Rats

424 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse de leurs tissus. Sevrés à un mois, ils reçoivent jusqu'à deux injections sous la rétine sous anesthésie générale, subissent jusqu'à six examens du fond d'œil et trois électrorétinogrammes, et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la jugulaire portant chacun sur 10 à 15 % de leur volume sanguin. Le projet teste des outils de thérapie génique contre la maladie de Stargardt et sert aussi, selon les finalités déclarées, à la formation professionnelle. Le porteur justifie le choix du rat par la taille de l'œil, cinq fois plus gros que celui de la souris, qui facilite l'injection et permet, écrit-il, de récolter suffisamment de matériel après la mort de l'animal.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique rare qui touche les yeux, et plus particulièrement la rétine, une partie essentielle pour voir. Elle affecte surtout une zone appelée la macula, qui nous permet de voir les détails et de bien voir en plein jour. Environ 1 personne sur 8 000 à 10 000 est concernée par cette maladie. Dans la rétine, il y a des cellules qui réagissent à la lumière, appelées photorécepteurs, qui utilisent de la vitamine A. Mais quand ces cellules captent de la lumière, elles produisent des déchets toxiques. Normalement, une protéine, la ABCA4, aide à se débarrasser de ces déchets. Cependant, quand il y a un problème dans le gène ABCA4, les déchets s'accumulent et détruisent ces cellules, ainsi que d'autres cellules importantes dans l’œil. Pour l’instant, il n’y a pas de traitement pour cette maladie. Des chercheurs essaient d’utiliser une technique appelée thérapie génique pour corriger le gène ABCA4. Ils envisagent d’utiliser CRISPR/Cas9, un outil pour modifier les gènes. Le problème, c’est que le gène ABCA4 est trop grand pour être inséré facilement dans les cellules avec les méthodes actuelles, comme avec des vecteurs viraux (des virus modifiés qui servent de transporteurs). Les scientifiques cherchent donc à améliorer ces vecteurs et à essayer d’autres solutions, comme utiliser des mini-versions du gène ou des "nanoblades", sortes de petites "lames" moléculaires, avec des lentivirus (autres types de transporteurs). Les nanoblades ont déjà été testées dans d’autres parties du corps, mais pas encore dans l’œil. Enfin, un autre souci avec les vecteurs viraux est qu’ils peuvent déclencher une réaction du système immunitaire ou que leur effet ne dure pas assez longtemps. Les chercheurs doivent donc bien évaluer ces nouvelles approches pour trouver la meilleure solution pour traiter la maladie de Stargardt.

Bénéfices attendus

En thérapie génique, plusieurs facteurs peuvent provoquer une réaction du système immunitaire, comme la quantité de vecteur utilisé, le type de gène ajouté, ou la façon dont le traitement est administré. Pour la maladie de Stargardt, le gène ABCA4 est très grand, ce qui complique son insertion dans les vecteurs viraux habituels, comme les AAV (Virus Adéno-Associés). Cette étude vise à trouver la meilleure manière de corriger le gène ABCA4 et s’assurer qu’il n’y a pas de réponse immunitaire après l'insertion du gène dans l’œil. La technique CRISPR/Cas9 (outil moléculaire qui permet de couper des parties ciblées de l'ADN), déjà testée pour une autre maladie des yeux, offre de l’espoir pour traiter la perte de vision due à la maladie de Stargardt. L’utilisation d’un minigène permettrait de réparer plusieurs parties du gène ABCA4 en même temps, ce qui pourrait aider de nombreux patients avec des mutations différentes. En combinant les lentivirus et les nanoblades, les chercheurs espèrent améliorer l’efficacité du traitement, cibler précisément les cellules touchées, réduire la quantité de vecteur viral nécessaire et rendre l’intégration du gène plus sûre dans les cellules. Si cette approche fonctionne, elle pourrait non seulement soigner la maladie de Stargardt, mais aussi d’autres maladies liées à des gènes similaires

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne (ISR) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. Pour l’évaluation de certaines stratégies, jusqu’à deux ISR seront réalisées, espacées de 3 semaines. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT : Fond d’œil – Tomographie en Cohérence Optique) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de l’examen 30 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 6 FO-OCT. (iii) Imagerie rétinienne (ERG : Electro-Rétinogramme) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de l’examen 30 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 3 ERG. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 10-15% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire après anesthésie gazeuse de l'animal. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 4 prélèvements sanguins qui seront espacés d’au moins 2 semaines. Toutes les anesthésies seront espacées d’au moins une semaine pour laisser un temps de récupération à l’animal.

