Rats
Traitement de l’inflammation par Plasma enrichi en plaquettes (PRP) en cas de discopathie dégénérative mécanique sur modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une injection de collagénase dans un disque de la queue, sous anesthésie, en vingt minutes, provoque chez chaque rat une discopathie mécanique. Sept jours plus tard un millilitre de sang est prélevé, le plasma enrichi en plaquettes en est extrait puis réinjecté le même jour dans le disque abîmé, et une pompe est implantée sous la peau pour délivrer un analgésique en continu. Suivent douze semaines d'examens IRM de deux heures, à raison d'un par semaine, sur 12 rats utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. D'après le porteur, la discopathie provoque une douleur intense et longue si elle n'est pas soignée, avec enflure de la queue, prostration et pilo-érection, les rats étant tués dès l'atteinte d'un point limite ou au terme des douze semaines, pour prélever leurs queues.
Objectifs
Chez l’homme, les discopathies entrainant des lombalgies sont très fréquentes, estimées entre 15 et 50% dans la population générale. Caractérisée par une atteinte multifocale du complexe disque-vertèbre au niveau du squelette, la maladie se manifeste habituellement après 50 ans. Le retard diagnostique s’explique donc essentiellement par des plaintes cliniques aspécifiques évoluant par crise chez des patients. La prise en charge est généralement symptomatique par repos, kinésithérapie voire infiltration rachidienne de dérivés cortisonés. Dans une précédente étude, nous avons développé une méthode IRM permettant la détection des différentes zones de la vertèbre chez le rat sain et pathologique. Désormais, nous souhaitons traiter l’inflammation discale, évènement précoce de la maladie, chez le rat par du plasma enrichi en plaquettes (PRP). L’IRM permettra d’évaluer l’efficacité de l’injection de PRP sur la régénération discale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront de deux ordres : 1) si l’injection de PRP permet une régénération discale chez le rat, ceci pourra être facilement transféré en clinique pour aider au traitement des discopathies humaines. 2) l’IRM est une méthode d’imagerie non-invasive qui devrait permettre d’évaluer l’efficacité thérapeutique du PRP sans biopsie et à des temps précoces.
Procédures
Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque rat de ce projet subira une discopathie mécanique dans 1 disque de la queue grâce à une injection de collagénase. Cette chirurgie dure en moyenne 20min. Sept jours plus tard, 1mL sang sera prélevé en quelques secondes pour extraire le plasma contenant les plaquettes sanguines, qui sera injecté dans le disque pathologique la même journée (étape durant environ 10 minutes). Puis, une pompe sera implantée en sous-cutané pour libérer un analgésique en continu (procédure de 10 minutes environ). Finalement, des examens IRM de 2 heures seront réalisés 1 fois par semaine pendant 12 semaines.
Impact sur les animaux
La discopathie mécanique entraine une douleur intense et longue si elle n’est pas soignée, comme c’est le cas chez l’humain. Ainsi les nuisances peuvent inclure une enflure de la queue, une perte de poids temporaire, une prostration, une pilo-érection.
Devenir
Les animaux seront mis-à-mort lorsque les points limites seront atteints ou lorsqu'ils auront subi les 12 semaines de suivi IRM. Cette euthanasie est nécessaire pour prélever les queues et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence de sites inflammatoires, valider la régénération du complexe disco-vertébral et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.
Remplacement
Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons traiter une inflammation discale. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent un système immunitaire complet.
Réduction
Notre étude précédente a permis de suivre par IRM l’inflammation discale sans traitement par plaquettes sanguines. Nous souhaitons donc désormais utiliser principalement des rats traités avec des plaquettes sanguines, comme ceci est déjé réalisé chez l'humain. Nous analyserons la différence de vitesse de réparation du disque entre les 2 groupes. Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les 12 rats seront répartis dans 6 cages avec des tubes en carton, de la litière, de la paille, du coton, un bois à ronger, de la nourriture et de l’eau à volonté. Des observations quotidiennes et des scorages d’évaluation de la douleur hebdomadaires seront pratiqués dès le début de l’expérimentation pour évaluer l’évolution de la maladie. De ce fait, des points limites ont pu être établis. La cellule bien-être du laboratoire sera impliquée quotidiennement dans l’évolution du protocole. L’analgésie sera appliquée dès le début de l’expérimentation sur l’animal, et sera administrée tout au long des 12 semaines d’observations IRM.
Choix des espèces
Les rats seront utilisés du fait de leur utilisation courante dans la littérature pour ce modèle pathologique. De plus, nous avons réalisé une première étude sur cette espèce, qui nous servira dans les analyses en fin de projet. Comme nous souhaitons transférer les séquences IRM 3D nouvellement développées à l’homme, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g pour les rats) car la croissance est terminée et le prélèvement veineux de 1 mL possible.
Modèles rongeurs de fragilisation de la barrière intestinale et de translocation bactérienne appliqués à l’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles de défaillance hépatique chroniques (ACLF)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 3850
Barrière intestinale fragilisée par des agents chimiques, absorptions chroniques ou massives d'alcool, fonction du foie altérée: 4 150 souris et 3 850 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 5 900 d'entre eux en gravité sévère. Les animaux peuvent présenter des diarrhées parfois hémorragiques, une perte de poids, un état de choc et une détresse cardio-respiratoire avec des troubles de la régulation de leur température. Le porteur décrit des gestes "peu invasifs ou traumatisants" et affirme écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important, tout en indiquant que dans les études de survie la mort constitue le point final expérimental et qu'aucun point limite anticipé ne pourra alors s'appliquer. Il ajoute que les moyens de lutte contre la douleur peuvent introduire un biais expérimental, et vise une gravité "sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique".
