Rats

1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun voyant ses pattes arrière immobilisées par un adhésif seize heures par jour, de la naissance au vingt-huitième jour. Les ratons sont séparés de leur mère cinq heures au douzième jour, certains sont ensuite soumis à une course forcée sur tapis roulant trente minutes par séance, trois jours par semaine pendant quatre semaines, d'autres à des vibrations du corps entier quinze jours de suite. Une injection de marqueur dans le muscle après ouverture de la peau, une étude électrophysiologique d'une heure trente et un prélèvement de sang par section du bout de la queue complètent le protocole, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur annonce des contremesures qui permettraient aux enfants alités ou atteints d'un trouble de la coordination un développement harmonieux, quand ce qui est acquis ici est l'immobilisation quotidienne de rats nouveau-nés.

Objectifs

Les premières années de la vie sont déterminantes pour le développement de l’enfant et de la santé de l’adulte qu’il deviendra, et elles programment sa santé future (cf. concept des « 1000 premiers jours » lancé par l’Unicef). La jeune enfance est donc une période critique du développement au cours de laquelle les individus vont développer les compétences motrices et cognitives essentielles pour leur existence. Or, certains enfants sont contraints à l’hypoactivité parce qu’ils sont alités (maladie, accident, paralysie cérébrale…). D’autres, qui souffrent d’un trouble développemental de la coordination, présentent des atypies sensorimotrices. L’hypoactivité ou les troubles moteurs précoces sont à l'origine d'un développement anormal et durable de l'organisation et des fonctions du système nerveux. Ils conduisent à des troubles cognitifs et à un risque accru d’émergence de maladies civilisationnelles à l’âge adulte (diabète, hypertension...). Les objectifs de ce projet sont 1/ de fournir des preuves d'une altération du dialogue muscle-cerveau dans les déficits neurodéveloppementaux induits par l'hypoactivité et 2/ dans une perspective translationnelle, de développer des stratégies innovantes pour restaurer un dialogue efficace et robuste entre le muscle et le cerveau afin de contrecarrer les déficits. L’étude sera réalisée sur un total de 1760 rats dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après les interventions. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des procédures éthiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension des effets de l’hypoactivité au cours du développement (enfance) et de proposer des contremesures efficaces pour permettre un développement sensorimoteur et cognitif harmonieux.

Procédures

- La procédure de restriction sensorimotrice consiste à immobiliser les pattes postérieures pendant 16h chaque jour, de la naissance à P28. La pose de l'adhésif chaque soir dure env 1 min et le retrait chaque matin 1-2 min. - Prise alimentaire : les ratons sont isolés de la mère pendant une durée de 5 heures le 12e jour postnatal. - L'analyse IRM est réalisée une seule fois et dure env. 1 heure, depuis l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie finale. - Les animaux du groupe "exercice" seront entrainés à marcher sur la tapis 10 minutes / jour, 5 jours consécutifs, puis seront soumis à une course sur tapis roulant pendant 30 min, 3 jours /semaine, 4 semaines consécutives. - Vibration corps entier : pendant 15 jours consécutifs, avec un maximum de 15 min / jour. - Avant l’euthanasie, une goutte de sang sera recueillie par section de la pointe de la queue pour mesures de paramètres sanguins au moyen de bandelettes. Cette procédure très rapide ne génère pas plus de douleur pour l’animal que, pour les personnes diabétiques, le fait de se piquer le bout du doigt pour obtenir une goutte de sang. En outre, une pommade anesthésique sera appliquée préalablement. - Injection de marqueur rétrograde dans le muscle : cette procédure, réalisée sous anesthésie, nécessite d'ouvrir la peau pour injecter une petite quantité de marqueur dans le muscle au moyen d'une aiguille très fine. L’animal recevra une injection d’analgésique. La durée totale de l’intervention n’excèdera pas 30 min. - Une étude électrophysiologique (réflexe H) et mécanique (propriétés contractiles) : le niveau d’anesthésie sera vérifié tout au long de la procédure, en veillant toujours à ce que l'animal ne présente aucun signe d'inconfort. La durée totale de l’ensemble de cette procédure est de l’ordre de 1h30. À la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et différents tissus seront alors prélevés. - tests comportementaux : réalisés chaque semaine pendant 2 mois. Ils sont répartis sur 5 jours consécutifs, l'ensemble des tests réalisés les 3 premiers jours n'excède pas 30 minutes / jour. Le 4e jour, le test de fatigue dure jusqu'à ce que l'animal refuse de courir. La durée est de l'ordre de 30 min à 1h. Le 5e jour, le test dure toute la nuit mais l'animal est laissé dans sa cage d'hébergement.

