement de ses connexions synaptiques. Seule une obervation méticuleuse en microscopie permettra de comparer l'évolution des marqueurs au sein des différents types de neurones.
Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo les propriétés plastiques de populations neuronales distinctes au sein du système nerveux. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant de préserver le fonctionnement cérébral de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, les mécanismes sous-tendant l’intégration synaptique de ces neurones étant en grande partie inconnus, complexes, et impliquant l’activité du système nerveux dans son intégrité (impossible à modéliser).
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statisitquement fiables et robustes. Pour celà, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque groupe expérimental, en nous basant sur les acquis de nos précédents travaux.
Raffinement
En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximuim leur confort et leur sécurité durant la totalité des procédures expérimentales. Ainsi, les animaux adolescents et adultes seront d'abord en cages collectives de deux individus enrichies, puis en cages individuelles après la première chirurgie, un risque important de morsures mutuelles des points de suture étant à craindre à ce moment là. Cet isolement ne sera maintenu que durant une semaine après la chirurgie, un délai supérieur risquant d'entraîner des agressions inter-individuelles. Ces cages individuelles seront pourvues d'un environnement enrichi visant notamment à pallier l'isolement social (présence de plusieurs "tunnels" ludiques); les animaux seront en outre manipulés individuellement par l'expérimentateur pendant plusieurs minutes, 5 jours/semaine. Passé le délai d'une semaine, ils seront replacés avec leur précédent compagnon de cage. Après la seconde chirurgie, là encore les animaux seront mis en cages individuelles enrichies avant d'être euthanasiés 3 jours plus tard, toujours pour éviter les cas de morsure des sutures. Dans tous les cas, une pesée et une observation quotidienne post-opératoire seront réalisées, permettant de s’assurer du bon état de la plaie, des sutures et du bien-être des animaux, durant 3 jours consécutifs. Pour le cas particulier des ratons de 3 jours, la surveillance sera encore renforcée: ils seront surveillés 3 fois par jour durant la semaine post-opératoire. Notamment nous vérifierons si la poche gastrique (estomac vu "par transparence" à cet âge) est remplie de lait, indiquant que les animaux s’alimentent. Dans le cas contraire ils seront nourris par gavage: lait concentré dilué, via canule de gavage pour souris. Après sevrage, ils seront placés en cages collectives de deux individus, enrichies.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. Il s’agit en effet d’une espèce qui, de par ses capacités cognitives, sert de modèle de référence dans les études liées à l’apprentissage ou la mémoire, et donc également pour ce qui concerne la plasticité synaptique des neurones de l’hippocampe. Nous souhaitons utiliser les animaux à trois stades de développement différents: Le stade adulte (plus de 8 semaines chez le rat): les animaux seront donc par définition adultes au moment de la réalisation des expériences et lors de leur mise à mort. Le stade de développement P3 (3ème jour post-natal), et le stade adolescent (21 jours): étant donné que nous attendrons au minimum 8 semaines avant la seconde chrirugie, les animaux seront devenus adultes pour la suite des procédures.
Etude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Wistar
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Des rates gestantes reçoivent chaque jour une injection sous-cutanée et un gavage de glucose par semaine, après une injection destinée à enflammer les îlots de leur pancréas pour aggraver leur hyperglycémie. 972 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme qu'aucune étude n'a montré d'effet délétère du régime gras et sucré imposé pendant neuf à dix-sept semaines, et indique par ailleurs que la mise à mort des petits à la naissance et à douze jours ne peut se faire que par décapitation et par dislocation, sans couverture anesthésique. Embryons à 15,5 et 20,5 jours de gestation, nouveau-nés, jeunes de douze et de soixante jours : tous sont tués pour prélever cœur, aorte, poumons, reins, foie, sang et placenta.