Objectifs
Notre laboratoire est engagé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la décompensation aigue de la cirrhose hépatique et dans le développement de solutions thérapeutiques visant à protéger les patients qui la subissent. La cirrhose du foie est le stade terminal courant des maladies chroniques du foie provenant de différentes étiologies. L’aggravation de la maladie hépatique déclenche une cascade d’événements avec une prolifération bactérienne intestinale et une dysbiose comme événements centraux. Les toxines bactériennes peuvent directement provoquer la mort des hépatocytes, tandis que la dysbiose affecte également la fonction de barrière intestinale et augmente la translocation bactérienne, ce qui entraîne des épisodes inflammatoires, des infections systémiques, une vasodilatation et contribue à une décompensation aiguë accompagnée de défaillances de plusieurs organes. Les patients qui montrent des signes similairesou qui sont atteints de ces symptômes présentent une inflammation systémique élevée, qui est principalement précipitée par une infection bactérienne avérée et/ou une hépatite alcoolique sévère. Au cours de l’évolution de la cirrhose, les modifications du microbiote (dysbiose) sont aggravées par des modifications de la motilité intestinale, de la perméabilité, de la fonction de barrière envers le compartiment lymphatique et sanguin, de l'hypertension portale et du système immunitaire. Le rôle du microbiote semble crucial chez les patients atteints de cirrhose décompensée, car de nombreux événements déclencheurs sont liés aux microbes ou à leur interaction avec l’hôte. Ce projet de recherche sur cette maladie hépatique met l’accent sur les mécanismes associés au microbiote qui sont impliqués, de manière à pouvoir les cibler ou pour identifier des paramètres permettant d’évaluer les propriétés de composés en développement. Nous mettrons en place des modèles expérimentaux conçus pour fragiliser la barrière intestinale et induire une translocation bactérienne, ces modèles induits par des actions directes d’agents chimiques ou par des absorptions chroniques ou massives d’alcool pourront également être combinés à des modèles pathologiques où la fonction hépatique est altérée de manière à reproduire les caractéristiques de la pathologie.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique et par voie de conséquence d'autres organes, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second évènement aigu. Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent aussi à agir sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, et immunité). L’action régulatrice de composés sur la translocation bactérienne par une action directe sur la barrière ou indirecte sur le microbiote pourrait avoir un impact important sur la réduction des effets déclencheurs de la défaillance aigue du fonctionnement du foie.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales qui constituent ce projet conduit sur des rats ou des souris, nous serons amenés à effectuer des gestes peu invasifs ou traumatisants, il s’agit d’administrer aux animaux par des moyens classiques d’injection des agents qui vont conduire à l’apparition de la pathologie souhaitée ou à contrario des produits destinés à en limiter ou réduire les symptômes. Ces administrations seront dans certains cas répétées de manière quotidienne sur des périodes courtes (une semaine) , ou de manière bi-hebdomadaire au cours de période plus longues ( 10 semaines max) Dans les cas ou une immobilisation est plus confortable, pour l’opérateur et pour l’animal, et de manière systématique pour les prélèvements, une légère anesthésie de quelques minutes (3min) sera pratiquée par exposition des voies respiratoires à un agent anesthésiant.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet dont la finalité est le développement de modèles permettant de mener des évaluations de propriétés thérapeutiques de composés dans le traitement des patients dans un état ACLF dont la survie est engagée. La relation entre le foie et l’intestin joue un rôle primordial lors des phases qui précèdent le déclenchement de l’ACLF, l’altération de la fonction barrière et la translocation bactérienne sont des éléments que nous avons considérés et que nous devons reproduire dans nos modèles. Les modèles développés chez les rongeurs pourront présenter des troubles de la fonction digestive, associés à des diarrhées parfois hémorragiques et une perte de poids. Au cours de l’épisode ACLF, nous pourrons observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé lorsqu’il sera possible de les appliquer par exemple lors de la mise à mort à un temps fixe précoce prédéterminé. En revanche, dans les situations d’études de survie où la mort est le point final expérimental, il ne pourra pas y avoir recours à des points limites anticipés. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide du test statistique de Welsh qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Les administrations par voie veineuse de manière répétées peuvent présenter des difficultés techniques qui obligent parfois à augmenter les effectifs des groupes (échec des injections à combler), la possibilité des injections multiples ou continues sur es des animaux cathétérisées est de ce point un avantage car cela permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire , les souris par trio , l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les rongeurs sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, (condition importante dans ce projet.), mais il faut noter que la réponse du rat à l’induction de la fibrose (composant nécessaire à l’apparition de la cirrhose) est meilleure que celle de la souris. Dans le cas où il n’y a pas de différences majeures entre les espèces, le choix de l’espèce peut être strictement économique. L’hébergement des souris de petite taille est plus aisé. La souris nécessite 10 fois moins de réactifs ou médicaments parfois rare et précieux ou onéreux que le rat. La contrainte de la souris de petite taille est que les volumes d’échantillons biologiques obtenus sont limités, et on obtient moins d’informations scientifique à partir d’un seuil animal. Le recours dans ce cas au rat peut présenter des avantages.
Formation à la protection des animaux de la FAUNE SAUVAGE NON-HEBERGEE terrestre (Mammifères, Oiseaux, Reptiles) utilisés à des fins scientifiques
- Formation professionnelle
Rats : 5
Autres rongeurs : 50
Autres mammifères : 60
Autres oiseaux : 120
Reptiles : 50
Cinq plumes arrachées sur le corps des petits oiseaux, une brûlure superficielle des écailles ventrales pour marquer les couleuvres, jusqu'à quarante-huit heures de détention pour les serpents: 290 individus, dont 120 oiseaux, 60 sangliers, 50 rongeurs sauvages et 50 reptiles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal capturé subit en moyenne six actes parmi capture, contention, prise de sang, anesthésie, écouvillonnage cloacal ou buccal et pose d'un dispositif de biotélémétrie. Ces actes alimentent des démonstrations pratiques pour la formation réglementaire de personnes qui travailleront sur la faune sauvage, sans produire de connaissances, le porteur retenant des espèces communes et abondantes connues pour ne pas entrer rapidement en stress pathologique et estimant le recours à des animaux vivants "inévitable". 286 individus sont relâchés sur leur lieu de capture ou réintégrés dans leur élevage, les quatre rongeurs d'origine captive étant tués puis donnés en nourriture aux serpents élevés sur le site, faute d'être repris par le fournisseur.
Objectifs
Tout personnel scientifique utilisant des animaux à des fins scientifiques doit avoir validé une formation spécifique à l’expérimentation animale, laquelle inclue obligatoirement un module complémentaire spécialisé sur un groupe d’espèces au plus proche de ses modèles d’étude. Le présent projet concerne les démonstrations pratiques d'un module complémentaire spécifique obligatoire de formation règlementaire à la protection des animaux de la faune sauvage non-hébergée utilisés à des fins scientifiques. La présente formation est la première et seule formation en France offrant des modèles d’étude adaptés aux personnes travaillant sur la FAUNE SAUVAGE NON-HEBERGEE. Une telle formation doit comporter des démonstrations pratiques pour transmettre les bonnes pratiques à acquérir, mais réduites au minimum nécessaire en termes de nombre d’individus et de degré de contrainte des procédures appliquées. La finalité de ce projet est donc la formation en vue de l’acquisition des compétences professionnelles requises réglementairement pour utiliser des animaux des fins scientifiques. Les objectifs des démonstrations pratiques sont de transmettre par l’exemple, les bonnes pratiques en termes de capture, contention, prélèvements biologiques, sédation/ anesthésie, suivi des signes du stress et d’évaluation du statut sanitaire. Au préalable, ces pratiques sont enseignées lors d’enseignements en salle lors du module de base (3 à 6 mois avant le module complémentaire), puis la veille de chaque démonstration pratique lors du module complémentaire. Les démonstrations sont réalisées par des expert-e-s des actes à pratiquer sur chacun des groupes d’espèces proposées. De l’ordre de 20 pour cent du temps des démonstrations pratiques correspond à des actes sur des animaux vivants (maximum de 2 par démo et par groupe d’espèces), le reste du temps étant dédié à des apprentissages à l’aide de diverses méthodes de remplacement (photos, vidéos, mannequins).
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de promouvoir la préservation du bien-être des animaux sauvages utilisés dans des projets de recherche par la formation des concepteur-rice-s et applicateur-rice-s aux bonnes pratiques, adaptées à leurs modèles d’étude. Tant le bon sens que la réglementation imposent que les personnes soient formées aux actes à pratiquer. Cette acquisition de compétences se fait en 3 temps : conceptualiser (enseignements théoriques), assimiler (démonstrations pratiques), puis acquérir la maitrise technique des actes (tutorat). Le présent projet, par la démonstration pratique des actes les plus courants, promeut les bonnes pratiques en vigueur à ce jour, et ainsi assure un meilleur traitement des animaux par le raffinement des actes. Certaines recherches empiriques en écologie et biologie de la conservation animale imposent de capturer des animaux sauvages, les contenir temporairement captifs, et leur appliquer des actes techniques. Ce faisant, les animaux sont inévitablement en situation de stress. Tout l'enjeu de la protection des animaux sauvages utilisés à fins scientifiques est de savoir gérer simultanément ce stress et l’application des actes techniques. Ces deux compétences (suivi du stress et dextérité) ne peuvent pas être enseignées (i) sans pratique: le recours à des démonstrations sur des animaux vivants est inévitable, (ii) sur des animaux d'origine captive : ces derniers ne stressent pas comme les animaux sauvages car ils sont acclimatés (voir adaptés) à l'humain, avec un stress en réponse à la capture et la manipulation très atténué.
