Rats

Une étude réglementaire de toxicologie, précédée d'une étude pilote qui sert aussi à former les chirurgiens, doit ouvrir la voie aux essais cliniques d'un produit de thérapie tissulaire d'origine humaine contre la maladie de Parkinson. 150 rats Nude immunodéprimés, 20 pour le pilote et 130 pour l'étude principale, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués à la fin, ceux de l'étude principale pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation. Après un jeûne la veille, chaque rat reçoit sous anesthésie une injection dans le cerveau, un acte d'environ deux heures trente, et peut présenter ensuite désorientation, perte d'équilibre, hypothermie, douleur, tremblements ou convulsions. Des tests neurocomportementaux, que le texte ne détaille pas, ont lieu avant l'injection puis quatre et vingt-quatre heures après, et le liquide céphalo-rachidien est prélevé sous anesthésie, sans réveil, avant la mise à mort. Le porteur juge "nécessaire" l'immunodéficience partielle des rats pour réduire le risque de rejet du produit d'origine humaine.

Objectifs

Le premier objectif de ce projet est la validation du modèle d’administration intracérébrale chez le rat immunodéprimés (étude pilote), incluant la formation des chirurgiens. Une fois le modèle validé, le second objectif de ce projet est la réalisation d’une étude réglementaire de toxicologie générale (étude principale) chez le rat immunodéprimés. Cette étude consiste en l’administration unique du produit à tester (futur médicament) suivie d’observations régulières des animaux, pesées corporelle, évaluation des effets sur les paramètres sanguins et analyse macroscopique ou histopathologique, évaluation de la toxicocinétique et pharmacodynamique du produit. Cette étude permettra d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance d'un produit de thérapie tissulaire chez l'animal - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez l'homme avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la mise sur le marché d'une thérapie innovante permettant de traiter les patients atteints de Parkinson

Procédures

Chaque animal aura une procédure d’injection intracérébrale unique, réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique et une antalgie suffisante (durée environ 2h30). Des tests neurocomportementaux sont réalisés (durant le prétest et +4h et 24h postadministration ; durée approximative : 5 à 7 min). Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) et de sang seront réalisés en fin de procédure (avant mise à mort), sur animaux anesthésiés (sans réveil) (durée quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration intracérébrale sont réalisés sous anesthésie, après mise à jeun la veille. Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains reflexes neurologiques ainsi qu’une hypothermie, une douleur post-injection et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie) peuvent être observées temporairement. Des évènements anesthésiques liés à l’anesthésie volatile peuvent survenir. Des signes locaux (oedème, ...) au niveau des sites d’administrations peuvent être observés. Des symptômes neurologiques (tremblement, convulsion,…) peuvent être observés à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes (tous les animaux n’ont pas toutes les nuisances) : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors de prélèvement de sang. - Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie (incoordination) lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie - Stress lors de changement d’environnement lors d’évaluation neurocomportementale : durée du test en lui-même généralement quelques minutes. - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place afin d’éviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie).

Devenir

Les animaux de l'étude pilote seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de valider la procédure d’administration. Les animaux de l'étude principale seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telles que la thérapie tissulaire. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au candidat médicament et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique). Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les guidelines.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique. Afin de réduire ce nombre au minimum, les techniciens ont été préalablement formés en ex-vivo. Le nombre d’animaux dans ce projet est basé sur les guidelines et est le minimum pour pouvoir interpréter et conclure sur l’évaluation histopathologique et l’analyse de biodistribution. Au total, 150 animaux seront utilisés dans ce projet : 20 animaux pour l’étude pilote, 130 animaux pour l’étude principale. L’étude pilote, sur un nombre limité d’animaux, va permettre de mettre au point et valider la technique d’administration intracérébrale et avant le démarrage de l’étude principale, qui a pour but de déterminer la toxicité d’un candidat médicament sur un nombre plus important d’animaux

