Rats
Formation et validation de la méthode de prélèvement de liquide synoviale et d’administration intra-articulaire chez le rat et le chien pour une application dans des études de toxicologie réglementaire
- Formation professionnelle
Chiens : 10
40 rats et 10 chiens vont être utilisés dans ce projet, les rats opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les chiens réutilisés ensuite dans d'autres procédures. Chaque chien peut subir quatre prélèvements de liquide synovial au genou, deux par articulation, plus deux injections intra-articulaires par genou, le tout sous anesthésie, avec un risque de gonflement, de douleur articulaire et d'infection. L'objectif déclaré est de former le personnel à ces gestes pour des études de toxicologie réglementaire préalables à la mise sur le marché de médicaments et de dispositifs médicaux. Le porteur ajoute que l'apprentissage sur ces deux espèces permet de transposer les compétences aux primates non humains, dont l'utilisation à des fins de seule formation n'est pas réglementaire.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la recherche pré-clinique et effectue des études de toxicologie et pharmacologies réglementaires (Bonnes Pratiques de Laboratoire, textes ICH M3(R2) et ICH S3A) indispensables à la mise sur le marché de médicaments, vaccins, dispositifs médicaux, thérapies, etc. Ce type d’études requièrent une qualification au poste et aux gestes techniques réalisés, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs. Pour que ces études soient menées par du personnel qualifié, la formation initiale et continue du personnel aux nombreuses techniques de prélèvements et d’administration est primordiale. Ce projet a pour objectif de valider la faisabilité de l’administration intra-articulaire et du prélèvement de liquide synoviale chez le rat, ainsi que former le personnel à ces deux actes chez le chien afin de pouvoir l’effectuer dans le cadre d’étude de toxicologie et de pharmacologie réglementaire.
Bénéfices attendus
Ce projet assure la validation de l’injection intra-articulaire et du prélèvement de liquide synoviale chez le rat et la formation pratique à ces 2 gestes chez le chiens pour personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir la maitrise des gestes techniques nécessaires à la qualité des données expérimentales (précision, reproductibilité) et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de raffinement (impact minimum des gestes techniques sur le bien-être des animaux : en particulier stress, anxiété, douleur) dans le cadre d’études pré-cliniques.
Procédures
Dans ce projet, les chiens peuvent être soumis à 4 prélèvement de liquide synovial (2 par articulation du genou), avec au moins 3 jours de repos entre 2 prélèvements et jusqu'à une semaine pour une même articulation. Ces prélèvements se font systématique sous anesthésie. Les rats peuvent être soumis à des prélèvements intra-articulaires terminaux uniquement (sous anesthésie, sans réveil) Chez ces deux espèces, deux injections intra-articulaire sous anesthésie par articulation du genou peuvent être faite avec au moins 1 semaine d'intervalle pour une même articulation et 3 jours entre 2 articulations afin de s'assurer de l'absence d'effets délétères de l'injection.
Impact sur les animaux
L’injection ou le prélèvement de liquide synovial peut entrainer un gonflement, une douleur au niveau de l’articulation, ou encore une infection si les conditions d’asepsie ne sont pas respectées.
Devenir
La procédure est une procédure légère : les animaux peuvent donc être ré-utilisés dans d'autres procédures, afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cette re-utilisation se fait sur décision vétérinaire prenant en compte l'ensemble des procédures dans lesquels l'animal a été et va être impliqué.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles satisfaisants des articulations des rats et des chiens qui permettraient de ne pas utiliser d’animaux pour pratiquer ces deux gestes. Le recours à l’utilisation d’animaux de formation est donc nécessaire afin de maitriser les bons gestes in-vivo avant la manipulation et la réalisation d’actes sur des animaux d’étude. Cela permet également de suivre l’état clinique de l’animal à postériori de la formation, indiquant la bonne réalisation du geste ou non. L’utilisation de rats euthanasiées dans le cadre d’autres procédures ou une procédure sans réveil seront faites avant le passage à l’animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux à commander spécifiquement en vue d’être utilisé pour ce projet, les animaux non euthanasiés ou non utilisés en fin d’étude et les animaux sentinelles seront réutilisés en 1er intention. De plus, afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre d’animaux de formation, les deux articulations du grasset pourront être utilisées deux fois chacune, avec au moins 3 jours d’intervalles entre 2 articulations et 1 semaines pour une même articulation afin de s’assurer de l’absence d’effet délétère. Enfin, lorsque cela est possible, les 2 gestes techniques (prélèvement de liquide synoviale et injection intra-articulaire) seront réalisés sur la même articulation, réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Tout lot de rats ou tout chien inclus dans ce projet fait l’objet d’un examen et d’une approbation du service vétérinaire afin de s’assurer du bon état de santé de chaque individu et, si besoin, d’exclure du projet ceux jugés inaptes à une utilisation en formation. Une traçabilité des animaux utilisés en formation est assurée, comme pour toute autre utilisation, et enregistrée comme toute autre utilisation des animaux sur le site, ce qui en permet le suivi et l’analyse en réunion SBEA. Chaque animal utilisé possède une fiche individuelle sur laquelle est documentée, à chaque utilisation, le(s) type(s) de gestes techniques pratiqué(s) en précisant les volumes d’administration et de prélèvement, les produits administrés, etc), ainsi que l’identification du collaborateur en formation et du tuteur présent lors de la session. Ces fiches individuelles sont consultables par le service vétérinaire et la SBEA dans le cadre du suivi de l'utilisation des animaux en formation. La ré-utilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ permet l’utilisation d’animaux habitués à la contention et à la réalisation des gestes techniques, ce qui contribue à une diminution du stress de l’animal avant sédation. Enfin, le passage à la réalisation d’un geste technique sur l’animal vivant peut d’abord se faire sans réveil (pour les rats), afin de s’assurer de la bonne maitrise du geste et réduire au maximum le risque d’apparition de nuisances au réveil de l’animal. Les animaux sont hébergés collectivement. Cependant, un isolement pourra être effectué pendant 24h suivant la réalisation des gestes techniques afin de mieux observer l’apparition d’effets délétères. Cet isolement ne sera que physique, et fera l’objet d’enrichissement supplémentaires (ajout d'un jeux/objet supplémentaire non présent au quotidien dans les box d’hébergement, ainsi que des friandises cachées dans des copeaux propres). Tous les animaux hébergés dans l’établissement font l’objet d’un suivi quotidien. Les chiens font l’objet de sessions régulières d’habituation aux manipulations et contentions effectuées dans le cadre des études pré-cliniques, encadrées par un programme de training mis en place et suivi par la SBEA.
Choix des espèces
Ce projet est préliminaire à la réalisation d’études de toxicologie réglementaires (ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo chez le rat et le chien, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois.
Evaluation de candidats médicaments dans le modèle d’asthme chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Sensibilisés par injection une fois par semaine pendant trois semaines, puis enfermés dans des chambres de plexiglas pour respirer le même réactif en aérosol trente minutes, trois fois par semaine pendant trois semaines, 1 200 rats développent un asthme expérimental. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et tous les rats sont tués à l'issue, soumis à un prélèvement terminal de sang, d'organes ou de liquide bronchoalvéolaire. Le porteur décrit des crises de gêne respiratoire, une respiration sifflante et une hyperréactivité bronchique pouvant aller jusqu'à la détresse respiratoire, et prévoit jusqu'à douze heures d'affilée en chambre de pléthysmographie. Les bénéfices annoncés, des médicaments qui amélioreraient la qualité de vie des patients asthmatiques, restent au stade de l'évaluation préclinique, quand l'atteinte respiratoire infligée aux rats, elle, est immédiate.