Procédures
Quel que soit le groupe d'espèces, les animaux utilisés sont exposés en moyenne à une combinaison de 6 actes (4 à 9 suivant les espèces et les démos), parmi : 1) stress léger pendant la capture, les contentions, et la détention (5 min à 48 heures suivant les espèces et les démonstrations pratiques) ; 2) douleur légère et transitoire lors d’un prélèvement sanguin (quelques minutes); 3) inconfort pendant l’induction et le réveil d’une courte anesthésie (5 min à 2h), l’équipement avec un dispositif électronique de biotélémétrie (15 à 45 min), et/ou l’écouvillonnage cloacal et/ou buccal. En sus, les nuisances spécifiques à des actes démontrés que sur certains groupes (si et uniquement si des apprenants le sollicitent) sont: sur sanglier, douleur légère à modérée et [transitoire] (quelques minutes) lors du marquage pour identification individuelle (boucle auriculaire et transpondeur, réduit par cryoanalgésie locale); pour les serpents, douleur ponctuelle légère sur quelques secondes à minutes lors du marquage pour identification individuelle (brûlure superficielle d’écailles ventrales), le stress de contention pendant une échographie (1 à 3 minutes) illustrant les possibilités d’exploration fonctionnelle (activité cardiaque, reproductrice, alimentaire), ponction veineuse intracardiaque ; sur les oiseaux, inconfort lors d’un prélèvement de liquide uropygien par palpation ou d’un écouvillonnage buccal ou du jabot chez les pigeons et l’arrachage de 5 plumes du corps (petites plumes). Ces actes peuvent être stressant ou douloureux mais très temporairement, ils n’induisent pas de détresse ou souffrance durable: ce sont les actes utilisés en routine pour étudier ces espèces dans la nature, sans indication d'impact durable. Chaque acte de prélèvements biologiques n’est pratiquée qu’une seule fois par individu au cours d’une session de formation (et deux sessions de formation par an, avec évitement de la réutilisation entre sessions).
Impact sur les animaux
Les actes induisant une légère douleur transitoire sont: les prélèvements sanguins (tous groupes d'espèces), l'écouvillonnage cloacal ou rectal (tous groupes d'espèces), l’implantation d'un nano-transpondeur sous-cutané (sangliers), marquage à l’aide de boucles auriculaires (rongeurs, sangliers), marquage par cautérisation superficielle d'écailles ventrales (couleuvres), l'injection d'anesthésique (intra-musculaire sur sanglier et tortues, intra-péritonéal sur rongeur), l'arrachage de plumes de corps (petits oiseaux). Les actes induisant un stress transitoire sont: la capture, la contention/détention/hébergement temporaire, la manipulation (tous groupes d'espèces), l'équipement avec un dispositif électronique biotélémétrique (sur collier pour rongeurs, sur harnais pour oiseaux, collé sur tortues). Les actes induisant un inconfort transitoire sont: l'anesthésie (tous groupes d'espèces), l'écouvillonnage buccal (tous groupes d'espèces sauf tortues), la pose d'une bague à la patte (oiseaux).
Devenir
Tous les animaux capturés à l'issue de la formation seront replacés = relâchés sur le lieu de capture ou réintégrés dans leur groupe d'élevage, car aucune des procédures prévues n’est susceptible d’induire une douleur prolongée. En cas de complications irréversibles (blessure, épuisement), le vétérinaire référent décidera du devenir de l’animal (soin ou euthanasie). Nous rappelons qu'aucune mise à mort ne sera réalisée à fins pédagogiques. Pour les animaux captifs utilisés, lorsque qu'il n'a pas été possible de capturer des individus sauvages, ils seront tous réintégrés dans l'élevage dont ils sont issus (à l'exception des rongeurs d'origine captive, le fournisseur ne les reprenant pas et l’Etablissement Utilisateur n’ayant pas d’animalerie rongueur pour les maintenir en élevage, ces rongeurs sont mis à mort puis donnés comme alimentation aux serpents élevés à fins scientifiques sur site).
Remplacement
Chaque année, nous accroissons les médias de remplacement à disposition des formateurs: recours à des cadavres (obtenus de manière opportuniste avec dérogations idoines; p. ex. mortalité routière, accident lors de projet nécessitant la capture, animaux euthanasiés en centre de sauvegarde de faune sauvage) ou achat de mannequins pour la démonstration d’actes potentiellement douloureux ou de mise à mort (mannequin de rat pour contention et ponction veineuse caudale ; mannequin de cerf et phoque pour (télé)anesthésie, prélèvement sanguin) ; constitution d’une banque d’’images et vidéos dédiées (collectées lors des démonstrations pratiques, ainsi que lors de leurs projets par les formateurs). Néanmoins, le but pédagogique de démonstration de l’intérêt de méthodes alternatives aux pratiques communes (Raffinement) nécessite le recours à quelques animaux vivants par session de la formation. Les démonstrations pratiques, dans des conditions réalistes, sur de très petits nombres d’animaux sauvages en nature, nous semblent donc indispensables pour atteindre cet objectif pédagogique.
Réduction
Le nombre d’individus utilisés a été réduit le plus possible : maximum N = 2 par démonstratin pratique et par groupe d’espèces (1 utilisé par le formateur pour démontrer les actes, 1 utilisé par un apprenant sous tutorat du formateur pour appréhension des actes) ; avec réutilisation des individus de la Démo2 dans la Démo3 dans la majorité des procédures. Ainsi, pour une session de formation sur un groupe d’espèces, maximum 6 individus sont utilisés (sauf pour les tortues : maximum 4, du fait de la disponibilité limitée en individus pour ce groupe d’espèces). Nous faisons deux sessions de formation par an: 6 groupes en Juin (2 x grands mammifères, petits mammifères, grands oiseaux, petits oiseaux et reptiles - serpents), 4 groupes en Septembre (petits mammifères, grands oiseaux, petits oiseaux, reptiles - tortues). Ce sont donc au total max. 58 individus qui sont utilisés par an, soit max. 290 individus sur la durée du projet (5 ans). Autres leviers de réduction: 1) la majorité des individus utilisés en Démo font simultanément partie de projets de recherche en cours sur site, et sont donc mutualisés entre projets (entre finalité scientifique et pédagogique ; cas des sangliers, oiseaux, serpents) ; 2) en cas d’absence de volontaire pour pratiquer ou de demande de la part des apprenants, le formateur peut décider de ne pas faire la 2ème démonstration prévue (ainsi, ~ 1 fois sur 2, dans les démos d’anesthésie, 1 seul individu est anesthésié au lieu de 2) ; 3) les manipulations sont filmées, réduisant ainsi la nécessité ultérieure de recourir à des démonstrations d’actes, et augmentant la diversité des situations auxquelles les apprenants sont exposés ; 4) l’offre de formation sur un groupe d’espèces donné et une session donnée n’est proposée que si il y a au moins 4 inscrits demandant à être formé sur ce groupe (et maximum 5 inscrits par groupe). Si la demande est inférieure, le groupe d’espèces concerné n’est pas proposé = il n’y a pas d’utilisation d’animaux pour ce groupe à cette session.