Impact sur les animaux

Pour les animaux du groupe RSM (soumis à une restriction sensorimotrice), la peau des pattes postérieures peut se trouver sensibilisée par l’application quotidienne d’adhésif médical. En outre, l’immobilisation peut induire des contractures musculaires. Lors du retrait du système d’immobilisation chaque matin, la peau est soigneusement inspectée et les mouvements de flexion et extension des pattes postérieures sont réalisés délicatement. L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant peut générer un stress et de possibles douleurs musculaires. Les animaux seront habitués à la course sur tapis roulant à faible vitesse pendant au minimum trois séances préalablement à l’exercice proprement dit. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.

Devenir

Les animaux des différents groupes expérimentaux seront mis à mort afin de prélever des tissus.

Remplacement

L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. La plupart des interventions sont non invasives et peuvent être réalisées sur les mêmes animaux. Toutefois, lors de l’euthanasie, deux types de perfusion différentes seront nécessaires pour prélever les tissus, ce qui oblige à prévoir deux lots d’animaux. En outre, pour éviter un effet éventuel de la portée (dû par exemple au comportement maternel), il faut diversifier les portées d’origine au sein d’un même groupe (par exemple, 10 animaux seront obligatoirement issus de 5 portées différentes au minimum).

Raffinement

Les rats seront hébergés en cage collective dans des condition de température et d’hydrométrie contrôlée avec une alimentation et un apport en eau à volonté. Ils bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. Les expérimentations et les prélèvements seront effectués dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d'hébergement. Des anesthésiques et antalgiques adaptés au protocole seront utilisés. Des points limites adaptés seront appliqués. Les animaux présentant au minimum un point limite seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les rats seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 3 mois, ce qui permettra d'étudier les conséquences chez le jeune adulte d'une restriction sensorimotrice subie au cours de l'enfance.

Tués parce que le retrait de la canule implantée dans leur crâne provoquerait des lésions incompatibles avec une vie dans de bonnes conditions, 1 000 rats et 500 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de une heure à une heure trente pour l'implantation de canules en profondeur, puis six à sept heures relié par des câbles à une seringue et à un collecteur, dans un espace restreint, séance qui peut être répétée une seconde fois à deux ou trois jours d'intervalle. Des candidats médicaments leur sont administrés en bolus, en une fois ou chaque jour pendant une semaine, pour mesurer leur effet sur des neurotransmetteurs. Le porteur indique que les modèles alternatifs développés au laboratoire ne mesurent que certaines molécules sécrétées par des cultures de neurones, et que le choix entre rat et souris dépend aussi de la quantité de molécule disponible.

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines maladies psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser des substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ou l’espérance de vie des patients atteints de maladies psychiatriques ou neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le rongeur.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. La phase de collecte des échantillons est en général de l'ordre de 6 à 7 h (animal connecté en permanence pour la collecte de dialysat) et peut être répétée maximum 2 fois à intervalles de 2 à 3 jours. Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique (une administration par jour sur une durée de 7 jours maximum).

Impact sur les animaux

La phase d'anesthésie peut induire un léger stress. Des douleurs peuvent être liées à l'implantation du ou des guides canules au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Il n'est pas attendu d'effets néfastes suite à l'administration d'un candidat médicament. Pendant le test, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène, sur plusieurs heures dans un espace restreint. Les cables sont légers mais limitent le déplacement de l'animal pendant toute la durée du test ce qui peut générer un stress chez l'animal.

