Rats
Modèle expérimental de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1425
Lapins : 1425
Une lésion est provoquée sur un seul œil de chaque animal, puis des gouttes sont instillées jusqu'à six à huit fois par jour et des produits injectés dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical. 1 425 souris, 1 425 rats et 1 425 lapins vont être utilisés, soit 4 275 individus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une gêne ou une douleur limitée à quelques heures après l'induction, tout en indiquant ailleurs que la lésion entraîne une altération partielle et permanente de la vision. Tous les animaux ayant suivi la procédure entière sont tués pour des analyses histologiques et des dosages.
Objectifs
La cornée, partie du globe oculaire située en avant de l'œil est un tissu transparent. Dans certaines pathologies, des vaisseaux sanguins envahissent de façon anormale l’intérieur de la cornée. Ce phénomène appelé « néovascularisation cornéenne », est un problème majeur de santé publique car la perte de la transparence de la cornée empêche une vision correcte et peut conduire à une cécité. Les origines de ce phénomène sont multiples : maladies héréditaires, séquelles d’un traumatisme ou d’une brûlure, complications d’infections virales ou bactériennes, complications de greffes de cornées, port prolongé de lentilles de contact. La majorité des traitements actuels ciblent la régression des vaisseaux par : - Application de produits anti-inflammatoires, - Coagulation des vaisseaux à l’aide d’un laser ophtalmique, - Transplantation de membrane amniotique. Ces traitements ne sont pas toujours efficaces et les effets secondaires fréquents ne sont pas à négliger : - Augmentation de la pression intra oculaire avec risque de glaucome, - Apparition de cataracte (opacification du cristallin, autre structure de l’oeil dont la transparence est capitale pour la vision). Les récents traitements visent les facteurs directement impliqués dans la formation de ces nouveaux vaisseaux au niveau moléculaire. L’objectif du projet est la mise en place au sein de l’établissement utilisateur de modèles expérimentaux de néovascularisation cornéenne chez le lapin et le rongeur afin de participer au développement de nouvelles thérapies pour cette pathologie. Le principe est d’induire sur un seul oeil, par différentes méthodes, la prolifération de vaisseaux suite à une lésion cornéenne.
Bénéfices attendus
Les pathologies de la cornée sont un réel handicap puisqu’elles peuvent conduire à la cécité. L’assemblage en couches cellulaires très organisées et dépourvues de vaisseaux, garantit la transparence du tissu essentielle à la vision. Ce « privilège » anti-angiogénique résulterait d’un équilibre entre production de facteurs anti-angiogéniques et répression de facteurs pro-angiogéniques. Lors d’une atteinte de la cornée, il y a une rupture dans cet équilibre, en faveur de la production de facteurs angiogéniques. Cette rupture entrainerait le développement de nouveaux vaisseaux à partir du limbe vers le centre de la cornée, le limbe étant la zone de transition entre la sclère opaque et la cornée transparente.
Procédures
La mise en place de la pathologie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique le jour de l’induction. Les procédures correspondantes décrites en détails dans la partie 4 ne dureront pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains (examens OCT, HRT) qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes (2-3 minutes pour un examen au biomicroscope, lampe à fente et 5 minutes pour les examens types OCT ou HRT). Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, l’induction de la lésion cornéenne devrait entrainer une gêne ou une douleur pendant quelques heures après l’induction. Elle sera soulagée par l’administration d’un analgésique. Nous avons déjà expérimenté ces modèles dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Conception et évaluation de nouveaux stents actifs pour réduire la resténose intra-stent et la thrombose aigue de stent.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Lapins : 80
Incisés, cathétérisés, munis d'un stent posé dans une artère iliaque puis recousus, 240 rats et 80 lapins subissent chacun une intervention d'environ une heure. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever les artères stentées et mesurer la resténose et l'inflammation. Il s'agit de comparer un nouveau stent actif à un stent nu, alors que les méta-analyses citées par le porteur n'ont pas mis en évidence de bénéfice des stents actifs existants. Le RNT annonce une douleur "légère à modérée" au motif que la paroi interne des vaisseaux n'a pas de récepteurs de la douleur, puis décrit hyperthermie, perte de poids, troubles de la cicatrisation, mobilité réduite et hébergement individuel de trois à sept jours après l'opération.
Objectifs
Le traitement endovasculaire est le traitement de choix des lésions athéromateuses peu évoluées des artères coronaires et périphériques. Au niveau des artères coronaires, plus de 80 % des procédures de revascularisation endovasculaires comportent la pose d’un stent. Cependant, un processus chronique de resténose après la mise en place du stent (resténose intra-stent, RIS) par prolifération cellulaire excessive survient dans 20 à 30 % des cas à 6 mois, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. Les stents actifs actuels ont permis une réduction de la RIS par libération d’agents cytotoxiques immunosuppresseurs qui inhibent le cycle cellulaire. Néanmoins, l’effet bénéfique de ces stents sur la limitation de la RIS est contrebalancé par un risque accru de thrombose aiguë tardive du stent, lié à la dé-endothélialisation et à l’absence de recouvrement des mailles par une néointima. Les méta-analyses réalisées jusqu’à présent n’ont donc pas mis en évidence de bénéfice lié à l’utilisation des stents actifs actuels. Plusieurs équipes de recherche tentent actuellement de mettre au point de nouveaux stents actifs libérant des drogues pro-cicatrisantes (drug-eluting stent, DES) afin de limiter et non d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires tout en permettant la ré-endothélialisation du stent, évitant ainsi les risques de thrombose aiguës. Malgré ces améliorations, un risque accru de thrombose tardive du stent a été observé avec la première génération de DES. Les travaux scientifiques dans ce domaine sont donc très demandés pour résoudre ces problèmes en optimisant les DES existants, tout en respectant la biocompatibilité avec le sang et les tissus. L'innovation et la recherche continuent pour améliorer tous les aspects de la technologie DES, tels que le matériau et la structure de la plate-forme, les polymères, la distribution de l'enrobage, l'enrobage supplémentaire et les médicaments antiprolifératifs, ce qui a conduit à des générations plus récentes et améliorées de DES. Pour cela, les différents axes de recherche exploités dans notre équipe sont : changer la plateforme du stent en elle-même, modifier la surface du stent et libérer localement des anticoagulants, des traitements antiplaquettaires ou antiprolifératifs pour inhiber la croissance néo-intimale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche préclinique sur les nouveaux stents actifs de nouvelle génération offre de nombreux avantages potentiels en termes de compréhension de sa sécurité et de l'efficacité, de réduction des risques pour les patients et de développement de nouvelles approches pour prévenir la resténose. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Compréhension de la réponse artérielle et aperçu mécaniste des processus biologiques : La réponse artérielle à l'implantation d'un stent est complexe, et les études chez l'animal sont essentielles pour prédire les performances chez l'homme. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la resténose et la thrombose, ce qui est crucial pour améliorer les traitements chez les patients. Les modèles animaux utilisés dans ce projet fourniront un aperçu mécaniste des processus biologiques fondamentaux, aidant ainsi à mieux comprendre ces mécanismes complexes. 2. Évaluation de la sécurité : L'évaluation préclinique des nouvelles technologies de stents est très importante pour comprendre leur sécurité potentielle. Il est essentiel de s'assurer que ces stents ne provoquent pas de complications ou de réactions indésirables chez les patients. 3. Potentiel d'efficacité : En plus de la sécurité, ces études peuvent également donner des indications sur l'efficacité potentielle des nouvelles technologies de stents actifs de nouvelle génération. Cela permettra d'identifier les stents les mieux adaptés à différentes situations cliniques. 4. Réduction des risques : Les stents actifs de nouvelle génération ont le potentiel de réduire les échecs de stent et les risques de thrombose aiguë en permettant la ré-endothélialisation du stent. Cela peut conduire à une forte réduction du risque de réintervention coronaire, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. 5. Plate-forme d'essai préclinique bien définie : Les modèles animaux établis dans ce projet fournissent une plate-forme d'essai préclinique bien définie pour évaluer les cibles et les stratégies de prévention de la resténose. Cela permet de tester de nouvelles approches avant de les appliquer chez l'homme. 6. Bénéfices pour la recherche et l'industrie : Ces études profiteront à plusieurs communautés au sein de la chaîne de développement, d'essai et d'évaluation clinique. Les résultats de ces recherches peuvent être utilisés par les chercheurs, les cliniciens et l'industrie pour améliorer les dispositifs médicaux et les traitements.