Objectifs
Affectant des millions de personnes à travers le monde, l'asthme est une affection pulmonaire chronique qui touche les personnes de tous les âges. Elle se manifeste par des crises, caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, de toux sèche ou de sensation d’oppression dans la poitrine. Les crises d'asthme peuvent durer de plusieurs minutes à quelques heures. Entre deux crises, la respiration redevient normale. L’asthme est caractérisé par trois composantes : l’inflammation des bronches, leur hyperréactivité et leur remodelage. Ces trois phénomènes sont intimement liés et s’influencent entre eux. L’inflammation bronchique est liée à l’activité anormale de différentes cellules de l’immunité au niveau du tissu bronchique. Lorsqu’elles sont agressées par une substance chimique ou microbiologique, les cellules de la paroi des bronches (cellules épithéliales bronchiques) déclenchent une réaction de défense qui fait intervenir plusieurs molécules pro-inflammatoires de la famille des cytokines qui vont déclencher différentes cascades réactionnelles locales. L’hyperréactivité bronchique se traduit par la contraction exagérée du muscle lisse des bronches et au rétrécissement des voies respiratoires au contact d’une substance déclenchante. Le remodelage bronchique correspond à l’accumulation d’anomalies au niveau des cellules qui structurent les voies aériennes (hypertrophie, hyperplasie, fibrose). Ce phénomène aboutit à l’épaississement de la paroi des bronches. L’asthme altère considérablement la qualité de vie des patients. Il entraîne des insomnies, une baisse d’activité et un absentéisme à l’école ou au travail. Un asthme mal contrôlé peut conduire à une altération de la fonction respiratoire. En effet, certains patients répondent mal ou pas du tout aux thérapies ciblées et il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou des associations médicamenteuses. Dans ce contexte, le présent projet consiste à évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle d’asthme chez le rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices recherchés sont le développement de médicaments destinés à améliorer la qualité de vie des patients asthmatiques. Les modèles précliniques appropriés à l'évaluation de l’asthme sont nécessaires pour comprendre les mécanismes sous-jacents entraînant le développement de la réaction asthmatique chez l’homme. Ces modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter les problématiques de la réaction asthmatique (diminution des symptômes, de la réaction inflammatoire,…) quels qu'en soient l'origine et/ou le mécanisme d'action.
Procédures
Les rats sont sensibilisés une fois par semaine pendant 3 semaines minimum par injection d'un réactif (durée d'environ quelques secondes). Quelques jours après la phase de sensibilisation, les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas et reçoivent par aérosol le même réactif (durée : 30 minutes, 3 fois/semaine, pendant 3 semaines). Le traitement avec les candidats médicaments est initié en parallèle des aérosols (administration pendant quelques secondes) de manière chronique (durée maximum de 3 semaines selon le composé, soit 21 administrations). Quelques jours après les challenges, la fonction respiratoire des animaux est évaluée dans des chambres de plethysmographie (maximum 12 heures, incluant la période de stabilisation). A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang, ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l’induction de la pathologie entraine une atteinte de la fonction respiratoire, une réaction inflammatoire et un remodelage pulmonaire. Parmi les symptômes les plus couramment observés dans ce modèle d’asthme, nous retrouvons des crises caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, d’hyperactivité bronchique pouvant aller jusqu’à la détresse respiratoire (dans des cas extrêmes). De plus, un stress lié aux prélèvements et aux administrations répétés peut être ressenti par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (sang, organes ou liquide bronchoalvéolaire).
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester in vivo (et donc du nombre d’animaux), il ne représente pas la complexité du système immunitaire. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction inflammatoire (respiration sifflante, hyperactivité bronchique, sécrétion de mucus, mesure des taux de cytokines, immunoglobulines...).
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Dans le contexte d’études cherchant à réverser/diminuer la réaction inflammatoire, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à un autre, 8 rats minimum sont généralement nécessaires pour atteindre une sensibilité correcte du test. De nombreux critères d’évaluation (scores ou valeurs quantitatives telles que suivi du poids corporel, mesure des paramètres respiratoires, dosages des immunoglobulines, cytokines,…) sont intégrés dans ces études. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire et adapté à la condition des animaux (troubles respiratoires), afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Les rats répondent bien à une variété d'allergènes couramment utilisés pour induire des modèles d'asthme, tel que l'ovalbumine..., permettant l'étude de différents aspects de la maladie. Il existe une vaste base de publications chez le rat dans la recherche sur l'asthme. Cela permet de comparer les résultats de nouvelles études avec des données antérieures, offrant ainsi une continuité et une cohérence dans la recherche. Principalement rongeurs sevrés, après 4 semaines de développement, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Evaluation d’un élément d’essai dans une étude pré-clinique de pharmacocinétique, de pharmacodynamie ou de toxicité
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 120
Chiens : 240
Furets : 180
Cochons : 120
Les protocoles suivent ici la commande d'un donneur d'ordre, chaque étude fixant l'espèce, les doses et la durée selon le candidat médicament à enregistrer. 1 800 souris, 1 800 rats, 240 chiens, 180 furets, 120 cobayes, 120 lapins et 120 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des administrations une à trois fois par jour pendant un à 91 jours, subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins le premier jour pour les non-rongeurs, et parfois une chirurgie de quinze à soixante minutes pour implanter un cathéter ou une micro-pompe. Les animaux ayant reçu une substance toxique ou atteint les points limites sont tués, les autres réutilisés, et c'est le vétérinaire qui décide si un chien ou un furet peut être replacé, selon le nombre et la sévérité des procédures qu'il a déjà subies.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas ou le moins possible d’effets délétères sur l’animal. L’intérêt sociétale est majeur puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique, de manière à déterminer les temps de pré-traitement, la durée de vie, les doses présentant le plus d'efficacité et le moins d'effets secondaires... Mais aussi à évaluer leur distribution dans, et/ou leur potentielle toxicité sur différents organes. Ils sont donc nécessaires pour 1/réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale en ciblant au mieux les doses et temps de pré-traitement pour les études d'efficacité par exemple dans des modèles de pathologie, et 2/apporter des données pré-cliniques préalables aux études cliniques et à la mise sur le marché des médicaments.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations d'éléments d'essai par diverses voies, de manière unique (de l'ordre de 1 à 60 secondes) ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale. A l'administration d'un élément d'essai peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides biologiques, de manière unique (de l'ordre de quelques secondes à plusieurs minutes par prélèvement) ou répétée à diverses fréquences (1 à 8 fois par jour, sur une durée de 1 jour à plusieurs mois). Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Dans le cas d'administrations répétées ou par perfusion, ou de prélèvements sanguins répétés, d'une chirurgie (implantation de cathéter veineux ou autre dispositif de type micro-pompe ou système d'accès vasculaire, ou prélèvement de tissus d'intérêt) peut être pratiquée sur les animaux, quelques jours avant le début des administrations ou des prélèvements, ou en fin d'étude. Ce type de procédure chirugicale dure entre 15 et 60 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Quelques nuisances peuvent être causées par certaines procédures: par exemple, un stress provoqué par les administrations, des prélèvements divers ou à l'isolement (le cas échéant), une potentielle douleur post-opératoire (après chirurgie d'implantation de cathéter veineux ou autre dispositif) ou une gêne causée par le volume occupé par un dispositif implanté en sous-cutané.
Devenir
Pour les 7 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu un élément d'essai toxique (atteinte des points limites) ou une substance dont les effets à long terme sont potentiellement néfastes, sont euthanasiés. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux qui ont reçu un traitement dont les effets à long terme sont connus pour être non-néfastes. La réutilisation des animaux (toute espèce) est soumise à l’approbation du vétérinaire, celle-ci est privilégiée pour contribuer à la réduction du nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale. La décision de replacer un chien ou un furet est prise par le vétérinaire, en fonction du nombre et de la sévérité des procédures subies par l'animal, et éventuellement de son age.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, la biologie clinique, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes, ou l'étude vise à évaluer la distribution d'une substance pharmacologique dans l'organisme vivant, dans son intégralité. Selon les espèces, le métabolisme est différent. Selon le stade d’avancement du projet ou selon le type de composé, il peut être nécessaire d’effectuer ces études sur les espèces suivantes : rats, souris, cobayes, lapins, chiens, furets, porcs. Ces techniques nécessitent l’utilisation d'animaux de laboratoire et ne peuvent être efficacement remplacées par des méthodes alternatives.
Réduction
Ce projet s'intègre dans un objectif de Réduction du nombre d'animaux utilisé en expérimentation animale. En effet, il permet de sélectionner dans des groupes réduits, les doses et les temps de pré-traitement les plus efficaces (et d'éliminer les doses sub-efficaces et/ou présentant trop d'effets délétères) avant les études pré-cliniques d'efficacité ou de sécurité, permettant, ainsi, de réduire de manière importante le nombre d'animaux utilisé dans d'autres modèles d'études précliniques (modèle de pathologie, tests comportementaux et/ou physiologiques...). Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire. Le nombre d'animaux utilisé pour chaque étude est réduit au strict minimum, de manière à permettre une interprétation correcte et objective des résultats, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux sera déterminé en fonction des procédures secondaires qui seront ensuite réalisées sur les animaux ou selon les lignes directrices de l’OCDE dans le cas des études de toxicité. Ce projet, d’une durée de 3 ans, couvrirait un maximum de 36 études chez le rat, 18 chez la souris, 6 chez le cobaye, 9 chez le furet, 6 chez le lapin, 12 chez le chien et 6 chez le porc, en considérant qu’une étude correspond à une procédure expérimentale. De plus, la formation du personnel technique permettra de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé (limitation du nombre d’animaux surnuméraires et de l'euthanasie prématurée des animaux).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, l'état d'hydratation, les tremblements, la respiration, etc...), ainsi qu'en une limitation de l'effectif au strict nécessaire. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Enfin, lorsque nécessaire (e.g. en cas de prélèvements sanguins importants), une réhydratation des animaux est prévue.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur (Réf. ICH M3(R2)). Le choix de l’espèce est propre à chaque étude et justifié par le donneur d’ordre, en fonction de la substance à tester, de son mécanisme d’action, de l’éventuelle disponibilité de données préliminaires issues de tests de pharmacocinétique ou d’innocuité, préalablement réalisés, ce peut être aussi en fonction des similitudes avec l’homme concernant des voies métaboliques précises ou un système physiologique cible. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 420). Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis l'âge de sevrage jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 409).