Devenir

Les rongeurs seront mis à mort à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisés, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait du guide canule implanté pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux. Les tests qui seront appliqués ne sont pas encore complétement définis car la technique d'analyse des dialysats est toujours en cours de développement (bien que la partie in vivo chez le rongeur soit mise en place). Des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des essais ont été réalisés pour tester le même animal à deux reprises et limiter le nombre d'animaux utilisés. Cependant, les animaux ne pourront pas être utilisés plus de deux fois pour garantir une diffusion homogène des molécules entre deux tests. Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour la phase chirugicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une solution analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Les animaux sont maintenus en 2 par 2 pendant toute la durée de l'étude (excepté la phase de test), avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalables réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Les voies métaboliques peuvent également être différentes entre les espèces, les spécificités de chaque candidat médicament peuvent amener à choisir une espèce plutôt que l'autre. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

Opérés du fémur pendant une trentaine de minutes pour qu'un trou soit percé dans le condyle puis comblé par un matériau à tester, 20 rats passent ensuite au scanner sous anesthésie à trois, quinze, trente et soixante jours, dans un établissement différent de celui de la chirurgie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que l'opération provoque de la douleur et des difficultés à se déplacer pendant les premiers jours, avec un risque de rupture des sutures, et que les anesthésies répétées causent des désagréments. Au soixantième jour, tous sont tués pour que l'os régénéré et ses vaisseaux soient prélevés et analysés.

Objectifs

Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).

Impact sur les animaux

Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.

Devenir

Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

Une chirurgie de vingt minutes pour injecter un composé entre les méninges, puis jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures : 3 480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, presque tous tués à l'issue pour prélever sang, liquide céphalorachidien et organes. L'objet réel est d'évaluer où se distribuent des nanoparticules lipidiques et des exosomes chargés de candidats médicaments neurologiques, dans le cadre de la recherche pharmaceutique. Seuls 174 rats, ceux qui n'auront finalement reçu aucun produit, pourront être réutilisés dans un autre projet. Le porteur retient le rat parce que la voie intrathécale employée en clinique humaine y est praticable et parce que les études réglementaires ultérieures utilisent la même espèce, et affirme qu'un modèle animal reste "nécessaire" pour juger l'interaction avec l'"organisme entier".

Objectifs

Il existe de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. Une proportion très importante de ces pathologies atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, souvent rares, sont très invalidantes voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En 2021, près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. L’objectif principal de la R&D Pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies neurologiques. Il est nécessaire que les candidats médicaments atteignent les cellules du système nerveux en passant la barrière hématoencéphalique Ce passage étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par injection dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. De nouvelles formulations utilisant des nanoparticules lipidiques (LNP) ou des exosomes (vésicules protéiques naturellement excrétées par les cellules qui constituent une voie de communication intercellulaire) ont été développées pour améliorer la biodistribution dans les structures cérébrales, l’activité et/ou la tolérabilité de ces candidats médicaments. A terme, il pourrait même être possible d’administrer les candidats médicaments dans ces formulations par d’autres voies d’administration (intraveineuse ou intranasale), moins contraignantes que la voie IT utilisée en clinique pour l’administration de candidats médicaments seuls. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution de différents LNP et exosomes dans un premier temps seuls, puis chargés avec le candidat médicament, après administration intrathécale, intraveineuse ou intranasale chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Après sélection par screening in vitro des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, l’utilisation du rat est nécessaire afin d’évaluer la distribution, l’activité et la tolérabilité du candidat médicament dans la formulation sur un organisme complet et des structures cérébrales plus faciles à discerner

Bénéfices attendus

Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies neurologiques et notamment neurodégénératives sont administrés par voie intrathécale, permettant de s’affranchir du passage de la barrière hémato-encéphalique et ainsi permettre l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient notamment dans le cadre d’administrations répétées Le bénéfice apporté par ce projet est ainsi d’optimiser les formulations de ces candidats médicaments pour améliorer leur activité, leur distribution et de diminuer leur toxicité. Le fait de charger ces candidats médicaments dans des nanoparticules lipidiques ou des exosomes peut aussi permettre de protéger la molécule de la dégradation (permettant de réduire le nombre d’administrations et donc la contrainte à la fois pour l’animal mais aussi pour l’Homme) et d’évaluer l’utilisation de voies d’administration autres que la voie intrathécale (moins de contraintes pour l’animal et pour l’Homme dans les études ultérieures).