Procédures
Les deux procédures seront réalisées sur les animaux (rats et lapins) sous anesthésie générale et avec une analgésie péri-opératoire. Les gestes techniques comprennent des incisions cutanées, l'implantation d'un stent par voie endovasculaire, et enfin, les sutures cutanées. Au total, 240 rats et 80 lapins seront utilisés pour ces procédures. Chaque intervention sur un animal prendra environ 1 heure et ne sera effectuée qu'une seule fois sur chaque animal. Les prélèvements de tissue vaisseau à la fin de procédure sont réalisé sur les animaux euthanasié, aucuns prélèvements sont prévus sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Le projet est attentif à plusieurs nuisances et effets indésirables qui pourraient survenir chez les animaux de l'étude. Les points suivants seront particulièrement analysés : 1. Douleur légère à modère : Étant donné qu'il s'agit d'une chirurgie cardiovasculaire standard, la mise en place réelle du stent à l'intérieur de l'artère ne provoque généralement pas de douleur, car la paroi interne des vaisseaux sanguins ne possède pas de récepteurs de la douleur. Donc animaux ne ressentent rien pendant cette partie de la procédure. Cependant, une légère gêne ou une sensation de pression lors de l'insertion du cathéter peut être ressenti, donc une anesthésie locale sera généralement administrée pour engourdir la zone où le cathéter est inséré. 2. Hyperthermie : La recherche de la température de l'animal sera effectuée pour détecter tout signe d'infection post-opératoire. Ce risque est présent au moins pendant les 15 premiers jours, pendant le temps de cicatrisation cutanée. 3. Perte de poids : La perte de poids peut être due à la difficulté de mobilisation causée par la chirurgie au niveau du membre de l'animal, entraînant une restriction alimentaire et hydrique. Cette diminution du poids est prévisible pendant environ 7 jours, les rats retrouvant leur mobilité habituelle après ce délai. 4. Anomalies de cicatrisation : Des problèmes tels que désunion, saignement, hématome, ou écoulement suspect (indiquant une infection) seront surveillés pendant les 15 premiers jours, pendant le temps de cicatrisation cutanée. 5. Limitation de la mobilité de l'animal : Bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité peut être observée chez les modèles similaires au cours de la première semaine post-opératoire. 6. Altération de l'état physiologique par stress post-opératoire : Des manifestations telles que des troubles de posture, de toilettage, de dépilation peuvent survenir chez l'animal en raison du stress post-opératoire. Cette altération est prévisible pour une durée de 7 jours après l'opération. Il est important de souligner que ces effets indésirables et nuisances sont surveillés de près dans le cadre de l'étude. Des mesures adéquates seront prises pour minimiser ces effets et assurer le bien-être et le suivi approprié des animaux pendant toute la durée de l'étude.
Devenir
À l'issue de l'étude en deux procédures, une euthanasie sera réalisée car il sera nécessaire de prélever les artères iliaques stentées pour les analyses comparatives. Ces prélèvements permettront de procéder à des analyses histologiques pour vérifier le degré de resténose, des analyses biochimiques pour évaluer l'inflammation et l'efficacité de la drogue libérée. Plus concrètement, une comparaison sera faite entre le degré de resténose, l'inflammation et la ré-endothélialisation entre le stent nu et le nouveau stent actif. Si le nouveau stent actif s'avère plus performant que le stent nu habituellement utilisé, cela signifierait qu'il pourrait prévenir la formation de resténose intra-stent et de thrombose, tout en favorisant une ré-endothélialisation adéquate et une durée optimale du régime antiplaquettaire. La méthode d'euthanasie employée sera le surdosage d'anesthésique, réalisé sur un animal préalablement sédaté avec de l'anesthésie gazeuse.
Remplacement
Les stents à élution médicamenteuse (DES) doivent démontrer des bénéfices cliniques en termes de sécurité et d'efficacité acceptables. La sécurité de ces dispositifs semble plus facilement prévisible à partir de modèles in vitro, même si l'efficacité des DES peut être difficile à établir à partir de ces études. Cependant, avec la complexité croissante de ces dispositifs, les données cliniques corrélatives ont été accumulées, ce qui souligne l'importance croissante des modèles précliniques. Actuellement, il n'existe aucun moyen d'étudier la resténose in vitro, ex vivo ou in silico, car cela met en jeu des mécanismes physiopathologiques complexes résultant d'une inflammation, d'une prolifération et d'une migration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) du média vers la néointima, ainsi que d'une production excessive de matrice extracellulaire. Les modèles animaux de resténose sont donc essentiels pour comprendre ces processus physiopathologiques et évaluer la faisabilité, l'innocuité et l'efficacité des nouvelles cibles et des stratégies de prévention de la resténose. Il est donc nécessaire de développer des modèles précliniques simples, peu coûteux, rapides et précis pour étudier la resténose. Cependant, avant de réaliser des études sur des animaux, des analyses in vitro de cytotoxicité et de cytocompatibilité seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer la technique actuelle. Il est préférable d'avoir des données in vitro positives pour la ou les substances bioactives, en se concentrant sur des cibles cellulaires spécifiques, afin de prédire le succès biologique in vivo. Cela permettra de produire un équilibre favorable entre la croissance néointima, la couverture des cellules endothéliales, le remodelage des vaisseaux et le dépôt de thrombus, avec l'objectif de réduire au minimum le nombre d'animaux nécessaires pour les analyses in vivo. En somme, la recherche sur les stents à élution médicamenteuse nécessite des approches précliniques bien établies et appropriées pour comprendre la resténose et évaluer la sécurité et l'efficacité de nouvelles approches. Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans cette évaluation, mais l'utilisation d'analyses in vitro pertinentes permet de limiter la nécessité d'expérimentations animales tout en garantissant des résultats prometteurs pour les futurs traitements.