Raffinement
L’enjeu pédagogique majeur est la démonstration de pratiques de raffinement : évaluer et minimiser le stress des animaux sauvages pendant les contentions tout en démontrant le degré de dextérité requis pour une mise en œuvre sûre des actes. C’est la trame transversale à toutes les démonstrations pratiques. Les formateurs ont été choisis parmi les personnes les plus expérimentées en France pour chaque groupe d’espèces, offrant des démonstration sûres et rapides des actes techniques courants, ajustés en fonction de la condition de stress de l’animal manipulé. Les anesthésies ne sont pratiquées que par des vétérinaires, pratiquant sur faune sauvage (et formés à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques). Des équipements de capture et contention minimisant le stress ont été acquis (pièges pour petites mammifères, sabot de contention pour sanglier). L’hébergement temporaire (max. 48h pour les serpents, 1h à 27h pour les autres groupes) est accompagné de mesures de préservation des 5 libertés (calme auditif et olfactif, obstruction visuelle, abris et supports adaptés, alimentation et boisson ad libitum). Les animaux sauvages sont systématiquement relâchés sur leur lieu exact de capture. Les animaux captifs sont réintégrés dans leur lot d’origine. Chez les petits et grands mammifères, la douleur ponctuelle induite par le marquage d’identification (boucle auriculaire, transpondeur) est réduite par analgésie locale. Les surmulots sont sédatés pour réduire le stress lors de la contention. La démonstration de l’anesthésie par inhalation est privilégiée (plus rapide, moins risquée ; seule méthode sur oiseaux, petits mammifères et serpents). Pour les oiseaux, démonstration d’un point de ponction veineuse (veine cutanée jugulaire ou veine tibiale) avec moins de risque d’impact sur les performances de vol que le point usuel (veine brachiale ou ulnaire). Un dispositif d’imagerie par ultra-sons (doppler) a été acquis pour mieux localiser les points de ponction veineuse (reptiles). En cas d’animal risquant d’atteindre un état de stress pathologique (points limites et grille d’évaluation spécifiques à chaque groupe d’espèces), il est immédiatement mis au calme sous surveillance (quelques minutes à 1h), puis relâché au plus vite sur son lieu de capture. A défaut d’une récupération rapide, le responsable vétérinaire référent décide du traitement à apporter (idem en cas de blessure accidentelle ; 2 cas en 5 ans).
Choix des espèces
Les critères de choix des espèces sont: (1) espèces et individus d'origine sauvage, pour que les animaux présentent des comportements similaires aux espèces sur lesquelles les apprenants opèreront; (2) groupes taxonomiques d'animaux terrestres couramment utilisés en utilisation d'animaux de faune sauvage non-hébergée à des fins scientifiques et disponibles sur site de formation; (3) des espèces communes et abondantes, assurant une capture aisée en nombre suffisant dans les temps impartis, sans impact sur les populations et les espèces. (4) des espèces connues pour NE PAS entrer rapidement en phase de stress pathologique lors des manipulations (p. ex. sensibilité cardiaque, épuisement, apathie, hyper-activité). (5) en cas de défaut de capture le jour de la Démo, espèces disponibles en nombre suffisant dans les élevages de l'EU ou de son partenaire scientifique local, un parc zoologique à proximité. Les espèces pouvant être utilisées sont: Petits mammifères: Souris grise (Mus musculus), Rat noir (Rattus rattus), Rat surmulot (Rattus norvegicus), Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), Campagnol des champs (Microtus arvalis) Grands mammifères: Sanglier (Sus scrofa) Grands oiseaux: Canard domestique (Anas platyrhynchos), Oie domestique (Anser anser domesticus) Petits oiseaux: Mésange charbonnière (Parus major), Mésange bleue (Cyanistes caeruleus), Moineau domestique (Passer domesticus), Merle noir (Turdus merula), Pigeon biset domestique (Columbia livia), Diamant mandarin (Taeniopygia guttata) Reptiles – Serpents: Couleuvre verte-et-jaune (Coluber viridiflavus), Couleuvre d’Esculape (Zamenis longissimus), Couleuvre à collier (Natrix natrix) Reptiles – Tortues: Tortue d’Hermann (Testudo hermanni), Tortue grecque (Testudo graeca), Cistude d’Europe (Emys orbicularis), Emyde lépreuse (Mauremys leprosa) Stade: uniquement des animaux ayant atteint la taille adulte. Les individus juvéniles, n'ayant pas fini leur croissance, ne seront pas utilisés. Les femelles gravides/gestantes (dans la limite des capacité à détecter leur statut reproducteur) ne seront pas utilisées.
Évaluation de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1750
Pesées jusqu'à cinquante-deux fois, colite déclenchée par une administration intrarectale sous anesthésie, puis gavage jusqu'à trois fois par jour pendant cinquante-deux jours: 8 750 souris et 1 750 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 3 150 d'entre eux en gravité sévère. S'y ajoutent une coloscopie hebdomadaire jusqu'à huit fois par animal avec prélèvement de micro-biopsies, des prises de sang rétro-orbitales et des mises à jeun de douze à vingt-quatre heures. Les modèles de colite provoquent perte de poids, diarrhées et présence de sang dans les fèces, une perte de poids supérieure à 20 % en 24 heures justifiant selon le porteur une mise à mort immédiate. Tous ces animaux sont tués à l'issue, le prélèvement de tissus et l'examen de leur système immunitaire servant à fixer les doses qui seront ensuite administrées à des patients en essai clinique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles d’inflammation chronique de l’intestin chez le rongeur. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Son origine semble résulter de la combinaison complexe de facteurs environnementaux, associés à une susceptibilité génétique du patient et à la réactivité particulière de son système immunitaire, et au microbiote. Les traitements actuels sont peu nombreux et sont dans 70% des cas inefficaces. Les cycles récurrents d’inflammation peuvent conduire à des complications : sténose, fistules, perforations entrainant une urgence chirurgicale. Les MICIs sont également associés à un risque accru de cancer colorectal. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique de ces nouveaux traitements. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La colite ulcérative et la maladie de Crohn sont contrôlées à l’aide de médicaments immunosuppresseurs et antiinflammatoires (acide 5-aminosalicylique) qui atténuent l’inflammation intestinale. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Les traitements biologiques prescrits en deuxième intention sont très coûteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. De nombreux patients sont également réfractaires à ces traitements. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes dont des thérapies cellulaires et des fécalothérapies. A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les MICIs. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients dans les essais cliniques.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. - Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour soit jusqu’à 52 fois par animal. - Administration d’agent inducteur d’une inflammation intestinale, 3 possibilités : par voie intrarectale : 30 secondes sous anesthésie gazeuse, une fois par animal. Avec ou sans présensibilisation par voie cutanée : 15 secondes sur animal vigile, une fois par animal. par voie intraveineuse : 30 secondes sous anesthésie, une fois par animal. par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile. - Prélèvement de sang par voie retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale , 1 fois par œil et par animal. Le prélèvement retro-orbital sera utilisé, seulement dans le cas où un volume plus large et un prélèvement rapide est nécessaire. Prélèvements de sang via la veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié. • Prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque ou veine abdominale : 30 secondes, sous anesthésie générale profonde. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique: voie selon le composé : o Par voie orale à l’aide d’une sonde gastrique : 10 secondes sur animal vigile, jusqu’à 3 fois par jour, max 52 jours. o Par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, jusqu’à 7 jours, 7 fois max par animal. o Sous-cutanée : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, 52 jours max. o Par voie intraveineuse retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale, Une fois par œil et par animal. o Par voie intraveineuse via veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié, Une fois par semaine pendant 8 semaines. Pour certaines procédures seulement :•Coloscopie (proc.1): 15 minutes sur animal anesthésié, une fois par semaine soit jusqu’à 8 fois par animal. Prélèvement de 2 micro-biopsies 2 fois par animal max.• Test de perméabilité intestinale/administration de dextran par voie orale : 10 secondes sur animal vigile, une fois toute les 2 semaines soit 4 fois par animal; •Mise à jeun pour l’induction de l’inflammation intestinale (proc.2). Durée 12 à 24 heures, une fois par animal. •Mise à jeun pour le test de perméabilité intestinale (proc. 1). Durée 4 heures, une fois toutes les 2 semaines soit 4 fois par animal.