Procédures

- A l’administration (unique) sur tous les animaux de composés par voie parentérale nécessitant une contention courte ou le passage préalable dans une enceinte thermorégulée ou par abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique ; - A l’administration sous cutanée d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum dans l’étude - A un prélèvement unique de sang réalisés sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale (unique dans l’étude) : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (Degré de sévérité modéré) • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection (moins de 10sec) de la douleur (degré de sévérité modéré) • Administrations des formulations ou d’analgésique par voie intranasale intrapéritonéale, intramusculaire, ou sous-cutanée : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. (Degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modéré) - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalorachidien pour analyse et d’organes pour lecture de distribution ou d’activité. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple -ou s’il s’agissait d’animaux finalement non inclus.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer de nouvelles formulations innovantes pour l’administration de composés à visée neurologique. Si les modèles in vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont de plus en plus prometteurs, ils restent incomplets pour juger de la distribution, de l’activité et de la tolérabilité des candidats médicaments ainsi que de l’interaction avec l’organisme entier, le système immunitaire ainsi qu’avec les éléments figurés du sang. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les formulations à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.

Réduction

Une sélection des formulations les plus prometteuses est réalisée à l’aide de screening vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 5 individus/groupe selon la procédure) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Ces études permettent d’évaluer l’activité et la distribution du candidat médicament dans ces formulations et ainsi d’affiner le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Selon la procédure, un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte 40µL minimum) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volume sanguin (volémie) physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Selon la clinique observée, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’injection par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont manipulés et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’isolement), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision, une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse).

Choix des espèces

L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle - La voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des formulations et des futures candidats médicaments sont plus faciles à étudier chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Des molécules fournies par des clients, dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles, sont testées ici sur un modèle de règles douloureuses. 500 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des hormones pendant dix jours et jusqu'à vingt administrations de composés, puis une injection d'ocytocine qui provoque des crampes abdominales, avant d'être placés seuls en cage pendant une heure pour que ces crampes soient comptées. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les dix animaux par groupe et s'en remet à son expérience du modèle.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des rongeurs dans un modèle de dysménorrhée primaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysménorrhée.

Procédures

Les animaux vont avoir des administrations d’hormones et de candidats médicaments pendant 10 jours maximum. Ces gestes sont très rapides (moins d’une minute, 10 administrations pour les hormones et jusqu’à 20 administrations pour les composés médicaments) et seront réalisés par du personnel qualifié pour diminuer le stress des animaux. Une administration d’ocytocine (30 sec, 1 fois) provoquera des crampes abdominales et les animaux seront observés dans des cages individuelles pendant 1 heure pour compter ces dernières et observer le comportement de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, les animaux vont ressentir les mêmes symptômes que la pathologie induite à savoir des crampes abdominales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et des tissus seront prélevés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des dysménorrhées. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe au début de l’expérimentation mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et dans ce modèle, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. A la fin de l’expérience, des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure…Pour les procédures sous anesthésie, l’animal sera placé sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un symptôme d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez le rat et la souris. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Des administrations répétées, jusqu'à deux par jour pendant quatre semaines, précèdent des tests de douleur sur 3 600 souris et 2 400 rats. Ces 6 000 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 5 500 sont tués et 500 pourront être réutilisés dans d'autres projets s'ils n'ont reçu que les traitements contrôles. Les voies d'administration vont de l'orale à l'intradermique, et chaque animal est isolé de ses congénères jusqu'à soixante minutes pour les phases de test, d'habituation ou de récupération. Le porteur annonce des modèles comportementaux censés reproduire chez le rongeur le symptôme de la douleur humaine, et des tests provoquant des douleurs de moins de trente secondes, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