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie cardiaque sont des pathologies cardiaques qui sont trois fois plus fréquents chez les enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale, retrouvée chez les enfants nés d'une maman ayant eu un diabète gestationnel, a longtemps été considérée comme une conséquence de l’élévation du taux d'insuline dans le sang (hyperinsulinémie) retrouvée chez le foetus. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à cette pathologie cardiaque dans ce type de contexte (diabète gestationnel) n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. Une modification des protéines est augmentée lors de l'élévation du taux de glucose sanguin (hyperglycémie) et a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiaque. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux de cette modification protéique associée à une hyperglycémie, pourrait être un facteur causal de l’hypertrophie cardiaque néonatale retrouvée lors d'un diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de cette modification protéique dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse, (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par cette modification protéique.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie cardiaque sont trois fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent une unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. Un jour avant l’accouplement et jusqu’au jour dr l'euthanasie ou au jour de la mise bas, les mères recevront une fois par jour, une injection sous cutanée d'un composé pharmaceutique permettant d'augmenter les niveaux d'une modification protéique de manière indépendante de la diète. Une injection unique d'un analogue du glucose (sucre) induisant une réaction inflammatoire des cellules pancréatiques, complétera et exacerbera le phénotype d’hyperglycémie pendant la gestation. L'injection durera 5secondes et sera faite au début de la gestation. Entre la 14ème semaine d’âge et jusqu’à la mise bas, une fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie (taux du glucose dans le sang) seront réalisés afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage de glucose et au suivi de la glycémie sur les deux heures suivantes. Les mesures de la glycémie sont réalisées par un appareil spécifique, un glucomètre, avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète sera réalisée via une échocardiographie et un électrocardiogramme sur les animaux à 60 jours post naissance. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang). L'injection répétée sur des femelles gestantes est une procédure validée et maitrisée par l'équipe. Lors des précédentes expérimentations, aucun risque de mise à bas précoce ou de surrisque de canibalisme n'ont été observé et rapporté.
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète sur une telle période. L'injection de notre modulateur pharmacologique peut entrainer une inflammation localisée et celle de notre analogue du glucose induit une réaction inflammatoire des îlots du pancréas. Ces dernières seront surveillées quotidiennement. En outre, s’il y a une inflammation sur le site d’injection, un anti inflammatoire cutané sera utilisé. Le gavage oral de glucose pour faire les tests de tolérance sera effectué en sonde rigide et ce dernier n'a pas d'effets indésirables sur la mère et les petits. La durée d’une gestation entre la 12ème semaine de vie est de 21jours, soit 3 semaines. C’est pour cela que la dernière date de prélèvements des embryons est 20.5 de jours de vie embryonnaire..
Devenir
A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le placenta, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et la modification protéique. Considérant la grande disparité physiologique entre les animaux dans le développement du diabète, une première phase de mise au point de modèle de diabète gestationnel chez l’animal a été nécessaire et effectuée par notre équipe sous une demande préalable . Les animaux de cette saisine ayant validé le modèle, seront réutilisés et viendront compléter nos animaux des groupes contrôles pour ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 972 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture classique. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux, et lorsque cela est possible (euthanasie des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique sera mise en place. Le sacrifice des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux à 15,5 jours de vie embryonnaire ; à 20,5 jours de vie embryonnaire, à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post-naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de notre modification protéique lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.
Tutorat sur gestes techniques sur rongeurs dans le cadre de la formation continue
- Formation professionnelle
Rats : 250
500 souris et 250 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, tous tués en fin de formation, la plupart des gestes étant pratiqués sous anesthésie générale. Chaque souris subit deux prélèvements sanguins aux veines mandibulaires, deux ponctions de 200 µl aux sinus rétro-orbitaires et un prélèvement intracardiaque de 500 µl, chaque rat deux prélèvements mandibulaires et deux ponctions caudales de 500 µl, auxquels s'ajoute l'apprentissage de la contention et du gavage sur animal vigile. Aucune donnée scientifique ne sortira de ces séances, qui servent à valider les acquis de stagiaires sur des gestes nouveaux pour eux ou oubliés. Les animaux viennent de l'élevage interne, jugés "surnuméraires" ou de génotypes "inexploitables", ou bien anciens reproducteurs déjà destinés à être tués, et le porteur indique que l'apprentissage peut commencer sur des corps d'animaux tués dans d'autres protocoles.
