Rats

Valider un appareil neuf : 48 rongeurs, 24 souris et 24 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par inhalation de CO2 à l'issue. Le premier jour, une session de 6 minutes 20 délivre un choc électrique de 0,4 mA pendant une seconde, et le lendemain deux sessions de rappel, l'une de six minutes sur le contexte, l'autre de huit minutes sur les indices, mesurent la peur conditionnée. Le porteur écrit qu'il n'existe pas de méthode de remplacement et que le conditionnement de la peur chez le rongeur est la référence pour l'étude de la mémoire aversive. Le projet vise la seule confirmation que le matériel neuf donne les mêmes réponses que celui qu'il remplace.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider le nouveau matériel en reproduisant le protocole de conditionnement de la peur chez le rat et la souris, et de confirmer que les réponses comportementales observées sont comparables à celles obtenues avec le dispositif précédent.

Bénéfices attendus

La validation du nouveau matériel permettra de s’assurer de la reproductibilité du protocole de conditionnement de la peur chez la souris et le rat, et de confirmer la comparabilité des résultats avec ceux obtenus précédemment. Elle assurera ainsi la fiabilité du nouvel équipement pour les études à venir.

Procédures

Les animaux seront soumis au test de conditionnement de la peur. Ce test comprend 3 sessions. Le premier jour, une session de 6 min 20 sec est réalisée durant laquelle un choc électrique (0.4 mA pendant 1 sec) est délivré. Le deuxième jour, 2 sessions de test sont réalisées. Une session de rappel contextuel d'une durée de 6 min a lieu le matin. Une session de rappel des indices d'une durée de 8 min a lieu l'après-midi.

Impact sur les animaux

Le protocole de conditionnement de la peur implique un stimulus aversif modéré, qui peut induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Le test ne pouvant être répété, les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 à l'issue de la procédure.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode de remplacement. Le conditionnement de la peur chez le rongeur est le modèle de référence pour l’étude de la mémoire aversive.

Réduction

La variabilité des résultats obtenus avec ce nouveau dispositif n’étant pas encore connue, ce premier jeu d’animaux permettra d’en estimer la dispersion et de définir, pour les études futures, un effectif minimal adapté aux objectifs expérimentaux.

Raffinement

L'intensité du choc est faible (0,4 mA pendant 1 s) pour limiter la douleur. Les sessions sont courtes (6-8 min). Les animaux sont habitués aux manipulateurs et à la salle, logés avec enrichissement (nids), et observés attentivement avant/après chaque session.

Choix des espèces

Ces deux espèces couvrent les modèles utilisés dans le laboratoire. La validation sur souris et rat garantit la polyvalence du nouveau matériel pour les projets futurs. Les animaux seront utilisés au stade adulte jeune. Nous les réceptionnerons à l'âge de 8 semaines et ils seront testés à l'âge de 11 semaines.

3 800 rongeurs, 3 200 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à huit prises de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à quatre-vingt-seize heures d'hébergement individuel en cage de collecte des urines et des fèces. Les molécules sont administrées par voie orale sans anesthésie, ou par injection sous anesthésie gazeuse. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le porteur présente ce travail comme une activité de plateforme, dont les résultats servent à décider de la poursuite ou de l'arrêt du développement d'une molécule.

Objectifs

Le développement d’un nouveau médicament est un processus long, qui nécessite de nombreuses étapes avant de pouvoir envisager son administration chez l’être humain. Il est notamment indispensable d’étudier son comportement dans un organisme vivant. Des équipements spécialisés permettent ainsi d’analyser comment une molécule est absorbée, distribuée dans les différents organes, transformée puis éliminée par l’organisme. Ces études permettent de déterminer si elle atteint bien les tissus ciblés, en quelle quantité, pendant combien de temps et par quelles voies elle est évacuée. Ces informations sont essentielles pour évaluer le potentiel d’une molécule innovante et accompagner son développement dans le cadre de projets de recherche scientifique et préclinique.

Bénéfices attendus

Les études menées par notre plateforme permettent de fournir des informations indispensables sur la répartition et la concentration de la molécule dans l’organisme, ainsi que sur sa persistance et ses voies d’élimination. Ces informations sont nécessaires pour évaluer la pertinence des molécules candidates et orienter la décision quant à la poursuite ou non de leur développement. D’un point de vue médical, une connaissance des paramètres de ces molécules dans des organismes vivants permettent une translation clinique de ces paramètres chez l’Homme.