La douleur est une expérience complexe, sensorielle et émotionnelle, aigue ou chronique, mettant en jeu des récepteurs et nerfs présents dans tout l’organisme ainsi que des régions cérébrale spécifiques. Indépendamment de la cause, la douleur doit être prise en charge afin de soulager le patient avec des traitements qui reposent essentiellement sur les médicaments antalgiques (3 niveaux en fonction de l’intensité de la douleur incluant le paracétamol, la codéine, la morphine). D’autres substances peuvent aussi être utilisées telles que les anesthésiques locaux, des antispasmodiques, des antidépresseurs ou encore des relaxants musculaires. Mais ces traitements symptomatiques peuvent entrainer des effets indésirables selon les substances utilisées : nausées, somnolence, dépendance… Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouvelles entités pharmacologiques synthétisées ou acquises au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le symptôme la douleur chez l’homme. Ce projet implique l’obtention de données comportementales chez l'animal nécessaires pour envisager la poursuite du développement de produits pharmacologiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l'animal l’efficacité potentielle de nouvelles entités pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules à moduler les symptômes de la douleur chez le rongeur, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique choisie. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l'Homme.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, intra-veineuse, intra-musculaire, sous-cutanée ou intra dermique ) , la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas pas plus de 2 administrations/jour) ainsi que la durée (période maximale de 4 semaines) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés/inducteurs avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (

Devenir

Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles de la procédure 1, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le symptôme de la douleur dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, la souris et le rat étant ici les espèces les plus adaptées.

Réduction

Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…) ou isolés de leurs congénères pour les tests lors de périodes les plus courtes possibles (moins de 60 min) selon les besoins de la procédure. Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).

Choix des espèces

Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur la douleur. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de douleur décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.  

13 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue au motif qu'une exposition à la toxine les rendrait inutilisables ailleurs. Chacun reçoit la mycotoxine Enniatine B1 une fois par gavage et une à deux fois par voie intraveineuse, puis subit quatorze prélèvements sanguins à l'état vigile, répartis sur deux journées séparées par une période de récupération. Les rats arrivent déjà cathétérisés par le fournisseur, ce que le porteur compte au titre du raffinement, et leurs concentrations plasmatiques doivent alimenter un modèle mathématique censé prédire l'exposition humaine à cette toxine des céréales. Le porteur annonce vouloir "établir pour cette toxine des méthodes alternatives à l'expérimentation animale", et écrit dans le même document que l'étude chez le rat reste "indispensable" pour extrapoler des cellules à un "organisme entier".

Objectifs

L’Enniatine B1 est une mycotoxine émergente secrétée par les microchampignons du genre Fusarium. La toxicité potentielle a été étudiée mais il n’a pas été reporté de cas d’intoxication humaine cependant, du fait de son activité ionophorique, elle interagit avec plusieurs composants cellulaires avec des effets notamment au niveau du foie, estomac, intestin et reins, en cas d'exposition chronique. Elle fait partie des enniatines les plus prévalentes dans les céréales et les produits céréaliers. Ainsi, cette prévalence implique une exposition, aussi bien des humains que des animaux se nourrissant de céréales, de manière quotidienne à de faible doses. Par ailleurs, le manque de données sur la toxicologie de l’Enniatine B1 entraine l'impossibilité de fixer des seuils de sécurité pour la santé. Le projet vise à combler certaines lacunes sur ces données et à établir pour cette toxine des méthodes alternatives à l'expérimentation animale. Il s’articule autour de plusieurs axes, tout d’abord des expérimentations sur des cellules hépatiques humaines et de rats, dans le but d’étudier le devenir de la toxine. La seconde étape consiste en l’extrapolation par modélisation mathématique pour passer de l’échelle cellulaire à l’animal. Les données de cette extrapolation requièrent une validation par une étude des concentrations sanguines de l’Enniatine B1 chez le rat, sachant qu’on ne peut envisager des études chez l’humain dans un contexte toxicologique. Les données sanguines chez le rat serviront au développement d’un modèle mathématique qui reflète le fonctionnement de l’organisme chez le rat. La comparaison des concentrations toxiques pour les cellules hépatiques et les concentrations sanguines prédites par le modèle mathématique permettra de déterminer les seuils toxiques pour l’humain.