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation aux conditions environnementales avant le début des procédures. Les rats seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité comportementale, dans des portoirs ventilés avec filtration de l'air, dans des cages sur fond plastique et sur de la litière de cellulose avec un enrichissement adapté (papier kraft, tunnel, …). La procédure d’administration intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique. Une analgésie préventive sera mise en place avant et après administration du produit de l’élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intracérébrale, une évaluation neurocomportementale sera réalisée durant le pretest et après adminisration. De plus, les animaux ont accès a une eau de boisson filtrées et le matériel qui rentre dans l'animalerie est désinfecté. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile et sont évalués par le vétérinaire en cas d'anomalies. Des anti-inflammatoires / antibioiques seront prescrits en cas de signes d'infection locale et/ ou d'hyperthermie sans atteinte neurologique. L'euthanasie sera réalisée si les signes cliniques suivants sont observés : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée • incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal • atteinte importante du niveau de conscience et vigilance de l’animal • stéréotypie • hyperthermie supérieure à 40°C ne répondant pas au traitement• signes de détresse et/ou douleur

Choix des espèces

Le rat répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Dans le cadre de ce projet des rats immunodéprimés (rat Nude RNU) seront utilisés afin de permettre l’évaluation toxicologique d’un produit de thérapie tissulaire. Une immunodéficience partielle des animaux est nécessaire afin de réduire le risque de rejet en raison de l’origine humaine du produit de thérapie tissulaire. L’ensemble du projet se fera sur jeunes adultes/adultes afin de mimer les futures conditions d’utilisation clinique.

80 rats vont être utilisés, chacun passant trois fois la même série, deux tests moteurs et une prise de sang sous anesthésie, avant puis à deux reprises après une chirurgie du cerveau qui induit une forme de maladie de Parkinson. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et tous les rats sont tués à la fin pour prélever leur cerveau. Selon la méthode d'induction, ils peuvent présenter une baisse de motivation, ou des déficits moteurs qui gênent leurs déplacements et leur alimentation et s'accompagnent d'une perte de poids. Le texte ne nomme ni les deux tests moteurs ni ce qui provoque la maladie pendant l'opération de 45 minutes. Les retombées pour les patients, un diagnostic précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques, dépendent de composés encore à identifier, alors que chaque rat subit l'opération du cerveau.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les modifications précoces qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson dans deux modèles animaux complémentaires, chacun mimant des caractéristiques pathologiques et des stades différents de la maladie.

Bénéfices attendus

Outre une meilleure connaissance des modifications comportementales et du métabolisme (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui accompagnent la progression de la maladie de Parkinson, cette étude permettra l’identification de composés biologiques qui serviront de marqueurs de la pathologie et favoriseront le diagnostic précoce de la maladie pour une prise en charge optimale des patients, mais également l’identification de composés biologiques qui pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux tests moteurs (l’un de 10 minutes le premier jour, l’autre d’une heure le deuxième jour) et un prélèvement sanguin (le 3ème jour, sous anesthésie générale, durée de 5 minutes) avant induction de la maladie par chirurgie du cerveau (durée de la chirurgie : 45 minutes). Puis les animaux seront à nouveau soumis à ces mêmes tests moteurs et prélèvement à deux temps différents à distance de la chirurgie (une et quatre semaines pour un modèle et trois et dix semaines après pour l’autre modèle).

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ils sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront un à trois mois.

348 rats et rates vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de pose de cathéter intraveineux à demeure puis une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour l'implantation de fibres de photométrie ou l'injection de vecteurs viraux, avant d'être entraînés à s'auto-administrer de la nicotine jusqu'au développement d'une addiction. Le porteur table sur une attrition de 20 % au bout de trois mois d'expérience et fixe pour cela les groupes comportementaux à quatorze individus. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, "ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires" et qu'aucun modèle in silico valide n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle des différents sous-types neuronaux du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal chez le rat - une région du cerveau jouant un rôle clé dans le contrôle du comportement de recherche et de prise de drogue. Cependant, les mécanismes neuronaux locaux sous-tendant ces modifications d'activité du cortex préfrontal sont actuellement inconnus. Les réseaux corticaux du cortex préfrontal sont composés de neurones excitateurs mais aussi d'interneurones inhibiteurs locaux qui exercent un puissant contrôle sur l'activité du circuit du cortex préfrontal. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à étudier le rôle respectifs des neurones excitateurs et des interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Pour cela, les animaux seront tout d’abord entrainés à acquérir l’auto-administration intraveineuse de nicotine et à développer une addiction à la nicotine. Puis, nous mesurerons l’activité des différentes populations de neurones lors du développement de l’addiction à la nicotine. Enfin, nous chercherons à modifier l'activité de ces populations neuronales et à en évaluer les effets sur la consommation de nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de révéler les effets spécifiques de la nicotine sur les interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal qui pourraient expliquer le développement de l’addiction à la nicotine, et constituerait donc une percée dans le domaine de la dépendance. Le développement de stratégies visant à inverser ou à prévenir ces changements d'activité neuronale pourrait éventuellement conduire à la découverte d'un traitement efficace contre la prise de tabac et conduire à l’arrêt du tabagisme. Enfin, comme nous proposons d’examiner l'activité neuronale du cortex préfrontal avant, pendant et après l'escalade de la consommation de nicotine, nous serons dans une position idéale pour identifier les dysfonctionnements neuronaux préexistants. Ainsi, notre projet devrait également fournir des informations sur les marqueurs neurobiologiques de la susceptibilité à l’addiction à la nicotine.