Réduction
La détermination du nombre d'animaux pour l'étude est basée sur une analyse de la littérature portant sur le même modèle animal, à savoir 10 études sur rat et 14 études sur lapin, toutes traitant du même sujet d'étude. Le nombre moyen d'animaux par groupe analysé dans ces études est de 10. Une seule étude a réalisé une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80%, et a trouvé un nombre minimal requis de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 animaux par groupe a été sélectionné pour cette étude. La stratégie de réduction du nombre d'animaux est également prise en compte dans le design de l'étude. Pour limiter au maximum le nombre d'animaux nécessaires, une première étape consistera à étudier la formation de néointima sur le modèle de rat. Cette première étape permettra de sélectionner les matériaux qui ont donné les meilleurs résultats à l'issue de ce premier modèle sur rat. Ainsi, la réalisation du deuxième modèle sur lapin se fera avec un nombre d'animaux réduit et ciblé, en se basant sur les résultats obtenus avec le modèle de rat. Cette approche permet d'optimiser l'utilisation des animaux et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires tout en obtenant des informations pertinentes sur les effets des matériaux étudiés. Elle s'inscrit dans une démarche éthique et responsable pour la recherche préclinique, en minimisant autant que possible l'impact sur les animaux tout en préservant la validité scientifique de l'étude.
Raffinement
Le principe de raffinement sera mis en œuvre par divers moyens afin d'assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude. Voici les mesures prévues : 1. Conditions de vie : Les animaux seront soumis à un cycle de 12 heures jour/nuit en alternance. Ils seront logés dans une salle avec un flux d'air contrôlé et une température maintenue à 21°C. Ils auront un accès libre à l'eau et à une alimentation standard, sans modification de leur régime habituel. 2. Enrichissement du milieu : Le milieu de vie des animaux sera enrichi pour leur permettre de manifester leur comportement naturel. Des éléments tels qu'un sol dur avec une litière, des moyens d'exploration et de cachettes (tunnels en carton, petits dômes en papier mâché, etc.) seront mis à leur disposition. Des éléments favorisant la nidification, comme des cylindres de coton, des carrés de cellulose et des rondelles de peuplier compressé, seront également présents. Des objets à ronger, tels que des morceaux de bois, seront fournis pour répondre à leurs besoins de mastication. 3. Vie sociale des rats : Avant l'intervention, les rats seront placés en cages comportant 3 à 4 rats, de manière à respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et compte tenu des conditions post-opératoires restreintes, ils seront logés individuellement pendant une période minimale de 3 jours, pouvant s'étendre jusqu'à 7 jours. Cela permettra de leur offrir un environnement optimal pour récupérer sans douleur après la procédure. 4. Surveillance du bien-être : Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux. Leur poids sera mesuré quotidiennement pendant les 7 jours suivant l'opération, puis une fois par semaine. La température sera surveillée pour détecter tout signe d'hyperthermie, qui pourrait indiquer une infection post-opératoire. Une évaluation quotidienne de la plaie post-opératoire sera effectuée pour détecter toute désunion, saignement ou hématome. La capacité de déambulation de l'animal sera évaluée quotidiennement et devrait revenir à la normale en 7 jours. Enfin, des analyses comportementales seront réalisées, notamment en observant la posture, la position des oreilles, l'enfoncement des yeux et en vérifiant si le toilettage est effectué normalement. Toutes ces mesures sont mises en place pour garantir le bien-être et le confort des animaux tout au long de l'étude, en conformité avec les principes éthiques de la recherche préclinique.
Choix des espèces
Le modèle rat de resténose intra-stent (RIS) est bien décrit et validé dans la littérature. Il permet d'observer un remodelage vasculaire suffisant pour étudier les variations du ratio entre l'épaisseur de la néo-intima et l'épaisseur du média formées après 28 jours d'implantation du stent, en réponse à un traitement pharmacologique. Ce modèle présente l'avantage d'être relativement peu coûteux et permet une analyse approfondie des mécanismes cellulaires impliqués grâce à une large gamme d'anticorps disponibles sur le marché, notamment pour des analyses par western blot. En ce qui concerne le modèle de RIS chez le lapin, il est considéré comme le meilleur modèle pour étudier la ré-endothélialisation des mailles du stent. Il permet également d'obtenir une resténose plus importante que chez le rat. Après avoir réalisé une première étude chez le modèle murin, la confirmation des résultats obtenus dans le modèle lapin est indispensable. Dans la littérature, l'implantation d'un stent dans les artères iliaques du lapin et les artères coronaires du porc sont les modèles animaux les plus couramment utilisés pour étudier la resténose. Cependant, ces modèles ne sont pas toujours idéaux pour mener une étude physiopathologique approfondie. Ils ont des limitations telles que le nombre limité d'anticorps disponibles pour l'analyse des protéines cellulaires, l'impossibilité de travailler avec des souches transgéniques ou knock-out, et des coûts élevés liés aux matériels radiologiques et chirurgicaux nécessaires pour les opérations. En revanche, le modèle de resténose chez le rat offre un large éventail d'outils de recherche expérimentaux et permet de tester différentes nouvelles thérapies contre la resténose. Ce modèle est donc un outil important pour mener des recherches approfondies sur la resténose et développer de futures thérapies pour lutter contre ce phénomène. De plus, il présente l'avantage d'être simple, peu coûteux, rapide et précis, ce qui en fait un modèle de dépistage utile dans l'étude de la RIS. Les rats utilisés seront de la souche wistar, âgés de 10 semaines, et les lapins seront de la race New Zealand white, âgés de 130 à 150 jours, présentant une hypercholestérolémie. Ces âges ont été choisis pour correspondre à un stade adulte de développement chez le rat et le lapin, ce qui les rend représentatifs de la population clinique des patients adultes qui sont pris en charge pour la mise en place d'un stent.
Etude de biodistribution de molécules marquées par des approches non invasives d’imagerie optique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 180
Anesthésiés une fois pour être dépilés, une fois pour recevoir la molécule testée, puis à chaque séance d'imagerie optique, jusqu'à trois par jour, 270 souris et 180 rats, soit 450 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque anesthésie dure dix minutes au plus, et une prise de sang en cours d'étude puis une prise terminale peuvent s'y ajouter. Les molécules, des anticorps ou fragments d'anticorps par exemple, viennent de clients, et l'entreprise déclare ne pas en connaître la nature, d'où des effets indésirables "difficiles à anticiper". Le nombre de jours d'imagerie n'est pas précisé. Tous sont mis à mort en fin de procédure, pour des prélèvements de tissus et de sang.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont multiples. En effet, il s'agit d'évaluer le comportement de molécules ou biomolécules (anticorps, fragments d'anticorps...) après administration chez l'animal vivant, par des approches d'imagerie non invasive. Cela permettra d'analyser la distribution au sein de l'organisme (tissulaire, organes d'élimination,...), l'évolution dans le temps, la durée avant disparition du signal (élimination).
Bénéfices attendus
En évaluant la biodistribution de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ce projet permettra d'apporter des informations précieuses et cruciales sur leur devenir suite à leur administratrion chez l'animal vivant, et aidera à la sélection des meilleurs candidats médicaments avant essais chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des anesthésies gazeuses : lors de la dépilation (1 fois), lors de l'administration de la molécule à tester (1 fois), puis une par session d'imagerie (maximum 3 par jour). Chaque anesthésie n'excèdera pas 10 minutes. Des prélèvements sanguins inférieurs à 1 minute (1 au cours de l'étude et 1 terminal) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
La manipulation, les administrations, les anesthésies et prélèvements peuvent provoquer du stress chez les animaux. Des effets indésirables liés à l'administration des molécules thérapeutiques (mauvaise tolérance...) peuvent être observés mais sont difficiles à anticiper car nous ne connaissons pas la nature des molécules de nos clients.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés. Des prélèvements de sang total pourront également être réalisés.