Bénéfices attendus

Le projet vise à combler les lacunes sur le devenir et la toxicité de l’Enniatine B1 pour le foie. Les données serviront au développement d’un modèle mathématique validé par l'étude chez le rat pour comparaison avec les études sur cellules. Ce modèle servira d’outil de prédiction de l’exposition humaine par estimation des concentrations plasmatiques et permettra de simuler des scenarios d’exposition. Les concentrations plasmatiques prédites par le modèle, comparées aux concentrations toxiques pour le foie permettront de déterminer le risque pour la santé humaine à long terme.

Procédures

Chaque rat, recevra l’Enniatine B1 une fois par voie orale et une ou deux fois par voie intraveineuse. Le gavage réalisé une fois pour chaque rat dure moins de 2 minutes. L’injection en intra veineuse se fait en 15 secondes. Chaque rat à l’état vigile subira au total 14 prélèvements de 0.1 mL de sang et durant moins de 30 s. Les échéances pour chaque rat seront réparties sur 2 jours séparés par une période de récupération comme suit : - 7 prélèvements à 0 min (avant l’injection), 10 min, 20 min, 45 min, 2h, 6h et 24h ou bien 5 min, 15 min, 30 min, 1h, 4h, 8h et 24h après injection intraveineuse. - 7 prélèvements à 0 h (avant gavage), 1h, 4h, 7h, 9h, 11 h et 24h ou bien 15 min, 2h, 6h, 8h, 10h, 12h et 24h après administration par voie orale. A noter que l’injection intraveineuse et les prélèvements ne sont pas invasifs, car effectués via un cathéter préalablement installé par notre fournisseur agrée avant l'arrivée des animaux au sein de nos locaux. Un contrôle quotidien préventif est toutefois nécessaire pour s'assurer de la pérénité des cathéters.

Impact sur les animaux

Le cathéter posé pour réduire la douleur et l’inconfort des prélèvements peut être sujet à une infection ou une inflammation induisant une douleur ou une souffrance chez le rat. Par ailleurs, le gavage qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté, afin de s’assurer de la sécurité des animaux et de réduire l’inconfort lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet, seront mis à mort après le dernier prélèvement de la dernière séquence de chacune des procédures (pilote et principale). Ayant été exposés à une toxine, les rats pourraient développer une toxicité retardée ou des effets pouvant changer le fonctionnement de leur organisme, notamment au niveau du foie ou la toxine est métabolisée. De ce fait, ils ne peuvent être réutilisés dans d'autres projets.

Remplacement

Cette étude est indispensable pour valider les résultats des expérimentations de la cinétique de l'Enniatine B1 obtenus sur des modèles cellulaires. Les études sur des cellules isolées ne reflètent pas le fonctionnement d’un organe ou d’un organisme entier, qui ne peut s’apprécier que par des études chez l’animal. Ces études restent indispensables pour pouvoir extrapoler les données sur cellules à un organisme entier. Les méthodes alternatives comme les expérimentations in vitro ou la modélisation permettent de réduire le recours à l’expérimentation animale ou le nombre d’animaux utilisés mais aucun modèle expérimental ne permet dans l’état actuel d’avancement de la science de s’affranchir complètement des études sur animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux par procédure, un design expérimental spécifique sera appliqué, permettant d’utiliser les mêmes animaux pour deux administrations avec une période de récupération suffisante à l’excrétion totale de l’Enniatine B1 avant la seconde administration. Ce design permet de couvrir un nombre suffisant de prélèvements sanguins, tout en respectant le volume sanguin maximal à prélever par rat. De plus, en réutilisant les rats dans une seconde séquence, le nombre d’animaux par temps de prélèvement garantira des données pouvant être exploitées dans un modèle mathématiques avec ses variations (grâce à l'augmentation du nombre d'animaux par temps de prélèvement en réutilisant les animaux dans une seconde séquence).