Etude de l’efficacité de molécules pharmaceutiques dans un modèle d’induction de lésion pulmonaire aiguë par injection intranasale de lipopolysaccharides chez la souris et le rat.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Rats : 513
847 souris et 513 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une endotoxine bactérienne leur est instillée dans le nez sous anesthésie gazeuse pour provoquer une lésion pulmonaire aiguë avec œdème, puis ils reçoivent par voie orale, une à deux fois par jour, les composés d'une société pharmaceutique, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort pour analyse histologique des poumons. Le porteur annonce vingt-cinq études sur ce modèle. Il présente le choix de la voie nasale plutôt que trachéale comme "un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire", la dégradation de la fonction respiratoire provoquée restant selon lui "limitée" parce que ces études durent 24 heures.
Objectifs
La lésion pulmonaire aiguë (ou ALI pour acute lung injury) est une forme d'insuffisance respiratoire, caractérisée par une atteinte pulmonaire inflammatoire diffuse aiguë qui entraîne une augmentation de la perméabilité des capillaires alvéolaires et un œdème pulmonaire non hydrostatique. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), forme la plus invalidante d’insuffisance respiratoire, représente encore une cause importante de mortalité chez les patients. Nous souhaitons développer un modèle in vivo d’inflammation pulmonaire aigue pour une évaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques développés par notre société. Les modèles murins d’infection intranasale par le LPS (une endotoxine) constituent des modèles de choix pour cette pathologie. Cette endotoxine d’origine bactérienne provoque une réponse inflammatoire importante chez les animaux et chez l’Homme. L'administration intranasale du LPS provoque une réponse inflammatoire pulmonaire rapide et locale à court terme. Ce modèle aigu nous permettra de relier l’efficacité à l’exposition pulmonaire de nos composés (pharmacodynamique). La voie d’administration intranasale est également moins invasive que l’injection par voie intratrachéale (avec ou sans chirurgie). Selon la littérature scientifique, la reproductibilité et l’impact sur l’inflammation et les lésions du tissu pulmonaire semblent être comparables entre les deux voies d’administration. Ainsi, le modèle LPS intranasal offre un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire. Ce modèle de lésion pulmonaire aigue se rapproche fortement du phénomène inflammatoire observé chez l’Homme lors d’atteintes pulmonaires aiguës. En termes de mécanisme d’action, la production excessive de molécules du stress oxydatif, induite par l’administration de LPS, joue un rôle déterminant dans le déclenchement et le maintien de la réponse inflammatoire aigüe. Ce modèle constitue donc un modèle de choix pour évaluer nos composés pharmacologiques ciblant le stress oxydatif.
Bénéfices attendus
La lésion pulmonaire aiguë, par son stade aggravé (le syndrome de détresse respiratoire aiguë - SDRA), est un syndrome clinique sévère courant en unité de soins intensifs, qui conduit à une forme d'insuffisance respiratoire, entraînant une mortalité jusqu’à 30 à 40 %. Les résultats attendus dans ce modèle nous permettront d’identifier rapidement les molécules avec le meilleur potentiel thérapeutique. Par ailleurs, les mécanismes inflammatoires impliqués correspondent parfaitement au mode d’action de nos molécules. Cela nous permettra de valider leur action dans ces processus inflammatoires. Ces molécules pourront par la suite être incluses dans le processus de développement pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
L’administration intranasale de LPS se fera sous anesthésie gazeuse en moins d'une minute. Une contention légère permettra le traitement par voie orale en 20 secondes, 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie gazeuse (moins de 1 minute) avant euthanasie (sans réveil entre les 2 actes).
Impact sur les animaux
Le LPS a pour effet une dégradation de la fonction pulmonaire, malgré tout limitée pour ces études de 24h. La légère contention nécessaire pour le traitement par voie orale, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prelever les tissus pulmonaires afin d'analyser l'évolution de la maladie en histologie.
Remplacement
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leur mécanisme d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Pour évaluer l’activité des composés in vivo, il est indispensable de recourir ensuite à l’utilisation de modèles animaux intégrant au mieux la physiopathologie humaine (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammation…). Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro et c’est pour cela que ce modèle in vivo est nécessaire. De plus, ce modèle vivo est décrit dans la littérature scientifique et a été validé avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été utilisé par le passé pour développer des molécules au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux maximum nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront utilisés. Nous optimiserons les études pour utiliser le moins de groupes contrôle possible. Ainsi, 25 études seront réalisées dans ce porjet.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. La voie d’administration intranasale est privilégiée par rapport à l’infection intratrachéale pour éviter une contention forte (injection par otoscope et sonde) ou de la chirurgie. Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. La formation du personnel, la taille de la sonde et l’adaptation des volumes administrés permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Après réception, un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager le comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces dont les manifestations inflammatoires sont les plus connues et se rapprochent le plus de celles de l’Homme dans ce modèle. Comme décrit dans la littérature, la souris est le modèle animal le plus utilisé pour ce modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par le LPS. Il est approprié car plusieurs signes physiopathologiques caractéristiques de cette atteinte inflammatoire ont été rapportés dans la littérature scientifique. Nous établirons également le modèle chez le rat si nécessaire, dans le cas de composés ayant une pharmacocinétique plus favorable chez le rat par rapport à la souris. L’implication du stress oxydatif dans ce type de pathologie a été rapporté dans la littérature scientifique via des études in vivo. Basé sur la littérature scientifique et sur notre expérience antérieure sur le modèle, les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines d’âge à l’induction de l’inflammation.
Travaux pratiques formation niveau applicateur des procédures expérimentales sur rat et souris
- Formation professionnelle
Rats : 300
Tués à la fin de chaque session de formation, faute de pouvoir être affectés à un autre projet, 600 souris et 300 rats subissent des gestes techniques d'apprentissage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit au maximum deux gestes parmi injection intraveineuse caudale, injection intrapéritonéale, injection sous-cutanée, prélèvement submandibulaire et gavage, ce dernier étant le seul pratiqué sans anesthésie. Le porteur écrit lui-même que les animaux pourront être impactés par des gestes hésitants, voire brusques, et que leur stress ne pourra pas être évité dans un premier temps. L'effectif est calé sur le nombre de personnes à former, quatre sessions de trente personnes par an pendant cinq ans, et le porteur précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
Les objectifs de ce projet de formation sont multiples : avoir une première approche de la réalisation des travaux pratiques de fin de formation de niveau applicateur, uniformiser les pratiques afin d'être le plus reproductible possible et raffiner les techniques pour fournir une qualité optimale dans les résultats expérimentaux sur rats et souris. Cette formation réglementaire pratique est intégrée/fait suite à une formation théorique pour les personnes de niveau applicateur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples : première approche des gestes techniques classiques, sensibilisation sur les bonnes pratiques, raffiner les techniques en optimisant le matériel utilisé, les manipulations et harmonisation des savoir-faire afin d'être reproductible. Ce projet s'inscrit dans une démarche court terme : formation directe du personnel, moyen terme : réalisation des gestes techniques dans le cadre scientifique.
Procédures
Les gestes techniques réalisés seront les suivants : prélèvement/injection intraveineuse caudale, injection intrapéritonéale, injection sous-cutanée, prélèvement submandibulaire et gavage. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie générale (sauf pour le gavage). Deux gestes techniques maximum seront faits sur un animal. Les collaborateurs ne pourront effectuer l'intégralité des gestes. Pour les rats, le binôme se mettra d'accord pour la réalisation des 2 gestes techniques. Si l’injection intraveineuse en veine caudale seule était souhaitée, elle serait faite par une seule des deux personnes du binôme. Seule l’injection intraveineuse en veine caudale sera un geste unique sur un animal. Chaque geste durera moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Comme tout geste technique non maitrisé en phase de de découverte ou d'apprentissage, il est évident que les animaux pourront être impactés par des gestes techniques hésitants, voire brusques. En effet, le stress des animaux ne pourra pas être évité dans un premier temps notamment à cause de la manipulation en cours d'apprentissage de la personne concernée (travail de préhension et contention). Ceci entrainera principalement des douleurs légères de courte durée et du stress.