Remplacement
La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la distribution des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe. L'approche en imagerie non invasive permet de réduire et de raffiner le modèle d'étude : la stratégie d'expérimentation permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle (étude longitudinale). Des analyses post mortem (imagerie ex vivo et analyse des tissus) seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possible relatives aux molécules administrées.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal,...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Les procédures d'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, dans une enceinte avec lit chauffé. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : -Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au niveau du site d’injection de la molécule. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris/rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. En effet, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entre ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêtes pratiques décisifs: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont aussi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Travaux pratiques pour des sessions de formations règlementaires pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques (modèle rongeur).
- Formation professionnelle
Rats : 1470
Issus pour partie d'animaux de réforme de l'établissement, 1 550 souris et 1 470 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques de formation réglementaire, tous tués à l'issue, 2 100 opérés sous anesthésie sans réveil et 920 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut être contenu cinq fois dix minutes, recevoir cinq injections et subir deux prélèvements, puis une anesthésie de trente minutes à trois heures et une craniotomie, une laparotomie ou une cathétérisation. Ces séances servent à délivrer l'attestation de compétence exigée par la directive 2010/63/UE, avec un animal pour la démonstration de l'intervenant et un animal par binôme ou trinôme de stagiaires. Le porteur indique recourir à des rats inertes de type Koken, à un tapis de peau artificielle et à une vidéo pour certaines démonstrations, avant que les stagiaires ne passent aux animaux vivants.
Objectifs
Cette série de travaux pratiques a vocation d’enseigner les bonnes pratiques en expérimentation animale sur modèle rongeur (contention, préhension, prélèvement, analgésie, soins …) dans le but de minimiser les contraintes exercées aux animaux. Cet enseignement est dispensé pour des formations spécifiques destinées aux personnes concevant et réalisant des procédures expérimentales sur modèle rongeur mais également aux personnels appliquant des procédures chirurgicales. Il prend place dans la règlementation (Directive 2010/63/UE Article 23 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques) qui définit l’adéquation des compétences du personnel par rapport à la fonction exercée et délivre une attestation valable pour le suivi des compétences.
Bénéfices attendus
Le but de ces formations est d'acquérir une qualification rendue obligatoire par la règlementation européenne dans l'exercice de ses fonctions. Ces formations permettent aux stagiaires d’acquérir, au travers de sessions de TP sur modèles inertes et modèles animaux, les bonnes pratiques en chirurgie expérimentales chez le rongeur de laboratoire (notamment : maintien d’une asepsie, mise en place et monitoring d’une anesthésie générale, gestion de la douleur et des soins pré, per et post opératoire...), et ce, dans diverses approches chirurgicales (laparotomie, craniotomie...) Toutes ces formations sont agréées par le ministère de l’agriculture et de la souveraineté alimentaire.
Procédures
Contention des animaux (rat et souris) : 5 fois par animal, pendant 10 minutes. Injection/administration : 5 fois par animal, environ 5 minutes Prélèvement : 2 fois par animal pour les souris, environ 10 minutes. Anesthésies (30 minutes à 3 heures). Interventions chirurgicales (craniotomie, laparotomie, cathétérisation) (30 minutes à 3 heures).
Impact sur les animaux
Le nombre d’étudiants peut entraîner un stress pour les animaux vigiles. De la même manière l’apprentissage de la contention et de la manipulation des animaux vigiles peut générer un stress pour les animaux tout comme les prélèvements et injections intrapéritonéales et intraveineuses. Les animaux subiront une anesthésie et des interventions chirurgicales (craniotomie, laparotomie) et lors des procédures chirurgicales vasculaires, nous ne pouvons exclure un risque hémorragique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les animaux utilisés dans les procédures seront euthanasiés avant le réveil afin d’éviter toute douleur post-opératoire. Ils ne seront pas ré-utilisés pour éviter un effet cumulatif.
Remplacement
Cette série de travaux pratiques répond aux exigences des programmes de formations règlementaires (Concepteur/Opérateur et Chirurgie). Pour faciliter l'approche de certaines techniques de contention et voies d'administration, les modèles d'animaux inertes (rats Koken) seront utilisés. Les étudiants ne seront confrontés qu’ensuite aux animaux vivants. Avant le TP de télémétrie, une vidéo est présentée aux étudiants pour rappeler les bonnes pratiques et les étapes critiques, en insistant sur l’asepsie, la qualité de l’anesthésie, et la gestion de la douleur. Une approche similaire est en cours de mise en place pour les autres TP de chirurgie. Pour les techniques de suture, nous utilisons un tapis de peau artificielle.
Réduction
Le nombre de rongeurs utilisés est calculé à ce que nous estimons être le strict nécessaire pour un bon apprentissage : 1 animal pour l’intervenant à chaque TP pour la démonstration de l’intervention ainsi qu’1 animal par binôme/trinôme de stagiaires pour l’apprentissage. Nous privilégions systématiquement l’utilisation d’animaux de réforme issus de notre établissement utilisateur. Le recours à l'utilisation d'un support vidéo pour la partie démonstration de certains TP de chirurgie, en lieu et place d'un animal, sera un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser l’angoisse de certains animaux due au contexte d’une activité de formation (nombreuses personnes présentes), ceux-ci sont familiarisés à la manipulation par un technicien avant le déroulement de la procédure. Ils sont isolés dans une pièce annexe et sont amenés dans la salle d'expérimentation au fur et à mesure des besoins. Afin de réduire la douleur lors des actes chirurgicaux, des injections de solution d'anesthésique local sont réalisées systématiquement sur les trajets des incisions 5 minutes avant ouverture de la peau. Les rats et les souris seront anesthésiés en veillant bien à ce que le niveau d’anesthésie obtenu corresponde bien à une anesthésie chirurgicale, et que tous les réflexes (retrait membres, retrait queue..) soient effectivement abolis. Une analgésie sera mise en place 30 minutes avant chaque induction d’anesthésie. Le maintien de la température sera garanti par l’utilisation de couvertures chauffantes thermostatées. Pour les souris, la manipulation et la contention se fait en évitant la prise par la queue, et en privilégiant la prise par la paume de la main ou l’utilisation de tunnels de contention. Pour les rats utilisés dans le TP "contentions et administrations", pour limiter le stress associé à des manipulations multiples, une sédation légère sera réalisée.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des rongeurs (rats et souris) et répondent à la catégorie d’animaux des formations règlementaires agréées. Les animaux utilisés dans le cadre de ces TP sont des animaux adultes car ce sont majoritairement des animaux adultes qui sont impliqués dans les procédures expérimentales que réaliseront les stagiaires dans leurs laboratoires.
Evaluation du profil pharmacocinétique de candidats médicaments sur des rongueurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 408
Des candidats médicaments sont administrés en une fois ou chaque jour pendant quatorze jours, puis les animaux sont tués pour prélever leur cerveau. 612 souris et 408 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Il s'agit de mesurer comment les molécules se répartissent dans l'organisme et de choisir la voie d'administration la plus adaptée pour de futures études sur des modèles de maladies neurodégénératives. Le porteur annonce des points limites déclenchant la mise à mort sans en nommer un seul, et justifie six échantillons par groupe pour l'analyse par spectrométrie de masse sans expliquer comment on arrive à 1 020 animaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de générer des échantillons biologiques pour déterminer comment évolue la concentration, et la répartition de candidats-médicaments dans l'organisme en fonction du temps. Ce projet permettra également de déterminer la voie d’administration la plus adapté pour un candidat-médicament, pour de futures études d'efficacité dans des modèles pré-cliniques de maladies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour des maladies neurodégénératives. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats-médicaments pourra se poursuivre.