Impact sur les animaux
Ces procédures induiront chez l’animal des nuisances modérées à sévères : pesée quotidienne (30s), injection de cellules (30s), administration de traitement par gavage ou injection (i.p., i.v., s.c.) (15 à 30s) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations (1 min). De plus, les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances (30 à 60s). Des microéchantillons de sang pourront également être prélevés sur animaux vigiles (30s). Une mise à jeun de 4h, pendant le cycle diurne, pourrait être réalisée pour une étude perméabilité intestinale (4h par étude). Une mise à jeun de 12 à 24 heures, pourrait être réalisée pour induire le modèle TNBS selon la procédure numéro 2. Les effets indésirables attendus des modèles de colite sont une perte de poids, des diarrhées, la présence de sang au niveau des fèces et/ou du rectum. Une piloérection, une réduction de la mobilité et une perte de poids > à 20% en 24h ou 30% depuis le jour 0 justifieraient une mise à mort immédiate.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire
Remplacement
Il existe des modèles ex-vivo d’organoïdes intestinaux permettant un premier criblage pour évaluer l’efficacité des composés permettant de limiter le recours à l’animal dans les premières phases de développement. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (ganglions mésentérique, rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peut pas à ce jour constituer un environnement fiable pour prédire la pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des entités à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes impliquant entre autres la migration de cellules immunitaires vers l’intestin. Cependant, des tests in vitro et in silico qui permettent de prédire les profiles pharmacocinétiques et les interactions avec la cible moléculaire d’intérêt seront utilisés en amont des études de ce projet. Ceci permettra de limiter le recours à l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin favoriser un comportement naturel (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture...). Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des études en utilisant exclusivement des techniques non-aversives (ex : prélèvement de l’animal de sa cage avec l’aide d’un tunnel). Les procédures potentiellement douloureuses ou sources d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique a minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux et systèmes d'hébergement suivront un programme de contrôle d’hygiène et sanitaire afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation non seulement affecte le bien être mais peu aussi impacter la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris. De nombreuses données sur les modèles de MICIs chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent que les rats (min. 5 semaines) et les souris (min. 7 semaines) adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine des MICIs car ils disposent d'un système immunitaire mature
Impact de la charge hypoxique induite par l’hypoxie intermittente sur la taille de l’infarctus du myocarde chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Placés en hypoxie huit heures par jour pendant trois semaines, au moment où ils dorment, 490 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont tous tués par prélèvement du cœur. Le porteur décrit une gêne respiratoire, une perte de poids, un stress et une baisse d'activité les trois premiers jours, puis une adaptation. Chaque semaine, les rats portent une à trois heures un collier ou un gilet de télémétrie, subissent une mesure de pression à la queue et, pour une partie, un test de tolérance au glucose avec six gouttes de sang prélevées après six heures de jeûne. L'effectif annoncé repose sur douze animaux par groupe, le porteur ajoutant que cinq mâles et cinq femelles par groupe suffiraient si les résultats se recoupent, sans que le passage à 490 rats soit expliqué.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. La sévérité des apnées modifie la quantité d’hypoxie qui a pour conséquence une grande valabilité de réponse entre les patients. Dans l’objectif de mieux comprendre la variabilité de réponse chez le patient et améliorer la prise en charge. L’objectif de cette étude et d’évaluer l’impact de différentes quantités d’hypoxie sur l’aggravation de la taille de l’infarctus du myocarde chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. La prise en charge des apnées du sommeil est complexe et le profil des patients hétérogène. L’étude de la charge hypoxique (quantité d’hypoxie) chez le rongeur permettra de mieux comprendre les mécanismes qui aggravent les pathologies cardiaques et mieux phénotyper les patients afin proposer des thérapies alternatives ou complémentaires aux traitements actuels.
Procédures
Tous les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie (contrôle) pendant 3 semaines en modulant la quantité d’hypoxie. Chaque semaine, pendant 1 à 3 h les animaux seront équipés vigile d’équipement de télémétrie (colliers/gilets) afin d’évaluer les paramètres cardiorespiratoires et soumis à une mesure de la pression artérielle à la queue. A la fin de cette procédure, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, une mesure de pression artérielle sera réalisée et les rats seront mis à mort par prélèvement cardiaque afin d’évaluer ex-vivo la taille de l’infarctus du myocarde. Dans la deuxième partie du projet, les rats subiront un test de tolérance à l’insuline ou au glucose. Ce test consiste à injecter de l’insuline ou de glucose chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injection ou prélèvement). A la fin de cette procédure, les rats seront anesthésiés et analgésiés, et mis à mort par prélèvement cardiaque puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.
Impact sur les animaux
L’hébergement des rats dans l’animalerie conventionnelle entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement du dispositif d’exposition à l’hypoxie. L’exposition à l’hypoxie induit une dyspnée, une perte de poids, un stress et une diminution de l’activité chez le rat, qui interviennent exclusivement pendant la phase d’hypoxie (8h/j), qui correspond à la phase de sommeil des animaux. Ces atteintes sont transitoires, la perte de poids et la dyspnée sont observées au cours des 3 premiers jours d’exposition, puis les animaux s’adaptent et les courbes de prise de poids sont ensuite parallèles à celles des animaux contrôles exposés aux mêmes flux d’air sans l’hypoxie (normoxie). Le test de tolérance à l’insuline et au glucose chez l’animal éveillé nécessite une mise à jeun de 6 heures et une injection intrapéritonéale d’insuline ou de glucose, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort. En effet, l’objectif de ce projet impliquant la réalisation d’une ischémie reperfusion ex-vivo le prélèvement du cœur est indispensable.
Remplacement
Le présent projet ne peut pas être réalisé en remplaçant l’animal par des méthodes alternatives puisqu’il s’agit ici d’une étude systémique. En effet, un des objectifs de cette étude est de corréler des marqueurs cliniques de dysautonomie (ECG, pression artérielle…) à la quantité d’hypoxie et à la taille de l’infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin que l’effectif par groupe permette d’observer d’éventuelles différences significatives mais en tenant compte d’éventuels problèmes au moment de la cannulation du cœur et de l’absence de réponse de certains animaux lors de la réalisation des tests métaboliques (+20 % => n=12 par groupe). Les gilets de télémétrie nous permettent d'effectuer des mesures longitudinales de la fonction cardiorespiratoire, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous réaliserons ce projet sur des animaux mâles et femelles, si les résultats observés entre les mâles et les femelles n’est pas différents les résultats seront groupés et il ne sera pas nécessaire d’effectuer la totalité des animaux 5 mâles et 5 femelles par groupes seront suffisant.
Raffinement
Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages, même pendant l’HI et la N (enrichissement adapté ne modifiant pas les flux d’air et ne permettant pas aux animaux de se cacher). Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de stabulation dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie intermittente. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. L’utilisation de gilets de télémétrie permettent le suivi cardiorespiratoire des animaux sans nécessiter une quelconque chirurgie ou une anesthésie pour acquérir un ECG, ce qui participe au raffinement, de plus, il est très bien toléré par les rats. Compte tenu des multiples conditions de charge hypoxique, nous avons choisi de réaliser l’épisode d’ischémie-reperfusion ex-vivo plutôt qu’in-vivo, ce qui permet de réduire la contrainte et la souffrance potentielle pour les animaux. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront des antalgiques pré et post-opératoires selon nos protocoles normalisés Une fois endormis, les rats seront transférés sur tapis chauffants pour maintenir leur température corporelle leur température sera également contrôlée par un thermomètre rectal raccordé à une plaque chauffante pour ajuster les variations de température. L’anesthésie sera vérifiée tout au long de la chirurgie (pincement de la patte postérieure ou de la queue). Tous les gestes et soins effectués sur les animaux seront réalisés par des personnes formées et compétentes.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiopathologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est un modèle de référence dans les publications. Les animaux seront commandés à l’âge adultes 5-10 semaines (≈ 200 g et 300 g pour les femelles et mâles respectivement) et utilisés après 1 semaine de stabulation.