Impact sur les animaux

A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Le modèle rat est un modèle qui tolère bien des injections de fortes doses de vecteur en sous rétinien. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les anesthésies répétées peuvent stresser les animaux mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif (en cas d’anesthésie fixe) pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.

Devenir

L'euthanasie des animaux est nécessaire pour obtenir les échantillons de tissus sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés sur des cellules en laboratoire pour évaluer l'efficacité de différents systèmes de thérapie génique. Cependant, ces modèles en laboratoire ne peuvent pas reproduire toute la complexité des interactions biologiques présentes dans un organisme vivant. Cela rend difficile la reproduction de ces résultats dans un corps vivant. En laboratoire, il est aussi impossible de vérifier la répartition du traitement dans le corps ou son efficacité thérapeutique complète. La rétine de l'œil, qui est une structure complexe faite de plusieurs couches de neurones et de cellules nourricières, ne peut pas être recréée parfaitement en laboratoire. Même avec des méthodes utilisant des cellules souches, il est difficile de tester les interactions complexes du cycle visuel. C'est pourquoi l'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier comment les gènes se comportent dans la rétine avant de commencer les essais cliniques sur l'homme. Les rats sont préférés aux souris pour ces études car leurs yeux sont cinq fois plus gros, ce qui facilite l'injection et assure une meilleure répartition du traitement. De plus, la taille de leurs yeux permet de récolter suffisamment de matériel pour les analyses après leur mort.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux nécessaire pour nos expériences. Ce nombre est basé sur des tests similaires que nous avons déjà effectués. En examinant les études publiées et notre propre expérience en laboratoire, nous avons déterminé que 8 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des résultats fiables. Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques pour analyser les données générées par l’expérience.

Raffinement

Toutes les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie générale et locale pour minimiser la douleur. Si nécessaire, des analgésiques et anti-inflammatoires seront ajoutés. Les animaux seront surveillés chaque jour et le vétérinaire sera informé dès que des signes de détresse apparaîtront pour adapter les soins. Pour leur bien-être, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec du papier froissé, des bûchettes de bois et des tunnels. Si un animal doit être hébergé seul, nous augmenterons les éléments d'enrichissement pour lui. Ils auront toujours accès à la nourriture et à l'eau en permanence. Nous appliquerons des critères d'arrêt stricts pour intervenir rapidement en cas de souffrance, en fournissant des traitements pour la douleur ou en prenant la décision d'une euthanasie si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons des rats Long Evans, qui ne sont pas albinos, car leur vision est moins affectée par l'âge, ce qui est important pour analyser l'effet des traitements sur la structure de la rétine. Pour tester l'efficacité, nous utilisons des rats génétiquement modifiés pour avoir la maladie de Stargardt. Ces rats, provenant de la lignée Sprague Dawley, ont été créés avec la technologie CRISPR/Cas9, qui nous a permis de produire des rats n’exprimant plus le gène ABCA4 (ABCA-/-). Nous avons confirmé que ce modèle présente les caractéristiques attendues de la maladie, avec des problèmes métaboliques dans la rétine similaire à ceux observés chez les patients. Les rats seront des jeunes sevrés (à l’âge d’un mois) pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.