Devenir
A la fin de chaque session de formation, les animaux seront euthanasiés, ne pouvant pas être utilisés pour un autre projet.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de permettre aux personnes ayant déjà participé à la partie théorique du niveau applicateur, de mettre en pratique les connaissances acquises. Des alternatives à l’utilisation d’animaux vivants ont été envisagées : travaux pratiques intéractifs, utilisation de poupées pour imiter la taille de l'animal, etc. Dans le cadre de la première approche des gestes techniques, il est nécessaire d'assurer une formation complémentaire technique et de suivi sur animal vivant. En effet, certains gestes techniques tels que les gavages ou les injections nécessitent l'utilisation d'animaux vivants afin d'avoir la dextérité et la sensibilité du geste (fausse route, injection/prélèvement non maitrisé, etc.).
Réduction
Dans le cadre de la mise en place de ce projet, le nombre d'animaux aura été réduit au maximum. Le nombre d’animaux utilisés est estimé en fonction du besoin d’un nombre de personnes à former. Il est pris en compte d’éviter l'effet cumulatif des gestes techniques, en limitant le nombre de geste par animal par binôme. Il est calculé l'utilisation d'1 souris pour 1 personne formée et d'1 rat pour 2 personnes formées. Il est prévu 4 sessions de formation de 30 personnes par an, soit 600 personnes au total sur les 5 ans. Au total, 900 animaux seront utilisés (150 rats femelles, 150 rats mâles, 300 souris femelles et 300 souris mâles). Les espèces et les sexes à utiliser et à observer seront répartis au sein des différents binômes d'une session de formation. Il est à noter que pour les animaux destinés à ce projet, il sera envisagé de récupérer les animaux destinés à la mise à mort car ils ne répondent pas aux critères voulus (trop vieux) pour la vente ou l’utilisation dans d’autres projets. Cela permettrait également d'éviter de produire des animaux destinés à de la formation interne. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Etant dans le cadre d'une formation interne, toutes les précautions seront prises pour permettre de limiter le stress ou la douleur liée à l'apprentissage du geste technique : travail de contention préalable, réalisation de la majorité des gestes sous anesthésie, utilisation de canules souples, diminution de la taille de l'aiguille quand cela est possible. Un travail en amont sera fait avec les personnes sur la contention des animaux. L'observation sera continue pendant les gestes techniques pour détecter précocément tous signes de douleur, souffrance ou mal-être qui nécessiteraient une sortie de la procédure.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche scientifique française. Il est nécessaire que la formation effectuée se fasse sur les mêmes espèces. Aucune souche ne sera privilégiée afin de permettre aux opérateurs d'être opérationnels sur l'intégralité des demandes et contraintes techniques. Les animaux utilisés seront des animaux de réformes (souche, âge, poids non vendables) afin d'avoir un panel plus large d'animaux sans les produire spécifiquement pour la formation.
Evaluation préclinique de dispositifs médicaux d’implantation dentaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Une dent arrachée sous anesthésie générale, l'implant dentaire posé dans la foulée, trente minutes à une heure d'intervention, puis des semaines d'observation ponctuées de prises de sang et d'examens du site d'implantation sous anesthésie. 120 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur liste les suites possibles, douleur, perte d'appétit, gêne à la mastication, infections bactériennes et saignements du site opératoire, puis conclut qu'il n'est pas possible de maintenir les animaux en vie, les tissus autour de l'implant devant être prélevés pour histologie. Il rappelle que le rat ne remplit pas tous les critères recommandés pour ce type de test, hygiène orale et maturité squelettique, et que l'essai est commandé par un donneur d'ordre en vue d'une mise sur le marché.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé d’implantologie et de chirurgie dentaire (exemple : implant, vis, ciment, ...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en chirurgie dentaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour l’extraction dentaire, puis l’implantation du dispositif à tester dans la foulée . Ces interventions peuvent durer de 30 minutes à 1h environ et ont lieu sous anesthésie générale et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non (
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : -douleur et stress liés à la chirurgie. -perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -gêne à la mastication et la prise alimentaire pouvant entrainer une perte de poids à plus long terme -les infections bactériennes liées à la chirurgie. -les saignements au niveau du site opératoire.
Devenir
Pour répondre aux objectifs du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les tissus et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé dentaire. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou design d’étude le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et Aavant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (produit de nidification : coton), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (analgésie post-opératoire, désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée si nécessaire en cas de signes cliniques…). Les prises de sang peuvent être réalisées si nécessaire sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous anesthésie locale, ou encore sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie préalable, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle.
Choix des espèces
Il n’existe pas de modèle animal validé pour tester les dispositifs médicaux dentaires, mais les textes de référence recommandent l’utilisation d’animaux dont : -les mâchoires sont de taille adéquate pour permettre l’accès chirurgical et l’implantation du dispositif, -il existe la présence de dents opposées, -la maturité squelettique est atteinte, -l’hygiène orale peut être contrôlée, -l’alimentation est omnivore et qui présentent des mouvements de mastication. La littérature scientifique reporte l’utilisation du rat comme un modèle de choix dans l’évaluation préliminaire des dispositifs médicaux à visée dentaire. Cependant cette espèce ne remplit pas tous les critères citées plus haut tel que la maturité squelettique difficilement objectivable (pas de fermeture des plaques de croissance osseuse + non nécessaire selon la littérature) et hygiène orale difficile à contrôler. Néanmoins, l’espèce rat constitue un modèle de choix car certaines similarités physiologiques sont observées entre l’implantation chez l’humain et chez le rat (structure osseuse, mécanismes de cicatrisation…). Ainsi ce modèle permet d’ obtenir des données préliminaires et contribuer au développement d'interventions sûres et efficaces pour l'implantation dentaire chez l'Hommeutiles pour les étapes de développement du produit.
Détermination du profil hémostatique d’un candidat médicament par le test du temps de saignement à la queue chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 260
Une incision à la queue, puis le chronomètre jusqu'à l'arrêt du saignement, c'est la prestation vendue aux commanditaires de candidats médicaments. 240 souris et 260 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à l'issue du test ou plus tôt si le produit testé provoque des effets indésirables. Le test se déroule sous anesthésie et dure de quatre à soixante minutes, parfois précédé d'une chirurgie de pose de cathéter de vingt à quarante-cinq minutes, et les prises de sang peuvent atteindre cinq par jour chez la souris et huit chez le rat. Une partie des rongeurs est génétiquement modifiée pour reproduire l'hémophilie A, l'hémophilie B ou la maladie de Willebrand, le porteur ajoutant que les effets des produits ne sont pas prévisibles à l'ouverture du projet.
Objectifs
Le but de ce projet est de déterminer les capacités pro- ou anticoagulantes d'un candidat médicament par le test du temps de saignement à la queue chez le rongeur. Ce test constitue un outil pour évaluer la fonction plaquettaire et l’efficacité de la coagulation après administration d'un candidat médicament chez le rongeur sain ou présentant un trouble de la coagulation sanguine. Avant ou après l’administration du candidat-médicament et éventuellement du véhicule qui a servi à préparer la formulation de la molécule testée, l'animal est anesthésié et analgésié et une incision est réalisée au niveau de la queue. L’écoulement du sang est observé jusqu’à son arrêt. Un cathéter intraveineux ou carotidien peut être placé sous anesthésie, pour administrer le produit ou prélever du sang avant et pendant le test du temps de saignement. Un ou des prélèvements sanguins pourront être réalisés avant ou après le test pour déterminer la concentration plasmatique du produit et/ou ses métabolites.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les pathologies de la coagulation, un éventail de pathologies humaines touchant près de 1 125 000 personnes dans le monde. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques
Procédures
Les animaux de ce projet subiront : une administration de produit par différentes voies, avec moins de 3 minutes par administration. Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal vigile ou anesthésié (environ 2 minutes par prélèvements). Ces expériences (administration et prélèvements de sang) pourront être réalisées sur animal vigile ou anesthésié, à raison de 5 prélèvements maximums par jour chez la souris et 8 chez le rat, en respectant un volume maximal de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. Chirurgie d'implantation de cathéters (pour prélèvements et/ou administration) sous anesthésie et analgésie générale. Cette chirurgie durera environ 20-45min. Le test du temps de saignement à la queue sera réalisé sous anesthésie et analgésie générale (durée entre 4 et 60 min maximum) suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie pourra être éventuellement réalisé (durée entre 4 et 6 minutes).