Objectifs
Le tutorat entre dans les recommandations dans le cadre de la réglementation relative à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Le tutorat par une personne expérimentée a pour objectif de former et de valider les acquis de l’apprenant sur les gestes techniques nécessaires à son poste. L’apprenant ne pourra travailler seul qu’après cette validation. L'objectif est d'apprendre ou de réapprendre l'ensemble des gestes simples sur rongeurs vigiles ou anesthésiés en fonction des besoins des utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques. Les formateurs seront des concepteurs ou applicateurs membres confirmés de l'établissement d'utilisateur (EU) intervenant sur ces mêmes gestes lors de formations initiales. Les stagaires seront formés sur des gestes nouveaux pour eux ou qu'ils n'ont plus effectués depuis longtemps. Les animaux utilisés seront uniquement des animaux surnuméraires ou de génotypes inexploitables provenants des élevages internes de l'EU.
Bénéfices attendus
L'objectif est d'apprendre ou de réapprendre l'ensemble des gestes simples sur rongeurs vigiles ou anesthésiés en fonction des besoins des utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques ayant suivi une formation initiale
Procédures
Souris: 2 prélèvements de 3 à 4 gouttes au niveau des veines mandibulaires, 2 prélèvements de 200µl au niveau des sinus rétroorbitaires, 1 prélèvement intracardiaque de 500µl Rats: 2 prélèvements de 3 à 4 gouttes au niveau des veines mandibulaires, 2 prélèvements de 500µl au niveau des veines caudales
Impact sur les animaux
Les nuisances seront liées au stress de la manipulation/contention, du gavage et de l'utilisation d'aiguilles pour les prélèvements et injections sous anesthésie générale. Les procédures seront de gravité légère mais sans réveil, les animaux étant euthanasiés en fin de formation.
Devenir
Les animaux utilisés sont des animaux provenant des élevages internes de l'établissement utilisateur génétiquement inexploitables ou des anciens reproducteurs. Ces animaux étaient destinés à être euthnasiés. Cette saisine étant une saisne de formation, aucune exploitation de données scientifiques n'est envisagée. L'ensemble des animaux utilisés seront donc euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Cette demande d’autorisation de projet a pour objectif de former les personnels appliquant des procédures expérimentales sur l'ensemble des gestes techniques les plus courants sur animal vivant et vigile. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. L'apprentissage des gestes pourra débuter par une première approche technique sur des animaux déjà euthanasiés provenant d'autres protocoles de recherche.
Réduction
L'utilisation de chaque animal sera optimisée au maximum puisque la formation pourra se terminer par un travail sur l'animal post mortem (marquage, injection sous cutanée, injection intradermique, dissection/anatomie). Les animaux utilisés seront uniquement des animaux surnuméraires ou de génotypes inexploitables provenants des élevages internes de l'animalerie ou des anciens reproducteurs.
Raffinement
L'ensemble des animaux sera hébergé en groupes déterminés 1 semaine avant le début de la formation dans des cages enrichies de frisotis de papier, coton et cabanes en plastique rouge (souris) ou en inox (rats). Exceptés l'apprentissage de la contention et du gavage, l'ensemble des gestes sera effectué sous anesthésie générale. L'ensemble des gestes sera effectué sous contrôle direct d'un formateur (1 formateur par stagiaire) après une démonstration assurée par un formateur expérimenté. L’ensemble des animaux utilisés auront été manipulés individuellement régulièrement par le personnel de l’animalerie afin de les habituer et de limiter leur stress lors de la formation . Chaque stagiaire viendra prendre son animal et l’habituera à être manipulé avant de pratiquer la contention.