Procédures

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...). Tous les animaux seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d’un cathéter intraveineux à demeure, puis à une chirurgie stéréotaxique pour la pose de fibres de photométrie ou pour l’injection de vecteurs viraux chémosensibles (45 min en moyenne). Toutes ces chirurgies sont effectuées sur une couverture chauffante en conditions aseptiques, sous anesthésie et analgésie profonde.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin soit de prélever leurs cerveaux pour des expériences ex vivo d’électrophysiologie sur tranche ou de transcriptomiques, soit d’effectuer des contrôles histologiques pour vérifier l’emplacement des fibres de photométrie et l’expression des virus.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; et 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales du projet et les différents objectifs à remplir. Les expériences seront réalisées chez des rats males et des rats femelles répartis dans 3 groupes (1 groupe qui ne développe pas d’addiction, 1 groupe qui développe une addiction à la nicotine, et un groupe témoin non exposé à la nicotine), soit 6 groupes expérimentaux au total. Pour les expériences comportementales, en tenant compte du taux attrition estimé à 20% au bout de 3 mois d’expérience, il faudra démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Pour les expériences d’enregistrement de photométrie et de mesures ex vivo, l’effectif sera plus petit (n = 10) mais sera compensé par un grand nombre de mesures enregistrées par animal. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera de 348 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de NaCl pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Lorsque l’un des critères ou point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.

Une injection sous la peau de la patte ou de la face suffit à provoquer chez eux une inflammation, puis une hypersensibilité douloureuse au toucher. 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sous anesthésie profonde pour prélever les tissus nerveux. L'objectif est de comprendre comment cette inflammation dérègle un canal des astrocytes, un travail qui prolonge des résultats déjà obtenus au niveau trigéminal. Le porteur programme sept séances de tests comportementaux de trente-cinq minutes chacune, sans dire lesquels, et qualifie ces mesures de peu douloureuses puisque l'animal peut retirer sa patte.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la genèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Les objectifs de ce projet est d'étudier si il y aussi une dérégulation en condition inflammatoire au niveau de la patte et de la face.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 1 : Injection sous-cutanée (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face ou de la patte selon le modèle). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après les données antérieures le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés de façon à avoir un enrichissement social. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à partir de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale d'anestésique sous sédation profonde. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Enfin, comme énoncé précédemment, ce projet fait suite à d'autres études et doit donc être réalisé sur la même souche de rat. Pour les expériences comportementales et l'étude protéique, nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaine, comme dans les projets précédents (125g à 250g).