1 908 souris et 297 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de vecteur viral dans la veine de l'œil ou dans la veine de la queue, des prélèvements de sang hebdomadaires, des mesures répétées de force et de fatigue musculaires sous anesthésie, et des évaluations cardiaques précédées d'une épilation du thorax. Le projet sert à fixer la dose qui figurera dans le dossier réglementaire déposé pour obtenir l'autorisation d'essai clinique, après des cas de toxicité graves allant jusqu'au décès de patients traités à forte dose. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire la perte de locomotion ni les réactions immunitaires déclenchées par un vecteur d'origine virale.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des maladies génétiques invalidantes affectant le muscle squelettique et sans traitement à l’heure actuelle. Elles sont dues à des mutations de gènes. Une option thérapeutique possible pour ces pathologies est la thérapie génique qui consiste à transférer une copie normale du gène déficient à l’aide d’un transporteur, un virus modifié capable d’amener le gène thérapeutique dans la cellule sans entrainer d’effets nocifs. Ces virus modifiés sont appelés des vecteurs. Le muscle squelettique représente environ 40% de la masse corporelle, ce qui nécessite d’utiliser des doses élevées de vecteur pour toucher l’ensemble de la musculature. Cependant, ces doses élevées de virus modifié peuvent entrainer des effets secondaires graves. Par conséquent, il y a un besoin de développer des produits efficaces à plus faible dose. Des études préliminaires ont permis d’obtenir des vecteurs efficaces à plus faible dose pour transférer un gène dans le muscle (jusqu’à 10 fois plus efficace). La meilleure dose efficace n’est pas connue. L’objectif de ce projet est donc de déterminer in vivo la meilleure dose efficace de ces nouveaux produits sur des modèles rongeurs de maladies musculaires. Les traitements seront administrés à 2 âges afin de mimer 2 stades différents des maladies humaines. Les analyses réalisées permettront de définir la dose conduisant à un effet thérapeutique, ce qui servira à déterminer la dose qui sera utilisée chez l’homme lors d’essais cliniques. Les études seront incluses dans le dossier réglementaire à déposer aux agences dans le but d’obtenir l’autorisation d’essai clinique.

Bénéfices attendus

Les produits de thérapie génique en cours de développement clinique utilisent des doses élevées de vecteurs, qui se sont parfois assorties d’effets toxiques importants, conduisant dans le pire des cas au décès du patient. Ce projet a pour but d’identifier des produits de thérapie génique de seconde génération efficace à plus faible dose, ce qui permettra de résoudre les problèmes de toxicité, tout en conservant une bonne efficacité thérapeutique.

Procédures

Le traitement par transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux anesthésiés pour l’injection à la veine de l’œil soit sur animaux non anesthésiés pour l’injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. Afin d’évaluer le bénéfice du traitement, des explorations de la fonction musculaire seront réalisées sur les animaux en début et au cours du protocole. Leur durée moyenne est de 10 minutes. La fatigue musculaire sera également évaluée plusieurs fois au cours du protocole avec un maximum de trois à cinq fois selon la durée post-injection. Les animaux sont anesthésiés, l’examen dure environ 20 minutes. Les animaux sont soumis à une évaluation de la fonction cardiaque au début et en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont les suivantes: → Les animaux seront maintenus en contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. → Certains actes mesurant la force du muscle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil. → Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment de l’injection intraveineuse du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique ou de dobutamine, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang. → Des lésions locales de type inflammatoire ou des irritations accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par l’épilation nécessaire pour pratiquer les mesures de la fonction cardiaque, par la pose d’électrodes au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé. Une sécheresse oculaire peut également être observée au cours des anesthésies. → Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte légère ou modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes et des muscles pour l’analyse des tissus et des niveaux de produits thérapeutiques reçus afin de vérifier l’efficacité thérapeutique et l’absence de toxicité.

Remplacement

Le projet consiste à déterminer l’effet thérapeutique de nouveaux produits de thérapie génique au niveau des muscles squelettiques et du coeur. Cette évaluation ne peut pas être réalisée dans des modèles cellulaires car 1) il est impossible de mimer les symptômes de la maladie dans ces modèles (type perte de la locomotion ou atteinte des paramètres cardiaques) ; 2) Il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du produit thérapeutique entre les différents organes ; 3) Il est impossible de recréer en laboratoire les réactions immunitaires complexes qui peuvent se développer après l’injection de vecteurs d’origine virale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats significatifs sans utiliser d’animaux surnuméraires. Nous utiliserons les mêmes animaux témoins pour des expériences différentes chaque fois que possible. Un maximum d’analyses sera réalisé sur chaque organe prélevé. Un nombre plus important de doses sera testé sur les jeunes animaux, et selon les résultats obtenus, un nombre réduit de doses sera testé sur des animaux plus âgés, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en tout.