Elevage et maintien de souris et de rats variants et transgéniques à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 6500
25 600 souris et 6 500 rats vont être produits et génotypés sur la durée du projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une seule intervention, un prélèvement de queue ou d'oreille sur animal éveillé accompagné d'un tatouage des phalanges, moins de cinq minutes en tout. Les animaux issus de ces quinze lignées génétiquement altérées, treize de souris et deux de rats, sont destinés à d'autres projets sur les dystrophies musculaires, puis tués, gardés pour la reproduction ou transférés vers une utilisation continue. Le porteur indique développer en parallèle des muscles artificiels dérivés de cellules de patients, tout en qualifiant les expériences prévues d'"absolument indispensables".
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux. Ce projet permettra l’élevage de 13 souches de souris et de 2 souches de rats génétiquement altérées nécessaires à la mise en oeuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des dystrophies musculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour (maladies orphelines de traitement).
Procédures
Les prélèvements de tissus (queue et/ou oreille) se font sur animaux vigiles. Cet acte se fait en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser tous les actes. En effet, les prélèvements de tissus se font en moins d'une minute, mais les instruments sont nettoyés entre chaque animaux ce qui augmente un peu le temps total. Les tatouages se font également en quelques minutes. Pour une durée total (néttoyage compris) n'excédant pas 5 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu (queue ou oreille) sur jeunes animaux vigiles. La contention d’animaux jeunes peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures.
Devenir
Euthanasie des animaux ou gardé en vie pour la reproduction ou une utilisation continue.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont et en parallèle de ce projet. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions scientifiques dans des modèles cellulaires et nous développons des muscles artificiels dérivés notamment de cellule de patient. L’utilisation d’animaux dans des études scientifiques ne se fait que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions. Par exemple quand il est nécessaire d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. Enfin, dans le but de diminuer le nombre d’animaux à produire, certaines de nos lignées ayant le même fond génétique, les animaux contrôle peuvent être utilisés comme contrôles pour plusieurs lignées.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 25600 souris et 6500 rats pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. En cas d’observation de la moindre douleur, définit par des points limites stricts en fonction des procédures, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris et rats étant des animaux sociaux, aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Pour évaluer les effets des fortes doses, nous utiliserons l’espèce rat car elle est plus sensible au niveau cardiaque, ce qui nous permet d’avoir une meilleure sensibilité de l’expérience. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer les fonctions musculaire ou cardiaque et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles pathologiques les plus sévères.
Imagerie cérébrale comme nouvel outil d’étude des troubles du spectre autistique chez le rat (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Douze rats sur 111 seront maintenus en vie et placés en retraite ou réaffectés à d'autres projets, les 99 autres tués pour des analyses de tissus, y compris les ratons surnuméraires des portées jugées trop nombreuses. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour douze animaux et modéré pour 99. Neuf rates gestantes sont gavées quarante-deux jours d'affilée avec un retardateur de flamme ou reçoivent une injection du médicament de référence, puis sont tuées au sevrage de leurs petits. Leurs 90 descendants passent quatre tests comportementaux destinés à repérer ceux qui présentent les signes autistiques recherchés, et dix-huit au maximum iront en imagerie cérébrale sous anesthésie, quatre séances en deux semaines.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet validera une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.
Procédures
Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids. Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie. Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (4) entraine un stress physique mineur de courte de durée.
Devenir
Neuf femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 90) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 12 rats (6 femelles et 6 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe et placés par deux dans des cages ventilées, avec des buchettes de bois et de la frisure de papier Kraft pour enrichir leur environnement. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.
Choix des espèces
Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.
Evaluation des paramètres de pharmacocinétique et validation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules candidates pour lutter contre les maladies neurogénétiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 120
8 120 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les molécules candidates leur sont administrées sous la peau, dans la veine, dans l'abdomen ou par gavage, avec des prises de sang à la queue jusqu'à trois fois en deux heures, et pour la dernière expérience un gavage quotidien pendant quatorze jours destiné à trouver la dose maximale supportée. Les souris utilisées portent une maladie neurodégénérative dont les symptômes moteurs et mentaux s'aggravent avec l'âge, et le porteur reconnaît que la toxicité des doses testées peut provoquer des effets secondaires. Rien dans le texte n'explique comment on arrive à 8 240 animaux : le porteur décrit seulement quatre expériences enchaînées, chacune conditionnée aux résultats de la précédente.
Objectifs
Des études in vitro récentes ont permis de découvrir une molécule permettant de retarder l’évolution d’une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié. Ce projet vise donc à trouver d’autres molécules, dérivées de la molécule initiale, dont les propriétés chimiques auraient des effets optimaux sur le traitement de cette maladie par rapport à la molécule initiale. Nous vérifierons d'abord si ces nouvelles molécules présentent un meilleur potentiel thérapeutique que la molécule initiale. Si c’est le cas, parmi tous les candidats, nous sélectionnerons les 3 meilleurs afin de réaliser une étude d’efficacité sur le long terme. Enfin, nous procéderons à des tests sur les 3 molécules sélectionnées pour déterminer la dose maximale sans danger pour l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à trouver des molécules qui soient aussi efficaces, voire plus, avec de meilleures propriétés chimiques. Une molécule qui se dissout bien et est bien absorbée peut être prise par voie orale, ce qui permet de réduire la dose nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique. Cela diminue également le risque d'effets secondaires indésirables, qui sont souvent la raison pour laquelle les patients arrêtent leur traitement.
Procédures
Quatre voies d’administration différentes seront testées : injection sous-cutanée, injection intra-veineuse, injection intra-péritonéale et gavage oral. Quelle que soit la voie, l’administration du médicament sera réalisée par un geste d’une durée inférieure à 30 secondes pour limiter le possible stress engendré par l’administration du traitement. Dans la 1ère expérience, du sang sera prélevé à la queue à 3 reprises au cours des 2h suivant le traitement. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 2e expérience, du sang sera prélevé à la queue juste avant le traitement, puis 1h, 3h et 6h après. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 3e expérience, du sang sera prélevé à la queue tous les mois (un seul prélèvement/animal/mois) durant toute la durée du traitement. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 4e expérience, les animaux seront quotidiennement traités par gavage oral pendant 14 jours. Au 14e jour, du sang sera prélevé à la queue de chaque animal. Ces deux gestes auront une durée inférieure à 30 secondes chacun.
Impact sur les animaux
Le modèle animal de cette maladie présente des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Un stress lié à l’administration du traitement est possible. Le prélèvement sanguin peut aboutir à une légère baisse du volume sanguin. Des effets secondaires dus à une toxicité des doses testées peuvent être observés.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de la maladie sont atténués voire résorbés par le traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec nos médicaments sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 4 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisée que si l’expérience 1 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2, 3 et 4 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de la maladie. Enfin, l’utilisation du rat adulte, en parallèle de la souris, pour l’étude de toxicité se justifie par le fait qu’elle prépare aux futures études de toxicité exigées par la réglementation et qui doivent être réalisées chez le rat.