Procédures

Un opérateur spécialisé réalisera une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil ou une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse. Des prises de sang(1 minute) seront réalisées : au maximum 8 sur une période de 24h par animal vigile. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant maximum 96 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et les fèces.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale, un stress lors de la prise de sang et un stress avec parfois une légère perte de poids lié à l’hébergement individuel dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et fèces.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour prélever leurs organes.

Remplacement

Bien que des études in vitro ou des études preuve de concept soient réalisées en amont pour l’ensemble des molécules, il n’est pas possible de recréer in vitro ou in silico la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu. Dans le cadre d’une application future en santé humaine, il est donc indispensable de mener une étude in vivo.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, une sélection préalable des molécules d’intérêts sera réalisée in vitro. Pour chaque molécule retenue, une seule dose sera évaluée in vivo. Cette dose sera définie à partir des paramètres pharmacologiques obtenues in vitro et des données in vivo préliminaires déjà disponibles dans la littérature. Enfin, les analyses statistiques reposeront sur un nombre minimum d’animaux. Les molécules seront évaluées chez les deux sexes avec le nombre minimum d’animaux à manipuler, soit 3 à 5 animaux par sexe.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi comprenant des maisons, des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid et des bâtonnets en bois à ronger, pendant une période d’acclimatation d’au moins sept jours. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé et habilité. Pour réduire ou supprimer le stress relatif aux administrations et aux prélèvements, ceux-ci seront réalisés dans une pièce au calme sans passage. La douleur engendrée est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H à 96H de la manipulation. Afin de détecter au plus vite tout signe de souffrance , une surveillance de leur état général et de leur comportement sera réalisée grâce à une grille de score et à l’utilisation de points limites définissant les circonstances potentielles pour lesquelles des prises en charge appropriées doivent être mises en place rapidement. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel dans les cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des organismes-modèles reconnus pour l’étude de la physiologie et de la physiopathologie de l’être humain. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, correspondant à une période où les principales fonctions physiologiques, métaboliques, rénales, cardiovasculaires et hépatiques sont matures et stabilisées. Ce stade permet d’obtenir des paramètres biologiques interprétables, tout en limitant les biais liés à la croissance, au développement postnatal ou au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes est ainsi adaptée aux objectifs du projet et cohérente avec les standards des études précliniques réalisées chez le rongeur.

Le protocole est mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client, dont la direction scientifique a validé la justification du projet, afin de trier des molécules candidates avant d'éventuels essais chez l'humain. 81 rats rendus obèses et diabétiques par une alimentation enrichie en graisses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est hébergé seul, pesé 23 fois, traité 10 fois et piqué 16 fois pour des prélèvements de sang, le porteur précisant que le rat a été préféré à la souris à cause du nombre de prélèvements et des volumes sanguins voulus. L'intérêt affiché est d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter la suite du développement aux molécules les plus prometteuses, la mise à mort finale servant des analyses pharmacocinétiques et des prélèvements d'organes.

Objectifs

Le présent projet sera mené pour le compte d’un laboratoire pharmaceutique dans le cadre d’une recherche privée. Le présent projet vise à explorer le profil pharmacologique du médicament X administrées chez le rat rendu obèse et diabétique par une alimentation enrichie en graisses, dans le but d'optimiser leur développement. La justification scientifique du projet a en outre été validée par la direction scientifique et par les chefs de projet de la société cliente.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sont positifs, les formulations du médicament X pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite autorisé à être mis sur le marché en tant que traitements anti-obésité et anti-diabétiques, et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités que le médicament actuel. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la biodistribution du médicament X pourrait également améliorer l'efficacité des traitements actuels.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (23 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des composés (10 administrations ; durée : 1 minute); 3) Prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) ; 4) Prélèvements sanguins pour analyses pharmacocinétiques (14 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) 5) Anesthésie générale avant mise à mort (durée : 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'hébergement en cage individuelle sera source de stress du fait d'un isolement partiel des animaux qui garderont néanmoins des contacts visuels et olfactifs. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements et les prélèvement d'une goutte de sang à la pointe de la queue occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des rats sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

A l'issue de l'étude, l'ensemble des animaux sera mis à mort pour des analyses pharmacocinétiques et/ou des prélèvements d'organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de rat obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 16 ou 17 animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements sera réalisée par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation d'une semaine sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages glycémiques (une seule goutte de sang prélevée en bout de queue). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des leads (molécules actives) déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de leads, permettant d'optimiser la R&D du client et de limiter le développement ultérieur aux leads présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques.