Choix des espèces
Cette saisine est une saisine d'apprentissage ou de réapprentissage de gestes techniques afin de préparer les personnes aux gestes qu'elles auront à effectuer dans leurs protocoles de recherche au sein de notre établissement utilisateur. Le rat et la souris sont les 2 espèces utilisées au sein de notre établissement utilisateur et seront donc les seules concernées. L'ensemble des animaux seront des adultes, l'âge n'étant pas important dans l'apprentissage de la plupart des gestes, il s'étalera de 7/8 semaines pour les animaux génétiquement inexploitables à 8/10 mois pour les anciens reproducteurs.
Entrainement à l’exploration échographique sur le rat
- Formation professionnelle
Dix rats reproducteurs réformés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, chacun subissant jusqu'à six séances d'échographie d'une heure trente sous anesthésie, espacées de deux semaines. La veille de chaque séance, l'animal est anesthésié pour être rasé, puis dépilé à la crème le jour même, avant que l'opérateur ne manie la sonde pendant quatre-vingt-dix minutes. Ils sont ensuite tués pour servir à des mises au point de manipulations ex vivo et d'histologie. Ces soixante séances possibles ne produisent aucune donnée scientifique : elles servent à ce que trois concepteurs et deux applicateurs maîtrisent un échographe récemment acquis et testent une sonde plus silencieuse, le porteur renvoyant le bénéfice pour l'humain à "plus long terme".
Objectifs
Une partie importante de nos travaux de recherche est en relation avec la fonction cardiovasculaire et pour étendre nos moyens d’investigation dans ce domaine, notre laboratoire a acquis récemment un échographe petit animal. Avec ce projet, nous avons deux objectifs : 1 – pour devenir un expert en échographie, le concepteur doit s’entraîner régulièrement sur un rat anesthésié afin de maîtriser l'outil. 2 – lors de notre formation initiale, l’ingénieur-formateur a mieux appréhendé nos besoins et propose de tester une nouvelle sonde d’échographie qui émettra moins de bruit de fond.
Bénéfices attendus
Cette procédure permettra aux membres du laboratoire de maîtriser l’échographie cardiovasculaire. A court terme, cette technique non invasive pourra être mise en œuvre dans les nombreux protocoles expérimentaux utilisés pour nos études précliniques visant à développer des programmes de prévention des pathologies cardiovasculaires par l’activité physique et/ou la nutrition, ou pour la prévention des accidents de décompression. A plus long terme, ces connaissances pourront ensuite être transférées à l’humain dans le cadre d’études cliniques utilisant aussi l’échographie.
Procédures
Une séance d’échographie est réalisée ainsi : Chaque rat(e) sera anesthésié pour pouvoir raser les poils des zones d’intérêt la veille de l’échographie. Avant la session d’échographie qui dure 1h40, l’animal est anesthésié et maintenu au chaud grâce à un tapis chauffant. Il sera dépilé à la crème dépilatoire (durée 5 minutes environ) puis le concepteur maniera la sonde échographique pendant 1h30. Cette séance est réalisée 6 fois sur le même animal, espacée de deux semaines.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable attendu est : - le stress lié à la contention et au temps d’induction de l’anesthésie : durée 5 minutes de gravité légère.
Devenir
Ces 10 animaux sont déjà des rats réformés de 1 an qui seront mis à mort de façon réglementaire afin de s’entraîner à la mise au point de manipulations ex-vivo et d’histologie.
Remplacement
Pour maîtriser la technique d'échographie, il est nécessaire de s'entraîner sur animal anesthésié et nous ne pouvons pas nous passer de l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Nous avons pris contact avec notre SBEA pour utiliser des animaux reproducteurs-reproductrices réformés qui ne sont pas entrés en procédure expérimentale et qui sont prévus pour une mise à mort. 10 rat(e)s sont attendus sur l’année universitaire 2024-2025. Ce nombre nous permet de réitérer les gestes techniques régulièrement au maximum 6 sessions sur le même rat, espacées chacune de deux semaines. Aucune étude statistique n’est prévue car nous sommes dans le cadre d’une formation à une technique d’imagerie non invasive chez le rat. Trois concepteurs sont concernés par cette formation et deux applicateurs qui feront chacun à minima 30 sessions sur les 60 possibles.