Evaluation du remodelage et restructuration cardio-vasculaire du rat lésé médullaire (T4) et traitement sérotoninergique (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Déjà lésés à la moelle épinière et porteurs d'un capteur télémétrique au titre d'un projet antérieur, 30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet ajoute deux séances d'anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes pour une imagerie par résonance magnétique, à vingt-quatre heures d'intervalle. La paralysie du train arrière impose une vidange manuelle de la vessie une à quatre fois par jour, un isolement de sept jours après l'opération et une antibiothérapie contre les infections urinaires, contraintes que le porteur détaille avec précision. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de modélisation du système sérotoninergique capable de prédire les effets de la lésion.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LM) sont un problème de santé important dans le monde, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensoriels et moteurs bien connus et identifiés, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome. Les symptômes comprennent des troubles cardiovasculaires, une thermorégulation dysfonctionnelle et la présence de dysréflexie autonome (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie pouvant mettre en jeu le pronostic vital). Ces troubles sévères contribuent à 40 % des décès chez les patients. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats spinaux, l'administration quotidienne pendant 28 jrs d'un agoniste sérotoninergique (5-HT) favorise la récupération motrice. Outre ce rôle démontré, la 5-HT joue également un rôle omniprésent dans le système cardiovasculaire puisqu'elle module, entre-autre, le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. Le précédent projet montre des données préliminaires très encourageantes et met en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires. Si les résultats sont prometteurs et pourraient être utilisés dans de prochaines études cliniques, il nous faut maintenant compléter ces données sur des données physiologiques. Nous savons (bibliographie) que les rats ayant subi une lésion de moelle en T5 présentent un remodelage des neurones sympathiques post-ganglionnaires innervant le cœur. Nous comparerons donc des individus contrôles, traités avec du NaCl et traités avec notre molécule sérotoninergique. De même, nous savons que les troubles cardiovasculaires provoquent des modifications sur la physiologie d’organe tel que le cœur mais aussi le rein (directement impliqué dans la régulation de la pression artérielle). Nous souhaitons comparer, là encore, des individus contrôles, traités avec du NaCl et traités avec notre molécule sérotoninergique. Si nous avions dans un premier temps envisager de faire un avenant au projet précédent, il s’avère que l’utilisation de capteurs de télémétrie (utilisés pour suivre les paramètres cardiovasculaires) est incompatible avec une IRM et que le traçage des neurones innervant le cœur demandait une 3ème chirurgie, peu éthique pour les animaux (procédure sévère). Nous avons donc décidé de déposer un nouveau projet éthique pour compléter nos données déjà récoltées.
Bénéfices attendus
Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Une précédente étude de notre équipe a montré l'implication de molécules agissant sur le système sérotoninergique et leur capacité à restaurer en partie l’impact de ces troubles. Notre projet pourra permettre une avancée dans le traitement des patients.
Procédures
Les animaux seront issus d'une précédentes DAP (projet multi-sites). Ils seront tous (30) anesthésiés 1h30 environ en deux sessions séparés de 24h pour subir une imagerie (projet éthique 2/2). Toutes les anesthésies seront gazeuses (isoflurane).
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une chirurgie pouvant induire de la douleur et 30 d'entre eux, en subiront une 2ème. Ces chirurgies peuvent induire de la douleur. De plus, la lésion de la moelle épinière (2ème chirurgie de la procédure 2) va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients ; des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur et des problèmes cardiovasculaires (tachycardie et hypotension orthostatique). 20 animaux seront insolés pendant les 7 jours post-opératoires afin d'assurer leur soins postopératoires dans de bonnes conditions. Les injections quotidiennes ne doivent pas induire de douleurs (fait sous la lésion – absence d’intégration sensorielle) mais induisent un stress limité (duo d’expérimentateurs durant toute la durée). Le test de marche sur le tapis roulant peut induire un stress à l’animal. Enfin, les sessions d’IRM ne devraient pas induire de nuisances, néanmoins, les animaux seront anesthésiés environ 1h30 en 2 sessions de 45 minutes.
Devenir
Nous avons besoin des tissus pour faire des analyses de remodelage de l'innervation d'organes cibles
Remplacement
Ce projet éthique s'inscrit dans un projet scientifique plus vaste où des études préliminaires ont mis en évidence l'implication du système sérotoninergique (5-HT) dans les épisodes cardiovasculaires dysfonctionnels qui apparaissent à la suite d'une lésion haute de la moelle épinière. L’organisation du système sérotoninergique est complexe avec de nombreux types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets de la lésion dans notre modèle
Réduction
Nous avons déterminé le n des lots en fonction des premiers résultats obtenus dans le précédent projet. Nous ferons une comparaison pour savoir si nous avons un des différences entre les lots. Il va falloir n=7 animaux par lots (avec ce nombre, nous avons été en mesure de faire des statistiques claires lors de notre précédent projet éthique). Toutefois, la complexité de l'expérimentation nous oblige à prévoir une marge d'erreur que nous aimerions ne pas avoir à utiliser (n=10 animaux par sexe).
Raffinement
Les soins post-opératoires (lésion de moelle) sont basés sur notre expérience de cette technique ainsi que sur des publications de raffinement écrites par les quelques équipes travaillant sur des sujets similaires au nôtre. Il a été validé par la structure de bien-être animale et nos vétérinaires. Les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse(isofluorane). Nous utilisons une analgésie multimodale pour les 2 chirurgies pendant 3 jours minimum. Pour la phase post-lésionnel, nous avons adapté les cages qui ont été usinées à façon pour s'adapter à la paralysie des animaux (eau proche du sol, mangeoire basse, tapis souple agrippant dans la cage pour aider à la mobilité, alimentation liquide pendant 4 jours post-opératoires pour pallier aux problèmes gastriques, vidange manuelle de la vessie de 1 à 4 fois par jour en fonction de la récupération des animaux et antibiothérapie post-opératoire pour éviter les infections urinaires. Des points limites stricts ont été mis en place avec l'aide de l'équipe vétérinaire.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets éthiques. Les animaux du projet précédent sont implantés (capteur télémétrique) à 225-275gr soit à 7/8 semaines d'âge environ. Afin de rester au plus proche de ce qui est fait sur le premier projet, nous commencerons ce projet avec des animaux du même âge.
Génotypage de lignées transgéniques en élevage par une technique invasive chez le rongeur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 200
27 000 souris et 200 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun pour une biopsie de la queue de moins d'une minute, pratiquée éveillé. Le prélèvement a lieu sur des souriceaux et des ratons de 5 à 15 jours et peut être refait à l'oreille, avec une douleur au moment du geste et un saignement possible. Ces 27 200 prélèvements servent à lire le génome de chaque petit pour trier ceux qui iront alimenter les recherches du laboratoire sur la vision et la cécité. Les porteurs du génotype recherché partent vers d'autres projets ou vers la reproduction, les autres sont utilisés pour entraîner les nouveaux arrivants à la préhension et à la contention, ou tués aussitôt.
Objectifs
Dans nos études sur les mécanismes de la vision, les maladies oculaires et la restauration visuelle, nous utilisons différents modèles de rats et de souris transgéniques. Afin de caractériser leur génome et de sélectionner les animaux d’intérêt pour nos études, nous devons caractériser leur génome précocement. Afin de pouvoir réaliser cette caractérisation, nous réaliserons une biopsie de queue ou de l’oreille afin d’en extraire l’ADN.
Bénéfices attendus
Les recherches menées au laboratoire grâce à l’utilisation de ces animaux permettront de comprendre les mécanismes conduisant à la malvoyance voire la cécité et de trouver des thérapeutiques efficaces pour limiter la progression des maladies de la vision et/ou de permettre la restauration visuelle.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seul fois dans sa vie à un prélèvement caudal. Cet acte dure moins d’une minute. Dans de rare cas, un reprélevèrent à l’oreille pourra être réalisé et dure quelques secondes. Ces actes sont réalisés sur des animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La contention des souriceaux et des ratons induisent un léger stress. Le prélèvement à la queue induit également une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible.
Devenir
Les animaux avec le génotype d’intérêt ou pouvant servir de contrôle seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère et pour le renouvellement des accouplements. Les animaux passants dans les projets de recherche seront en utilisation continue. Les animaux ne portants pas le génotype d’intérêt seront soit utilisés dans le cadre de la formation tutorat (préhension, contention) soit immediatement euthanasiés
Remplacement
Les animaux sont utilisés uniquement s’il n’existe pas d’alternative par des études in vitro sur des modèles de cellules en culture. L’action de certaines molécules nécessitent une étude sur l’organe dans son ensemble et les études de restauration visuelles ne peuvent être appréciés sur des modèles ex vivo.