Pour vérifier chez le rat un résultat obtenu chez la souris et jugé incertain, la présence dans le rein diabétique d'une substance impliquée dans la digestion, 22 rats Sprague-Dawley mâles reçoivent une injection de streptozotocine dans la veine de la queue. Le diabète ainsi provoqué s'installe pendant huit semaines, avec augmentation de la soif, de la faim et du volume d'urine, perte de poids modérée, déshydratation, altération du pelage et baisse d'activité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois prélèvements sanguins suivent l'évolution, et deux rats ont été ajoutés au groupe traité pour absorber un décès éventuel. Tous sont tués à huit semaines pour prélever les reins et une partie de l'intestin grêle, le porteur écrivant que ces prélèvements sont "indispensables" et qu'ils ne peuvent pas être réalisés sur des rats maintenus en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets du diabète de type 1 sur le rein. Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle l’organisme ne produit plus d’insuline, ce qui entraîne une augmentation du sucre dans le sang et peut endommager plusieurs organes, notamment les reins. Les chercheurs s’intéressent ici à une substance produite naturellement par l’organisme, appelée cholécystokinine. Cette substance est normalement impliquée dans la digestion des aliments, mais des travaux récents suggèrent qu’elle pourrait aussi être présente dans le rein chez les personnes atteintes de diabète. Cependant, ces premiers résultats restent incertains et doivent être confirmés avec des méthodes plus fiables. Le projet vise donc à vérifier si cette substance est effectivement présente dans le rein en situation de diabète, et à mieux comprendre son rôle. Cela permettra de déterminer si elle participe aux mécanismes liés aux atteintes rénales observées dans cette maladie. Les premières observations ayant été réalisées chez la souris, cette étude sera menée chez le rat, un modèle bien connu et largement utilisé, permettant d’obtenir des résultats plus robustes. À terme, ces travaux pourraient améliorer les connaissances sur les complications du diabète et contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour le suivi ou le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de vérifier de manière fiable des résultats scientifiques récents suggérant qu’une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine, pourrait être présente dans le rein en cas de diabète de type 1. Les données obtenues contribueront à confirmer ou à remettre en question ces observations, et ainsi à améliorer la solidité des connaissances dans ce domaine. À plus long terme, une meilleure compréhension du rôle éventuel de cette substance dans le rein pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les complications rénales du diabète. Ces complications étant fréquentes et importantes, toute avancée dans leur compréhension est susceptible d’avoir un intérêt scientifique et médical. Les résultats de ce projet pourraient également orienter des recherches futures visant à identifier de nouveaux indicateurs biologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie, ou de nouvelles pistes d’étude pour le développement de stratégies thérapeutiques. Toutefois, ces applications potentielles nécessiteront des travaux complémentaires avant toute utilisation concrète.

Procédures

Les animaux recevront une seule injection intraveineuse à la queue (durée maximum de 3 minutes) destinée à provoquer un diabète expérimental permettant l'étude de la maladie. Ils feront ensuite l'objet de trois prélèvements sanguins (durée maximale de 1 minute par prélèvement) au cours de l'étude (après 1, 4 et 8 semaines) afin de suivre l'évolution du diabète. La durée totale de suivi sera de huit semaines.