Procédures
Les animaux subiront des administrations de candidats médicaments, une seule fois ou quotidiennement sur 14 jours. Les stratégies d'anesthésies et d'analgésies impliquent des injections intra-péritonéales et souscutanées, ce qui peut induire à stress, juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les administrations de candidats-médicaments ou d'anesthésiques peuvent engendrer un stress lors de l’acte, notamment lors administrations chroniques. L’administration chronique de composé peut induire des nuisances en cas d’effets néfastes, pour cette raison, les animaux seront suivis quotidiennement
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. La mise à mort est nécessaire pour collecter les cerveaux.
Remplacement
Le profil de distribution tissulaire des candidats-médicaments dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide céphalorachidien, sa capture par différents types cellulaires et son élimination. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux a été déterminé pour minimiser le nombre d'animaux, en lien avec le laboratoire d'analyse qui traitera les échantillons biologiques. L'analyse par spectrométrie de masse sera réalisée avec 6 échantillons par groupe. Pour maintenir les relations sociales et limiter le stress, les animaux seront hébergées à plusieurs par cage (entre 2 et 4), et auront accès à des objets d'enrichissements
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les rats seront hébergés par 2, et les souris seront hébergées, au minimum par 2, et, au maximum par 4, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les procédures expérimentales utiliseront soit des souris, soit des rats. Le choix de l'espèce est motivée par la nature du projet et de la suite éventuelle en cas de résultats significatifs (pour évualier l'efficacité du composé, des modèles précliniques basés sur des souris ou des rats pourront être utilisés). Le type d'échantillons à collecter (ex. le volume de liquide céphalorachidien est plus important chez le rat, en comparaison avec la souris) pourra également orienter le choix du modèle. Les rongeurs, dont les souris et les rats, possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Les rongeurs sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Nous disposons d'équipements dédiés aux études impliquant des souris ou des rats. Les candidats-médicaments visent à traiter des maladies humaines apparaissant à l'âge adulte. Les rats seront âgés de 8 à 10 semaines, et les souris seront agées de 8 semaines, ce qui correspond à un stade de développement adulte.
Evaluation des effets anti-douleur d’un ou plusieurs candidats médicaments à l’aide d’une série de modèles de douleur associés à différents tests chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Un service de criblage de candidats médicaments antidouleur, facturé à la demande, mobilise onze modèles de douleur différents chez le rat. 12 600 rats vont être utilisés, 800 réutilisés et 11 800 tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 200 d'entre eux, modéré pour 4 800 et sévère pour 6 600. Douleur viscérale provoquée par un agent chimique et par distension du colon, douleur inflammatoire ou post-opératoire avec pression mécanique sur la patte, douleur neuropathique chronique induite par chirurgie, immersion de la patte dans un bain à 10 degrés, stimulus chaud sur la queue, jusqu'à six mesures par jour. Le porteur écrit qu'aucune analyse statistique ne sera réalisée, que les groupes témoins sont supprimés au profit de données historiques, et conclut que ce service permet "de répondre au mieux aux exigences des 3Rs".
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Il est intéressant dès les premiers stades de développement de tester les nouveaux principes actifs dans différentes aires thérapeutiques (douleur aigue, inflammatoire, viscérale, neuropathique et post-opératoire) afin d’évaluer leur efficacité. Ceci va permettre d’orienter le candidat-médicament vers un domaine d’application. Dans le cadre de ce projet, nous proposons un service de screening dans le domaine de la recherche préclinique de la douleur chez le rat. Ce service de screening s’appuie sur une sélection de 11 modèles/tests reconnus et maitrisés, il permet d’orienter la recherche. Ces études sont réalisées sur un nombre limité d’animaux tout en s’appuyant sur une puissante base de données historiques récoltées depuis plus de 15 ans par le laboratoire. Ce service permet ainsi de répondre au mieux aux exigences des 3Rs. Le but à long terme est de permettre le développement de nouvelles pharmacologies de référence dans le traitement de la douleur tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires. Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients
Procédures
Induction du modèle : chirurgie (15-20min) ou injection en intrapéritonéale (quelques secondes) afin d’induire le modèle. Ils seront ensuite testés avec un des tests suivants. Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Contention, isolement dans des compartiments Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Une douleur viscérale « chronique » ou aigue induite par un agent chimique et par distension colonique. Une perte de poids, une déshydratation ou une mauvaise cicatrisation (nuisances modérées) peuvent être attendues chez certains animaux. Une mise à jeun sera réalisée dans ceratines procédures - Une douleur inflammatoire ou post-opératoire avec inflammation de la patte et application d’une pression mécanique sur la patte - Une douleur neuropathique chronique induite par chirurgie ou aigue induite par un agent chimique. Une atteinte de la motricité est attendue. Des nuisances sont également attendues le jour du test lors de la contention et de la réalisation du test de pression de la patte et du test d’immersion de la patte dans un bain à 10°C. - Une douleur aigue liée à l’application d’un stimulus chaud sur la queue ou à la pression de la patte. Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère
Devenir
Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. De plus nous ne connaissons pas les impacts potentiels que l’administration en systémique des composés pharmacologiques a pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité du laboratoire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux (n=4/test), a été réduit au minimum acceptable permettant de donner des tendances de résultats avec un risque de faux positif accru par rapport à une étude classique à un n supérieur mais acceptable en termes de tendance. 60 molécules par an seront testées. Ce nombre est sur-estimé et dépend de la demande. Il sera réévalué si nécessaire en cours de projet. Les études ne contiendront ni animaux traités avec le véhicule, ni animaux traités avec une référence positive afin de réduire encore le nombre d’animaux employés. Les résultats obtenus dans ces études seront exprimés sous forme de pourcentage d’activité calculés en fonction de données historiques obtenues chez des animaux traités avec un véhicule depuis plusieurs années dans la société. Aucune étude statistique ne sera réalisée sur ces résultats qui devront être pris comme « des tendances ». Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille d'évaluation) associé à des points limites est mis en place au laboratoire.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs maximales sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou des stimuli plus douloureux que nécessaires. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mises en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir. Un système de fiche d'évaluation est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein de la communauté scientifique. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs ; d) données historiques disponibles chez cette espèce en grande quantité en interne et permettant la réalisation des calculs nécessaires à la réduction importante du nombre d’animal utilisé . Les animaux utilisés sont âgés entre 5 et 9 semaines. Ces stades ont été choisis car il est adapté au développement des modèles. De plus, cela permet d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Etude de nouveaux matériaux destinés à la régénération osseuse dans un modèle de défaut osseux fémoral chez le Rat 1/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Un rat qui ne se déplace plus, ou dont la plaie présente rougeurs et pus, est tué. 20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : un trou percé dans le condyle fémoral de la patte arrière, comblé par un matériau à tester, puis quatre passages au scanner sous anesthésie à 3, 15, 30 et 60 jours. Le porteur reconnaît une douleur et une difficulté à se déplacer les premiers jours, un risque de rupture des sutures et des désagréments liés aux anesthésies répétées. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer ces biomatériaux et que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" passer par des animaux non-humains, d'abord petits, puis plus gros.