Raffinement
Tous les actes réalisés pendant la procédure se font sous anesthésie. Les animaux sont placés sur tapis chauffant pour éviter la chute de température pendant la procédure mais aussi jusqu’au réveil des animaux concernés.
Choix des espèces
Le rat est un modèle préclinique que nous utilisons au laboratoire et sur lequel nous souhaitons maîtriser les explorations cardiovasculaires non invasives par échographie. Nous souhaitons utiliser des individus au stade adulte, matures sexuellement. Des animaux trop âgés ou trop lourds (dépassant 500g) présenteraient une taille incompatible avec la profondeur de pénétration du faisceau d’ultrasons, et ne permettraient pas d’obtenir des images cardiaques et vasculaires.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamique de produits injectés par voie intravasculaire ou extravasculaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés par voie intraveineuse, sous-cutanée, intratrachéale, intranasale, intravitréenne ou intra-articulaire, des rats passent jusqu'à dix acquisitions d'imagerie le premier jour, puis trois par jour pendant trois jours. 900 rats vont être utilisés, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger, pour caractériser la distribution de produits en vue de leur mise sur le marché. Le porteur indique que l'injection dans le coussinet du pied peut gêner la locomotion et l'accès à l'eau, et que l'injection dans l'œil peut provoquer un glaucome ou la perte de la vision de l'œil traité. 835 rats sont tués pour prélever leurs organes, 15 sont gardés en vie pour l'entraînement du personnel et 50 sont proposés à l'adoption.
Objectifs
L’autorisation de mise sur le marché d’un produit ou d’un médicament nécessite au préalable de caractériser sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique. La pharmacocinétique permet d’améliorer les dosages et la posologie du produit ou du médicament. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique après administration de produits chez le rat. Les produits impliqués dans ces projets auront déjà été testés in-vivo et aucune toxicité de ces produits n’est connu (en cas contraire, les produits devront faire l’objet d’une demande d’autorisation de projet spécifique). Le recours à l’imagerie médicale (imagerie à rayons X ou imagerie optique) dans ce projet permettra de suivre au cours du temps la distribution de produits radio-opaques, rendus fluorescents ou bioluminescents. Cette méthode d’analyse présente l’avantage d’être non-invasive, nécessitant seulement une anesthésie générale. Elle permet également de suivre un même animal au cours du temps et de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de déterminer les dosages, la posologie, la voie d’administration et les effets sur l’organisme d’un produit ou d’un médicament dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique ou répétée (selon la voie) du produit test par voie intravasculaire (intraveineuse) ou extravasculaire (sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale, pers os, intravitréenne ou intra-articulaire) en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, un effort sera fait pour ne pas excéder 5 injections maximum par animal. Sur animaux vigiles, les injections sont réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute), en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Des examens micro-scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisition par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisitions par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu'au 30e jour, puis maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°1. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu’au 30e jour, puis maximum 2 acquisitions par semaine la fin de l’étude pour la procédure n°2. Une injection de luciférine sera faite avant chaque acquisition de bioluminescence. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation des sites d’injection). Certaines voies d’administration sont plus inconfortables que d’autres et nécessitent une prise en charge analgésique pré et post injection : sous-cutanée dans le coussinet du pied qui peut gêner la locomotion de l’animal et donc l’accès à l’eau et à la nourriture et les injections intravitréennes pouvant altérer la vision (glaucome ou perte de vision de l’œil injecté). Dans tous les cas, des mesures adaptées sont mises en place.
Devenir
Les animaux dont un prélèvement d’organe est nécessaire seront euthanasiés. Il sera possible de réaliser une quantification des produits ex vivo par organe grâce à de l’imagerie optique ex vivo ou par d’autres techniques in vitro. Les rats dont les organes ne doivent pas être prélevés pourront soit être gardés en vie et réutilisés pour la formation du personnel ou bien, être proposés à l’adoption.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.