Raffinement

Pour les animaux non issus de l’élevage, une phase d’adaptation sera respectée avant la réalisation des procédures. L’ensemble des animaux est observé quotidiennement au niveau de la cage. Afin de limiter le stress et la douleur induite par les prélèvements de sang, ces derniers seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Dans le cas des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie gazeuse, des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus. Un point de compression est systématiquement réalisé pour favoriser la coagulation. La survenue de signes hémorragiques, gonflements ou rougeurs sera surveillée après le prélèvement. Un test de course sera réalisé : une phase d’entrainement sera réalisée pendant 4 à 7 jours avant le test. Lors des tests de mesure de la force des muscles, il y a un risque exceptionnel de blessure. Dans ce cas, un traitement à la bétadine sera prodigué jusqu’à la cicatrisation. La mesure de l’activité électrique du muscle sera réalisée après un traitement anti-douleur préalable réalisée 30 minutes avant le test. Le test sera réalisé sur une plaque chauffante sous anesthésie aérienne. Lors des mesures de l’activité du cœur, une épilation du thorax est réalisée : une application locale de crème anti-irritation sera réalisée à l’endroit de l’épilation. Lors des anesthésies, les animaux sont placés sur plaque chauffante.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car ces modèles reproduisent les caractéristiques principales des maladies étudiées. Dans le cas des modèles de la maladie de Duchenne, le modèle de rat présente des atteintes cardiaques plus représentatives de la pathologie humaine, tandis que le modèle de souris est un meilleur modèle de la pathologie du muscle. Dans certains modèles, le modèle de rats présente des cellules immunitaires spécifiques de la pathologie humaine, mais seule la souris présente une réduction de la force des muscles. L’utilisation de deux modèles de rats ou de souris est donc nécessaire, selon la question scientifique posée. D’autre part, les espèces de souris et de rats sont faciles à manipuler, héberger, et se reproduisent facilement et rapidement. Les approches de thérapie génique ont des efficacités variables selon l’état du muscle: elles sont généralement plus efficaces à des stades précoces, notamment parce que le tissu est en meilleur « état ». Pour cette raison, la dose efficace d’un même produit peut être différente selon l’état d’avancement de la pathologie Dans ce projet, dans le but de traiter des patients ayant des avancées différentes des maladies, il sera nécessaire d’utiliser des animaux adultes jeunes et des animaux plus âgés afin de reproduire les stades précoces et tardifs des pathologies.

Anesthésiés, entaillés au dos pour y créer une plaie en dix minutes environ, puis traités par injections intradermiques selon trois calendriers différents, 60 rats passent ensuite trois semaines seuls en cage pour éviter qu'ils ne s'arrachent les pansements. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le projet sert à choisir le rythme d'administration d'un traitement régénératif pour les études d'efficacité qui suivront, chez le rat sain puis chez le rat diabétique. À la fin des trois semaines, le sang est prélevé dans le cœur sous anesthésie profonde, puis les 60 rats sont tués pour prélever la peau et un ensemble d'organes.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de cette étude préliminaire est d’évaluer in vivo chez le rat le schéma de traitement optimal d’un nouveau traitement régénératif sur la cicatrisation de plaies cutanées. Des études in vitro sur des modèles cellulaires, cultures de fibroblastes et de kératinocytes, ont permis de démontrer une activité hyperproliférative cellulaire laissant envisager une régénération accélérée et donc une cicatrisation plus rapide de plaies cutanées, ainsi qu’une activité anti-inflammatoire associée. Ce projet constituera la toute première évaluation in vivo sur un modèle de plaie cutanée chez le rat de ce nouveau traitement régénératif, en comparaison avec un placebo. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués selon 3 schémas de traitement différents afin de déterminer le schéma de traitement optimal pour les études d’efficacité qui seront menées à la suite chez le rat sain puis chez le rat diabétique, avec différentes doses de ce nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif. A l’issue des 3 semaines de l’étude, des dosages hématologiques et biochimiques seront effectués sur un prélèvement de sang effectué en intracardiaque après placement des animaux sous anesthésie générale gazeuse, suivi après leur euthanasie du prélèvement de peau au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’organes pour la réalisation d’analyses histologiques et immunohistochimiques. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner le schéma de traitement du nouveau traitement régénératif montrant la meilleure efficacité sur la cicatrisation pour en poursuivre son développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