Objectifs
Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement. Le projet se fait sur deux EU, que le modèle est fait dans l'EU1 et l'imagerie dans l'EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.
Procédures
Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).
Impact sur les animaux
Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.
Devenir
Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement: les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Développement de protocoles d’apprentissage sur écran tactile chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Tués parce que jugés trop âgés pour être réutilisés, les rats de 18 mois de ce projet côtoient des rats de 15 semaines gardés vivants pour d'autres mises au point de tests comportementaux. 192 rats au total vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 96 étant réutilisés à l'issue et 96 tués. Ils passent jusqu'à une heure par jour dans une cage à écran tactile, cinq jours par semaine pendant cinq semaines, récompensés par du lait à la fraise. Leur eau de boisson est acidifiée à l'acide citrique cinq jours par semaine pendant six semaines, ce que le porteur qualifie de "légèrement aversif" tout en présentant le dispositif comme une méthode "peu stressante" reposant sur le renforcement positif.
Objectifs
Les tests couramment utilisés pour l'évaluation des fonctions cognitives chez les rongeurs sont souvent aversifs et ont généralement peu de points communs avec les tests utilisés en milieu clinique. Une méthode de plus en plus populaire pour évaluer les fonctions cognitives chez les rongeurs est la plateforme automatisée à écran tactile, sur laquelle un certain nombre de tests cognitifs différents peuvent être effectués d'une manière très similaire aux méthodes actuellement utilisées pour tester les sujets humains (par exemple, Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery, CANTAB). Cette méthodologie est peu stressante et fait appel à un renforcement appétitif plutôt qu'aversif. Elle présente un potentiel translationnel élevé (Bussey et Saksida, 2015) et se prête à un haut degré de standardisation. Cette technologie est couramment utilisée chez les primates non humains (PNH) mais reste peu employée chez les rongeurs. L'utilisation de cet outil chez les rongeurs, les PNH et les humains augmenterait la validité et la fiabilité des études translationnelles sur la cognition. L'objectif de ce projet est de mettre en place un protocole d'évaluation de la flexibilité cognitive et un protocole d'apprentissage spatial chez le rat jeune et le rat âgé. Ces protocoles seront ensuite proposés à la communauté scientifique pour des études sur le vieillissement ou la caractérisation de modèles de pathologies humaines comme l'autisme ou la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
Les tests couramment utilisés pour l'évaluation des fonctions cognitives chez les rongeurs ont peu de points communs avec les tests utilisés en milieu clinique. La mise en place de ces deux protocoles d'apprentissage sur écran tactile, inspirés de méthodes actuellement utilisées pour tester les sujets humains, permettra d'améliorer l'aspect translationnel des tests précliniques sur rongeurs pour l'évaluation des fonctions cognitives.
Procédures
L'eau de boisson des animaux sera acidifiée pendant les jours ouvrés de la semaine précédant le début de l'apprentissage, pour habituer les animaux à cette eau de boisson, puis pendant les jours de test afin d'augmenter l'appétence de la récompense (lait fraise), soit 5 jours par semaine pendant 6 semaines au maximum. Les animaux seront placés dans les cages d'apprentissage sur écran tactile au maximum 1 heure par jour, 5 jours par semaine pendant 5 semaines.
Impact sur les animaux
L'eau acidifiée dans les cages d'hébergement peut entrainer une légère perte de poids des animaux.
Devenir
Les animaux de 18 mois seront mis à mort car trop âgés pour être réutilisés. Les animaux de 15 semaines n'ayant réalisé que l'apprentissage sur écran tactile, ils seront conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs.
Remplacement
Les tests qui seront mis en place visent à évaluer l'apprentissage spatial et la flexibilité cognitive et ne peuvent être réalisés que sur des modèles animaux évolués tels que le rat.
Réduction
Ces tests n'ont jamais été réalisés dans notre institut et la bibliographie est très rare et peu informative sur leur puissance statistique. Cette étude préliminaire nous permettra d'avoir des données pour calculer cette puissance statistique et ainsi affiner la taille des effectifs pour de futures études sur des modèles de pathologies humaines. Le calcul de puissance sera réalisé sur le nombre d'essais réalisés pour atteindre les critères de réussite.
Raffinement
Les tests que nous souhaitons développer sont similaires à ceux utilisés chez l'humain pour évaluer les déficits cognitifs. Leur pouvoir translationnel est ainsi plus important que les tests classiquement utilisés chez les rongeurs pour étudier les fonctions cognitives. L'eau de boisson quotidienne sera légèrement aversive (mélange avec acide citrique à 1.5%) afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée de lait mélangé à du sirop de fraise) sans avoir à subir de privation ou de renforcement négatif.
Choix des espèces
La mise en place de ces protocoles d'évaluation des fonctions cognitives sur écran tactile ayant pour but la future caractérisation de modèles de pathologies humaines, le rat est une espèce pertinente pour ce projet. En effet, le rat présente des comportements élaborés et nous pouvons accéder à des animaux génétiquement modifiés. Les deux protocoles que nous souhaitons mettre en place serviront à caractériser des déficits d'apprentissage chez des animaux jeunes ou âgés en fonction des modèles de pathologie étudiés, c'est pourquoi nous souhaitons mettre ces tests en place chez des animaux de 15-20 semaines et des animaux de 18 mois.
Dégénérescence des photorécepteurs rétiniens
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1500
Lapins : 1950
Injections dans le vitré, implants cousus dans la conjonctive, la sclère ou la cornée, collyres administrés jusqu'à huit fois par jour : 1 500 souris, 1 500 rats et 1 950 lapins vont être utilisés pour provoquer chimiquement une dégénérescence de la rétine, puis tester des substances censées la freiner. 4 500 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 450 d'un niveau modéré, et le porteur reconnaît que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Il affirme par ailleurs que les maladies neurodégénératives ne sont pas douloureuses chez l'humain et transpose ce constat aux autres animaux. Tous seront tués pour analyse des tissus et dosage des produits, le projet servant aussi à la formation professionnelle et à des tests réglementaires d'efficacité.
Objectifs
La rétine est un tissu hautement spécialisé qui tapisse le fond de l'œil. Elle est composée de différents types cellulaires, elle repose sur l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) qui assure la survie et le bon fonctionnement des photorécepteurs: les cellules qui reçoivent le signal lumineux et le transforment en influx nerveux. Le signal est transmis et modulé par les autres cellules de la rétine, les cellules horizontales, bipolaires, amacrines et les cellules gliales, jusqu'aux cellules ganglionnaires dont les axones forment le nerf optique. Le nerf optique conduit le signal jusqu'au cerveau qui construit les images. Les maladies dégénératives de la rétine affectent un ou plusieurs types cellulaires. Ces maladies sont variées, liées au vieillissement comme la DMLA, héréditaires comme les rétinites pigmentaires, associées aux complications du diabète, ou encore à des traumatismes (décollement de rétine), elles entrainent soit directement l'atteinte des photorécepteurs, soit d'abord la détérioration de la RPE puis des lésions de photorécepteurs consécutives, il en résulte une baisse voire une perte de la vision pour l'œil atteint. Des auteurs ont utilisé les propriétés toxiques de certaines molécules envers des types cellulaires de la rétine afin de créer des modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne. Ces modèles expérimentaux permettent d'étudier les mécanismes des maladies mais aussi de tester des traitements potentiellement neuroprotecteurs. Le but de ce projet est de mettre place, en se basant sur les données bibliographiques, des modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne chez la souris, le rat et le lapin afin de tester l'efficacité de substances neuroprotectrices.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine.