Impact sur les animaux
Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint : pour d'éventuels prélèvements de sang, pour l'administration du composé à tester, et à chaque fois pour induire l'anesthésie avant la pose de cathéters et/ou le test du temps de saignement à la queue. Ces contentions peuvent donc engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations et lors des prélèvements sanguins. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables font l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.
Devenir
Euthanasie des animaux à l'issue du test de temps de saignement de la queue et/ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pro ou anti-coagulants d’une nouvelle molécule sur l'homme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou des effets secondaires d'un candidat médicament. A ce jour, le rongeur est l'espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d'étude (temps de saignement).
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 10 / par groupe. Sur la période du projet ( 5 ans), il est prévu de réaliser entre 10 à 12 études avec les rongeurs.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole anesthésique adapté pour le test de saignement de la queue, • La mise en groupe des animaux
Choix des espèces
Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le rongeur est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets pro ou anti coagulante d'un candidat médicament, notamment par sa facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Les rongeurs génétiquement modifiés susceptibles d’être utilisés dans le test de temps de saignement reproduisent les caractéristiques des pathologies de la coagulation humaine (Hémophilie A, Hémophilie B, maladie de Willebrand) par inhibition ou mutation des gènes responsables de la production des facteurs de coagulation. Ces modèles sont utilisés pour tester l'efficacité de nouveaux traitements, comme l'administration de facteurs de coagulation recombinants ou les thérapies géniques visant à corriger le défaut génétique. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Formation, entraînement aux gestes techniques, tests anesthésiques et actes d’imagerie sur rongeurs de laboratoire (souris et rats)
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Rats : 260
Pour entraîner des personnels aux gestes techniques, 1 380 souris et 260 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pris parmi les animaux dits de réforme de l'établissement. Chaque animal subit jusqu'à trois gestes, injections, prélèvements sanguins ou tatouage des phalanges, réalisés par des personnes peu ou pas expérimentées, avec les contentions prolongées et les piqûres hésitantes que le porteur reconnaît. S'y ajoutent des essais de protocoles anesthésiques pouvant provoquer des réveils précoces ou tardifs, une hypothermie, une hypotension ou une dépression cardiorespiratoire. Le devenir déclaré ne prévoit aucun animal gardé vivant, quand le porteur écrit que ceux passés par une procédure non invasive sont conservés, et il juge "indispensable" de travailler sur la souris.
Objectifs
Tous les utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques se doivent de maitriser les gestes techniques afin de s’assurer du bien être animal et réduire le nombre d’animaux utilisés lors de leurs projets expérimentaux. La formation initiale et les formations continues doivent être complétées par un entrainement aux différents gestes qui vont être réalisés lors des procédures. Le présent projet a pour but de lister certains gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme dans le cadre d’apprentissage ou de training. Par ailleurs, l’anesthésie et l’analgésie font partie de nombreux projets et sont essentiels au raffinement des procédures, autant pour le bien-être des animaux que pour la cohérence des résultats obtenus. Ce projet va permettre de valider différents protocoles anesthésiques et analgésiques. Il va également décrire la mise en œuvre d'actes d'imagerie à l'aide d'un échographe. Ces sessions permettront d'apprendre à utiliser l'appareil et de réaliser des repérages anatomiques, cela afin d'appréhender les anomalies anatomiques éventuelles.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’assurer une maitrise des gestes techniques réalisés par tous les utilisateurs de la zootechnie afin que ceux-ci puissent travailler en autonomie et dans le respect de la réglementation relative aux compétences des personnels. Ces formations permettront de s’assurer du bien être des animaux lors des procédures. Ces bonnes pratiques diminueront également le biais dans les protocoles expérimentaux lié au stress ou à la douleur de l’animal. La validation de différents protocoles anesthésiques et analgésiques permettra d’adapter au mieux les molécules utilisées pour une plus grande sécurité de l’animal, en regard des attendus du projet. L'echographie quant à elle permetra d'affiner le diagnostic dans des situations particulières.
Procédures
Les animaux, vigiles ou anesthésiés, pourront subir diverses administrations, injections, prélèvements sanguins ainsi qu’un tatouage aux phalanges. 3 gestes maximum seront réalisés sur chaque animal, la durée étant variable selon le degré de formation du stagiaire allant de queleques secondes à moins de cinq minutes. Les animaux subiront également des injections pour la validation des protocoles anesthésiques et analgésiques. Dans le cas de l'échographie la durée totale de chaque acte ne devra en aucun cas dépasser les trente minutes
Impact sur les animaux
Ce projet a pour but de former ou valider des gestes techniques sur des personnels peu ou pas expérimentés. Ces gestes mal maitrisés peuvent engendrer un stress ou une douleur chez l’animal : contention plus longue, injection hésitante, difficulté à trouver le site précis lors des injections/prélèvements veineux. Les tests anesthésiques pourront engendrer des réveils précoces ou au contraire tardifs, avec des effets secondaires plus ou moins marqués selon les molécules utilisées (hypothermie, hypotension, dépression cardiorespiratoire). Pas de nuisances attendues lors des sessions d'échographies.
Devenir
Afin de ne pas multiplier le stress et la douleur des animaux ayant participé à 3 sessions de training (procédure invasive), ils seront mis à mort après chaque procédure. Dans le cas des animaux impliqués dans une procédure non invasive, ils seront gardés en vie à la fin de celle-ci.
Remplacement
Pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile, ainsi que les spécificités anatomiques propres à chaque individu et les caractéristiques hémodynamiques d’un animal vivant ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives (mannequin ou peluche). Cependant, si cela est possible certains gestes pourront être mimé sur un animal ou un élément factice. Les animaux vivants restent indispensables pour former les personnes les utilisant dans les mêmes conditions que lors de la réalisation du projet scientifique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous n’utiliserons que des animaux de réforme. Ces derniers sont les animaux disponibles de notre établissement n’étant pas rentrés dans un protocole de recherche ou ne portant pas les gènes d’intérêts. Le nombre d’animaux sera également limité par participant. Pour les tests anesthésiques, la validation des protocoles nécessite un nombre limité d'animaux et ne fait pas l'objet de tests statistiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages ventilées par groupe, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (parmi igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest), et un statut sanitaire exempt de pathogènes contrôlé trimestriellement. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie quand cela est possible, et l’utilisation de tapis chauffants limite l’hypothermie lors des anesthésies. Les animaux utilisés sont choisis en bonne santé et sans phénotype dommageable. L’encadrement est réalisé par du personnel compétent, et l’état de santé des animaux contrôlé quotidiennement. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux réformés les écarte de toute utilisation de training.
Choix des espèces
Les équipes de recherche, pour la majorité, utilisent la souris comme modèle animal dans leurs projets expérimentaux. La zootechnie expérimentale accueille donc principalement des souris et le personnel de la zootechnie ainsi que les utilisateurs sont amenés à travailler sur ce modèle. L’objectif de ce projet étant d’améliorer la méthodologie des gestes techniques, il apparaît judicieux et indispensable de travailler sur la souris. Des manipulations sur rats sont également prévues dans le cas où des protocoles expérimentaux utilisent cette espèce. Les animaux seront utilisés en fonction de leur disponibilité. Le critère d’âge n’est pas restricif sur l’utilisation de ces animaux.
Identification et caractérisation de molécules ciblant les récepteurs d’aryl hydrocarbone (AHR) chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
2 440 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour les souris et menées sans réveil pour les rats. Les souris reçoivent des injections dans la veine du pénis ou de la queue, jusqu'à cinq anesthésies gazeuses et cinq séances d'imagerie de deux heures réparties sur cinq semaines. Les rats subissent une chirurgie de trente minutes pour la pose de cathéters dans la veine et l'artère fémorales, puis deux heures d'imagerie ponctuées de six prélèvements sanguins, sans jamais se réveiller. Le porteur écrit qu'après la sélection in vitro de dix molécules, il est "nécessaire" de les tester sur "l'animal vivant (organisme entier)", ni la barrière hémato-encéphalique ni la fonction d'entrée artérielle ne pouvant selon lui être modélisées autrement.
Objectifs
Récemment, l’étude de cette protéine s’est intensifiée car un dysfonctionnement de l’activité et de l’expression de cette protéine a été retrouvé en cancérologie (glioblastome, cancer du côlon, etc…) et dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ces pathologies, cette protéine est fréquemment sur-exprimé et/ou sur-activé, ce qui fait de cette protéine une cible d’intérêt pour le développement de nouveaux radiotraceurs à visée thérapeutique et/ou diagnostique. In vitro, des tests d’activation et d’inhibition de cette protéine ont permis de sélectionner 10 molécules candidates. Ces molécules ont toutes la spécificité de pouvoir être marquées au fluor 18. Les résultats obtenus sont très encourageants. Il est maintenant nécessaire de les tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour valider leur potentielle utilisation à visée diagnostique et/ou thérapeutique. La validation de l’utilisation d’une molécule candidate consiste à démontrer que cette molécule sera un outil performant permettant de quantifier l’expression de cette protéine .
Bénéfices attendus
Différentes études ont montré que cette protéine joue un rôle fondamental dans le développement et le fonctionnement de notre organisme. Plusieurs études ont montré que des dysfonctionnements liés à cette protéine étaient impliqués dans des maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde, lupus érythémateux), dans des maladies inflammatoires du tube digestif (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique…), les pneumopathies obstructives chroniques, ou encore différents types de cancers . Disposer d’un radiotraceur permettant de quantifier cette proteine in vivo serait un atout important pour les patients atteints de ces maladies afin d’aider à l’amélioration de leur prise en charge. De même, de nombreuses équipes de recherche sont en cours de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant cette protéine dans ces maladies. Dans ce contexte, disposer d’un traceur radioactif spécifique de cette protéine permettra de mieux caractériser les mécanismes d’action de ces médicaments et de définir les doses nécessaires à leurs potentiels effets thérapeutiques.
Procédures
Pour une expérimentation concernant l'injection d'un produit qui durera au total 125min: elle sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale (induction, maintien lors de l'injection) pendant 5 min sur des souris, injection dans la veine du pénis ou veine caudale 1 fois pendant 30 secondes. Pour une autre procédure concernant l'injection de 2 produits , d'une durée totale d'environ 150min , les souris auront 2 anesthésies gazeuses pendant 5 min lors de injection en intra-veineux (IV) (induction, maintien lors de l'injection) et injection en intraveineux 2 fois pendant 30 secondes à 20min d'intervalle. Pour l'expérimentation de l'imagerie: les souris auront 5 anesthésies gazeuses durant 130min à la fréquence d'une fois par semaine sur une durée totale de 5 semaines (induction, maintien pendant imagerie de l'animal) , 5 fois une pose de cathéter en intra-veineux, d'environ 10 min et ou 5 fois une injection intrapérionéale pendant 10 secondes et 5 imageries pendant 120min d'une fréquence 1 fois/semaine pendant 5 semaines. Pour la procédure des rats, cette expérimentation durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l'animal sous anesthésie générale. les animaux seront soumis à une chirugies d'environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l'atrère fémoral. les rats seront ensuites imagés pendant 120 min. au cours de l'imagerie , des prélèvements sanguins seront réalisés pendant l'imagerie à 1min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min et 120 min).
Impact sur les animaux
La manipulation avant l'anesthésie entraine un léger stress chez l'animal. La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du radiotraceur ou de l’antagoniste peut-être ressentie jusqu’à la mise à la mort. Un hématome associé à une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre. Une injection intrapéritonéale peut provoquer de la douleur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour des études ex-vivo
Remplacement
Cette étude in-vivo fait suite à de nombreuses étapes de mise au point et de caractérisation in vitro. La caractérisation in vivo et la validation d’un radiotraceur ne peuvent s’effectuer sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, la fixation d’un radiotraceur dans les différents organes d’intérêt, ainsi que le passage de la barrière hémato-encéphalique ne peuvent être modélisés in vitro/in silico. De plus, la fonction d’entrée artérielle ne peut-être substituée par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain de la distribution systémique et la fixation du radiotraceur au sein de l’organisme entier vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux détaillé dans ce document est maximal est sera revu à la baisse en fonction de la quantité de molécules qui passeront l’étape de biodistribution froide, donc ayant montré une fixation spécifique. Ce projet sur 5 ans pour 10 molécules nécessite l’utilisation de 2 espèces : - 2160 souris sauvages (non transgéniques) et 280 souris transgéniques pour la protéine concernée - 200 rats Wistar. Des tests statistiques seront réalisés à la suite de ces études.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit lors de ce projet. Pendant le protocole, si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. La posture de l’animal et sa réactivité à des stimuli externes seront monitorés chaque jour. Pendant les expérimentations, l’induction d’anesthésie gazeuse sera réalisée à 3% et les animaux seront maintenus à 2%, une protection oculaire sera appliquée. Si au cours du projet, les animaux présentent des signes de souffrance (poils hérissé, prostration…) la décision de la mise à mort sera prise par une personne habilitée à ce geste. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Une grille de score sera utilisée pour évaluer les expressions faciales une fois par semaine, le lendemain des expérimentation d'imagerie. Lors du protocole de la chirurgie, l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux à 4% et les animaux seront maintenus à 3%, une analgésie sera injectée durant tout la chirurgie et un anesthésique local sera appliqué au niveau du site d'incision. Une protection oculaire sera également appliquée. Durant cette manipulation, l'animal sera maintenu sur un tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés.
Choix des espèces
Le seul moyen de s’assurer de la spécificité d’un radiotraceur envers sa cible est d’utiliser des animaux qui n’expriment pas cette cible, soit des animaux transgéniques (souris) pour le gène désiré. En revanche pour la fonction d’entrée artérielle, dont le but est de caractériser la pharmacocinétique du radiotraceur, le rat sera utilisé car cette procédure n’est pas à l’heure actuelle réalisable chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole et des rats adultes qui ont la taille adaptée pour la réalisation de la chirurgie.
Transmission virale inter-espèces chez des animaux vertébrés dans un contexte insulaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 20
Autres rongeurs : 60
Autres mammifères : 100
Autres oiseaux : 200
Reptiles : 100
Autres amphibiens : 100
Chauves-souris endémiques de La Réunion, oiseaux, rats, tangues, geckos et amphibiens, le projet cible toute la communauté de vertébrés d'un même site. 600 animaux sauvages vont être capturés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, soit 200 oiseaux, 100 chauves-souris, 100 petits mammifères terrestres, 100 reptiles et 100 amphibiens. Chacun subit en cinq à dix minutes un écouvillon de fèces, un prélèvement d'urine, un écouvillon buccal, une prise de sang et un retrait de parasites, sans anesthésie pour les oiseaux, que le porteur juge plus risquée que les gestes eux-mêmes. La capture peut provoquer hyperthermie, déshydratation, essoufflement et cyanose des muqueuses, et si la plupart des animaux repartent, les individus des espèces visées par un arrêté préfectoral de destruction, rats noirs, rats bruns, souris grises, tangues, musaraignes, agames et geckos verts non indigènes, ne sont pas relâchés.
Objectifs
L’émergence des zoonoses (maladie causée par un agent infectieux pouvant se transmettre entre l’homme et d’autre animaux vertébrés) est liée à un ensemble de facteurs environnementaux, populationnels et intrinsèques aux agents infectieux. L’étude de ces facteurs permet d’évaluer le niveau de menace associé aux agents infectieux, mais également leur risque d’émergence, en particulier dans les populations humaines. Les zoonoses impliquant, par définition, des échanges d’agents infectieux entre des espèces animales vertébrées et l’homme, l’estimation du potentiel de sauts d’espèces de ces agents infectieux est une étape incontournable à l’évaluation du risque. Le franchissement de la barrière d’espèce est cependant conditionné par les contacts, directs ou indirects, entre espèces de vertébrés, mais aussi par les propriétés moléculaires des agents infectieux et leur capacité à se multiplier et se transmettre dans de nouvelles espèces. A La Réunion, quatre familles virales ont été décrites chez le Petit Molosse (Mormopterus francoismoutoui) : les Coronaviridae, les Paramyxoviridae, les Astroviridae et les Rhabdoviridae. Les analyses phylogénétiques réalisées sur ces virus semblent indiquer la possibilité d’échanges entre chauves-souris, rongeurs, et potentiellement oiseaux, en particulier pour les Paramyxoviridae et les Astroviridae. Le sens de ces échanges de virus (chauves-souris vers autres groupes taxonomiques, ou inversement), de même que la fréquence, le mode de transmission (par contact ou transmission environnementale) ou encore la capacité de ces virus à induire une excrétion virale assurant une transmission pérenne chez une nouvelle espèce, sont des aspects pour lesquels nous n’avons pas d’élément de réponse. L’objectif de ce projet est d’estimer le potentiel de changement d’hôtes des virus associés au Petit Molosse. Nous nous focaliserons sur les Coronaviridae, les Paramyxoviridae et les Astroviridae, pour lesquels la présence d’ARN viral a été mise en évidence à de nombreuses reprises. Les Rhabdoviridae ne seront pas inclus dans cette étude, étant donné qu’ils ont été mis en évidence uniquement sur la base d’analyses sérologiques (6), que leur détection sur des chauves-souris vivante est extrêmement rare, et du fait de leur potentiel limité à s’implanter durablement chez de nouveaux hôtes
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mettre en évidence des échanges des virus entre les chauves-souris et les autres espèces de vertébrés partageant le même habitat, et de déterminer le sens de ces échanges. La prise en compte du statut des espèces à La Réunion, indigènes ou introduites, permettra de confirmer la transmission de virus depuis des espèces synanthropiques (e.g. rats, pigeons) vers le Petit Molosse, seule espèce de mammifère endémique sur l’île. Nous apporterons également des réponses sur le mode de transmission inter-espèces, par l’analyse d’échantillons environnementaux (e.g. guano, terre, eau). Pour les Coronaviridae et les Paramyxoviridae, la faible diversité génétique permettra l’application de systèmes de détection spécifiques, de quantifier la charge virale et de confirmer le statut de réservoir de ces espèces. L’analyse de la diversité génétique des Astroviridae confirmera l’hypothèse d’une circulation « écosystémique » de ces virus. L’ensemble de ces résultats affinera notre évaluation du risque zoonotique associé à ces « virus réunionnais ».
Procédures
Pour chaque animal, les prélèvements suivant seront réalisés : (i) un prélèvement de fèces par écouvillon ou collecte dans le sac de contention, (ii) un prélèvement d’urine pour les mammifères, (iii) un prélèvement de salive (écouvillon oropharyngé ou buccal), (iv) une prise de sang (excepté pour les amphibiens), et (v) des parasites hématophages (pour les oiseaux et mammifères). L'ensemble de ces prélèvements durera environ 5 minutes pour chaque animal. L’anesthésie des oiseaux étudiés dans le projet représente en soit une procédure de classe supérieur à celle qui sera réalisée ici. Afin de limiter le stress des oiseaux nous n'anesthésierons donc pas les animaux dans le cadre de ce projet.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sur animaux sont toutes légères et courtes, mais le cumul de gestes est à prendre en compte car la durée de capture sera en conséquence plus longue. Nous estimons la durée de marquage et de prélèvements biologique (écouvillons et prise de sang) de 5 à 10 minutes par animal (quel que soit le groupe taxonomique). Toutes les espèces concernées étant des espèces sauvages non captives, l’ensemble des procédures induira un stress sur les animaux. Les nuisances attendues seraient des effets aiguës liés à la manipulation, mais nous n’attendons aucun effet sur le long terme, étant donné le caractère non invasif des procédures réalisées. Même si des mesures de raffinement et des points limites adaptés seront mis en place, nous pouvons observer des effets indésirables en relation avec le stress aiguë lié à la captivité : hyperthermie, déshydratation, essoufflement, cyanose (coloration anormale bleutée de la peau qui indique un manque d’oxygène dans le sang) des muqueuses, fatigue. La procédure de prélèvement sanguin serait la plus invasive. Nous pourrions observer exceptionnellement des hématomes sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront replacés, excepté les individus d’espèces soumises à un arrêté préfectoral de destruction ne seront pas relâchés dans l'environnement (Rat noir, rat brun, Souris grise, Tangue, Musaraigne, Agame des roches et geckos verts diurnes non indigènes).
Remplacement
Le projet porte spécifiquement sur la diversité et la transmission des agents infectieux chez des animaux sauvages, dans leur environnement naturel. Les espèces ciblées ne peuvent donc pas être remplacées.
Réduction
Le nombre maximal d'animaux utilisés sera de 100 à 200 par groupe taxonomique, ce qui permettra d'avoir un seuil de détection viral acceptable d'un point de vue statistique. Cette approche est en accord avec les stratégies d'expérimentation que nous avons utilisé dans le passé qui ont permis d'obtenir à la fois des résultats valides d'un point de vue statistique sans pour autant affecter la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux.
Raffinement
Pour les oiseaux, nous réaliserons les captures principalement à l’aube, pour une durée maximale de 5 heures. Nous éviterons de manipuler des oiseaux par temps de pluie, pour ne pas altérer l’étanchéité des plumes. La pose d'une bague permettra également d'identifier individuellement les oiseaux et de les relâcher immédiatement en cas de recapture. Pour les prises de sang, la vitesse normale de coagulation pour les oiseaux n'est pas connue, mais est habituellement considérée d'une durée d'environ cinq minutes. Le stress et les températures élevées sont susceptibles d'affecter cette durée. La fin de l'écoulement sanguin sera vérifiée avant le relâché des oiseaux. Enfin, l'hydratation des oiseaux sera réalisée de façon systématique avec une solution de glucose. Pour les chauves-souris, les captures se déroulerons le matin lors du retour des chauves-souris dans leur gîte, ou en fin d’après-midi afin de relâcher les individus au moment du coucher du soleil, heure normale à laquelle les chauves-souris partent s’alimenter. Les animaux seront capturés à l’aide d’un filet à papillon, en approchant délicatement les individus accrochés sur les parois de la grotte. Les chauves-souris seront immédiatement hydratées avec de l’eau et placées individuellement dans des pochons propres opaque, suspendus au calme et à l’ombre et recouverts d’un tissu polaire. Pour les petits mammifères terrestres, les animaux seront maintenus dans leur cage-piège à l’ombre recouvert d’un drap pour diminuer le stress avant manipulation. Un biberon d’eau sera proposé à tous les animaux quand ils seront encore dans leurs cages-pièges, avant le début de la contention. Une durée maximum sera fixée pour la réalisation de tous les actes dès lors que l’animal est contenu. Cette durée sera de 10 minutes maximum par individu, de la contention au relâché. L’environnement de l’animal pendant toutes les manipulations sera contrôlé : endroit calme, à l’abri du soleil, en sécurité, propre, avec une faible luminosité. Pour les reptiles et amphibiens, les captures se feront de deux heures après le lever du soleil à deux heures après le coucher du soleil. Cela permettra de couvrir l’ensemble des plages horaires d’activité des différentes espèces. Les animaux capturés seront placés dans des sacs en tissus pour diminuer le stress avant les mesures et seront relâchés sur la zone de captures.
Choix des espèces
Ce projet porte spécifiquement sur un ensemble d’espèces (communauté) partageant le même habitat. Nous ciblerons donc la totalité des espèces de vertébrés identifiées sur notre site d’étude : chauves-souris, oiseaux, petits mammifères terrestres, reptiles et amphibiens. Le nombre précis d’espèce ne peut être indiqué en amont du projet car il dépendra des opportunités de captures des animaux sur le terrain. Nous ciblons cependant : 1 espèce de chauves-souris, 10 espèces d’oiseaux, 5 espèces de petits mammifères terrestres, 11 espèces de reptiles et 2 espèces d’amphibiens. Les animaux seront classés en deux grandes catégories d'age pour ce projet : juvénile et adulte. Tous seront échantillonnés, excepté pour les amphibiens ou seuls les adultes seront capturés. Pour les autres groupes taxonomiques, les jeunes non sevrés ne seront pas capturés (poussins et jeunes mammifères non volant/sevrés).
Suivi calcique lors d’une crise d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 104
Dès qu'une convulsion tonique apparaît, ou si l'état épileptique dure plus de vingt minutes, l'animal est anesthésié ou tué. 104 souris et 104 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue parce que les deux chirurgies et les crises peuvent affecter durablement leur qualité de vie. Chacun subit deux opérations du crâne à une semaine d'intervalle, l'une pour injecter un vecteur viral, l'autre pour poser un implant, puis reçoit une substance convulsivante et porte un miniscope sur la tête pendant deux heures et demie. Le porteur indique que ces modèles de crises induites chimiquement sont "recommandés" pour tester l'efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché.
Objectifs
A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. L'objectif du projet consiste à mieux caractériser les modèles d'épilepsie chez le rongeur et évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. L’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, fait partie des signaux précurseurs avant l’apparition de décharges électriques et de la crise d’épilepsie comportementale. Cette augmentation en calcium peut mener à des modifications transitoires ou permanentes sur la plasticité et la mort neuronale. La compréhension du rôle du calcium dans l’induction de l’épilepsie pourrait permettre de nouvelles avancées thérapeutiques pour traiter cette maladie. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieurs et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire, qui peut conduire à la mort dans certains cas. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Les épilepsies peuvent être non-convulsives, on parle alors de crises d'absence. Elles affectent principalement les enfants et correspondent à une perte de conscience (avec un regard dans le vide). Le projet consiste en la mise en place d’une technique de suivi calcique intracérébrale lors d’une crise d’épilepsie généralisée ou partielle, avec ou sans mesure de l’électroencéphalogramme chez le rongeur. Une fois la technique établie, ces modèles pourront être utilisés pour évaluer l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux caractériser certains modèles d’épilepsie induits par une substance chimique par la mesure du calcium intracellulaire au niveau cérébral. L’évaluation de ce nouveau paramètre sur le flux calcique, en plus des décharges électriques et du comportement convulsif chez l’animal, sera utile pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Les modèles de crises généralisées et partielles induites par une substance chimique sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements).
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les animaux sont opérés deux fois avec un intervalle d’une semaine pour injecter le vecteur viral (45 minutes, 1 fois) puis réaliser la pause d'implant (90 à 150 minutes, 1 fois). Pour les études d’efficacité, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Pour chaque procédure, une substance réactive est administrée par bolus rapide, une fois, sur quelques secondes ainsi qu’une substance anti-épileptique, administrée de la même manière, en fonction des symptômes observés. Le comportement de l'animal sera évalué immédiatement après l’injection de la substance réactive (pendant 30 minutes à 2 h30). Pendant le test, un miniscope sera placé sur la tête de l’animal pour permettre le suivi calcique intracérébral. En fonction de la procédure, l’électroencéphalogramme sera évalué en activant l’implant télémétrique. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (a minima 24 heures avant le test) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux seront opérés deux fois à un intervalle d'une semaine. La phase d'anesthésie peut induire un léger stress et la phase chirurgicale peut entraîner des douleurs post-opératoires au niveau du crâne de l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Pendant le test, un miniscope de quelques grammes sera placé sur la tête de l'animal pour une durée maximale de 2h30. Les crises partielles peuvent conduire à l'apparition d'un état épileptique permanent (supérieur à 25 minutes), caractérisé par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l’animal et une perte d’équilibre. Dans les tests modélisant des crises généralisées, des convulsions cloniques peuvent être observées. Ces crises correspondent à une perte d'équilibre de l'animal avec des mouvements incontrolés des membres antérieurs et postérieurs dont la durée n’excède pas quelques minutes.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les 2 interventions chirugicales ainsi que les crises épileptiques (convulsives ou non) peuvent affecter durablement leur qualité de vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer l'effet de traitements sur les variations de calcium intracellulaire lors de l'ajout d'une substance chimique sur des cultures primaires de neurones. Ces tests permettent de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (température corporelle par exemple).
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir mettre en place la technique de manière fiable et évaluer plusieurs paramètres en parallèle (intensité moyenne du suivi calcique, électroencéphalogramme et comportement). Le nombre d’animaux est également adapté pour évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données: variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour chaque phase chirurgicale, une analgésie est assurée par l’administration d'analgésiques injectés par voie systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Un gel ophtalmique est également appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle est surveillée pendant toute la durée de l'anesthésie jusqu'au réveil de l'animal. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant). Les animaux sont hébergés deux par deux, et systématiquement avec un enrichissement adapté (bois à ronger et frisure). Dès l’apparition de convulsions cloniques, une substance antiépileptique sera administrée. De la même manière, l’animal recevra une substance antiépileptique si un état épileptique persiste au-delà de 20 minutes. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique ou la persistance d'un état épileptique.
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives induites par une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur après sevrage jusqu'à l'âge adulte (souris et rat) car les crises chez l'humain sont également détectées chez des sujets jeunes et adultes. Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer l'efficacité de nouveaux candidats médicaments dans le cadre de l'épilepsie.
Évaluation de nouveaux traitements contre la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 600
Greffés de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus, 2 500 souris et 600 rats développent une maladie du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, perte de poils, diarrhées, mobilité réduite et défaillance d'organes pouvant les tuer. S'y ajoutent des gavages, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, des prises de sang répétées et des mesures de température par sonde rectale. Le porteur ouvre le paragraphe des effets en parlant de nuisances "modérées", avant d'y ranger, quelques lignes plus loin, la mortalité par défaillance d'organes qu'il qualifie de sévère. Tous les animaux sont tués à l'issue, l'évaluation des candidats médicaments réclamant l'analyse des tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles de la maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD : Graft versus Host Disease) peut survenir après une greffe de moelle osseuse réalisée dans le cadre du traitement d’une leucémie. Les lymphocytes T contenus dans le greffon vont attaquer les cellules du patient greffé, conduisant à des lésions des tissus sains. La maladie du greffon contre l’hôte est une complication grave, parfois mortelle. Elle survient lorsque les cellules du donneur présentent une incompatibilité immunologique avec celles du receveur, et perçoivent ces dernières comme étrangères. Dans ce cas, les lymphocytes T du donneur, dits « alloréactifs », vont alors détruire les cellules et tissus sains de l’hôte. Ce phénomène survient chez environ 20 à 50 % des patients greffés, rapidement après l’intervention ou plus tardivement. Il peut être très difficile à traiter. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La maladie du greffon est contrôlée à l’aide de médicaments immunosuppresseurs qui atténuent le conflit immunitaire entre les cellules du donneur et celles du receveur. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Cependant beaucoup de patients sont réfractaires aux corticoïdes et de nouveaux traitements sont nécessaires puisque la maladie du greffon contre l’hôte est une cause de mortalité et de morbidité majeure. Les traitements biologiques récents sont très couteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes (y compris des thérapie cellulaires et fécalothérapie). A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies de la GvHD. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées d'un animal vigile, pendant 30s jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Mesure de la température corporelle d'un animal vigile ou sous anesthésie générale via une sonde rectale pour rongeur pendant 30s. • Les prélèvements de sang via la veine caudale seront réalisés soit sur animal vigile, soit sur animaux anesthésié à l’isoflurane pendant 30 à 60s. Les prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque seront effectués sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 30 à 60s. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n’excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l’animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu’à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voir orale (gavage à l’aide d’une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée ou via la veine caudale) pendant une durée de 15 à 30s : Sur animaux vigiles. • Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 15 à 30s.
Impact sur les animaux
Cette procédure induira chez l’animal un certain nombre de nuisances modérées : injection de cellules, , administration de traitement par gavage ou injection (ip, iv, sc) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations. De plus, les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations de composés (voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous cutanée) et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances. Les effets indésirables attendus (suite à une xénogreffe) sont une perte de poids, une perte de poils, une piloérection, une réduction de la mobilité, des diarrhées, des douleurs qui selon la gravité justifierait une mise à mort immédiate (modéré). Une GvHD peut entrainer une mortalité selon le type de greffe, notamment lors de xenogreffe qui peut entrainer une défaillance des organes de l’hôte . ‘sévère
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Remplacement
Il existe des modèles de peau humaine isolée qui permettent de détecter avec une grande précision la possibilité pour un patient de développer une GvHD (compatibilité donneur/receveur). Cette méthode a aussi été utilisée avec des peaux de rats pour des études de transcriptomiques et recherche de biomarqueurs. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peuvent pas à ce jour constituer un environnement fiable pour des études de pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Chaque étude comprendra en moyenne 60 animaux (10 animaux par groupe : Ctrl-Naif, Vehicle et 4 groupes traités avec des composés). Chaque projet de développement nécessite en moyenne l’évaluation de 5 entités thérapeutique expérimentale. Nous estimons réaliser 2 projets par an dans le domaine de la GvHD. Le nombre d’animaux est donc 60 (animaux par étude) x 5 (composé par projet) x 2 (projet par an) x 5 ans. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire (3100 animaux estimés).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin de satisfaire la manifestation de leur comportement naturelle (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture,..). Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique à minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux d'hébergement et les systèmes d’hébergement suivront un programme d’hygiène et sanitaires (programme sanitaires) afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adaptés sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car Le stress lié à la manipulation peut être une nuisance pour l’animal, et aussi avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris qui sont communément utilisées en pharmacologie. De nombreuses données sur les modèles de GvHD chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent clairement que les rats (4-5 semaines) et les souris adultes (7-8 semaines) représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine de la GvHD car ils doivent disposer d'une système immunitaire mature