Raffinement

Dans le respect des normes du bien-être animal, les rats seront hébergés dans des cages en polypropylène, aux bonnes dimensions, sur litière. Les rats seront au minimum deux par cages. Par ailleurs, les cages seront équipées d’enrichissements comme : briquettes, balles, billes…etc, et seront en étroite proximité pour favoriser le contact visuel et sonore entre les rats des autres cages. De même, les cages à métabolisme seront également équipées d’enrichissements comme les balles. Le design expérimental est conçu pour réduire autant que possible l’inconfort des animaux en limitant au strict nécessaire leur manipulation. Ainsi, l’utilisation d’animaux cathétérisés, permet de réduire l’inconfort et la douleur lors des prélèvements sanguins et de faciliter l’administration par voie intraveineuse. De plus, Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avec une solution de chlorhexidine avant fermeture, et surveillés régulièrement pour détecter d’éventuels signes d’infection. L’expérimentation sera effectuée par des opérateurs formés, maitrisant les gestes de contention afin de limiter l’inconfort et la souffrance des rats. De même, la surveillance des signes limites déterminés au préalable permet d'intervenir rapidement sur les animaux. Des méthodes et des médications appropriées sont prévues pour réduire le stress, l’inconfort ou la douleur. L’administration d’analgésiques (Anti-Inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou bien des dérivés morphiniques) est prévue si nécessaire.

Choix des espèces

Les rats ont été choisis pour l’expérimentation animale car le laboratoire dispose déjà de données sur des cellules isolées de foie de rats Sprague-Dawley. Les rats utilisés pour cette étude sont au stade de développement entre 6-8 semaines, pour permettre la pose chirurgicale des cathéters. Ce choix est également justifié par le fait de réduire la quantité de toxine (Enniatine B1) utilisée, et pour répondre aux besoins en terme de prélèvements sanguins.

Trois cents rats sont réutilisés pour entraîner du personnel à des gestes techniques, les autres tués dès la fin de la phase expérimentale parce que les composés testés ont pu modifier leurs structures et leur immunité. 2 750 rats juvéniles à adolescents vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des candidats médicaments contre la douleur. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter intrathécal ou intraveineux, jusqu'à six stimulations mécaniques ou thermiques par jour répétées sur plusieurs jours, des administrations par une dizaine de voies différentes, des prélèvements sanguins et jusqu'à vingt-quatre heures de mise à jeun. Le porteur affirme que la douleur, "expérience sensorielle et émotionnelle", ne peut pas être étudiée in vitro et que l'évaluation chez l'animal vigile "reste la seule option" avant le passage chez l'être humain.

Objectifs

La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. D’une part, le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur et tests comportementaux et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). D’autre part, certains tests visent à évaluer les effets secondaires de composés pharmacologiques issus de différentes classes. En effet, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». De plus, les Gabapentinoides provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. C’est pourquoi il est nécessaire de développer de nouvelles molécules antalgiques de référence tout en limitant les effets secondaires. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de composés administrés en perfusion ou de manière répétée. Ces tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour l’implantation de cathéters. Lors des tests ils pourront être exposés à une stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux seront également soumis à la contention ou isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. Les animaux seront soumis à un anesthésiant gazeux durant quelques minutes pour l'implantation du cathéter qui nécessite une micro-chirurgie (10minutes). De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’un stimulus douloureux ou non (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (légère < 1 min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 4h maximum). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle :, nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Le port d'un adaptateur au système de de perfusion dans la nuque peut etre une nuisance légère (légère gène,) Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Certains animaux subiront les nuisances liées à la mise à jeun (modérée maximum 24h). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie. La nuisance liée aux perfusions est l’anesthésie gazeuse qui peut-être répétée.

Devenir

Le test de composé pharmacologique en développement ne permet pas la réutilisation des animaux pour tester de nouveaux composés car un impact des composés pharmacologique sur les structures, l’immunité, etc… n’est pas exclu. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité. Néanmoins, dans le cas des procédures n'impliquant pas la mise à mort immédiate des animaux, les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Ces tests sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place au laboratoire.Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclus ou limités à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse si certains groupes contrôles ne sont pas nécessaires. En fonction du design de chaque étude de tests statistiques appropriés seront effectués.

Raffinement

Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de certains tests, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (c’est-à-dire la réponse à un stimulus non douloureux chez l’animal sain). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection sous cutanée de solution hydratante en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. La pose d’un système de perfusion est un raffinement en soi car il permet d’éviter les injections répétées en intraveineux et réduit les temps d’anesthésie pour injection.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents (4-7semaines). Ce stade a été choisi car ilpermet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.