Pour constituer une banque de tissus et de fluides partagée entre laboratoires, 150 souris et 30 rats, chez qui des maladies neurodégénératives sont modélisées, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soixante d'entre eux subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie, dès l'âge de quatre semaines. Tous sont tués par perfusion à travers le cœur, à partir d'un mois, pour l'examen histologique du cerveau. Le porteur annonce un risque de paralysie lié à la maladie modélisée et présente la banque comme un moyen de "ne pas générer des animaux supplémentaires", alors qu'elle repose sur 180 animaux tués pour la remplir.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) sont des troubles neurodégénératifs. Les similitudes et les différences entre les maladies neurodégénératives (MN) sont définies en fonction du statut pathologique des zones et des types de neurones affectés. Cependant, on ne sait toujours pas quelles altérations sont les causes ou les conséquences de ces maladies. Ce projet de recherche permettra de mettre en commun nos forces et notre matériel biologique afin d'élucider les points communs et les spécificités des pathologies. Pour ce faire, nous devons construire une bio banque (base de données) de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de MN qui sera utilisée et partagée par tous les investigateurs. Cet effort permettra de réduire le nombre d'animaux générés et utilisés indépendamment par chaque chercheur dans une seule bio banque utilisée et ouverte à tous ceux qui s'intéressent aux MN dans la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Construire une biobanque disponible de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de maladies neurodégénératives Cette biobanque disponible pour tous les laboratoires du departement et aura pour bénéfice de donner un accès aux tissus et aux prélèvements. Cette action permettra leur mutualisation, et ainsi de ne pas générer des animaux supplémentaires.

Procédures

Chirurgie à partir de 4 semaines (2heures sur animal anesthésié) pour 60 animaux Perfusion intracardiaque (sur animal anesthésié) et euthanasie à partir de 1 mois d'âge pour l'ensemble des animaux

Impact sur les animaux

1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie ce risque est compensé par l’analgésie 2/Risque de paralysie du à la MN

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau

Remplacement

La souris et le rat sont les espèces de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement des maladies neurodegenratives. Néanmoins, toutes les étapes préliminaires pouvant être réalisées in vitro, telles que les validations des constructions moléculaires qui seront injectés en intra cerebral le seront sur cultures cellulaires

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat sont deux espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à partir de 4 semaines. Afin de travailler sur des modèles cohérents avec la mise en place de phénotypes pathologiques

Pour répondre à une revue scientifique qui réclame les mêmes expériences sur des femelles ovariectomisées avant de publier un article en révision, 80 rattes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, l'ablation des ovaires en dix minutes puis une ouverture du crâne de trente à quarante-cinq minutes pour implanter une canule à la surface des méninges. Jusqu'à quatre injections de substances inflammatoires y sont faites, une tous les deux jours, suivies de mesures de la sensibilité de la face au filament pendant trois heures, et chaque ratte reste seule en cage jusqu'à deux semaines pour ne pas arracher la canule. Le porteur écrit que la procédure ne permet pas de réutiliser les animaux, toutes sont donc tuées à la fin.

Objectifs

L'objectif général du projet est d'étudier l'influence des hormones dans la migraine, dans un modèle animal qui consiste en l'injection de substances inflammatoires (SI: bradykinine, prostaglandines, sérotonine, et histamine) à l'aide d'une canule positionné à la surface des méninges des rats. Nous avons déjà montré que les males et les femelles à différents cycles hormonaux avaient une douleur migraineuse différente et une sensibilisation des neurones du complexe trigémino-cervical (TCC ) dépendante du cycle hormonal. Ces résultats font l'objet d'un article en révision dans une revue scientifique qui nous demande de réaliser les mêmes séries d'expériences mais avec des femelles contrôles ovariectomisées. Nous souhaitons donc i) évaluer l'intensité de la douleur ressentie, ii) étudier l'activation globale des neurones impliqués dans la migraine, et iii) enregistrer les propriétés électrophysiologiques des neurones du TCC suite à des injections répétées de substance inflammatoire au niveau des méninges et ceci chez des femelles contrôles ovariectomisées.

Bénéfices attendus

Même si la migraine touche plus les femmes que les hommes et est fortement corrélées aux cycles hormonaux, la plupart des études précliniques ont été réalisées chez les mâles. Ainsi, à moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiologiques d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles selon le cycle hormonal. A plus long terme, mieux comprendre cette pathologie pourra nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes et cycle menstruel.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales qui consistent en une ovariectomie et en une craniotomie, pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation (mimant ce qui se passe pendant les crises de migraine). Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. L'ovariectomie dure 10 minutes et l'implantation de la canule dure environ 30 à 45 min. Les injections des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine seront de 1 injection tous les 2 jours avec 4 injections au maximum ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Une mesure de la sensibilité cutanée de la face sera réalisée à l’aide de filament de Von Frey. Les jours d’injection de subsatnces inflammatoires ou de solution physiologique, la mesure des seuils se fera avant et toutes les 45 min pendant 3 heures après l’injection de soupe inflammatoire pour vérifier l'apparition et/ou l'aggravation de l'allodynie.