Impact sur les animaux

L'injection destinée à induire le diabète peut entraîner une augmentation durable du taux de sucre dans le sang. Les animaux concernés peuvent présenter une augmentation de la consommation d'eau et de nourriture, une production accrue d'urine, une perte de poids modérée ainsi qu'une diminution de l'activité. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un inconfort bref au moment de leur réalisation. Une surveillance régulière est prévue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les mesures nécessaires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques, notamment les reins et une partie de l’intestin grêle. Ces prélèvements sont indispensables pour atteindre les objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisés sur des animaux maintenus en vie.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de répondre pleinement à l'objectif de cette étude. L'expression de la cholécystokinine (CCK) dans le tissu rénal doit être étudiée dans le contexte d'un organisme vivant présentant un diabète induit et conservant l'ensemble des interactions physiologiques entre le pancréas, le système endocrinien, le système cardiovasculaire, le rein et les différents mécanismes métaboliques. Des approches in vitro telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes rénaux ont été considérées. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l'état diabétique systémique ni ses conséquences endocriniennes et métaboliques complexes. Les outils de modélisation informatique disponibles ne permettent pas non plus de prédire de façon fiable les modifications de l'expression tissulaire de la CCK dans ce contexte. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum compatible avec l'obtention de résultats scientifiquement exploitables. Le projet comprend deux groupes expérimentaux : un groupe traité par streptozotocine développant un diabète (12 animaux) et un groupe contrôle (10 animaux). Le dimensionnement des groupes repose sur les données disponibles dans la publication de référence et sur l'expérience acquise avec ce modèle expérimental. Chaque animal contribue à plusieurs critères d'évaluation au cours de la même procédure (suivi glycémique, prélèvement terminal de plasma et collecte des reins), ce qui permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque individu. L’ajout de 2 animaux supplémentaires dans le groupe traité permet de s’affranchir d’un éventuel décès et de garantir la robustesse des résultats. Par ailleurs, les prélèvements terminaux permettront la valorisation maximale des tissus récoltés afin d'éviter la réalisation d'études complémentaires nécessitant de nouveaux animaux lorsque cela sera scientifiquement pertinent.

Raffinement

La durée d’acclimatation sera d’une semaine minimum. Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, avec enrichissement et manipulation selon les bonnes pratiques. Après évaluation de la douleur potentielle (paliers définis avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), une analgésie pourra être administrée si nécessaire (signes de douleur, inconfort ou absence de fèces). Une observation quotidienne de l’état général est réalisée tout au long de la procédure, avec soins adaptés en cas de signes cliniques (traitements, soins locaux, enrichissement, réhydratation, réchauffement, ajout d’aliments et/ou gels hydratants, facilitation de l’accès à l’eau). Des points limites sont définis et ajustés selon les observations, avec traçabilité via grilles de score et documents qualité. L’induction du diabète par streptozotocine peut entraîner des symptômes du diabète : hyperglycémie, polyurie (augmentation de la quantité d'urine), polydipsie (augmentation de la consommation d'eau), polyphagie (augmentation de la consommation de nourriture), perte de poids, déshydratation, altération du pelage et baisse d’activité. Les animaux diabétiques feront l’objet d’une surveillance renforcée incluant le suivi du poids, de l’hydratation, du pelage, de la mobilité, des consommations alimentaire et hydrique et de la glycémie. La fréquence des observations sera augmentée dès l’apparition de signes compatibles. Des mesures de soutien (réhydratation, aliments accessibles ou humidifiés, gels hydratants, enrichissement complémentaire) seront mises en place précocement afin de limiter l’impact du modèle et prévenir toute aggravation. Pour l’injection intraveineuse de streptozotocine, les animaux seront habitués à la manipulation via des tunnels dans la cage. L’administration sera réalisée avec un tunnel de contention adapté afin de réduire le stress. Une vasodilatation préalable par réchauffement modéré facilitera l’accès veineux et limitera les tentatives. Les injections seront effectuées par du personnel formé afin de minimiser la durée et les complications.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans l’étude du diabète, car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec certains mécanismes observés chez l’Homme pour cette maladie. De plus, ce modèle est bien connu et largement documenté, ce qui permet de comparer les résultats obtenus avec de nombreuses données scientifiques déjà disponibles. Des rats jeunes adultes seront utilisés. Les animaux seront transférés en zone d’expérimentation à l’âge de 4 semaines afin de bénéficier d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant le début de l’étude. L’induction du diabète sera réalisée à l’âge de 5 semaines, puis les animaux seront suivis pendant 8 semaines. Le choix de cet âge est directement lié aux objectifs du projet. Lorsque la substance utilisée pour induire le diabète est administrée à des animaux très jeunes, elle conduit à un modèle présentant des caractéristiques proches du diabète de type 2. En revanche, une administration réalisée à partir de 5 semaines d’âge permet d’obtenir un modèle bien caractérisé et largement utilisé du diabète de type 1, qui correspond à la maladie étudiée dans ce projet. Par ailleurs, le projet vise à étudier une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine. Chez le rat, la production de cette substance évolue fortement au cours des premières semaines de vie avant de se stabiliser. L’utilisation d’animaux âgés d’au moins 5 semaines permet donc de limiter l’influence du développement normal de l’animal sur les résultats et d’obtenir des données plus fiables concernant les effets du diabète.