L’induction d’une plaie cutanée, effectuée sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. Les traitements par injections intradermiques, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, engendreront une douleur très localisée au niveau de chaque site d’injection. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats, pendant une durée de 3 semaines, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Procédures

Les 60 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis éventuellement 6 heures, 12 voire 24 heures après celle-ci si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées suivant 3 schémas de traitement différents : 1 seule fois, 1 fois par semaine ou 2 fois par semaine après induction de la plaie cutanée, sous anesthésie générale, en 8 minutes environ. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements seront effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, et engendreront une douleur très localisée et transitoire. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes ouvertes, permettant à chaque rat de voir, sentir et entendre au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 60 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez le rat mâle ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection ou d’ulcération de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des briques en bois et un tunnel en carton de large diamètre seront placés dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité avec différentes doses du nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif, chez le rat sain puis diabétique. Les animaux seront de jeunes rats mâles et femelles âgés de 8-10 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-11 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats mâles utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.

Objectifs

La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.

Procédures

Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.

Remplacement

Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.

Des rats sains, retenus comme le modèle rongeur "le plus prédictif" en toxicologie, sont les premiers à recevoir les candidats médicaments de ce laboratoire. 2 700 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 pouvant être réutilisés dans un autre projet, les autres tués pour le prélèvement du sang, du liquide céphalorachidien et des organes. Ils reçoivent le composé jusqu'à trois fois par jour pendant quatre semaines, par gavage ou par injection, subissent jusqu'à six prises de sang en 24 heures, un recueil urinaire de dix-sept heures en cage à métabolisme et des examens ophtalmologiques et cardiologiques. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études réglementaires ultérieures, en écartant plus tôt les candidats les moins prometteurs.

Objectifs

Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif de la recherche et du développement (R&D) de nouveaux candidats médicaments est de développer de nouvelles entités chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. Pour un candidat médicament, la R&D pharmaceutique in vivo se doit de déterminer la fenêtre thérapeutique pour l’administration chez l’Homme, c’est-à-dire l’intervalle de doses entre lequel le candidat est à la fois actif et efficace (pharmacologie) et engendre le moins de toxicité possible (sécurité non clinique). Pour cela, des études de toxicologie (incluses dans cette demande d’autorisation de projet) ainsi que des études de pharmacologie (efficacité, mode d’action du candidat médicament) doivent être mises en place préalablement à tout essai clinique chez l’Homme. Lors du développement d’un médicament, il est nécessaire d’évaluer en parallèle : - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres projets) - et la sécurité : à l’aide d’études de toxicologie sur le rat sain (forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et modèle rongeur considéré comme le plus prédictif en toxicologie) (procédures encadrées par la présente DAP). Les études préliminaires in vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet permettent de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître la fenêtre thérapeutique (gradient pour lequel des doses sont à la fois efficaces et non toxiques). Les données d’efficacité et de sécurité permettent ainsi conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament. Les études de ce projet interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études in vivo réglementaires) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après une première étape de caractérisation et de sélection des molécules in vitro (tests de neurotoxicité ou d’hépatotoxicité sur des cellules) et in silico (analyse informatique de la toxicité d’un composé pour le génome). Elles sont réalisées chez le rat uniquement pour les candidats médicaments les plus prometteurs qui seront utilisés pour la suite du développement afin de déterminer en parallèle leurs profils de sécurité, s’ils n’étaient pas encore établis.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisé pour un projet) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ains le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisé pour un projet.

Procédures

- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : • Administration orale : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour) (Degré de sévérité léger) • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). • Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une intrapéritonéale unique ou modéré si l’administration intrapéritonéale est réitérée. Pour les autres types d’administration degré léger. • Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) • Recueil urinaire (cages à métabolisme) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (inférieure à 17h) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). • Administration sous-cutanée (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (Degré de sévérité léger). Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalorachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple -ou s’il s’agissait d’animaux finalement non inclus.