Impact sur les animaux

La douleur suite aux chirurgies est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour garder en place la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines maximum.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe.

Raffinement

Les rates bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur :si l’animal perd plus de 15% de son poids dans la semaine qui suit la chirurgie, s'il a de grosses difficultés à se déplacer, à relever pour se nourrir, si l'animal présente des tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue), nous mettrons fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données que nous avons obtenues et ceux de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans la veine caudale sous anesthésie, puis subit neuf prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire, avant que son cœur, son foie, ses poumons et sa thyroïde ne soient prélevés pour y doser le produit. Il s'agit de mesurer où se répartit dans le corps une amiodarone encapsulée dans des nanocapsules lipidiques, première étape du développement d'un médicament contre la fibrillation atriale. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ni aucune modélisation ne permettent ces mesures, et juge "indispensable" de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Objectifs

La fibrillation atriale est le plus fréquent des troubles du rythme cardiaque et touche environ 300 000 personnes en France. Le médicament antiarythmique amiodarone est le seul médicament autorisé pour le traitement de cette pathologie en cas d’insuffisance cardiaque malgré ses effets indésirables cardiaques et extracardiaques associés. En effet, l'amiodarone se distribue dans le coeur mais également dans de nombreux organes tels que la thyroïde, le foie, le poumon ou l'oeil. Améliorer les formulations médicamenteuses permettrait donc de mieux traiter les patients. Ce projet vise à utiliser les nanomédecines pour cibler le coeur et diminuer la distribution d'amiodarone aux autres organes afin de limiter ses effets secondaires. L'introduction de l’AMD dans des particules de très petite taille, appelée encapsulation, représente une stratégie prometteuse pour diminuer sa toxicité et améliorer son efficacité. L’objectif de ce projet est d’évaluer la biodistribution , c'est-à-dire la répartition dans les différents organes , la pharmacocinétique, c'est-à-dire le devenir dans l’organisme et la toxicité de l’amiodarone encapsulée par rapport à la molécule seule in vivo chez le rat. Les études de la pharmacocinétique et de la distribution tissulaire des différentes formulations d'amiodarone représentent une étape essentielle dans le développement d’un potentiel nanomédicament. Ce projet permettra d’analyser le devenir des formulations dans l’organisme, d'évaluer une potentielle accumulation dans les organes et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables propres à la nanoparticule. L'objectif est de valider la première étape de développement d'un nouveau médicament qui entraîne moins d'effets secondaires que le médicament actuel.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si l'introduction de l’AMD dans des particules de très petite taille est capable de cibler le coeur. La fibrillation atriale est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce des patients, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer un accident vasculaire cérébral. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée. A ce jour, la fibrillation atriale constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients et rendre l'amiodarone accessible à un plus grand nombre de patients. Le but du présent projet est de démontrer que l'encapsulation d'AMD pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de la fibrillation atriale.

Procédures

Les animaux anesthésiés (isoflurane) seront soumis à une procédure d'injection dans la veine caudale. La durée totale de l’intervention est d'environ 3 min. 9 prélèvements de sang seront réalisés en sous-mandibulaire.

Impact sur les animaux

Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Une douleur modérée au site de ponction veineuse pourrait être induite par les prélèvements sanguins multiples.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale en vue du prélèvement des organes post-mortem (coeur, foie, poumon, tyroïde) pour les dosages tissulaires d'amiodarone.

Remplacement

Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible des études de biodistribution et pharmacocinétique qui doivent être réalisées in vivo.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 6 rats par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience et a aussi été estimé à l'aide d'un logiciel de biostatistiques. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux la biodistribution tissulaire et la pharmacocinétique de l'amiodarone encapsulée , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée à l’aide de tests non paramétriques. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur un même rat: prélèvements sanguin et tissulaires.

Raffinement

Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation systématique d’anesthésique avant la procédure et d’analgésique si l'animal montre des signes de douleurs. Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la procédure et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les rats sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix pour les études de biodistribution et de pharmacocinétique. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques pour la biodistribution et la pharmacocinétique. Rats jeunes adultes de 3 mois pour s'affranchir de l'effet du vieilissement.