340 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de quarante-cinq minutes en moyenne pour l'implantation d'un dispositif d'auto-administration de cocaïne, puis entre vingt-cinq et quatre-vingt-une séances de trois heures, cent vingt d'entre eux étant en plus opérés du cerveau pendant environ une heure. Certaines séances sont associées à de brèves expériences aversives destinées à provoquer l'arrêt de la consommation, le porteur décrivant chez le rat un sevrage "extrêmement faible". Il présente le choix du rat comme "une sorte de compromis", cette espèce étant selon lui assez proche de l'humain pour constituer un "modèle animal valide" et assez éloignée "par rapport à d'autres espèces plus sensibles" sur le plan éthique.

Objectifs

Parmis les personnes développant une addiction à la cocaine, une partie significative parvient à atteindre l’abstinence. Notamment, des événements négatifs intenses (accidents, maladies) peuvent constituer des signaux clés qui font prendre conscience aux individus qu’ils sont « allés trop loin ». Cependant, l’abstinence met du temps à s’établire et la survenue d’événements négatifs est risquée. Aussi, trouver des thérapies efficaces est nécessaire. Les objectifs de ce projet sont de modéliser l’abstinence induite par des événements négatifs et d’en étudier les bases cérébrales. Nos travaux antérieurs montrent que des rats ayant une prise soutenue de cocaine arrêtent quasi-instantanément de prendre la drogue lorsqu’elle est associée à un événement négatif. Cependant, cette abstinence est de courte durée et beaucoup de rats rechutent lorsque les conséquences négatives disparaissent. Selon des témoignages et données issus de la littérature, l’apparition cyclique de conséquences négatives aurait un effet cumulatif qui pourrait conduire à l’abstinence. Aussi, notre protocole testera l’effet de l’exposition cyclique à des conséquences négatives (1 fois tous les 10 jours) sur l’abstinence volontaire. Nous prévoyons que la majorité des rats arrivera à une abstinence durable après un maximum de 5 cycles. Une certaine variabilité est cependant attendue avec des individus atteignant l’abstinence après 1, 2, 3, 4 ou 5 cycles. Aussi, nous prélèverons les cerveaux des rats dès qu’ils présenteront une abstinence durable. L’évaluation post mortem du cerveau permettra d’identifier les zones cérébrales associées à l’abstinence volontaire dans les différents sous-groupes de rats. Après avoir isolé les régions cérébrales associées à l’abstinence volontaire, nous les activerons ou désactiverons temporairement pour confirmer leur rôle causal dans ce comportement. Afin de mieux comprendre l’engagement/désengagement progressif de ces régions avec l’abstinence, les signaux cérébraux, dans ces régions, seront également mesurée en direct durant le comportement. Enfin, pour évaluer les spécificités biologiques associées à l’abstinence, les régions cérébrales clés seront prélevées chez les différentes populations de rats pour des études biologiques approfondies.

Bénéfices attendus

Ces expériences fourniront des informations uniques sur les bases neuronales de l’abstinence de la cocaine. De plus, elles mettront en lumière les spécificités neuronales et moléculaires au moment précis où les individus développent une abstinence. A moyen terme, les résultats issus de ces expériences seront très important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques de l'addiction. En effet, ces résultats permettront d'orienter de futures études d'imagerie cérébrale chez l'humain et permettront d'affiner la compréhension des mécanismes nécessaires à la mise en place de l'abstinence.

Procédures

Etant basé sur la prise de cocaine, la totalité des animaux (n=340) sera soumise à une chirurgie permettant l'auto-administration de cocaine (45 minutes en moyenne). Les animaux seront sous anesthésie chimique et sous analgésie. De même, l'ensemble des rats sera soumis à des tests comportementaux comprenant des séances d'auto-administration de cocaine de 3 heures. Suivant les groupes et les phénotypes (rechute ou abstinence), les rats suivront entre 25 et 81 séances d'auto-administration. Certains animaux (n=120) seront égelement soumis à une chirurgie du cerveau (1 heure en moyenne). Les animaux sont sous anesthésie gazeuse et sous analgésie.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances pouvant éventuellement être attendues sont principalement celles associées aux différentes chirurgies, c'est à dire : possible risque d'inflammation ou d'infection, apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, perte des points de suture avant cicatrisation complète. Le cas échéant, les douleurs post opératoire seront minorés par des antalgiques durant quelques jours. Afin de mener à l'abstinence, certaines séances d'auto-administration seront associées à de brèves (0,5 sec) expériences aversives légèrement stressantes, mais non douloureuse, dont l'intensité ne dépassera pas le degré modéré. Avec l'abstinence, les animaux cesseront rapidement et durablement de consommer de la cocaine induisant un sevrage. Cependant, il est à noter que comme pour la majorité des psychostimulants, la cocaine entraine un sevrage extrêmement faible chez le rat.

Devenir

A l'issu de chacune des procédure, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé pour des études post mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (jeunes adultes, mâles et femelles). Ce recours à l’animal se justifie pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologique invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe de certains processus cérébraux dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou informatiques valides et réalistes permettant d’étudier les processus cérébraux avec un niveau de complexité suffisant ; 3) contrairement à la dépendance physique, l’addiction est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ; 4) Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider des mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions.

Réduction

Ce projet s'intéresse à la présence de deux sous groupe d'animaux : ceux qui s'abstiennent et ceux qui rechutent. Etant donné que tous les animaux ne montreront pas une prise stable de drogue, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 10 rats. En effet, pour que nos expériences soient concluantes sur le plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 6 individus dans chacun des sous groupes (abstinence et rechute). Par ailleurs, et si nécessaire, certains animaux qui ne montreront pas une prise stable de drogue mais qui montrent tous les signes de bonne santé, pourront être utilisés pour des tests chirurgicaux (optiminsation de certains paramètres). Dans ce cas, la procédure de chirurgie sera similaire en tous points à celle décrite dans ce projet. Ceci permettra, de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.

Raffinement

Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie chimique ou gazeuse, sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection de solution saline pour favoriser la réhydratation. Pendant une période de récupération de 7 jours les animaux sont surveillés quotidiennement pour détecter rapidement d'éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et d'y remédier rapidement. Suivant un arbre décisionnel établi, la décision de soins conservatoires sera appliquée en fonction du type et de l'intesité de l'inconfort et/ou de la douleur. Si la prise en charge ne fonctionne pas après 5 jours de traitement ou si une aggravation rapide est observée, la décision de mise à mort sera prise rapidement par le porteur du projet. Avant le début des expériences, les rats sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales afin de limiter le stress et l’anxiété. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de l’arrêt de la procédure/du test. Ces critères sont listés dans une grille d'observation ayant plusieurs niveau d'intervention selon le niveau de douleur (de léger à sévère). Ces manifestations éventuelles sont suivies quotidiennement par des méthodes non invasives.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis dans la musure où cette espèce est suffisamment proche de l’homme du point de vue de son évolution (mammifère, divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles. Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.

Modéliser la distribution et l'élimination de mélanges de PFAS dans l'organisme, pour choisir quels prélèvements pratiquer chez des travailleurs exposés : 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils reçoivent une dose orale unique par gavage, sont tondus deux fois, subissent dix prélèvements sanguins sous anesthésie locale et passent 72 heures consécutives en cage à métabolisme, puis cinq séjours de 24 heures répartis sur les 60 jours du protocole. Le porteur désigne la cage à métabolisme comme la plus grande source d'inconfort après exposition, et écrit ne pas attendre que la quantité de PFAS administrée ait une "incidence majeure sur le bien-être des animaux". Le rat est retenu parce que la ligne directrice 417 de l'OCDE le préconise, le porteur indiquant qu'il est "utilisé de manière quasi exclusive dans les études toxicologiques".

Objectifs

Les composés perfluoroalkylés et polyfluoralkylés, connus sous le nom de PFAS (ou encore « polluants éternels »), représentent une famille de composés chimiques regroupant plusieurs milliers de molécules produits par l’activité humaine. En raison des multiples liaisons carbone-fluor qui les caractérisent, les PFAS sont très stables et dotés de propriétés physico-chimiques intéressantes pour de nombreuses applications. Ils sont largement utilisés dans l’industrie pour leurs propriétés imperméables, antiadhésives et de résistance à la chaleur. À ce jour, plus de 200 applications ont été recensées pour environ 1 700 composés (fartage, cosmétiques, textiles, ustensiles de cuisine, semi-conducteurs, plastiques, batteries, dispositifs médicaux, peintures, emballages, mousse anti-incendie, pesticides, encres…). Leur persistance dans l’environnement suscite des inquiétudes quant à leur impact potentiel sur la santé humaine et les écosystèmes, ce qui fait des PFAS une préoccupation majeure en termes de pollution chimique.