Réduction
Le génotypage précoce des animaux permet de sélectionner et de conserver uniquement les animaux ayant le profil génétique d’intérêt. Les animaux n’ayant pas le bon profil seront utilisés si possible en tant que témoin dans l’étude. Ces derniers pourront aussi être utilisé dans le cadre de formation/tutorat au sein de notre institut (formation des nouveaux entrants). Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé en fonction des animaux produits les deux années précédentes et aussi sur la base de l’évolution du nombre d’équipes et de projet au sein de notre institut. Nous estimons que 27000 souris et 200 rats seront nécessaires aux études des chercheurs pour les 5 prochaines années.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation en portoir ventilé avec enrichissement (coton, bâton à ronger et tunnel ou maison pour les souris, papier kraft et bâton à ronger pour les rats). Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. La température des cages et l’hygrométrie sont contrôlées, le cycle jour-nuit est de 12h. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément à la règlementation par des expérimentateurs formés et habilités. Un point de compression est réalisé en cas de saignement abondant.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques présentes dans notre établissement sont sélectionnées, maintenues et utilisées en fonction des objectifs scientifiques des projets de recherche Selon les projets (rats et souris) : Les animaux seront tatoués et génotypés entre 5 et 10 jours post-natals. Les animaux seront identifiés et génotypés par pose d’une bague à l’oreille entre 10 et 15 jours post-natals. Plus la biopsie est précoce, mieux c’est pour l’animal d’un point de vue du Bien-etre animal.
Caractérisation du modele de rat DMD avec une etude comparative de l’efficacité de deux produits de therapie genique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une partie des rats de ce projet porte la mutation du gène DMD, qui prive les muscles de dystrophine et cause dans la maladie de Duchenne une atrophie progressive des muscles et une atteinte du cœur. 368 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever tissus et fluides, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent un prélèvement au bout de la queue, des prises de sang, trois anesthésies générales, des mesures de la force musculaire, de l'activité électrique du cœur et des muscles, des fonctions cardiaque et respiratoire, et les rats traités reçoivent sans anesthésie une injection intraveineuse unique de thérapie génique. Le porteur conclut que toutes "les nuisances possibles sont localisées et réversibles", et écrit à propos de cette maladie que "les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire récessive liée au chromosome X et elle est causée par des mutations du gène DMD qui entraînent la perte de la protéine dystrophine, une protéine essentielle à la santé et au fonctionnement des muscles. Cette mutation affecte les muscles et provoque leur atrophie progressive causant une perte progressive de la fonction motrice avec, à terme, la perte de la capacité de marcher, puis une insuffisance respiratoire et une cardiomyopathie. La dystrophie musculaire de Duchenne se manifeste dès les premières années de la vie et malheureusement il n'existe pas encore de traitement curatif. La thérapie génique est en cours d’études pour re-établir l’expression de la protéine dystrophine dans les muscles et traiter la maladie. Il existe très peu de modèles animaux de la maladie Duchenne qui manifestent tous les symptômes de la maladie et sur lesquelles les études d’efficacité peuvent être amené. Le modèle de souris reproduit bien la pathologie au niveau des muscles squelettiques, mais seul le modèle de rats présente un déficit cardiaque représentatif de la pathologie. Pour cela nous envisagions la création d’une lignée de rat DMD pour déterminer les anomalies fonctionnelles au niveau des muscles du cœur et le biomarquers sanguing. L’étude de ce modèle au cours du temps nous permettra de mieux comprendre les processus pathologiques afin d’envisager les stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La caractérisation du modèle rat DMD nous permettra de déterminer la fenêtre optimale pour le traitement par thérapie génique dans la phase suivante. A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les rats DMD devraient permettre d’exprimer la protéine dystrophine au niveau des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une amélioration du phenotype dystrophique. Ce projet de développement non clinique permettra de comparer la dose minimale efficace de deux terapie genique afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la DMD par la thérapie génique chez les patients.
Procédures
Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques (virus non pathogènes transportant le médicament) seront délivrées par une injection intraveineuse unique sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes) ou anesthésié (10 minutes maximum avec l’anesthésie). Les rats seront soumis à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes : mesure de la force musculaire (durée moyenne 1 heure), mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité et de mobilité et mesure de composition corporelle (durée moyenne 15min). Certains de ces tests nécessitent une anesthésie ou un traitement antidouleur préalable : pour réaliser l’ensemble des tests, les rats recevront trois anesthésies générales par voie aérienne, une injection d’un traitement antidouleur et une injection d’une molécule anesthésique avant l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation de la fonction des organes seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un bout de queue ou d’oreille, des injections du traitement thérapeutique, des injections de molécules anesthésiques ou antidouleurs, ainsi qu’au moment des prélèvements de sang. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire. Une sécheresse oculaire pourrait être observée au cours des anesthésies gazeuses. Des irritations de la peau pourraient être observées à l’endroit de l’épilation nécessaire pour la mesure de la fonction cardiaque. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements et analyses des tissus et des fluides.
Remplacement
La maladie de Duchenne est causée par l’absence d’une protéine appelée la dystrophine : les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions. Le projet consiste à mesurer l'effet d’un médicament composé d’un virus non pathogène transportant la dystrophine au sein des cellules cardiaques et musculaires malades : ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de virus transporteurs de notre médicament entraine une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre les virus, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.
Réduction
Le nombre de rats utilisés dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats (groupes de 10 ou 11 rats selon les procédures) ; 2) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) ; 3) l’obtention des rats non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux et 4) un suivi quotidien, des règles strictes de raffinement et le respect des points limites permettant de garantir le bien-être animal et l’exploitation de toutes les données produites.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant certains tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles. Lors de certains de ces tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie gazeuse ou sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant et pendant les 48 heures qui suivront la fin des tests. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur. Tous les tests seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés une fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance. Les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés par la communauté scientifique pour mesurer l'efficacité de médicaments pour la maladie de Duchenne (DMD), pathologie qui affecte le bon fonctionnement des muscles et du cœur. Le modèle de souris de cette maladie permet une évaluation très complète des différents muscles, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque typique des Hommes affectés par la maladie. Le rat est le modèle reproduisant tous les aspects de la pathologie (atteinte des muscles et du cœur). L'utilisation du modèle de rats DMD permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les rats utilisés seront de jeunes adultes âgés de 1 mois à 9 mois. La caractérisation préalable du modèle permettra de déterminer à quel moment la pathologie apparait et son évolution, ce qui permettra de tester l’effet du traitement à différents stades de progression de la maladie (prévention ou guérison), afin de se rapprocher au plus juste des différentes conditions de traitement qui seront testées sur les malades humains.
Etude de la modification des membranes cellulaires dans la neuropathie toxique induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Un score de douleur supérieur à quinze déclenche la mise à mort du rat concerné. 96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever des tissus du système nerveux. Ils reçoivent des administrations répétées d'un anticancéreux jusqu'à développer une neuropathie, puis subissent chaque semaine un test d'allodynie tactile d'une heure au maximum par animal et un test d'allodynie au froid, avant une mesure de la conduction du nerf sciatique sous anesthésie. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée mais "indispensable", et retient le rat parce que son activité et son comportement spontanés conviennent à l'étude de la douleur par tests comportementaux.
Objectifs
L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.
Procédures
Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max). La mesure de la conduction se fera sur animal sous anesthésie permettant la pose des capteurs au niveau du nerf sciatique (3-5 min max) avant euthanasie.
Impact sur les animaux
L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à la mise à mort de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15.
Choix des espèces
Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet.