Rats
Elevage de mod?les murins pr?sentant des troubles de l?audition associ? ? une caract?risation g?n?tique par pr?l?vement (multi-sites 1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 11500
23 000 rongeurs, 11 500 souris et 11 500 rats, pour deux gestes de moins de trente secondes chacun : la pose d'une puce électronique et une biopsie de génotypage, l'une et l'autre sur rongeur éveillé, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'élevage produit des lignées qui deviennent sourdes, spontanément ou par altération génétique, et qui serviront ensuite à étudier la surdité et à tester des traitements. Le porteur indique n'attendre aucun signe clinique particulier au-delà de la perte d'audition, et prévoit d'héberger seuls certains mâles jusqu'à sept jours "afin d'améliorer l'indice de productivité de la lignée". Le devenir déclaré compte les 23 000 rongeurs comme mis à mort, alors que le résumé les répartit entre expédition vers un autre établissement, utilisation sur place et mise à mort pour la gestion de l'élevage ou faute de "génotype d'intérêt".
Objectifs
La surdit?, alt?ration quantitative ou qualitative de l?acuit? auditive peut toucher une seule oreille, surdit? unilat?rale, ou les deux oreilles, surdit? bilat?rale et ?tre plus ou moins s?v?re. En fonction de leur s?v?rit?, les pertes auditives peuvent avoir des cons?quences variables sur la vie des patients : impacts n?gatifs sur l?acquisition du langage oral, sur l?apprentissage scolaires et le d?veloppement cognitif, cons?quences sur la vie sociale, d?clins cognitifs chez les personnes ?g?es pouvant conduire ? des alt?rations de la m?moire ou ? la survenue de d?mences? L?Organisation Mondiale de la Sant? (OMS) estime que 466 millions de personnes pr?sentent des troubles auditifs dans le monde. En France, environ 6 millions de malentendants sont recens?s soit 8 ? 10 % de la population. La surdit? affecte 6% des 15-24 ans et plus de 65% des 65 ans et plus. Bien que des traitements et chirurgies existent (aides auditives conventionnelles pour r?tablir la conduction a?rienne, aides en conduction osseuse, implants ?), l?audition, dans bien des cas, n?est pas totalement restaur?e. L?objectif de ce projet est d??lever des rongeurs mod?les pertinents pour l??tude de la surdit?. Ces mod?les peuvent d?velopper spontan?ment ou via des alt?rations g?n?tiques une perte d?audition. Les animaux issus de ces d?veloppements seront utilis?s afin d??tudier l?apparition et le d?veloppement de la surdit? mais ?galement de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la proc?dure qu'il comporte seront mis en ?uvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
L?identification des mutations spontan?es et l?am?lioration des outils permettant les manipulations g?n?tiques ont permis de cr?er et/ou d?identifier des mod?les animaux de diverses maladies humaines provoqu?es par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un g?ne, mod?les dont l'int?r?t pour la compr?hension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'?ventuelles th?rapeutiques est ?vident. Ces mod?les murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc tr?s pertinents pour l??tude de l?apparition et du d?veloppement de la surdit? mais ?galement le d?veloppement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Une puce ?lectronique sera pos?e sur animal vigile afin de l?identifier. Une biopsie sera r?alis?e sur animal vigile afin de g?notyper l?ensemble des animaux obtenus. Chacune de ces interventions ne durera pas plus de 30 secondes. En r?gle g?n?rale, une seule puce et une seule biopsie suffisent pour identifier un animal et ?tablir son g?notype. Ces interventions pourront avoir lieu dans les deux ?tablissements utilisateurs.
Impact sur les animaux
Une douleur l?g?re ainsi qu?un l?ger stress peuvent ?tre induits lors du pr?l?vement de biopsies et de la pose associ?e d?une puce ?lectronique en vue de l?identification et du g?notypage de l?animal. En fonction des besoins et afin d?am?liorer l?indice de productivit? de la lign?e, il pourrait ?tre n?cessaire d?h?berger individuellement des m?les pour une p?riode ne d?passant pas 7 jours avant qu?ils soient pr?sent?s aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait g?n?rer un stress l?ger. Au-del? de la perte d?audition en elle-m?me, il n?est pas attendu de signe clinique sp?cifique chez les animaux atteints de surdit? que cette derni?re soit totale ou partielle.
Devenir
Les animaux sont soit exp?di?s dans un autre ?tablissement utilisateur soit utilis?s dans notre ?tablissement (utilisation continue), soit mis ? mort pour la gestion de l'?levage (atteinte des points limites du ph?notype dommageable, pr?l?vement de gam?tes). Les animaux ne pr?sentant pas de g?notype d?int?r?t pour la poursuite du projet seront mis ? mort (pas d?autre utilisation possible).
Remplacement
Les projets exp?rimentaux comportent classiquement une phase d'?tude initiale in vitro qui permettent une s?lection initiale des propri?t?s pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypoth?ses permettant l'obtention de donn?es pr?liminaires et compl?mentaires. Les mod?les murins propos?s ne peuvent pas ?tre remplac?s par des m?thodes alternatives car une deuxi?me ?tape d'?tude n?cessite de consolider les r?sultats in vitro et valider ses hypoth?ses sur un mod?le in vivo. Le projet actuel ne peut pas ?tre envisag? sans ?tape in vivo donc sans mod?le animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une ?tude clinique sur les patients souffrant de surdit?, il est n?cessaire de d?montrer que les mol?cules s?lectionn?es ont les effets pharmacologiques escompt?s et qu'elles ne pr?sentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont r?alis?s en fonction des besoins exp?rimentaux li?s ? l'utilisation de ces animaux apr?s exp?dition. Le nombre d?animaux est calcul? de mani?re ? utiliser le minimum d?animaux par groupe permettant l?obtention de r?sultats homog?nes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos donn?es historiques permettent d?utiliser le minimum d?animaux avec une optimisation de rendement pour des r?sultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n?a ?t? r?alis?e.
Raffinement
En dehors de la d?ficience auditive elle-m?me, aucun signe clinique sp?cifique n?est attendu chez les animaux atteints de surdit?, qu?elle soit compl?te ou partielle. Les animaux seront ?valu?s sur leur aspect physique et leur comportement selon une grille d?observation indiquant les points limites. Les animaux aptes au transport seront livr?s d?un ?tablissement ? l?autre via un transporteur agr?? et en respectant le bien-?tre des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d?une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront plac?s dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de liti?re, d?aliment, d?enrichissement et d?hydrogel. Les animaux seront transport?s via des camions ventil?s et thermor?gul?s.
Choix des espèces
Le choix de l?esp?ce est conditionn? par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des mod?les animaux simples ? ?lever, ? reproduire et ? entretenir en grand nombre ainsi qu?? manipuler et modifier g?n?tiquement comparativement ? d?autres esp?ces. Ils sont un mod?le de choix pour les ?tudes pr?cliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur dur?e de vie et de la disponibilit? en r?actifs exp?rimentaux. Les g?nomes des souris et des rats sont bien caract?ris?s et tr?s comparables au g?nome humain. Enfin, la proximit? clinique entre les mod?les de rongeurs g?n?tiquement modifi?s et les maladies humaines fait de ceux-ci des mod?les de choix relativement robustes pour extrapoler les r?sultats et en tirer des r?sultats pertinents pour la pathologie humaine. L??ge des animaux est conditionn? par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront h?berg?s dans nos locaux d?s leur naissance et jusqu?? leur envoi chez nos partenaires ou leur mise ? mort. Pour l??levage, les accouplements seront r?alis?s ? maturit? sexuelle. Au moment de l?exp?dition, l??ge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront ?tre envoy?s ? nos partenaires d?s le sevrage ou avec leur m?re si les animaux ne sont pas encore sevr?s. Des femelles gestantes pourraient ?galement ?tre exp?di?es avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d?ovules, des adultes matures sexuellement seront utilis?s.
Production du parasite responsable du paludisme murin pour des études biologiques, immunologiques et pour le développement de vaccins antipaludéens.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 275
Infectés par le paludisme puis contrôlés chaque jour par une goutte de sang, 8 585 rongeurs, 8 310 souris et 275 rats, subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et sont tous tués, le prélèvement final se faisant sous anesthésie profonde sans réveil. Ces infections servent à produire les parasites P. berghei et P. yoelii, que trois axes de recherche décrits dans un projet complémentaire utiliseront ensuite. Le porteur écrit que les infections "ne nuiront pas aux libertés individuelles des animaux" au motif que les procédures s'arrêteront avant l'apparition des symptômes cliniques. Les inoculations se font sur de jeunes adultes de quatre semaines parce qu'ils "ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite".
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale du paludisme dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant 2 parasites (P.berghei et P.yoelii) dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle des phases cutanée et hépatique de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre les formes cutanée et hépatique du parasite 3. Développement préclinique d'un vaccin ciblant les formes cutanée et hépatique du parasite Le projet « Production du parasite responsable du paludisme murin pour des études biologiques, immunologiques et pour le développement de vaccins anti-paludéens » concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire pour générer les parasites qui seront utilisés dans ces trois axes de recherche. Les procédures adressant les questions scientifiques spécifiques utilisant des animaux de laboratoire liées à ces trois axes seront décrites dans un projet complémentaire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée à partir d’une goutte de sang. Le prélèvement dure quelques secondes et est effectué quotidiennement, le plus souvent à partir du troisième jour pour 3 jours. Un prélèvement de sang final est réalisé après analgésie et anesthésie. Cette anesthésie est profonde et d’une durée suffisante pour réaliser le prélèvement sans réveil de l’animal. Après le prélèvement, les animaux sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile ne souffrira que de l’inconfort transitoire causé par la réalisation, selon les experiences, d’injections, la réalisation de gavage oral ou le prélèvement de volumes de sang. Les infections mises en œuvre ne nuiront pas aux libertés individuelles des animaux dans la mesure où les procédures prendront fin avant l’apparition des symptômes cliniques, soit par des prélèvements de sang terminaux sans réveil effectués sur des animaux profondément anesthésiés, soit par mise à mort.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans les procédures expérimentales seront mis à mort.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. En l’absence de méthodes alternatives adéquates, l’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Une deuxième difficulté réside dans la production du stade parasitaire inoculé dans la peau de l'hôte par le moustique vecteur. Il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium in vitro. Par conséquent, pour réaliser l’ensemble des études proposées, des infections hebdomadaires de rongeurs et de moustiques sont nécessaires pour l’obtention de ce stade parasitaire. Dans le but de réduire à l’avenir le recours aux animaux, un de nos axes de recherche aborde ce problème en proposant la mise au point d’un système de culture des sporozoïtes in vitro.
Réduction
Nous sommes conscients de la nécessité de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche scientifique. En l’absence de méthodes alternatives permettant de s’affranchir du recours aux rongeurs pour produire les stocks cryo-préservés de sang infecté et les staes parasitaires de Plasmodium berghei et yoelii, nous avons donc mis à profit notre expérience de plus de 15 années dans le domaine pour optimiser nos protocoles d’infection et réduire au minimum nécessaire le nombre d’animaux permettant une production stable et robuste de parasites. Ceci passe notamment par l’utilisation d’inoculums standardisés de parasites, d’une quantification précise de l’infection et d’une étape de contrôle qualité et de standardisation de chaque stock de sang avant utilisation en routine. Par ailleurs, un de nos axes de recherche a pour objectif la mise au point d’une méthode de culture in vitro des parasites, ce qui à l’avenir pourrait permettre de réduire encore le recours aux animaux.
Raffinement
Toutes nos procédures expérimentales ont été établies de manière à causer le moins de souffrance possible aux animaux et calibrées de manière à prendre fin avant l’apparition de symptômes du paludisme chez les animaux infectés. A partir d’une parasitémie seuil correspondant à un délai de deux à trois jours avant la possible survenue de manifestations cliniques liées à l’infection palustre, les animaux seront suivis quotidiennement et leur comportement sera évalué en utilisant une échelle de détresse pour détecter des problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. En particulier, si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc. Si les points limites - définis de sorte à précéder l’apparition des symptômes liés au paludisme - sont atteints, les souris seront immédiatement mises à mort. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses seront menées sur des animaux anesthésiés. Pour les procédures invasives, les rongeurs bénéficieront de plus d’une couverture analgésique supplémentaire pour prévenir tout inconfort durant la manipulation. Tous les animaux anesthésiés seront par ailleurs mis à mort avant leur réveil.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La plupart des concepts issus des modèles rongeurs, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-paludisme, se sont révélés exacts chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Les animaux sont acclimatés pendant 7 jours minimum. Les inoculations de parasites aux souris et rats seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite.
Imagerie photoacoustique et de fluorescence de l’activité neuronale dans le systeme nerveux central chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 65
Ouverture du crâne pendant trente minutes à deux heures quinze, pose d'une fenêtre crânienne, injections de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau au moyen d'un cadre stéréotaxique : 194 souris et 65 rats, 259 individus au total, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Certains enchaînent des séances d'imagerie répétées pendant quelques semaines à plusieurs mois, jusqu'à ce que la qualité des données ne permette plus de poursuivre. L'objectif est de mettre au point l'imagerie photoacoustique, une technique dont les applications médicales sont renvoyées au long terme. Le porteur indique que l'effectif n'a pas été calculé statistiquement, les informations requises manquant encore pour cette technologie, et l'avoir fixé d'après son expérience et celle d'autres équipes.
Objectifs
Les techniques actuelles de microscopie permettent d’observer l’activité des neurones dans le cerveau avec une très grande précision. Cependant, la lumière utilisée pour ces observations ne pénètre que sur une faible profondeur, de l’ordre d’un millimètre. L’étude de régions cérébrales plus profondes nécessite alors des interventions chirurgicales invasives pouvant altérer les tissus observés. L’imagerie photoacoustique est une technologie émergente qui pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à des profondeurs plus importantes tout en limitant ces contraintes. Cette technique utilise la lumière pour stimuler les tissus et les ultrasons pour recueillir l’information. Elle pourrait ainsi permettre d’accéder à des régions du cerveau aujourd’hui difficiles à étudier. L’objectif de ce projet est de développer et d’optimiser cette technologie afin de la rendre utilisable pour l’étude de l’activité neuronale. Les travaux porteront sur trois aspects complémentaires : l’amélioration des performances de l’instrument d’imagerie, le développement de fenêtres crâniennes adaptées permettant le passage de la lumière et des ultrasons, et l’identification des marqueurs biologiques les plus adaptés à cette nouvelle méthode. Une première phase d’optimisation sera réalisée sur des échantillons de tissu nerveux, avant une phase d’évaluation chez l’animal vivant. À terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles approches d’imagerie cérébrale permettant d’étudier le fonctionnement du cerveau de façon moins invasive et à plus grande profondeur que les techniques actuellement disponibles.
Bénéfices attendus
La compréhension du fonctionnement du cerveau repose sur la capacité à observer l’activité des neurones dans des conditions aussi proches que possible de leur état naturel. Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre de nombreuses maladies neurologiques, psychiatriques ou neurodégénératives et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles méthodes de diagnostic ou de traitement. Les techniques actuelles d’imagerie permettent déjà d’observer l’activité cérébrale avec une très grande précision, mais elles sont principalement limitées aux régions superficielles du cerveau. L’étude de structures plus profondes nécessite souvent des interventions invasives susceptibles de perturber les tissus observés. L’imagerie photoacoustique constitue une approche prometteuse pour dépasser cette limitation. Elle pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à plusieurs millimètres de profondeur, voire davantage, tout en limitant les perturbations induites par la mesure elle-même. À terme, cette technologie pourrait permettre l’étude de structures cérébrales profondes impliquées dans la mémoire, le mouvement, les émotions ou certaines pathologies neurologiques. Le projet vise ainsi à développer et optimiser une nouvelle méthode d’imagerie fonctionnelle du cerveau, capable de fournir des informations plus détaillées et moins invasives que celles actuellement accessibles pour les régions profondes du système nerveux central. Les connaissances acquises bénéficieront principalement à la recherche fondamentale en neurosciences, mais elles pourraient également contribuer, à plus long terme, à l’amélioration de la compréhension et de la prise en charge de nombreuses maladies du cerveau.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions réalisées sous anesthésie générale : * Injection de faibles volumes de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau à l’aide d’un dispositif stéréotaxique. Cette intervention dure généralement entre 1 heure 15 minutes et 1 heure 45 minutes et est suivie d’une période de récupération post-opératoire. * Réalisation d’une ouverture limitée de l’os du crâne (craniotomie) afin de permettre l’accès aux structures cérébrales d’intérêt et, selon les procédures, la mise en place d’une fenêtre crânienne destinée à l’imagerie. Selon la procédure, la durée de l’intervention est comprise entre 30 minutes et 2 heures 15 minutes. Les animaux récupèrent ensuite de l’anesthésie et bénéficient d’un suivi post-opératoire adapté. * Séances d’imagerie réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie générale selon la procédure considérée. Ces séances permettent d’enregistrer l’activité cérébrale sans provoquer de douleur supplémentaire. * Dans les procédures où la dernière intervention est terminale, les animaux sont placés sous anesthésie profonde et ne sont pas réveillés. Selon les objectifs scientifiques, cette intervention se termine soit par une perfusion intracardiaque, soit par l'administration d'un agent euthanasiant. Ces procédures terminales durent généralement une quinzaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont liées aux interventions chirurgicales nécessaires à la réalisation du projet, notamment les injections ciblées dans le cerveau et la mise en place de fenêtres crâniennes permettant l’imagerie. Comme pour toute intervention chirurgicale, ces procédures peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire après l’opération ainsi qu’une perte de poids temporaire pendant la phase de récupération. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale et bénéficient d’une prise en charge antalgique avant, pendant et après la chirurgie afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux font également l’objet d’un suivi post-opératoire rapproché permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Dans un faible nombre de cas, des irritations locales, une inflammation ou une infection peuvent apparaître au niveau de la zone opérée ou autour de la fenêtre crânienne. Si nécessaire, des traitements adaptés (anti-inflammatoires, analgésiques ou traitements locaux) sont mis en œuvre et des points limites prédéfinis permettent d'interrompre la procédure et de procéder à une euthanasie anticipée si le bien-être de l’animal est compromis. Les séances d’imagerie elles-mêmes sont non invasives. Elles sont réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie selon les procédures et ne devraient pas entraîner de douleur supplémentaire pour les animaux.
Devenir
À l'issue de toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sont mis à mort. Les procédures 1 et 2 se terminent par une perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale profonde. Cette intervention terminale est nécessaire à la préparation, à la conservation et à l'analyse des tissus nerveux dans le cadre du projet. Dans les procédures 3, 4 et 5, les animaux participent à des séances répétées d'imagerie cérébrale pendant une période pouvant aller de quelques semaines à plusieurs mois, en fonction de la qualité et de l'intérêt scientifique des données recueillies. Lorsque les objectifs scientifiques du projet sont atteints ou que la qualité des données ne permet plus de poursuivre les acquisitions dans des conditions satisfaisantes, les animaux sont euthanasiés. En outre, tout animal atteignant l'un des points limites prédéfinis garantissant son bien-être est immédiatement retiré de l'étude et mis à mort. La dernière phase de la procédure 6 est réalisée sous anesthésie terminale. Les animaux ne sont pas réveillés après la séance d'imagerie et sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde à l'issue de celle-ci. Aucun animal ne peut être replacé ou réutilisé à l'issue des procédures, en raison des interventions chirurgicales réalisées, de la présence d'implants crâniens, des injections intracérébrales effectuées et, selon les procédures, de la nécessité de prélever ou de préserver les tissus dans des conditions compatibles avec les objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Les cultures cellulaires et les autres méthodes réalisées en dehors de l’organisme vivant constituent des outils précieux pour réduire le recours aux animaux et sont utilisées dans ce projet chaque fois qu’elles permettent de répondre à une question scientifique. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du cerveau ou de la moelle épinière, qui reposent sur les interactions entre de très nombreuses cellules organisées en réseaux et en communication permanente avec le reste de l’organisme. Les préparations de tissu nerveux (tranches) préservent une partie de ces connexions et seront utilisées lors de la phase initiale d’optimisation du projet. Elles permettent d’obtenir des informations importantes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, elles ne reproduisent qu’imparfaitement le fonctionnement du système nerveux dans un organisme vivant. L’objectif principal du projet étant de développer une méthode permettant d’observer l’activité cérébrale dans des conditions physiologiques, certaines questions scientifiques nécessitent l’étude du cerveau chez l’animal vivant. À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir l’ensemble des informations recherchées.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux sont hébergés dans des conditions contrôlées, conformes aux bonnes pratiques, afin de limiter le stress et les problèmes sanitaires susceptibles d'influencer les résultats. Cette standardisation permet d'obtenir des données plus fiables et de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Habituellement, le nombre d'animaux utilisé dans une étude est déterminé à l'aide de méthodes statistiques. Toutefois, le présent projet vise à développer et optimiser une nouvelle technologie d'imagerie, pour laquelle les informations nécessaires à ce type de calcul ne sont pas encore disponibles. Les effectifs ont donc été définis à partir de notre expérience et de celle d'autres équipes utilisant des approches similaires. Plusieurs mesures sont mises en œuvre pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs expériences sont réalisées sur un même animal. Pour les procédures où cela est pertinent, une première phase d'optimisation technique, conduite sur un nombre limité d'animaux, permet d'identifier les meilleures conditions expérimentales avant le lancement des expériences principales. Cette stratégie réduit les échecs d'origine technique et contribue ainsi à limiter l'utilisation d'animaux. Enfin, les expériences sont réalisées chez des animaux des deux sexes afin d'éviter la production d'animaux non utilisés et de garantir que les résultats obtenus soient représentatifs des femelles comme des mâles.
Raffinement
Le projet a été conçu de manière à réduire autant que possible la douleur, la souffrance, l’angoisse et les contraintes imposées aux animaux. Les animaux sont hébergés en groupes afin de préserver leurs interactions sociales (2 à 5 souris ou 2 à 3 rats par cage). Leur environnement est enrichi à l’aide de matériaux de nidification, d’abris et d’objets à explorer ou à ronger. Ces enrichissements sont régulièrement renouvelés afin de favoriser l’expression de comportements naturels et d’améliorer leur bien-être. Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale. L’anesthésie par inhalation est privilégiée car elle permet un endormissement et un réveil rapides ainsi qu’un meilleur contrôle de la profondeur anesthésique. Des traitements antalgiques sont administrés avant et après les interventions afin de prévenir et limiter la douleur. Une analgésie locale est également réalisée au niveau de la zone opérée. Pendant les interventions, la température corporelle des animaux est maintenue à l’aide d’une couverture chauffante et un gel ophtalmique est appliqué afin de protéger les yeux. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opératoire est désinfectée afin de limiter les risques d’infection. Après les interventions, les animaux bénéficient d’un suivi renforcé permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de complication. Leur état général, leur poids et leur comportement sont évalués à l’aide d’une grille de suivi standardisée. Si des signes de douleur ou d’altération du bien-être sont observés, des traitements adaptés sont administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas malgré ces mesures, des points limites prédéfinis conduisent à une euthanasie anticipée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Notre expérience montre que les interventions prévues dans ce projet sont généralement bien tolérées lorsque ces mesures de prise en charge et de suivi sont appliquées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche en neurosciences. Leur système nerveux présente de nombreuses similitudes d’organisation et de fonctionnement avec celui des autres mammifères, ce qui en fait des modèles particulièrement adaptés pour développer et évaluer de nouvelles méthodes d’imagerie du cerveau. Le projet utilise à la fois des souris et des rats, car ces deux espèces présentent des avantages complémentaires. Les souris permettent notamment de tirer parti des nombreuses ressources génétiques disponibles, en particulier des lignées transgéniques exprimant des marqueurs biologiques d’intérêt pour l’étude de l’activité neuronale. Des souris sauvages et transgéniques adaptées aux objectifs du projet seront utilisées. Les rats seront principalement utilisés lors des expériences d’imagerie chez l’animal vivant. Leur taille plus importante est mieux adaptée aux caractéristiques techniques du système d’imagerie photoacoustique utilisé dans ce projet et facilite l’étude de structures cérébrales plus profondes. Certaines souches de rats, notamment les rats Long-Evans, pourront être privilégiées lorsque leurs caractéristiques sont particulièrement adaptées aux procédures prévues. Le projet nécessite l’utilisation d’animaux à différents stades de développement. Les expériences réalisées sur des échantillons de tissu nerveux utilisent préférentiellement de jeunes animaux, car leurs tissus sont mieux adaptés à la préparation de tranches destinées aux études préliminaires. Les expériences d’imagerie chez l’animal vivant sont réalisées chez des animaux plus âgés, dont le système nerveux est suffisamment développé pour répondre aux objectifs du projet.
Evaluation pré-clinique de nouveaux médicaments dans des modèles d’hypertension artérielle et/ou d’hypertrophie cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 2800
Les molécules testées sont celles de clients, administrées aux doses que ces clients ont fixées : 2 100 souris et 2 800 rats, 4 900 au total, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever tissus et sang. Une hypertension et une hypertrophie cardiaque leur sont provoquées par un régime gras et salé ou par perfusion de substances, puis les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant quatre mois au plus. Des pompes et des capteurs de pression sont implantés au cours de chirurgies de dix à vingt minutes, souris et rats passent 40 heures en cage individuelle sans enrichissement puis 24 heures en cage à métabolisme sur grille, et courent sur tapis roulant sous stimulation électrique. Les mesures terminales se font par pose d'un cathéter dans la carotide, sous anesthésie et sans réveil, au service d'une prestation préclinique vendue à des commanditaires extérieurs.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité mondiale, il est primordial de poursuivre la recherche dans ce domaine afin d’identifier et d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. Les atteintes cardiovasculaires peuvent se présenter sous de nombreuses formes (anomalies de la fonction cardiaque, de la structure du cœur) et sont dépendantes de nombreux facteur de risque : l’âge, le sexe, les maladies métaboliques (diabète et obésité), l’hypertension, le tabagisme, … Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie, il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie, en incluant une ou plusieurs comorbidités. Le développement de modèles prédictifs et robustes ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels.
Bénéfices attendus
Pour l’essentiel, la prise en charge des patients consiste à traiter les symptômes et les complications associées ainsi que la mise en œuvre de mesures concernant l’hygiène de vie des patients (alimentation, arrêt du tabac, activité physique). Malheureusement, cela peut s’avérer inefficace. Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, afin de comprendre les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouvelles cibles ou futurs médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.
Procédures
L’hypertension et de l’hypertrophie cardiaque seront induites chez des rats hypertendus avec ou sans régime spécifique (gras, riche en sel) ou par infusion de molécules pharmacologiques. Les composés à tester seront administrés, sur une durée maximum de 4 mois, une à deux fois par jour. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 minutes sous couverture analgésique). Si le projet requiert des mesures de pressions sur animaux vigiles et/ou sur des périodes de plusieurs heures, des capteurs de pressions seront chirurgicalement implantés (chirurgie de 15-20 minutes sous couverture analgésiques) et un suivi post-opératoire sera mis en place. Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés à maximum 4 reprises (2 minutes). Les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose pourront être effectués (7 mesures du taux de sucre dans le sang après administration de sucre et ce à 4 reprises pendant le projet). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (20 minutes maximum). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement (contact visuel mais pas olfactif et auditif). Pour la fonction rénale, la mise en place d’un patch, nécessitera une courte anesthésie (moins de 10 minutes) puis le test sera effectué sur animaux vigiles. La mesure des paramètres urinaires se fera en cage métabolique (24 heures, isolé sur grille). Au maximum, ces examens seront effectués avant la phase d’induction, à la fin de l’induction, au milieu et à la fin des traitements soit 4 fois. Il aura 2 examens sous anesthésie par semaine maximum. Au-delà, ils devront être distribués sur plusieurs semaines. Pour faire les échographies et fixer les patchs, nous devrons au préalable dépiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. En fin de procédure, les animaux seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.
Impact sur les animaux
Selon le modèle, une dysfonction cardiovasculaire sera induite plus ou moins rapidement et va engendrer chez les animaux des nuisances. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), modification des prises hydriques et alimentaires (perte de poids et déshydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Dans certains cas, les animaux seront nourris, au plus tôt à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet avec un régime enrichi en graisse et ou en sel. Cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : hypertension artérielle, obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer un inconfort. Les administrations (jusqu’à 4 mois, 1 à 2 fois par jours) et les prélèvements de sangs peuvent engendrer un stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires en cages métaboliques, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h générant un stress et un inconfort. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère (stimulation électrique). Les mesures de dépense énergétique et télémétrique imposent un isolement qui engendre un stress. L’induction par infusion d’agents pharmacologiques (pour l’induction de la pathologie ou du traitement) nécessite l’implantation sous-cutanée d’une mini-pompe ; les mesures de pressions sur animaux vigiles requièrent la mise en place d’un capteur et d’un émetteur. Dans les 2 cas, la mise en place de ces 2 dispositifs se fera au cours d’une intervention chirurgicale et entrainera une convalescence des animaux les jours suivant les interventions.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés grâce à des marquages histologiques, des analyses d’expression de gènes ou protéines dans le coeur, de paramètres cardiovasculaires et de la fonction rénale dans le sang...).
Remplacement
Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions cardiaques associées aux complications métaboliques, vasculaires et rénales ne peuvent être pleinement reproduites que dans un système in vivo pour le moment. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause de sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.
Réduction
Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte la mortalité (environ 10%) et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (10% des animaux exclus après répartition à la fin de l’induction). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par régime ou par agents pharmacologiques, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal sur les paramètres cardiovasculaires, métaboliques et rénaux pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.
Raffinement
Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), nous nous scorerons son état selon la grille de score spécifique (en pièce jointe). Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une blessures cutanées un protocole de soin sera effectué (désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Lors de la procédure, des mesures non invasives de la fonction cardiaque, vasculaire, rénale et métabolique peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques d'imagerie. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles, une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré, per et post-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires. Il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe, doppler, …). Le choix de l'espèce se fera en fonction des physiopathologies développées dans chacune des 2 espèces, des caractéristiques connues (publications, projets ultérieurs), des cibles thérapeutiques et des validations pharmacocinétiques, de la nature du traitement testé. L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 4 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie.
DNT : Évaluation des effets neurodéveloppementaux de substances chimiques impliquées dans la perturbation de l’axe thyroïdien par des mécanismes hépatiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Tués au jour 21 de la lactation pour prélever leurs organes, 544 rats vont être utilisés, des femelles accouplées et leur descendance, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Les femelles sont gavées chaque jour à la sonde du sixième jour de gestation jusqu'à trois semaines après la mise bas, soit 38 jours au plus, pour mesurer ce que trois substances connues pour induire des enzymes hépatiques font à leurs hormones thyroïdiennes et au développement nerveux de leur descendance. Les petits sont posés sur le dos dès le quatrième jour pour évaluer s'ils se retournent en moins de deux secondes, puis isolés quelques minutes et soumis à un clic mécanique à partir du dixième jour, chaque jour jusqu'à obtention d'une réponse. Le rat est retenu, indique le porteur, pour sa gestation courte, la disponibilité d'une souche caractérisée et les recommandations des instances réglementaires.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la continuité d'un projet précédent, qui a permis de mieux caractériser les paramètres clés de la toxicité neurodéveloppementale associée à une perturbation des taux d’hormones thyroïdiennes. Ces travaux ont conduit à la publication de trois articles scientifiques. Ce nouveau projet s’attachera à caractériser plus précisément le mécanisme d’action reliant une diminution des concentrations en hormones thyroïdiennes, consécutive à une augmentation de leur métabolisation hépatique, à d’éventuels effets sur le neurodéveloppement. Ce projet visera ainsi à approfondir la compréhension des liens mécanistiques entre induction enzymatique hépatique, déséquilibre de l’homéostasie thyroïdienne et altérations neurodéveloppementales. À cette fin, il s’appuiera à la fois sur des substances décrites dans la littérature scientifique et sur des molécules internes, toutes identifiées comme inducteurs d’enzymes hépatiques impliquées dans la métabolisation des hormones thyroïdiennes.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques reliant l’induction du métabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes à des effets sur le neurodéveloppement. Il contribue à mieux caractériser les conséquences d’une perturbation thyroïdienne secondaire à une action hépatique, en documentant à la fois les modifications hormonales et les marqueurs morphologiques et moléculaires observés chez la ratte et sa descendance. Les résultats attendus permettront également de comparer plusieurs substances partageant des mécanismes d’action proches, afin d’affiner leur caractérisation toxicologique et de mieux identifier les paramètres pertinents pour l’évaluation de leur potentiel de perturbation endocrinienne. À plus long terme, ce projet apportera des connaissances utiles à l’évaluation du risque pour la santé et à l’amélioration des stratégies de développement et de sélection de composés.
Procédures
Les femelles gestantes et allaitantes vigiles seront administrées journalièrement à l’aide d’une sonde souple adaptée à leur taille et âge, pendant maximum 38 jours (du jour 6 de gestation au jour 20 ou 21 après la mise bas). Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes et n’engendre pas de douleur. Durant la période de gestation, un prélèvement sanguin, pourra être réalisé sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Chaque femelle gestante pourra faire l’objet d’un micro-prélèvement à la veine saphène sur animaux vigiles pour un maximum de 200µL ou un prélèvement sanguin plus important, dans la limite des volumes recommandés, pourra être réalisé sous anesthésie à la veine sublinguale ou submentale. Ce prélèvement de sang sera réalisé sur une période d’une durée inférieure à 2 minutes. Au moment du sacrifice terminal (jour 21 de la lactation) un prélèvement à l’aorte abdominale sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sans réveil. Pendant la lactation des tests de développement seront réalisés sur les rats juvéniles. Pour mesurer le réflexe auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. Pour tester la mobilité, le petit sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner en moins de 2 secondes à partir de l’âge de 4 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. Des organes seront prélevés après la mise à mort des femelles et leur descendance au jour 21 de la lactation.
Impact sur les animaux
Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des rattes et de leur descendance ainsi que pendant la période d’hébergement isolé des femelles gestantes. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Un échantillon de sang peut être prélevé sur animaux vigiles par ponction à la veine saphène ou un prélèvement peut être fait après anesthésie par ponction à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Le prélèvement de sang peut induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. De plus, au moment du sacrifice terminal (PND21) un prélèvement à l’aorte abdominale sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sans réveil. Afin d’évaluer si le développement des rats juvéniles est normal, pour le système auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner en moins de 2 secondes. La nuisance engendrée est un stress léger car les tests sont peu invasifs et non douloureux. Les effets toxiques attendus devraient être modérés, car les trois substances étudiées sont des produits connus : les données disponibles dans la littérature et dans les études précédentes, notamment l’étude de toxicocinétique menée en amont de ce projet permet d’évaluer la tolérance aux doses prévues chez des femelles gestantes et allaitantes ainsi que chez leur descendance, indiquent que peu de signes cliniques sont attendus aux doses retenues. Les signes de toxicité pouvant apparaître en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de la salivation, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblements. D’autre part, des signes cliniques liés à la difficulté à mettre bas naturellement incluant un effort expulsif prolongé, agitation, écoulement vaginal inhabituel, respiration laborieuse, ou des signes cliniques liés à une difficulté à téter des petits à la naissance incluant déshydratation, pâleur, retard de croissance peuvent être observés.
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la gestation, la lactation et le développement de la descendance, tous les rats seront mis à mort au terme de la procédure pour prélèvements d’organes.
Remplacement
Avant la réalisation de l’étude in vivo, des essais in vitro, notamment sur cultures d’hépatocytes et de thyréocytes en 3D, sont utilisés pour évaluer le potentiel toxique hépatique et thyroïdien des substances. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, en particulier les interactions entre organes et les conditions physiologiques propres à la gestation et à la lactation. Elles ne permettent donc pas, à elles seules, de prédire de manière complète les effets chez la femelle gestante et sa descendance. L’étude chez l’animal reste ainsi nécessaire pour mesurer de façon intégrée les effets sur la mère, les modifications hormonales, l’exposition de la descendance et les conséquences potentielles sur le neurodéveloppement. Les résultats obtenus seront comparés aux données in vitro et utilisés pour alimenter des modèles mathématiques, afin d’améliorer à terme la prédiction des effets sur les hormones thyroïdiennes et le neurodéveloppement, tout en renforçant progressivement le remplacement des études animales.
Réduction
Ce projet est conçu dans le respect du principe de Réduction, en veillant à utiliser le nombre minimal d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiquement robustes. Le nombre d’animaux retenu, fondé sur l’expérience du laboratoire, est limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs de l’étude, notamment pour garantir une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des paramètres hormonaux. Ainsi, un effectif restreint de 8 femelles accouplées par groupe sera utilisé. Par ailleurs, plusieurs substances seront étudiées au sein d’une même étude, permettant le recours à un groupe témoin unique et contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux. En outre, seules des molécules préalablement sélectionnées au moyen de méthodes alternatives et considérées comme non dangereuses à ce stade seront évaluées in vivo, afin de restreindre le recours à l’animal au cours du processus de recherche et développement. Enfin, ce projet contribuera également au développement et à la validation d’approches alternatives susceptibles, à terme, de réduire plus largement le nombre d’animaux utilisés en toxicologie.
Raffinement
Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux rattes gestantes et allaitantes (matériel de nidification), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré procédural au strict minimum. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière le 1er jour de traitement (au moins 2 observations dans la journée) ainsi qu’au moment de la mise bas théorique à partir de GD 21. Ils sont pesés à intervalles réguliers pour vérifier leur croissance et leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptés aux femelles gestantes et allaitantes ainsi qu’aux rats juvéniles seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort (sauf pour les rats juvéniles à PND 4), les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle d’autopsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Ce projet est réalisé avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo- thyroïdien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal.
Choix des espèces
Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de sa courte durée de gestation, de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisies. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des jeunes femelles rats accouplées, âgées de 8 à 12 semaines au début de l’étude, seront utilisées dans ce projet, conformément aux pratiques en toxicologie du développement et aux recommandations internationales. Leur descendance sera suivie jusqu’à l’âge de 21 jours après la naissance, ce stade de développement étant particulièrement adapté à l’évaluation des effets des substances administrées à la femelle gestante et allaitante sur le développement embryonnaire, fœtal et postnatal précoce, après exposition in utero puis au cours de la lactation via le lait maternel. En effet, la période allant de la naissance jusqu’à la fin de la lactation, est reconnue comme une fenêtre de sensibilité particulière aux expositions susceptibles d’affecter le neurodéveloppement.
Évaluation de l’intérêt thérapeutique d’une prise orale du chélateur LiHOPO) dans la prise en charge d’une exposition initiale pulmonaire au plutonium.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Pour tester si un chélateur pris par voie orale élimine mieux le plutonium que le traitement actuel par injection, 182 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour mesurer le plutonium retenu dans leurs tissus. 112 d'entre eux reçoivent le plutonium par instillation dans la trachée sous anesthésie, 70 par injection, et 16 subissent dix-huit gavages, trois fois par semaine pendant six semaines. 142 rats séjournent seuls en cage à métabolisme, sur grille et sans litière, de un à trois jours par séjour et jusqu'à trois séjours pour certains, pour la collecte de leurs urines et de leurs selles. Le porteur attend une irritation de la trachée et une altération des cordes vocales après l'instillation, et écrit que le bénéfice pour les travailleurs du nucléaire contaminés "pourrait être à moyen terme".
Objectifs
En France, le plutonium (Pu) formé au sein d’un réacteur nucléaire est extrait du combustible d’uranium (U) usagé, pour le recycler dans un nouveau combustible mêlant U et Pu. Lors du procédé, des travailleurs peuvent accidentellement inhaler ce Pu en cas de rupture de confinement. La rétention corporelle d’un tel métal radiotoxique conduit alors à un risque sanitaire, comme le développement d’un cancer pulmonaire à long terme. Afin de limiter celui-ci, la seule stratégie est de stimuler la décorporation du Pu, c’est-à-dire de limiter ses dépôts tissulaires et favoriser son élimination corporelle. Pour cela, le complexant DTPA est administré chez le patient contaminé, afin qu’il se lie au Pu et l’élimine facilement et rapidement par les voies naturelles. Néanmoins, un tel traitement est perfectible : le DTPA a une action limitée, et son mode d’administration par intraveineuse est souvent incompatible avec un traitement répété au long cours qui s’avère parfois nécessaire. L’objectif général des études est d’améliorer ce traitement de décorporation des travailleurs du nucléaire ayant accidentellement été exposés à des composés de Pu. Aux Etats-Unis, une forme orale du complexant LiHOPO est en cours d’essais cliniques. Précisons qu’une autorisation de mise sur le marché américain d’un tel médicament prouvera son potentiel intérêt, mais ne permettra pas d’obtenir son autorisation ou sa disponibilité sur le marché français. Par ailleurs, alors que l’exposition pulmonaire au Pu est l’une des deux voies principales rencontrées chez le travailleur du nucléaire, les études pré-cliniques américaines n’ont pas testé l’efficacité du LiHOPO dans ce contexte. L’objectif du présent projet est d’évaluer l’intérêt d’une prise orale de LiHOPO dans le traitement de décorporation d’une exposition pulmonaire au Pu, en comparaison du traitement actuel par le DTPA. Différents protocoles de traitements devront être testés pour simuler des situations de prise en charge médicale ou des protocoles décorporants déjà appliqués chez l’être humain, et pour aider à interpréter les observations faites chez les travailleurs traités suite à ces protocoles. Les expérimentations seront menées chez le rat, un modèle animal pertinent qui a alimenté une grande part des précédentes études de décorporation du Pu menées depuis des dizaines d’années. De plus, il est désormais connu que les observations faites chez le rat le sont également chez l’être humain traité au DTPA après exposition au Pu.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de savoir si la prise orale de LiHOPO peut être envisagée pour améliorer le traitement de décorporation de travailleurs du nucléaire exposés au Puou pour la population générale en cas d’exposition suite à un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Dans le premier cas, le bénéfice pourrait être à moyen terme. Ils permettront également de mieux définir les compartiments biologiques, i.e. extra- ou intracellulaires, où a lieu la chélation du Pu par le LiHOPO.
Procédures
-70 rats seront exposés au plutonium en systémique par injection, sous anesthésie gazeuse (1X,
Impact sur les animaux
Après l’exposition pulmonaire des rats au plutonium en passant par la trachée, une irritation de la trachée, une altération des cordes vocales, une perturbation passagère de la ventilation pulmonaire le temps que le liquide soit absorbé par le tissu pulmonaire peuvent être observées. Il est possible que les sites d’injection soient transitoirement et légèrement douloureux après le réveil des animaux. Néanmoins, cela n’a pas d’impact visible sur leur comportement, prise alimentaire, etc. Les rats hébergés en cage à métabolisme comme en cage conventionnelle évoluent sur une grille et non sur une litière traditionnelle pour rongeurs, pouvant entrainer un inconfort de la marche voire des lésions aux pattes, ce qui n’a jamais été observé jusqu’alors. Un stress des animaux est attendu lors de : -leur manipulation lorsqu’ils sont conscients et vigiles, -leur anesthésie (manipulation + hypothermie) préalable aux actes réalisés lors de leur phase d’inconscience, -leur changement de condition d’hébergement
Devenir
Afin d’évaluer l’efficacité des traitements sur la rétention en plutonium dans les différents tissus, un prélèvement de ces tissus est prévu ; nécessitant l’euthanasie des rats.
Remplacement
Les expérimentations in vitro sont très utiles pour sélectionner et comparer des complexants qui ont un potentiel d’efficacité pour complexer le plutonium. Des études préliminaires au présent projet seront effectuées sur du sérum commercial pour choisir les doses en LiHOPO à tester, comparativement à la dose en DTPA recommandée chez l’être humain, avant les essais chez l’animal. Néanmoins, une expérimentation in vivo est la seule qui puisse apporter une réponse quant au potentiel décorporant des complexants. En effet, les modèles in vitro ne miment pas la complexité des milieux biologiques, etl’élimination corporelle. Par ailleurs, la biodisponibilité orale du complexant, c’est-à-dire son passage dans le sang, aura une grande importance, ce qui implique le besoin d’une système digestif entier. Le projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal .
Réduction
Les précédentes études du laboratoire montrent que des groupes de 8 rats sont nécessaires pour prouver l’efficacité d’un traitement sur la charge pulmonaire en un métal, après exposition pulmonaire à ce métal. avec des résultats statistiquement valables. Concernant les rats exposés au plutonium puis traités par la même voie d’administration intraveineuse, l’effet du traitement se mesurera essentiellement sur la prévention de la charge osseuse en plutonium. Une analyse statistique détermine que des groupes de 5 animaux permettront de révéler une diminution de la charge osseuse en plutonium.
Raffinement
L’instillation intratrachéale (pour administration pulmonaire) et le gavage gastrique (pour administration orale) seront effectués chez des rats pendant leur phase d’inconscience suite à leur exposition à un gaz anesthésiant pour : i) prévenir leur inconfort/sensibilité à la douleur, ii) assurer la reproductibilité de la localisation et de la dose délivrée en cobalt ou expectorant, iii) pour la radioprotection des opérateurs. Ces gestes sont maitrisés au laboratoire et ont apporté leurs preuves pour le confort des rats, comme pour la qualité des résultats. Avant de privilégier le gavage gastrique pour la prise orale des expectorants, des tests d’habituation pour une prise orale volontaire en usant d’un composé appétant ont été effectués. Lors d’un essai dans notre laboratoire, il a été constaté que cette technique était efficace tant que le complexant n’était pas mélangé au composé appétant considéré (sirop de banane). Le gavage gastrique a donc été retenu et sera employé. Il n’est pas traumatique pour l’appareil digestif. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages à métabolisme pendant 3 jours consécutifs maximum, ceux-ci pouvant se voir (cage de plastique transparent), s’entendre et se sentir. Une observation quotidienne et une pesée régulière (2X par semaine) des rats seront effectuées pour soulager au plus tôt une éventuelle souffrance avec traitements analgésiques/anti-inflammatoires. Pour estimer objectivement le niveau de souffrance, différents critères seront considérés et évalués selon une grille de scores qui est « ouverte » dès l’apparition d’un premier signe d’inconfort chez un rat.
Choix des espèces
Le rat est retenu pour nos études du fait de la richesse de la littérature dans le domaine de l’exposition à des métaux radioactifs chez cette espèce de rongeur. Sa taille, permet des prélèvements biologiques suffisants pour obtenir des niveaux de métaux mesurables. Les rats en expérimentation seront des animaux adultes, livrés à l’âge de 6 à 8 semaines, et utilisés aux âges de 7 à 9 semaines. Ces choix sont liés à la taille de l’animal, qui reste un compromis entre des poumons suffisamment gros pour tolérer au mieux l’instillation intratrachéale, et une taille des animaux qui n’induit pas un inconfort lors de leur hébergement en cage à métabolisme.
Etude de la fonction érectile chez les rongeurs après administration de candidats médicaments.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Rats : 1600
Gavage à la canule, injection dans l'abdomen, dans une veine de la queue, sous la peau ou directement dans le pénis : chaque administration se fait en une fois, la voie intra-caverneuse sous anesthésie, les autres sans. 3 200 individus, 1 600 souris et 1 600 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever des tissus. L'objectif est de tester des candidats médicaments contre la dysfonction érectile, le résumé signalant parmi les effets possibles une érection anormalement longue ou persistante et des troubles urinaires. Le porteur annonce le recueil d'observations comportementales sur les mêmes individus, sans dire lesquelles.
Objectifs
La dysfonction érectile correspond à une difficulté persistante à obtenir ou maintenir une érection suffisante pour avoir un rapport sexuel. En France, elle concerne plusieurs millions d’hommes, en particulier après 40 ans. Les traitements actuels les plus utilisés aident le corps à mieux faire circuler le sang vers le pénis. Ils agissent en facilitant la détente des vaisseaux sanguins, ce qui permet une meilleure arrivée du sang et donc une érection plus facile. Cependant, ces médicaments ne fonctionnent que s’il y a une stimulation sexuelle. Ils peuvent être pris de deux façons : soit ponctuellement avant un rapport, soit de manière régulière chaque jour. Le principe du traitement reste le même, seule la façon de le prendre change. Comme tout traitement, ils peuvent provoquer des effets indésirables, le plus souvent bénins, comme des maux de tête, des troubles digestifs, des douleurs musculaires ou une sensation de chaleur. Malgré leur efficacité, environ un tiers des patients n’obtiennent pas de résultats satisfaisants. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux médicaments, qui seraient plus efficaces ou mieux tolérées. Dans ce cadre, ce projet vise à mettre en place des procédures simples chez des animaux (rats et souris adultes) pour tester de nouveaux traitements potentiels et mieux comprendre leur effet sur la fonction érectile.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer et utiliser des modèles chez l’animal (rats et souris) pour mieux étudier la dysfonction érectile et tester de nouveaux traitements potentiels. L’objectif est de disposer de méthodes fiables pour évaluer l’efficacité de nouvelles substances. Cela permet de repérer celles qui pourraient améliorer la fonction érectile et de sélectionner les plus prometteuses pour la suite du développement. D’un point de vue médical, ces recherches pourraient aider à trouver des traitements plus efficaces, notamment pour les patients chez qui les solutions actuelles ne fonctionnent pas bien. À terme, cela pourrait améliorer la qualité de vie des patients et de leurs partenaires. Le projet cherche aussi à favoriser le développement de traitements mieux tolérés, avec moins d’effets indésirables. Enfin, sur le plan pratique, ce type d’approche permet de gagner du temps dans la recherche en identifiant plus rapidement les candidats les plus intéressants à développer.
Procédures
Les animaux (rats et souris) recevront chacun une seule administration pendant la procédure. Plusieurs voies d’administration sont possibles : soit par gavage (administration orale à l’aide d’une canule), soit par injection intrapéritonéale (dans l’abdomen), soit par injection intraveineuse dans la queue (dans une veine), soit par injection sous-cutanée (sous la peau), soit par injection intra-caverneuse (dans le pénis). Pour le gavage (sans anesthésie), le volume administré sera délivré lentement. Les volumes respecteront les recommandations en vigueur. Durée estimée : 30 secondes à 1 minute par animal Pour l’injection intrapéritonéale (sans anesthésie), les volumes administrés respecteront les recommandations en vigueur. Durée estimée : 30 secondes à 1 minute par animal, en fonction du comportement de l’animal. Pour l’injection intraveineuse (sans ou avec anesthésie), les volumes injectés respecteront les recommandations en vigueur. Durée estimée : 1 à 5 minutes par animal, en fonction de la facilité d’accès à la veine et du produit administré. Pour l’injection sous-cutanée (sans anesthésie), les volumes administrés respecteront les recommandations en vigueur. Durée estimée : environ 30 secondes par animal. Pour l’injection intra-caverneuse (avec anesthésie), les volumes administrés respecteront les recommandations en vigueur. Durée estimée : environ 15 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Certains signes généraux peuvent apparaître si un animal tolère mal le traitement. Par exemple : les poils peuvent se hérisser, les yeux peuvent être à moitié fermés, les moustaches collées, les oreilles plaquées vers l’arrière, ou encore une posture inhabituelle (dos voûté). On peut aussi observer une légère perte de poids, des sécrétions autour des yeux ou du nez, ou des signes d’inconfort au niveau du pénis, comme une érection anormalement longue ou persistante, ou une difficulté à ce que le pénis reprenne sa position normale, des troubles urinaires. Des signes de stress peuvent également être observés, du aux manipulations, à l’inconfort, aux administrations et au dispositif de contention. Des réactions locales peuvent aussi survenir à l’endroit où une intervention a été réalisée, comme une rougeur, un gonflement, ou plus rarement une infection. Enfin, des interactions entre animaux (par exemple en cas de cohabitation) peuvent parfois entraîner des blessures.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres études. Cela s’explique par la nature des expériences réalisées, qui incluent des administrations de substances et des procédures pouvant influencer durablement leur état physiologique. De plus, afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet, des prélèvements de tissus sont nécessaires pour réaliser des analyses complémentaires impossibles à effectuer chez l’animal vivant. Pour ces raisons, les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures, conformément à la réglementation en vigueur et aux principes éthiques encadrant l’expérimentation animale, afin de limiter toute souffrance inutile et de permettre l’exploitation scientifique complète des données obtenues.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est nécessaire dans ce projet, car la fonction érectile repose sur des mécanismes complexes faisant intervenir plusieurs parties du corps, notamment le système nerveux, la circulation sanguine et les hormones. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthodes alternatives (comme des tests en laboratoire sur cellules ou des simulations informatiques) capables de reproduire de façon fiable l’ensemble de ces interactions dans un organisme entier. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux reste aujourd’hui indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet. Le nombre d’animaux utilisés est toutefois limité au strict nécessaire afin de répondre à la question scientifique posée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera limité au strict nécessaire afin de garantir la robustesse scientifique des résultats (selon la littérature) tout en respectant le principe de réduction. Le nombre d’animaux par groupe expérimental sera limité entre 4 et 12, en tenant compte de la variabilité interindividuelle observée dans ce type de modèle. Le nombre de groupes sera déterminé en fonction du nombre de doses à tester pour chaque molécule. Les effectifs ont été définis de manière à permettre une analyse statistique appropriée, tout en évitant toute utilisation excessive d’animaux. Les données obtenues seront analysées à l’aide de tests statistiques adaptés (notamment une analyse de variance à deux facteurs – two-way ANOVA – suivie de tests post-test). Lorsque cela est possible, plusieurs types de données (observations comportementales, effets pharmacologiques, prélèvements tissulaires) seront recueillis chez un même animal, afin de maximiser les informations obtenues. Par ailleurs, les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité et, par conséquent, de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Aucune répétition inutile d’expériences ne sera réalisée.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales est conçu pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux, conformément à la réglementation et aux bonnes pratiques en expérimentation animale. Avant le début des expériences, une période d’adaptation d’au moins 7 jours est systématiquement respectée. Pendant cette période, les animaux s’habituent à leur environnement et aux personnes qui s’en occupent, grâce à des manipulations douces et répétées visant à les habituer au contact humain. Les animaux sont hébergés dans des conditions enrichies, avec des éléments permettant de favoriser leur bien-être et leurs comportements naturels, comme du matériel pour faire des nids, des abris, des tunnels ou des objets à ronger. Cela permet de réduire leur stress. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, dans des conditions conçues pour limiter le stress lié à la manipulation. Le matériel nécessaire est préparé à l’avance afin d’éviter toute attente inutile. Les procédures se déroulent dans des locaux adaptés et contrôlés. Les animaux sont suivis quotidiennement de manière attentive. Leur état général est évalué (poids, comportement, signes de mal-être) et des seuils d’alerte permettent d’interrompre rapidement la procédure si leur bien-être se dégrade. Les actes pouvant être douloureux sont réalisés sous anesthésie. Pendant ces phases, les animaux sont maintenus au chaud et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après la procédure, ils restent surveillés jusqu’à leur réveil complet. Si besoin, un soutien alimentaire adapté peut être mis en place pour limiter la perte de poids et maintenir leur état général. En cas de problèmes cutanés (comme des irritations ou des plaies), des soins locaux adaptés sont appliqués avec des produits vétérinaires appropriés pour favoriser la cicatrisation.
Choix des espèces
Le choix du rat et de la souris s’explique par leur utilisation fréquente dans l’étude de la fonction érectile et des troubles associés. Ces animaux présentent des ressemblances avec l’être humain, notamment au niveau des mécanismes qui contrôlent la circulation sanguine et le système nerveux impliqués dans l’érection. Le rat est souvent utilisé car sa taille facilite certaines manipulations et observations, comme les injections ou le suivi des réactions physiologiques. Il permet aussi d’obtenir des résultats généralement stables et reproductibles. La souris constitue un modèle complémentaire, notamment parce qu’il existe de nombreuses lignées génétiques disponibles. Elle est particulièrement utile pour les premières étapes de test de nouvelles substances. L’utilisation de ces deux espèces permet donc d’adapter les approches expérimentales selon les objectifs de l’étude, tout en restant conforme aux pratiques habituelles de la recherche. Les animaux utilisés sont adultes : à partir de 12 semaines pour les rats et de 10 semaines pour les souris, ce qui correspond à un stade de développement où les fonctions reproductives et physiologiques sont matures. Dans certains cas, des animaux plus âgés peuvent également être utilisés, selon les besoins de l’étude (souris de 6 à 12 mois et rats de 12 à 24 mois). Ce choix est justifié par le fait que les troubles de l’érection sont plus fréquents avec l’âge, car le vieillissement entraîne des modifications progressives du système sanguin et du système nerveux impliqués dans ce mécanisme. Utiliser des animaux plus âgés permet donc de se rapprocher de certaines situations observées chez l’humain.
Modèle murin de sepsis (ligature du caecum) pour le développement de thérapies innovantes immunomodulatrices et anti-infectieuses
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 160
Soumis à une ligature et une ponction du cæcum qui déclenchent une septicémie polymicrobienne, 480 rongeurs, 320 souris et 160 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une douleur abdominale aiguë, une léthargie, une perte de poids rapide, une déshydratation, un choc septique et des défaillances d'organes dans les cas graves, ainsi qu'une mortalité partielle liée à la longueur de la ligature et au calibre de la perforation. Les composés testés sont administrés une à quatre fois par jour pendant dix jours au plus, avec pesée quotidienne et une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie. Tous seront tués à la fin de chaque procédure pour mesurer la charge microbienne et les paramètres inflammatoires dans leurs organes.
Objectifs
Le projet utilise le modèle de ligature et ponction du cæcum chez la souris pour évaluer l’efficacité de composés anti-infectieux et immunomodulateurs dans le contexte d’une d’une septicémie polymicrobienne d’origine abdominale. Les objectifs principaux de ce protocole sont : Evaluer l’efficacité thérapeutique des petites molécules, peptides, anticorps, vaccins ou immunomodulateurs pour réduire la charge bactérienne systémique. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire : modulation de l’inflammation, prévention du choc septique et restauration de l’homéostasie immunitaire. Mesurer la protection des organes et tissus face aux dommages induits par l’infection abdominale. Comparer différentes stratégies thérapeutiques en situation de septicémie abdominales pour identifier les interventions les plus efficaces. Valider un modèle préclinique représentatif des infections polymicrobienne d’origine abdominale humaines pour le développement de traitements innovants contre les bactéries résistantes et les infections graves. Ce protocole est particulièrement adapté pour tester des traitements dans un contexte de septicémie polymicrobienne, où les modèles cellulaires ou tissulaires classiques ne permettent pas d’évaluer simultanément l’efficacité anti-infectieuse et l’impact immunomodulateur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine et animale. Il permet de compréhension des mécanismes de l’infection systémique : le CLP reproduit la septicémie polymicrobienne humaine, permettant d’étudier comment les bactéries déclenchent l’inflammation, le choc septique et la dysfonction organique. Permet également d’évaluer la réponse immunitaire en mesurant les effets immunomodulateurs des nouvelles molécules, anticorps ou vaccins, d’identifier des biomarqueurs de gravité de l’infection ou de réponse thérapeutique. Permet de la validation préclinique de nouveaux composés anti-infectieux, optimisation des stratégies thérapeutiques en situation de septicémie sévère, infections localisées. A plus large échelle, il permettra d’améliorer la prise en charge des infections graves en prévenant de la mortalité liée à la septicémie et au renforcement du pipeline thérapeutique.
Procédures
Le projet implique une chirurgie pour ligaturer et ponctionner le caecum. Cette procédure est réalisée sous anesthésie chimique et analgésique. Les traitements avec les composés testés sont de 1 à 4 fois par jour pendant 10 jours maximum. Ce geste n'excède pas 10 secondes par animal. Pour l'ensemble des protocoles, des pesées journalières sont réalisées ; pour chaque souris, une contention de 20 secondes maximum est nécessaire pour cette mesure. Enfin, des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (pendant 1 minute) sont pratiqués pour la mesure des paramètres inflammatoires. En prenant en compte le temps de récupération des souris, le nombre maximum de prélèvement est de 1 fois par semaine pour l'ensemble des procédures. 1 minutes avant le prélèvement, un traitement avec un analgésique est pratiqué pour réduire la douleur .
Impact sur les animaux
Pour un projet utilisant le modèle de ligature et ponction du cæcum (CLP) les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux, sont les suivants : La chirurgie provoque une douleur abdominale aiguë et les infections induites peuvent entraîner douleur diffuse, malaise, léthargie et perte d’appétit. Les animaux peuvent présenter des signes de stress tels que poils hérissés, posture recroquevillée ou mobilité réduite. Le sepsis peut provoquer un choc septique dans les cas sévères et défaillance organique possible. Une diarrhée, une perte de poids rapide et une déshydratation. Certains composés testés peuvent entraîner toxicité hépatique, rénale ou hématologique. Le CLP est un modèle de septicémie sévère ; une mortalité partielle est attendue en fonction de la longueur de la ligature et du calibre de la perforation.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires et des études d'histologie.
Remplacement
Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intègrons dans nos projets des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Il existe plusieurs alternatives non animales dans la recherche sur les maladies infectieuses et inflammatoires, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, organes) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques, essentiels pour comprendre les maladies infectieuses et inflammatoires. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes comme les poumons ou les reins pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions pathogènes et immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, pour les raisons suivantes : • Complexité biologique : Les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales. • Interactions systémiques : Les maladies infectieuses et inflammatoires nécessitent l'étude des interactions complexes entre les systèmes biologiques, ce qui ne peut être simulé sans un modèle vivant.
Réduction
Les modèles in vitro et tissulaires permettent de tester les composés anti-infectieux et immunomodulateurs sur des cultures cellulaires et tissulaires, évaluant leur efficacité, leur innocuité et leurs mécanismes d’action avant tout essai in vivo. Les organoïdes reproduisent des structures d’organes spécifiques, comme les poumons, la vessie et les reins, permettant d’étudier la réponse des tissus aux infections et traitements dans un environnement plus réaliste. En combinant ces approches, nous contribuons à la réduction des expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats. Cette approche permet d'identifier les composés les plus prometteurs et de maximiser l'efficacité des traitements contre les infections virales, bactériennes et fongiques. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées afin de déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque point de mesure ; généralement la charge virale, bactérienne ou fongique dans les organes ciblés, analyse des signes cliniques, mesure de biomarqueurs (exemple: biomarqueur hépatique) et évaluation de l'inflammation (cytokines, chimiokines ou histologie).
Raffinement
La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que la perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites (voir annexe) en raison des effets des infections et inflammations. Après l'infection ou l'administration de traitements, une surveillance plus rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place dans les premières 12 heures, pour détecter rapidement des signes de détresse, comme une perte de poids importante (plus de 20%) ou une diminution de l'activité. Des critères d'arrêt stricts et précoces sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqure...).
Choix des espèces
Le CLP est un modèle standardisé de septicémie polymicrobienne, largement validé dans la littérature. Les réponses physiopathologiques chez la souris et le rat (inflammation systémique, choc septique, dysfonction d’organes) reproduisent de manière fiable les principales caractéristiques de la septicémie humaine. La variabilité génétique contrôlée chez les souris permet une reproductibilité expérimentale élevée. Les souris sont suffisamment petites pour une manipulation chirurgicale délicate avec un minimum de matériel et de stress. Les rats, plus grands, permettent des prélèvements sanguins répétés, des mesures hémodynamiques et des interventions plus complexes sans compromettre leur survie. Les modèles murins et ratins permettent d’étudier simultanément la charge bactérienne systémique, la réponse immunitaire innée et adaptative et l’inflammation et lésions tissulaires dans différents organes. Aucun modèle in vitro ou tissulaire ne permet de reproduire cet ensemble d’événements physiopathologiques de manière intégrée. Les animaux utilisés dans le cadre des modèles de pathologies infectieuses sont des jeunes adultes, âgées de minimum de 6 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à une maturité immunologique, métabolique et physiologique optimale, ce qui en fait un modèle préclinique pertinent et standardisé pour l’étude des maladies infectieuses et inflammatoires humaines. A partir de la 6e semaine, les souris présentent un système immunitaire complet (réponses innée et adaptative), permettant une réponse fiable aux agents pathogènes étudiés (bactéries, virus, champignons). Les animaux sont sevrés, stabilisés, et moins sujets aux fluctuations hormonales ou de croissance rapides, ce qui renforce la reproductibilité expérimentale. La morphologie permet des manipulations techniques précises (voies d’infection, prélèvements sanguins, administration de traitements). La majorité des publications scientifiques et des recommandations réglementaires utilisent ce stade pour modéliser des infections polymicrobienne d'origine abdominale.
Modulation de la réponse immune après transfert de gène à l’aide d’AAV recombinant dans un modèle de rats
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un groupe de rats reçoit vingt-quatre injections intrapéritonéales, un autre six, en plus d'une injection intraveineuse de vecteur viral et de cinq prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. 92 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît une douleur légère à modérée dont l'intensité varie selon la fréquence des injections, tout en affirmant que le prélèvement sanguin terminal dans la veine cave "n'engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux". Tous seront tués à la fin de la procédure pour des études post-mortem.
Objectifs
La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés constituent des outils de choix. Une seule injection d'un virus adéno-associés permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de nombreux succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur et/ou le produit du transgène. En effet, les réponses immunes dirigées contre le vecteur et/ou le gène thérapeutiques ont été décrites comme pouvant être responsables d’une inefficacité du transfert de gène à long terme, d’effets indésirables ou encore empêcher l’administration du vecteur en cas d’immunité préexistante. Contrôler cette immunotoxicité est aujourd’hui un défi majeur pour le succès en clinique de la thérapie génique. A ce jour, l’une des molécules que nous allons injecter est utilisée comme traitement préventif en transplantation, est utilisée comme immunosuppresseur dans les protocoles de thérapie génique chez le patient. Bien que ce traitement permette, dans la majorité des cas, de maintenir une expression du transgène thérapeutique, il ne permet pas la réadministration du vecteur. L’autre molécule est utilisée dans le traitement de maladies auto-immunes. Une étude préliminaire réalisée chez la souris a montré que ce traitement pouvait moduler la réponse immune dirigée contre le vecteur et permettre sa ré-administration. Ce projet vise à évaluer l’effet d'un immunosuppresseur sur l’initiation d’une réponse anti-vecteur et anti-transgène dans un modèle de rat qui, contrairement à la souris, présente ces deux réponses après injection d'un virus adéno-associés par voie intraveineuse .
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre de prévenir la réponse immunitaire après injection de vecteur de virus adéno associés dans le but de développer des stratégies de thérapie génique plus sûres et plus efficaces pour le patient.
Procédures
Les 92 rats subiront une injection par intraveineuse de vecteur ou de sérum physiologique et 5 prélèvements sanguins. Des protocoles d'anesthésie et d’analgésie seront mis en place selon la procédure. Les injections et les prélèvements sanguins se dérouleront sous anesthésie gazeuse de courte durée (environ 5 à 10min). Les rats du groupe 3 recevront 6 injections d’une molécule en intrapéritonéale. Les rats du groupe 4 recevront 24 injections d’une autre molécule en intrapéritonéale. Une injection en intrapéritonéale se réalise en moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguins et au point d’injection de l’intraveineuse, due à la pénétration de l’aiguille. Les animaux ressentiront également une douleur légère à modérée, dont l’intensité pourra varier selon le groupe expérimental et la fréquence des injections, en raison de l’insertion de l’aiguille lors des injections intrapéritonéales .
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.
Remplacement
L’enjeu majeur des protocoles de thérapies géniques développés à l’aide des virus adéno-associés consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes. Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat, car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti-virus adéno associés et anti-transgène ainsi qu’une hépatotoxicité similaire à celle observée chez l’humain.
Réduction
Chez l’Homme, l’apparition et l’intensité d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire chez des rats. Le nombre de 10 animaux par groupe a été déterminé. Pour comparer la réponse immunitaire entre les différents groupes de l’étude, nous utiliserons une méthode statistique permettant d’identifier d’éventuelles différences entre eux. Les analyses sont conçues pour détecter de manière fiable des effets importants, tout en limitant le risque de conclure à tort qu’une différence existe. Ce choix repose sur des résultats préliminaires montrant une forte réaction immunitaire dans le foie ainsi que sur l’efficacité déjà observée d'un immunosuppresseur pour moduler la réponse immunitaire chez la souris.
Raffinement
Toutes les interventions sur les animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux.Pour l'euthanasie, le prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave n’engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement des tunnels en carton et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. Nous utilisons un modèle de rat dans lequel nous observons une réponse cellulaire après injection de fortes doses d'un virus adéno associés. Ce modèle semble reproduire les effets secondaires observés chez l’homme dans les essais cliniques après injection d'un virus adéno associés à forte dose. L'utilisation du rat est donc justifiée par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune. De plus, l’utilisation du modèle rat permet de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.
Évaluation d’agonistes biaisés du récepteur de l’apéline sur l’équilibre hydrique et la fonction cardiovasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Tués juste après la mesure de leur pression artérielle pour leur épargner des douleurs importantes et des complications vasculaires, les rats porteurs d'un cathéter fémoral donnent le ton du sort réservé aux 1 200 rats de ce projet, tous tués à l'issue. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Chaque rat reçoit une injection de l'une des dix versions modifiées de l'apéline, jusqu'à quatre prélèvements sanguins, environ 24 heures en cage individuelle de métabolisme, et pour certains la pose d'un dispositif de mesure dans l'artère fémorale suivie de deux heures d'enregistrement. Le porteur écrit que les "mini-organes" et les "organ-on-chip" "ne suffisent pas encore", et que l'utilisation d'animaux non-humains vivants reste "indispensable".
Objectifs
Le projet cherche à mieux comprendre comment une substance naturellement présente dans l’organisme (l’apéline) aide à réguler plusieurs fonctions essentielles : la quantité d’eau dans le corps et la pression du sang dans les artères. Cette substance agit en se fixant sur des « récepteurs », c’est-à-dire des sortes d’interrupteurs présents à la surface des cellules. Selon la manière dont ces « interrupteurs » sont activés, les effets peuvent être différents : certains agissent surtout sur les reins pour favoriser l’élimination d’eau, d’autres influencent davantage la pression sanguine. Des versions légèrement différentes de cette substance existent naturellement dans le corps. Elles n’agissent pas toutes de la même façon : certaines modifient la pression sanguine alors que d’autres favorisent principalement l’élimination d’eau par les urines. Les raisons de ces différences ne sont pas encore bien comprises. L’objectif est d’identifier des substances capables d’augmenter l’élimination d’eau sans faire baisser dangereusement la pression artérielle, ou de diminuer la pression artérielle sans perturber l’équilibre hydrique. Dans le premier cas ces composés pourront être utililsés pour traiter l’hyponatrémie, dans le second cas pour traiter l’hypertension. Le projet consiste donc à créer et étudier jusqu’à 10 versions de cette substance, développées à partir des formes naturelles déjà connues. Leur conception repose sur une approche rationnelle : certaines modifications chimiques sont choisies en fonction des effets observés avec les molécules naturelles, afin de mieux comprendre quelles parties de la molécule sont responsables des effets sur les reins ou sur la pression sanguine. Certaines versions seront également conçues pour rester actives plus longtemps dans l’organisme. Avant d’être étudiées chez l’animal, ces nouvelles versions seront d’abord testées en laboratoire sur des cellules afin de vérifier leur bon fonctionnement et leur stabilité. Seules les molécules présentant les résultats les plus favorables (par exemple une bonne stabilité, une activité suffisante et des effets ciblés) seront ensuite évaluées chez le rat. Les chercheurs observeront notamment la quantité d’urine produite, l’équilibre de l’eau et des sels minéraux dans le corps, ainsi que les effets sur la pression artérielle. Après ces études, des analyses complémentaires permettront de mieux comprendre comment ces substances influencent le fonctionnement des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
À court terme, le projet apportera de nouvelles connaissances sur la manière dont certaines substances agissent sur les cellules et influencent des fonctions essentielles comme la production d’urine, la pression sanguine et la souplesse des vaisseaux. Ces résultats aideront également à concevoir des substances plus efficaces et dont l’action est mieux ciblée. À moyen terme, les chercheurs espèrent identifier des composés capables d’augmenter l’élimination d’eau par les reins sans provoquer de baisse de la pression sanguine, ou au contraire de diminuer la pression artérielle sans perturber l’équilibre de l’eau dans le corps. Ces avancées pourraient servir de base à de futures recherches sur des maladies fréquentes touchant le rein et les vaisseaux sanguins. À long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies répandues ayant un impact important sur la santé publique, comme certaines maladies du cœur, l’hypertension ou l’hyponatrémie ou la polykystose rénale. Des traitements plus précis pourraient aussi réduire les effets indésirables observés avec les médicaments actuels. Au-delà des applications médicales, ce projet permettra d’améliorer les connaissances générales sur le fonctionnement des vaisseaux sanguins et des reins, ce qui bénéficiera plus largement à la recherche en santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions destinées à mieux comprendre les effets des substances étudiées sur l’équilibre de l’eau dans le corps et sur la pression artérielle. • Administrations de substances : chaque animal reçoit une molécule par injection. Ces gestes sont courts, d’une durée de quelques secondes. • Recueil des urines et suivi de la consommation d’eau et de nourriture: certains animaux sont placés pendant environ 24 heures dans des cages adaptées permettant de mesurer la quantité d’urine produite et l’eau et la nourriture consommées. • Prélèvements de sang : des échantillons sanguins sont prélevés une à quatre fois maximum selon le protocole expérimental, avec un intervalle de plusieurs dizaines de minutes à plusieurs heures entre les prélèvements. Ces interventions sont réalisées sous anesthésie afin de limiter la douleur et durent quelques minutes par prélèvement. • Mise en place dans l’artère fémorale d’un petit dispositif de mesure de la pression artérielle : elle est réalisée sous anesthésie générale. L’enregistrement de la pression du sang est réalisé dans la foulée, pendant environ deux heures. L’ensemble des interventions est organisé de manière à limiter le nombre de manipulations et à réduire autant que possible la durée de chaque étape.
Impact sur les animaux
Les effets prévus sur les animaux sont principalement liés aux manipulations et aux substances étudiées : 1. Gêne passagère lors des injections : Les animaux peuvent ressentir une douleur légère et très courte au moment de l’injection sous la peau. 2. Stress temporaire lié aux manipulations : La contention, la pesée et l’administration des composés peuvent provoquer un stress bref, limité au temps de l’intervention. 3. Adaptation au changement de cage : Pour les animaux qui sont placés pendant environ 24 heures dans des cages spéciales, l’hébergement individuel et le nouvel environnement peuvent modifier temporairement l’activité ou l’alimentation. 4. Effets physiologiques temporaires des composés : Selon la molécule, une augmentation temporaire de la production d’urine, de légères modifications des sels dans le sang ou l’urine, ou une baisse passagère de la pression artérielle peuvent survenir. 5. Mise en place du dispositif de mesure de la pression artérielle sous anesthésie (et enregistrement) : cette procédure peut entrainer des douleurs et un inconfort post-opératoires importants, ainsi que des complications vasculaires locales. Dans l’ensemble, ces effets sont courts, passagers et liés aux manipulations ou aux effets attendus des composés. Aucune maladie durable n’est prévue.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet sont euthanasiés à l’issue des procédures pour des raisons scientifiques et éthiques. Les analyses prévues nécessitent que le sang, les organes et les tissus soient prélevés immédiatement après la procédure afin de garantir la fiabilité des mesures. Dans le cas des animaux pour lesquels une mesure de la pression artérielle sera réalisée, l’euthanasie interviendra juste après la mesure afin de ne pas leur faire subir des douleurs importantes et de laisser survenir des complications vasculaires.
Remplacement
Avant d’utiliser des animaux, toutes les substances sont d’abord testées dans des expériences en laboratoire sur des cellules. Ces tests permettent de mesurer la façon dont les molécules se fixent sur leur récepteur, leur stabilité dans le sang et leur capacité à activer différentes voies de signalisation à l’intérieur des cellules. Cependant, aucun modèle en laboratoire ne peut reproduire l’interaction complexe entre les reins, le cœur, les vaisseaux sanguins, le foie et la circulation sanguine. Pour connaître l’effet réel sur la pression artérielle et la production d’urine, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant, avec tous les systèmes de régulation actifs. Les modèles « mini-organes » ou « organ-on-chip » ne suffisent pas encore. L’utilisation d’animaux vivants reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé pour être le minimum nécessaire afin de détecter de manière fiable les effets attendus. Les calculs se basent sur des données précédentes et sur des méthodes statistiques pour garantir que chaque animal contribue utilement aux résultats. La stratégie est progressive : seuls les composés qui montrent des résultats favorables en laboratoire sont testés chez l’animal. Des mesures supplémentaires permettent de réduire le nombre total d’animaux : • Combiner plusieurs mesures sur le même animal quand c’est possible ; • Standardiser strictement les conditions pour limiter la variabilité ; • Utiliser des courbes de doses optimisées pour éviter les répétitions inutiles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes et disposent d’un environnement enrichi (nids, tunnels, bâtonnets). Une période d’adaptation est respectée avant toute intervention. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel qualifié, dans un environnement calme pour limiter le stress. Les volumes injectés sont conformes aux recommandations réglementaires. Les interventions invasives ou terminales sont faites sous anesthésie générale avec contrôle de la profondeur de l’anesthésie et maintien de la température corporelle. Pour les études de 24 heures en cages adaptées permettant de mesurer la quantité d’urine produite, le contact visuel et olfactif avec d’autres animaux est maintenu. Une surveillance quotidienne permet d’évaluer le poids, le comportement et l’état général. Des points limites adaptés sont définis afin d’identifier précocement toute situation susceptible d’entraîner une souffrance et de mettre en place les mesures appropriées.
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car sa physiologie et son fonctionnement cardiovasculaire et rénal sont proches de l’Homme. Cette espèce permet de mesurer précisément la pression sanguine, la quantité d’urine produite et la composition des sels dans l’urine et le sang. La taille du rat facilite les prélèvements sanguins répétés nécessaires pour déterminer la durée d’action et la répartition des composés dans l’organisme. L’utilisation de rats issus de souches standardisées assure que les résultats sont comparables entre animaux, ce qui limite le nombre total nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Les rats utilisés sont adultes, âgés de 8 à 12 semaines, car à ce stade leur organisme est complètement développé. Cela permet de réaliser des mesures physiologiques stables et reproductibles, et d’évaluer correctement le métabolisme et la durée d’action des composés étudiés. L’utilisation d’adultes offre également une taille et une robustesse suffisantes pour les interventions, telles que la pose de cathéters ou le prélèvement de tissus, ce qui réduit le stress et le risque de complications.
Etude comportementale et fonctionnelle du modèle de cholestase hépatique par BDL chez le rat pour l’évaluation de stratégies thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une opération bloque l'écoulement de la bile hors du foie, ce qui installe progressivement une maladie hépatique et, avec elle, une atteinte du cerveau. 1 355 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 1 340 tués à l'issue et 15 réutilisés dans d'autres études. Le porteur écrit que l'intervention peut provoquer des douleurs les premiers jours, puis une baisse d'activité, une perte de poids et d'autres signes liés à l'atteinte du foie et du cerveau, sur cinq semaines de suivi. Les rats passent des tests deux fois par semaine, de cinq à vingt minutes, décrits comme simples et destinés à mesurer un ralentissement des mouvements ou des troubles de la mémoire, sans qu'aucun de ces tests soit nommé.
Objectifs
Ce projet vise à développer et étudier un modèle chez le rat dans lequel la bile, un liquide produit par le foie, ne peut plus circuler normalement. Cette situation permet de reproduire une maladie du foie et de mieux comprendre une complication grave appelée encéphalopathie hépatique. Cette complication touche le cerveau et peut entraîner des difficultés à se concentrer, des changements de comportement, une désorientation, ou encore des troubles plus importants. Dans les cas les plus graves, elle peut aller jusqu’au coma. Cette maladie a des conséquences importantes sur la vie des patients et peut mettre leur vie en danger.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, des tests simples seront réalisés pour observer le comportement et les mouvements des animaux. Cela permet de repérer et de mesurer les troubles liés à la maladie, comme un ralentissement des mouvements, moins d’activité, des difficultés à se déplacer, ou des problèmes de mémoire. Ces observations seront faites régulièrement pour suivre l’évolution de la maladie au fil du temps et voir comment elle affecte le cerveau en parallèle de l’atteinte du foie. Ces informations sont importantes car elles permettent de mieux comprendre cette complication, mais aussi d’évaluer sa gravité et de tester l’efficacité de nouveaux traitements. À terme, ce travail pourrait aider à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies graves du foie.
Procédures
Les animaux réaliseront des tests de comportement deux fois par semaine pendant une période maximale de 5 semaines. Chaque test dure entre 5 et 20 minutes. Des prélèvements de sang seront également effectués sous anesthésie pour éviter toute douleur : un premier au début de l’étude, puis un dernier à la fin. Pour certains animaux, un prélèvement supplémentaire sera réalisé une fois par semaine après l’opération. Les quantités de sang prélevées restent limitées et respectent les recommandations, afin de ne pas nuire à la santé des animaux.
Impact sur les animaux
Les tests réalisés pour observer le comportement des animaux sont simples et ne provoquent qu’une gêne légère et temporaire, liée surtout à la manipulation ou au fait d’être placés dans un environnement nouveau. Ils sont courts et espacés dans le temps pour limiter le stress. Les principales contraintes viennent du modèle lui-même, qui repose sur une opération permettant de bloquer l’écoulement de la bile et d’induire progressivement une maladie du foie. Cette intervention peut entraîner des douleurs après l’opération, surtout les premiers jours. Avec le temps, la maladie peut également affecter l’état général des animaux, avec moins d’activité, une perte de poids, ou d’autres signes liés à l’atteinte du foie et du cerveau. Les animaux sont surveillés de près tout au long de l’étude afin de limiter au maximum la douleur, le stress et la dégradation de leur état.
Devenir
Concernant la Procédure n°1 : les animaux seront réutilisés et replacés dans d'autres études. Pour la Procédure n°2 : tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser les analyses de caractérisation du modèle. Enfin, la Procédure n°3 : tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser les analyses pour étudier les effets des molécules d'intérêt.
Remplacement
Aujourd’hui, il n’est pas possible d’étudier cette maladie sans utiliser des animaux vivants. Cette affection est très complexe, car elle touche en même temps plusieurs organes, notamment le foie et le cerveau, et provoque des déséquilibres importants dans le corps ainsi que des modifications du comportement. Ces phénomènes sont liés entre eux et ne peuvent pas être reproduits correctement en laboratoire avec des cellules, des tissus isolés ou des outils informatiques. Même si certaines méthodes permettent d’étudier des aspects précis de la maladie, elles ne permettent pas de comprendre ses effets sur l’ensemble de l’organisme. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour mieux comprendre cette maladie et ses conséquences, notamment sur le cerveau et le comportement.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au strict minimum nécessaire. L’organisation des études est pensée pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. Lorsque cela est possible, les mêmes groupes d’animaux sont utilisés pour plusieurs mesures, et toutes les informations recueillies sont exploitées au maximum. Des premières études permettent aussi de mieux cibler les moments clés de la maladie, afin d’éviter d’utiliser des animaux de manière inutile par la suite. De plus, le suivi du comportement se fait grâce à des méthodes simples qui permettent d’observer plusieurs fois les mêmes animaux au fil du temps, sans en utiliser davantage. Enfin, des groupes spécifiques sont parfois nécessaires, mais leur nombre reste limité pour éviter toute utilisation excessive d’animaux.
Raffinement
Une attention particulière est portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Tout est mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie, avec des traitements contre la douleur avant et après l’opération. Les animaux sont surveillés de près après l’intervention et pendant toute la durée de l’étude, afin de vérifier leur état général, leur alimentation, leur hydratation et leur comportement. Si nécessaire, des soins supplémentaires sont apportés, comme une alimentation adaptée ou un apport en liquide, pour éviter une dégradation de leur état. Les tests réalisés sont simples, de courte durée et peu contraignants. Si un animal montre des signes de souffrance trop importants, l’expérience est arrêtée et une euthanasie est réalisée rapidement afin d’éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
Le rat est souvent utilisé pour étudier les maladies du foie et leurs effets sur le cerveau, car son fonctionnement est bien connu. Cela permet de reproduire de manière fiable l’évolution de la maladie observée chez l’être humain, avec des atteintes du foie qui peuvent entraîner des troubles du comportement et du fonctionnement cérébral. Le rat a aussi des comportements variés, ce qui permet d’observer facilement des changements comme des difficultés à se déplacer, à apprendre ou une altération de l’état général. Les études sont réalisées chez de jeunes animaux adultes, car leur organisme est suffisamment développé pour réagir correctement à la maladie. Leur système de défense fonctionne bien à cet âge, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables.
Détermination de la dose maximale tolérée et/ou de la dose maximale tolérée après administrations répétées de substances expérimentales chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 150
Le protocole dépend de la substance qu'un commanditaire souhaite évaluer, biologique, chimique, cellulaire, virale ou bactérienne. 800 rongeurs, 650 souris et 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, 780 tués à l'issue et 20 pouvant être réutilisés s'ils n'ont reçu qu'une seule administration et sont restés moins d'une semaine en procédure sans signe clinique. Chacun peut subir trois prélèvements de sang par la jugulaire et par jour, trois par côté à la saphène sur vingt-quatre heures, une pesée quotidienne, et jusqu'à une heure d'hébergement individuel en cage sans aucun enrichissement. Le porteur écrit que les méthodes de remplacement ne reproduisent pas encore l'ensemble des interactions d'un organisme vivant complet, et qualifie d'"indispensables" les données produites pour sélectionner les candidats les plus prometteurs.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance de nouveaux candidats thérapeutiques chez des rongeurs (souris ou rats) avant leur éventuelle utilisation chez l’être humain. Les substances étudiées peuvent être de différentes natures (biologique, chimique, cellulaire, virale ou bactérienne) et sont administrées aux animaux afin d’observer leur réaction à court terme après une ou plusieurs administrations. L’objectif est d’identifier les quantités de substance pouvant être administrées sans provoquer d’effets indésirables importants, ainsi que de mieux comprendre les éventuels signes de toxicité associés. Les animaux seront suivis régulièrement afin de détecter toute modification de leur état général, de leur comportement ou de leurs fonctions physiologiques. Les résultats obtenus permettront de mieux définir les conditions d’utilisation des futurs traitements et de choisir les doses adaptées pour les étapes suivantes de leur développement.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à obtenir des informations essentielles sur la sécurité et la tolérance de nouveaux candidats thérapeutiques avant d’envisager des étapes ultérieures de leur développement. Les substances étudiées peuvent être de différentes natures (biologique, chimique, cellulaire, virale ou bactérienne) et nécessitent une évaluation préalable afin d’identifier les quantités pouvant être utilisées sans provoquer d’effets indésirables importants. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre la réaction de l’organisme face à ces nouveaux traitements, d’identifier d’éventuels effets secondaires et de déterminer les conditions d’utilisation les plus adaptées pour les futures études. Ces informations sont indispensables pour sélectionner les candidats thérapeutiques les plus prometteurs et réduire les risques avant de poursuivre leur développement. L’utilisation de rongeurs est nécessaire car certains effets d’un traitement, comme sa diffusion dans l’organisme, sa transformation et son impact global sur les fonctions biologiques, ne peuvent pas être évalués uniquement avec des méthodes alternatives. Les modèles utilisés permettent ainsi d’obtenir des données complémentaires indispensables à l’évaluation de la sécurité des futurs traitements. Ce projet contribue également à améliorer la conception des études suivantes en permettant d’éviter l’utilisation de doses inappropriées et de limiter l’exposition inutile des animaux à des effets indésirables. Les procédures seront réalisées dans le respect des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), avec un nombre d’animaux limité au strict nécessaire, des méthodes optimisées et des critères d’arrêt définis afin de préserver au mieux leur bien-être. Le bénéfice attendu est donc de fournir des connaissances permettant de développer de nouveaux traitements de manière plus sûre, plus efficace et mieux adaptée aux besoins futurs en santé humaine ou vétérinaire.
Procédures
La randomisation pour former des groupes homogènes peut entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères (une seul fois). Les traitements peuvent être administrés par voies : • Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) • Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) • Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) • Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) Les animaux seront pesés (moins de 5 min, tous les jours) pouvant entrainer un stress leger Les prélèvements sanguins seront effectués par voies : • Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) • Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) • Queue (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) Pour les prélèvements individuels d’urine/fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). Les prélèvements de tissus/organes seront réalisés sur animaux euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter des effets indésirables liés aux substances administrées ou aux différentes manipulations réalisées au cours de l’étude. La nature et l’intensité de ces effets peuvent varier en fonction du produit étudié, de la dose administrée et de la méthode d’administration utilisée. Les effets observés peuvent inclure une diminution temporaire de l’activité, des changements de comportement, une perte de poids, une modification de l’alimentation ou de l’hydratation, ainsi que plus rarement des signes plus importants affectant l’état général (par exemple des troubles de la mobilité, des difficultés respiratoires ou des signes neurologiques). Ces effets peuvent apparaître peu de temps après l’administration et être transitoires, mais dans certains cas ils peuvent persister plusieurs jours. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter rapidement toute dégradation de leur état de santé. Des critères d’arrêt sont définis afin d’éviter une souffrance inutile. Les administrations de produits peuvent également provoquer des réactions locales au point d’injection ou d’administration, telles qu’une irritation, une inflammation ou une gêne temporaire. Les prélèvements biologiques peuvent entraîner une douleur légère et de courte durée liée à la ponction. Les manipulations répétées peuvent également générer un stress temporaire. Certaines procédures, comme l’administration orale par gavage ou les prélèvements réalisés sous anesthésie, peuvent entraîner un stress ou des effets liés à l’anesthésie, généralement limités à la durée de l’intervention. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé, avec des méthodes adaptées visant à limiter le stress, la douleur et l’inconfort des animaux, conformément aux principes de bien-être animal et des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement).
Devenir
Les animaux ayant fait l’objet de plusieurs gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux inclus dans les groupes de traitement, ayant reçu plus d’un traitement ou étant resté plus d’une semaine en procédure, seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux ayant reçu une administration unique et étant restés moins d’une semaine en procédure sans signes cliniques indésirables et rétrospectivement évaluer en gravité légère pourront être réutiliser.
Remplacement
Des méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux, telles que les modèles cellulaires, les tissus cultivés en laboratoire ou les outils informatiques, sont utilisées lorsque cela est possible afin d’étudier les nouveaux candidats thérapeutiques. Ces approches permettent notamment d’obtenir des premières informations sur l’activité des produits et d’identifier certains effets indésirables potentiels. Cependant, ces méthodes ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions qui se produisent dans un organisme vivant complet. L’efficacité et la tolérance d’un traitement peuvent dépendre de nombreux facteurs, comme sa diffusion dans le corps, sa transformation par les organes, son élimination et les réponses coordonnées de différents systèmes biologiques. Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de souris ou de rats reste donc nécessaire pour obtenir des informations sur la sécurité globale des composés étudiés avant de poursuivre leur développement. Le recours aux animaux sera limité aux expériences indispensables, avec une sélection adaptée du modèle utilisé et une optimisation des procédures afin de réduire le nombre d’animaux et de limiter au maximum les contraintes qui leur sont imposées, conformément aux principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement)
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les études seront conçues de manière progressive et avec des effectifs limités au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Lorsque cela est possible, un même animal pourra contribuer à plusieurs étapes d’évaluation, ce qui permet d’éviter de répéter inutilement certaines expériences. Les premières phases seront réalisées sur de petits groupes afin d’identifier rapidement les doses les mieux tolérées et de limiter le recours à des groupes plus importants. Les résultats seront analysés avec soin afin d’exploiter au mieux chaque étude et d’éviter de refaire des essais déjà réalisés. Les données obtenues pourront également servir à orienter les études suivantes et ainsi réduire le nombre total d’animaux nécessaires. La conception des études tiendra compte des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) afin de garantir une utilisation responsable des animaux tout en permettant d’obtenir les informations scientifiques nécessaires au développement de futurs traitements.
Raffinement
Toutes les procédures réalisées dans le cadre de ce projet seront conduites dans le respect des règles en vigueur relatives au bien-être animal. Les manipulations, administrations de substances et prélèvements seront effectués par du personnel formé et expérimenté afin de limiter au maximum le stress, l’inconfort et la douleur des animaux. Une surveillance régulière des animaux sera mise en place pendant toute la durée des études afin de suivre leur état général, leur comportement et détecter rapidement tout signe inhabituel pouvant être lié aux traitements administrés. Une attention particulière sera portée aux animaux susceptibles de présenter des effets indésirables, avec une adaptation du suivi si nécessaire. Des critères d’arrêt anticipé seront définis afin d’éviter toute souffrance inutile. Si un animal présente une altération importante de son état de santé, des mesures adaptées seront prises, pouvant inclure l’arrêt de la procédure ou une prise en charge appropriée. Les conditions d’hébergement seront optimisées grâce à un environnement adapté et à des mesures d’enrichissement permettant de favoriser le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les protocoles seront conçus pour utiliser uniquement le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats fiables. Les administrations et prélèvements seront réalisés selon des méthodes adaptées, en limitant leur fréquence et leur intensité autant que possible. Une approche progressive des études permettra d’identifier les niveaux de traitement bien tolérés tout en évitant d’exposer inutilement un grand nombre d’animaux à des effets indésirables. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans le respect des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) afin de concilier les objectifs scientifiques du projet avec la protection du bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris et les rats ont été choisis pour ce projet car ce sont des espèces couramment utilisées dans la recherche biomédicale, notamment pour évaluer la sécurité et la tolérance de nouveaux traitements avant leur éventuelle utilisation chez l’être humain. Les connaissances scientifiques disponibles sur ces espèces permettent de mieux interpréter les résultats obtenus et de comparer les effets observés avec ceux d’autres études. Ces animaux présentent également des caractéristiques adaptées aux objectifs du projet : leur taille permet de réaliser les administrations de substances, les suivis de l’état général et certains prélèvements nécessaires aux analyses. Ils permettent ainsi d’évaluer la manière dont un nouveau produit est toléré par un organisme vivant dans son ensemble. Les animaux utilisés seront principalement des animaux, mâles ou femelles, adultes ou ayant atteint un stade de développement suffisant pour les procédures prévues. Ce choix permet de travailler avec des animaux dont les fonctions biologiques sont suffisamment matures et de limiter les variations liées à la croissance. L’utilisation d’animaux adultes permet ainsi d’obtenir des résultats plus homogènes et plus représentatifs lors de l’évaluation de la tolérance des substances étudiées. Le choix de ces espèces et de ce stade de développement permet donc d’obtenir les informations nécessaires au développement de futurs traitements tout en utilisant des modèles adaptés aux objectifs scientifiques du projet.