Bénéfices attendus

L'étude vise à modéliser la distribution et l'élimination dans l'organisme (toxicocinétique) de mélanges de PFAS pour optimiser les stratégies de prélèvement en milieu professionnel et identifier les matrices biologiques les plus pertinentes. Elle cherche également à repérer des métabolites (exogènes et endogènes) pouvant servir de marqueurs biologiques d'exposition ou d'effets précoces liés aux poly-expositions.

Procédures

Les animaux recevront une seule fois par voie orale les produits chimiques étudiés ou le véhicule (huile végétale). Ils seront tondus 2 fois (avant l’administration orale et à la fin de l’expérimentation) afin de récupérer leurs poils. Cette opération sera réalisée par 2 opérateurs et n’excèdera pas 2 min. L’administration orale par gavage des substances se fera chez l’animal vigile et demandera une contention inférieure à 1 min. Les animaux seront placés en cage à métabolisme permettant le recueil de l’urine pendant 72 h au début de l’expérimentation et pendant 5 périodes de 24 h réparties sur la durée du projet (60 jours). Dix prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie locale, chaque prélèvement nécessitant une contention de l’animal de quelques minutes. En fin d’expérimentation, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et d’échantillons biologiques.

Impact sur les animaux

L’administration par voie orale ainsi que les prélèvements sanguins à la veine de la queue entrainent un stress physique mineur de courte durée. Le placement en cage à métabolisme (maximum 72 h consécutives) constituera la plus grande source d’inconfort post-exposition. Il n’est pas attendu que la quantité de produits administrée ait une incidence majeure sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de prélever différents organes et échantillons biologiques.

Remplacement

À ce jour, en l’absence de connaissances suffisantes, il est nécessaire d’utiliser des animaux de laboratoire pour étudier la biodistribution et l’excrétion de mélanges de PFAS. L'étude vise à modéliser la toxicocinétique de mélanges de PFAS pour optimiser les stratégies de prélèvement en milieu professionnel et identifier les matrices biologiques les plus pertinentes. Elle cherche également à repérer des métabolites (exogènes et endogènes) pouvant servir de biomarqueurs d'exposition ou d'effets précoces liés aux poly-expositions.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir interpréter les résultats obtenus. En l’absence de données de toxicocinétique pour la majorité des substances testées, des animaux des 2 sexes seront utilisés. En se basant sur la ligne directrice 417 de l’OCDE relative à la conduite des études de toxicocinétique, un minimum 4 animaux de même sexe doivent être utilisés.

Raffinement

Après une semaine d’acclimatation à l’animalerie, une technique de manipulation positive dite de « tickling » sera mise en place. Cette méthode consiste à reproduire, par des stimulations tactiles douces et répétées, les comportements de jeux sociaux entre jeunes rats. L’efficacité du tickling sera contrôlée par l’émission de vocalisation sonores mesurables associées à des états émotionnels positifs. Il sera ensuite pratiqué avant chaque manipulation des animaux pendant toute la durée du projet. Les animaux seront habitués progressivement à la préhension/contention avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à ces manipulations. Tout au long de la procédure, les animaux seront placés en groupe et de manière hebdomadaire dans une aire de jeu comportant différents enrichissements (tunnels, abris, éléments d’exploration). Cet environnement favorisant les interactions sociales, stimule l’activité exploratoire naturelle et contribue à réduire le stress lié à l’hébergement et aux manipulations expérimentales, améliorant ainsi le bien-être général des animaux. La semaine précédant l’administration orale, les animaux seront habitués en introduisant la canule de gavage vide dans l’œsophage. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé, une attention toute particulière sera portée au moment du gavage et des prélèvements sanguins.

Choix des espèces

Actuellement, peu de données toxicocinétiques sont disponibles pour les PFAS. Dans ce cas, le rat est l’espèce préconisée par la ligne directrice 417 de l’OCDE car utilisé de manière quasi exclusive dans les études toxicologiques. Des rats femelles et mâles âgés de 12 à 14 semaines au moment de l’administration orale seront utilisés, ce qui correspond à un stade adulte de développement.