Remplacement

Ce projet couvre l’ensemble des études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. En effet, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études. S’ajoutent à cela des informations des études de pharmacologie sur l’efficacité des candidats médicaments, permettant de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo

Réduction

Une sélection des molécules les plus prometteuses est réalisée à l’aide de tests vitro / silico avant la mise en œuvre de ce projet. Le nombre habituel d’animaux (4 à 8 animaux/dose avec une mixité conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Il permet d’intégrer de la mixité (nécessaire pour évaluer la toxicité d’un composé sur l’appareil reproducteur mâle et femelle) dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Ces études permettent de confirmer les données obtenues grâce aux méthodes alternatives Elles sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (développement de modèle et de recherche de mode d’action du candidat médicament). Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études de pharmacologie, le développement de la molécule peut être arrêté évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Elles permettent aussi de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque et l’impact sur le bien-être des animaux. Selon la procédure, un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, etc…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet. En cas de protocole particulier (exemple : nouveau schéma d’administration ou suivi d’un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être impliqué pour définir un design expérimental optimal. Enfin, la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les volémies physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou non, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat mise en place avant l’apparition des points limites. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont manipulés et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (exemple : contention pour administration par injection). L’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Les groupes peuvent être mixtes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire par exemple), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). La durée du recueil urinaire sera limitée à son strict minimum (maximum de 17h). Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision, une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Les 2 procédures de ce projet sont réalisées sur l’espèce rat car elles interviennent en amont des études réglementaires réalisées sur ce modèle. Comme ces études permettent, en particulier, de choisir les doses et le schéma d’administration des études réglementaires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires obligatoires, elles doivent être réalisées sur le même modèle expérimental que celui des études réglementaires. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. Lorsque cela est possible, l’espèce rat doit répondre aux effets pharmacodynamiques du candidat médicament. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en parallèle chez la souris. Les animaux sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Tester des molécules antiépileptiques pour le compte de clients suppose une lignée de rats sélectionnés de génération en génération pour faire des crises d'absence. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers d'entre eux subit une neurochirurgie d'une heure doublée d'une chirurgie abdominale pour la pose de capteurs, puis des enregistrements cérébraux de deux à quatre heures une à deux fois par semaine, des injections pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant 28 jours, et un hébergement en cage individuelle après l'implantation. Le porteur chiffre les effectifs d'après "l'activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années", l'utilisation réelle dépendant de "la demande".

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantesdans le monde. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, une forme généralisée d’épilepsie sera étudiée : l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requière tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes. Puis ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif ; Une étude pharmacologique sur ce modèle a montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients ainsi qu’une aggravation des crises chez le rat avec les mêmes antiépileptiques. Ce modèle, au cours des années, est devenu un modèle de référence pour évaluer les effets soignants et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Le but de se projet est d'identifier les nouvelles molécules pouvant soigner l'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l'épilepsie et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Procédures

Environ 1/3 des animaux de ce projet vont subir : - une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. - une chirurgie abdominale (en simultané avec la neurochirugie) pour le placement de capteur - la pose de dispositif sous cutané sous anesthésie générale (1/4 heure) - des enregistrements une à deux fois par semaine pendant 2 à 4 heures. - Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. - des prélèvements sanguins pourront être faits.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Pour se faire la mise à mort des animaux en fin de chaque porcédure est nécessaire

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle vise à étudier des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, les animaux sont traités en plan d'étude croisé (tous les animaux reçoivent toutes les molécules avec à chaque fois une vérification de l’EEG avant une nouvelle administration - chaque animal est son propre contrôle). Chaque animal possède deux voies d’enregistrements permettant ainsi de réaliser les enregistrements même si un canal d’enregistrement devient inexploitable. Pour la procédure 1, nous pouvons l’estimer à 60 lots sur 5 ans (1 lot par mois). Un maximum de 14 rats par lot est prévu. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 120 lots (2x60) de 20 rats sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisé. Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’etude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 2400 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection d’analgésique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 heures après la première injection (0.05 mg/kg, i.p). Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements (= cours de récréation). Les animaux sont rassemblés dans une enceinte fermée avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. La lignée de rats utilisée a été développée en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et cérébrale que l’humain. Les activités neurologiques, visibles lors des enregistrements cérébraux ont des similitudes avec ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fasse sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises apparaissent à partir de l’âge de 30 jours post-natal et sont stables et bien établies à partir de 2 mois d’âge.