Réduction
L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution d’u produit testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisés sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué en in-vivo par exemple.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum sera respectée ou 7 jours si les animaux sont transportés par avion ou s’il y a un changement du cycle circadien ou si l’objectif est d’étudier l’activité enzymatique, la pression artérielle ou le rythme cardiaque. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la période d’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude (sauf dans certain cas si l'animal BKG est seul). En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre un contact visuel et olfactif avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire sera apporté. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et vérifier leur état général. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré régulièrement et pourra être complété par un scoring des signes cliniques généraux comportement général de l’animal, réponse à la stimulation, état de son pelage, présence d’écoulement nasaux et occulaires, difficultés respiratoires) ou en lien avec la voie d’administration pour les injections dans les coussinets (inflammation, lésion, nécrose du site d’injection, difficulté dans la locomotion et le déplacement pour atteindre l’eau et la nourriture) et intravitréenne (inflammation, lésion au site d’injection, gêne à l’oeil injecté : oeil-mi-clos, fermé ou glaucome). Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés (en fonction des connaissances des produits).
Choix des espèces
Le modèle rat a été choisi : - Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la pharmacocinétique et pharmacodynamique en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). - Pour leur gabarit permettant d’observer une taille d’articulation relativement grosse (par rapport à la souris) Des rats seront utilisés au stade jeune adulte (environ 6 à 8 semaines) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal.
Effet des inhibiteurs de DYRK1A sur la sensibilité à l’insuline dans des modèles d’obésité et de diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Le bout de la queue est coupé chaque semaine pour prélever du sang, environ vingt fois sur cinq mois, chez 208 rats. Ils vont tous être tués pour prélever les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 192 d'entre eux reçoivent trois injections par semaine pendant quatre semaines d'un inhibiteur candidat contre le diabète de type 2, et 48 subissent un test métabolique de deux heures avec cinq prises de sang supplémentaires. Le porteur retient un rat rendu obèse par un régime riche en graisse et un rat GK spontanément diabétique, qu'il présente comme proches de la maladie humaine, l'inconfort lié à l'obésité étant qualifié de léger.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par un taux de glucose élevé dans le sang du à une diminution du nombre de cellules qui sécrètent l'insuline (les cellules bêta du pancréas) et à une diminution de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles (foie, tissus adipeux et muscle). La prolifération des cellules bêta du pancréas est modulée par une enzyme et les inhibiteurs de cette enzyme se présentent comme des candidats médicament prometteurs pour le traitement du diabète. Ce projet se situe dans la continuité des travaux en cours dans notre équipe sur un nouvel inhibiteur sélectif. Nos résultats de cette première étude montrent que le traitement à l'inhibiteur entraine une augmentation de la prolifération et donc du nombre de cellules bêta et une réduction des taux de glucose sanguin chez le rat diabétique. Nous proposons à présent d'étudier les effets de cet inhibiteur sur les tissus cibles de l'insuline afin d'établir si le traitement améliore l'action de l'insuline. Nous analyserons les effets de l'inhibiteur dans deux modèles : un modèle de diabète de type 2 spontané, le rat GK (Goto-Kakizaki), caractérisé par une légère diminution de la sensibilité à l'insuline sans obésité associée, et un modèle d'obésité avec une réduction importante de la sensibilité à l'insuline induit par un régime riche en graisse (HFD, High Fat Diet). Ces différents modèles sont nécessaires en raison de leur complémentarité (diminution de la sensibilité à l'insuline, obésité ...) pour disséquer au mieux les effets de l'inhibiteur sur ces maladies métaboliques présentes chez l'humain. De plus, cette étude sera effectuée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique à l'inhibiteur peut améliorer l'action de l'insuline sur ses tissus cibles dans les deux sexes. Nous utiliserons le rat sain Wistar (mâle et femelle) comme contrôle de ces deux modèles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera d'identifier l'inhibiteur de DYRK1A comme candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée chez les patients diabétiques de type 2. Les résultats positifs de notre projet en cours sur la croissance des cellules bêta pancréatiques implémentés par cette nouvelle étude sur la résistance à l'insuline nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique "curative" plus complète, capable de limiter la progression du diabète grâce à la restauration d'une masse cellulaire bêta fonctionnelle et une amélioration de la sensibilité à l'insuline de ces tissus cibles chez le patient diabétique de type 2.