Procédures
Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou intra vitréenne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope, electrorétinogramme), réalisées chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (dans la majorité des cas 6 à 8 administrations maximum par jour). Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Les administrations de produit par pose d’implant nécessitent une anesthésie et éventuellement des points de sutures au niveau des conjonctives, de la sclère ou de la cornée. Cet acte chirurgical dure cinq minutes tout au plus et sera réalisé généralement une seule fois, puisque l’implant à vocation à délivrer son contenu sur une longue période. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les maladies neurodégénératives ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'oeil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
Le animaux seront mis à mort pour des analyse de tissus ou dosages de produits.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animaux en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux sont de jeunes adultes, les lapins inclus auront minimum 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux
Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la protéinurie dans un modèle de néphrite passive de Heymann chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Le test de molécules fournies par des clients passe ici par 900 rats immatures de 4 à 5 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour la collecte de tissus. Deux injections intraveineuses déclenchent une néphrite de Heymann, maladie rénale qui provoque œdèmes et insuffisance rénale, puis les composés sont administrés jusqu'à six semaines, parfois par pompe osmotique implantée sous la peau du cou. Chaque animal passe deux fois par semaine vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme et subit jusqu'à deux prises de sang hebdomadaires. Le porteur reconnaît ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles des molécules testées, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les effectifs, arrêtés à douze animaux par groupe sur la base de son expérience.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester des candidats médicaments pour leur efficacité sur la protéinurie induite par le développement d’un modèle de néphropathie.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de ce syndrome.
Procédures
Les animaux auront 2 administrations intraveineuses pour l’induction de la pathologie, des administrations de composés pendant 6 semaines maximum. Ces gestes sont rapides (environ 1 min) pour limiter au maximum le stress des animaux. Les animaux pourront également avoir une pompe osmotique implantée en sous-cutané au niveau du cou. Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme pendant 24H (2 sessions par semaine maximum) et seront donc isolés de leurs congénères pendant cette période. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile au cours de l’expérience (maximum 2 prélèvements par semaine, durée du geste 2 min) et un prélèvement terminal plus important sur animal vigile ou anesthésié.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur. De plus, la récolte des urines se fait via l’utilisation de cage à métabolisme individuelle. Les animaux seront donc séparés temporairement de leurs congénères pouvant provoquer un certain stress. De plus, ce modèle mimant une néphropathie, les animaux pourront donc être gênés par les différents symptômes de cette pathologie à savoir des œdèmes, insuffisance rénale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et des tissus seront collectés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la néphropathie passive de Heymann. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (tunnel, morceau de bois). En accord avec la règle de raffinement, les procédures sous anesthésie seront réalisées avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et des antalgiques seront administrés. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure... Si un animal présentait un symptôme pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Le modèle de néphropathie passive de Heymann permettant de mimer le cadre clinique de la néphropathie glomérulaire chez l’Homme est décrit dans la littérature chez le rat immature de 4-5 semaines.
Etude des mécanismes responsables du syndrome cardiorénal chez des modèles rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 500
Un rein retiré par chirurgie, un second passage sur la table dix jours plus tard, une échocardiographie sous anesthésie, vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme, cinq mesures de pression artérielle sur cinq jours consécutifs, un électrocardiogramme, une prise de sang après un mois d'insuffisance rénale : 500 rats et 540 souris vont subir cet enchaînement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie rénale ainsi provoquée entraîne perte de poids, perte d'appétit et augmentation de la diurèse, auxquelles s'ajoute un régime alimentaire spécial qui peut modifier la mobilité et le comportement. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre le syndrome cardiorénal, en partant de l'hypothèse que l'inflammation y joue un rôle central. Tous sont tués en fin de procédure, le porteur jugeant "obligatoires" les analyses de sang et d'organes prélevés.
Objectifs
Les comorbidités cardiovasculaires de l’insuffisance rénale chronique , ce qu’on appelle le syndrome cardiorénal, sont dramatiques et impactent la survie des patients. La prévalence de l’insuffisance rénale chronique en Europe est pres de dix pour cent. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre rein et coeur par exemple ou rein et microbiote, mais également d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’inflammation (infiltration de monocytes et macrophages, augmentation de l’expression de molécules pro-inflammatoires) joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l’aldostérone. La modulation de l’inflammation dans les organes affectés (rein, cœur) peut également jouer un rôle critique dans l'instauration et/ou le maintien du remodelage rénal et cardiaque. Les anomalies du microbiote intestinal associées à l’insuffisance rénale chronique peuvent contribuer à ces altérations. Les objectifs du projet sont de comprendre les mécanismes et éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques du syndrome cardiorenal. Notre hypothèse est que l’inflammation joue un rôle central dans le syndrome cardiorénal, soit directement au niveau de l’organe cible, soit indirectement en affectant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de comprendre les conditions et mécanismes par lesquels un récepteur hormonal et sa cible aval sont impliqués dans le syndrome cardiorénal présent lors d’une insuffisance rénale chronique dont la prévalence en Europe est d’environ dix pour cent. Pour cela, l’efficacité des antagonistes de ce récepteur hormonal et de sa cible aval seront étudiés ainsi que le rôle de la dysbiose induite par l’insuffisance rénale chronique dans ce processus. Le rôle des cellules intestinales (épithéliales, cellules musculaires lisses) ou inflammatoires/macrophages dans ces processus seront identifiés. Ces résultats permettront de proposer des alternatives diagnostiques et thérapeutiques aux patients souffrant de syndrome cardiorénal
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Pour induire une insuffisance rénale chronique, l’ablation d’un rein est réalisée par chirurgie sous anesthésie et avec une prise en charge analgésique avant/pendant et après l’opération (20 min, 2 fois à 10 jours d’intervalle). L exploration de la maladie cardiaque comporte une échocardiographie sous anesthésie gazeuse (15 min, 1 fois). Pour recueil des urines (une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Un électrocardiograme (une fois, durée 15 min) est réalisé (animal vigile). Des prélèvements sanguins sont effectués une fois après 1 mois d'insuffisance rénale chronique (1 minute) chez l’animal vigile. L’euthanasie est réalisée en fin de période expérimentale après analgésie et anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (chirurgie rénale, échocardiographie) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de la maladie rénale chronique (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial peut entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle ou l’installation des gilets pour l’électrocardiograme 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, cytokine, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris et le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde et de la signalisation sous-jacente dans le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
1040 animaux (500 rats et 540 souris) seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft et batonnet en bois. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. Lors des anesthésies, la température interne est suivie et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. La douleur post-opératoire sera prise en charge par une analgésie et des croquettes hydratées seront déposées au fond de la cage pour faciliter l’alimentation. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, les analyses cardiovasculaires seront réalisées sous anesthésie afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris ont été choisies car ce sont des modèles établis pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons de deux modèles de rats génétiquement modifiés permettant de surexprimer le récepteur minéralocorticoïde (RM) dans ses territoires naturels d‘expression (rat) et d’inactiver l’expression d'un gène d'intérêt, ainsi que de modèles souris génétiquement modifiées permettant de moduler l’expression du RM de façon conditionnelle uniquement dans les types cellulaires d’intérêt. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Modèles de migraine pour évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2415
Pour évaluer des candidats anti-migraineux, 1 623 souris et 2 415 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des crises de migraine leur sont provoquées par injection d'un réactif ou par stimulation optogénétique, une fois par jour ou tous les deux jours pendant deux à quatre semaines, après une chirurgie de trente minutes à deux heures pour implanter des électrodes crâniennes chez une partie d'entre eux. Le porteur décrit des tests de réaction à des stimuli tactiles ou thermiques provoquant une douleur aiguë, arrêtée dès le retrait de la patte, et un hébergement en cage individuelle jusqu'à quatorze jours pour les rats blessés par leurs congénères. Les animaux porteurs d'implants crâniens et ceux soumis à des inductions répétées sont tués, le porteur estimant qu'un maintien en vie les exposerait à des céphalées récurrentes, tandis que 50 souris et 50 rats sont réutilisés.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique courant et potentiellement invalidant, caractérisé par des crises récurrentes de maux de tête modérés à sévères, souvent accompagnés d'autres symptômes tels que la sensibilité à la lumière, au son et/ou aux odeurs, ainsi que des nausées et des vomissements. Les migraines peuvent être classées en deux principaux sous-types : les migraines avec aura et les migraines sans aura. Les migraines avec aura représentent environ un quart de tous les cas de migraines. L'aura se réfère à une série de symptômes neurologiques qui précèdent habituellement le mal de tête, pouvant inclure des phénomènes visuels tels que des éclairs de lumière, des taches aveugles ou des zigzags lumineux, ou des sensations sensorielles telles que des engourdissements ou des picotements dans les membres. L'aura dure généralement moins d'une heure et précède souvent le mal de tête, bien que parfois elle puisse se produire simultanément avec le mal de tête ou même après. Les migraines sans aura sont beaucoup plus courantes, représentant environ 75 à 85 % de tous les cas de migraines. Contrairement aux migraines avec aura, celles-ci surviennent sans les symptômes neurologiques précurseurs. Les migraines constituent un fardeau significatif pour les individus qui en souffrent, ainsi que pour la société dans son ensemble, en raison de leur prévalence élevée, de leur impact sur la qualité de vie et de leurs coûts économiques associés. Malgré les progrès dans la compréhension de la physiopathologie de la migraine, le développement de thérapies efficaces reste un défi majeur. Dans ce contexte, l'évaluation préclinique d'agents pharmacologiques potentiels est essentielle pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques. Le présent projet vise ainsi à évaluer l'efficacité voire potentiellement la sécurité d'anti-migraineux chez le rongeur, en utilisant des modèles animaux présentant des symptômes typiques de la migraine.
Bénéfices attendus
L'objectif principal est de déterminer si les candidats médicaments sont capables de réduire l'intensité, la fréquence et/ou la durée des crises migraineuses chez le rongeur afin de potentiellement développer de nouveaux traitements plus efficaces contre les différents types de migraine. De plus, cette évaluation permettra de recenser de potentiels effets secondaires de ces traitements, tels que la toxicité et les altérations comportementales. Cette approche préclinique revêt une importance cruciale puisqu'elle permet une évaluation initiale de l'efficacité des anti-migraineux potentiels avant de les tester chez l'homme, réduisant ainsi les risques et dans une moindre mesure les coûts associés au développement clinique. De plus, elle offre la possibilité d'identifier de nouveaux mécanismes thérapeutiques et de comprendre les bases biologiques de la migraine, ce qui pourrait conduire au développement de thérapies plus ciblées et plus efficaces à l'avenir. En résumé, ce projet s'inscrit dans une démarche visant à améliorer la prise en charge de la migraine en identifiant de nouveaux traitements potentiels et en comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à cette pathologie. Les résultats obtenus contribueront au développement de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 4 semaines en fonction de la spécificité du traitement), sous anesthésie (quelques minutes) si nécessaire. L'induction de crises migraineuses sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou quelques minutes sous anesthésie) ou par stimulation optogénétique (quelques minutes, sous anesthésie), de manière unique ou répétée (en général, 1 fois/jour ou tous les 2 jours pendant 2 semaines, max 4). Cette induction et éventuellement le placement d'électrodes pour enregistrement d'ondes cérébrales pourra nécessiter une phase chirurgicale (de 30 minutes à 2h si électrodes) sous anesthésie. Dans certains cas, les signaux électriques au niveau cérébral seront mesurés après l'induction de la migraine (en général pendant 1h). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes à 30 minutes pour les tests d'exploration/activité locomotrice) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte, ou placement dans un dispositif nouveau comportant une zone ouverte ou fortement éclairée) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Dans les modèles impliquant une chirurgie, il est possible que celle-ci entraîne une douleur post-opératoire au niveau de la peau du crâne (un analgésique est toutefois administré en péri-opératoire). Pour les cas avec implantations d'électrodes chez le rat, ceux-ci seront potentiellement hébergés en cage individuelle en cas de blessure causée par le congénère, ce qui peut entraîner un stress le temps de l'étude (1 à 14 jour en général). Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone cutanée peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal). L'induction de crises migraineuses est supposé entraîner une douleur de type céphalées pour les animaux le jour de test (il n'est pas attendu de crises spontanées).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude dans les modèles sévères, impliquant à la fois une chirurgie avec placement d'implants crâniens qui ne permettent pas un maintien en vie dans de bonnes conditions. Ils seront également euthanasiés en cas d'induction répétée de crises de migraine et de tests de douleurs, afin déviter tout risque de développement de céphalées récurrentes ou de pathologies associées à un stress chronique. Les animaux ayant reçu un traitement aux effets potentiellement néfastes ou soumis à un prélèvement de sang ou d'organes terminal seront euthanasiés car cela ne permet pas leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Les animaux ayant reçu une seule induction de crise migraineuse, ou les animaux Sham (pas d'induction de la migraine), pourront être maintenus en vie, s'ils n'ont pas reçus un traitement induisant des effets néfastes.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier. Les migraines sont des affections complexes impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques incluant notamment le système nerveux central et le système vasculaire. Les modèles animaux permettent d'étudier ces interactions multisystémiques dans un contexte physiologique plus réaliste. Les modèles animaux permettent d'évaluer à la fois l'efficacité et, si pertinent, la sécurité des anti-migraineux potentiels à différents niveaux, notamment l'absorption et la distribution du médicament, ainsi que ses effets sur les organes et les systèmes biologiques. Cependant, dans certains cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques (test t de Student, ANOVA one-way) ou non paramétriques (tests de Mann-whitney, Kruskal-Wallis) pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori la catégorie éthique et les méthodes de raffinement, si pertinent. Le cas échéant, pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
Les rats et les souris partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains, ce qui en fait des modèles animaux pertinents pour évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Des modèles de migraine chez le rat et la souris ont été développés pour reproduire certains aspects de la pathophysiologie de la migraine, tels que l'hypersensibilité à la lumière et au son. Ces modèles permettent d'étudier les mécanismes de la migraine et d'évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Majoritairement à l'âge adulte (au moins 6 semaines après la naissance), mais la migraine pouvant survenir chez des patients jeunes, potentiellement dans certains cas spécifiques des rongeurs plus jeunes (stade post-natal - adolescence) pourraient être utilisés.