Procédures
Tous les animaux (208 rats) subiront plusieurs prélevements d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant toute la durée du projet (environ 20 prélèvements sur 5 mois). Ce prélèvement dure quelques secondes et engendre une douleur légère. 144 animaux subiront 2 prélèvements de sang pour les dosages d'insuline: - un prélèvement avant et un prélèvement à la fin du regime. Ce prélèvement dure moins d'une minute. 192 animaux subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (3 injections par semaine pendant 4 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, 48 rats subiront une injection et 5 prélevements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Contrairement aux inhibiteurs "classiques" qui provoquent bradycardie et tachycardie, la nouvelle génération d'inhibiteur utilisée dans ce projet, n'induit pas de toxicité ni de neurotoxicicté du fait qu'il ne traverse pas la barrière hématoencéphalique. Les légers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure lors de l'injection du traitement mais également à la piqure lors de l'injection du glucose et de l'insuline pendant les tests métaboliques, ainsi qu'a la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. De plus, l'obésité générée par le régime riche en graisse peut induire un léger inconfort pour les animaux. L'étude sur la signalisation de l'insuline n'entraine pas de nuisance car les prélèvements sont effectués post mortem.
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.
Remplacement
Cette étude sur la signalisation insulinique nécessite de travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in vitro, notamment sur des lignées de cellules immortalisées, ou ex vivo, sur des îlots de Langerhans isolés permettent uniquement de mettre en évidence des mécanismes spécifiques, mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements. Ainsi pour atteindre notre objectif spécifique, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable. Le choix du rat Wistar HFD et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'ils présentent de grandes similitudes dans leur physiologie et leur physiopathologie avec la maladie chez l'humain.
Réduction
La stratégie expérimentale visera à étudier l’implication de DYRK1A sur les voies de signalisation de l'insuline. Dans ce sens nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. En référence à nos études précédentes et en accord avec les tests statistiques, nous utiliserons des groupes de 8 animaux. L'impact environnemental de cette étude n'est pas source d'angoisse et de souffrance particulière.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de deux par cage pour respecter leur comportement social naturel. Les animaux diabétique auront une litière adaptée et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux. Les biberons seront renouvelés 3 fois par semaine. Les cages comprendont des batonnets de bois afin que les animaux puissent satisfaire leur besoin naturel de rongueur. Les rats seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique, le comportement et les modifications de poids selon un grille de score établie préalablement avec l'utilisation de points limites et de critères d'arrêt de souffrance adaptés.
Choix des espèces
Nous développerons notre projet en utilisant le rats Wistar et le modèle de rat Goto Kakizaki (GK). Le modèle Wistar est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité et des comorbidités associées telles que le diabète. Le modèle des rats GK est dérivé du rat Wistar et présente spontanément un diabète de type 2 au stade adulte. Les animaux non vertébrés n'ont pas de pancréas organisé comme l'humain et les rongeurs. De ce fait, le choix du rat pour cette étude réside dans les grande similitudes que cette espèces présente dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'humain. La génération de notre modèle nécessite l'utilisation de jeunes rats âgés de 6 semaines. Le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline chez ces rats nécessite au moins trois mois. De ce fait, le traitement pharmacologique ne pourra débuter que vers l'age de 4-5 mois. Les tests métaboliques et le test de signalisation insulinique seront effectués après 4 semaines de traitement pharmacologique, et donc les rats seront âgés entre 5 et 6 mois.