Rats

312 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, deux prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie et des tests métaboliques de deux heures avec cinq prises de sang. Une partie reçoit du chlorure de lithium dans l'eau de boisson, à 600 mg/L pour les jeunes de cinq semaines et 1 200 mg/L pour les adultes de trois mois, avec des effets secondaires attendus sur le poids et le comportement. Pour 32 d'entre eux, les prélèvements sanguins répétés peuvent entraîner une perte de sang incontrôlée, une anémie ou une détresse respiratoire, risques que le porteur énonce lui-même. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement des tissus, dont les îlots pancréatiques destinés à des expériences menées hors des rats.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie très fréquente qui représente aujourd’hui un important problème de santé dans le monde. Elle apparaît lorsque le pancréas, un organe qui aide à contrôler le taux de sucre dans le sang grâce à une hormone appelée insuline, ne fonctionne plus correctement. Cette maladie touche des centaines de millions de personnes et peut entraîner de graves conséquences pour la santé, notamment des problèmes au niveau du cœur, des reins ou de la vue. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement permettant de guérir définitivement le diabète de type 2. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment cette maladie se développe afin de trouver de nouvelles solutions pour la traiter. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2, le pancréas est soumis à une inflammation chronique, c’est-à-dire une réaction de défense du corps qui dure trop longtemps et finit par endommager l’organe. Cette inflammation semble être provoquée par une présence excessive de cellules immunitaires, les cellules chargées normalement de défendre l’organisme contre les infections. Cependant, nous ne savons pas encore précisément d’où viennent ces cellules immunitaires. Nous pensons qu’elles pourraient être produites en grande quantité par la moelle osseuse, le tissu situé à l’intérieur des os qui fabrique les cellules du sang et du système immunitaire. Notre laboratoire a déjà montré que, dans le diabète, la moelle osseuse produit davantage de cellules immunitaires favorisant l’inflammation. Nous faisons donc l’hypothèse que réduire cette inflammation dans la moelle osseuse pourrait aussi diminuer l’inflammation du pancréas et ralentir sa dégradation. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’inflammation dans le pancréas et dans la moelle osseuse à l’aide de modèles de la maladie. Il vise également à tester de nouvelles approches thérapeutiques pour voir si elles permettent de limiter cette inflammation et de préserver le bon fonctionnement du pancréas. Cette étude sera réalisée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique peut améliorer l'état inflammatoire dans les deux sexes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes inflammatoires impliqués dans le diabète et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Une partie des animaux de la procédure 1 et 2 seront traités au chloride de lithium (LiCl) dans l’eau de boisson à une dose de 600mg/L (rattons de 5 semaines) et 1200mg/L (rats adultes de 3 mois). Les animaux de la procédure 1 et 2 (312 rats) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mes mesurer leur glycémie chaque semaine. Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, les rats subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute). Une fois, avant le début du traitement, et, une fois, à la fin du traitement, nous prélèverons une petite quantité de moelle osseuse chez les mêmes rats. Cette opération sera effectuée sous anesthésie générale et un anti-douleur sera injecté avant et après la procédure pour limiter au maximum la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer leur état. Certains animaux de la procédure 2 (32 rats) subiront plusieurs prélèvements d'un petit volume sanguin pour isoler leurs cellules immunitaires qui serviront à des analyses en dehors de l’animal. Ce prélèvement est réalisé sous anesthésie et dure quelques minutes. Dans cette procédure, nous prélevons du sang 2 fois au cours de toute la durée de vie de l’animal et chaque prélèvement sera espacé d’une semaine pour leur laisser le temps de se remettre totalement du geste.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 et 2, les nuisances attendues sont les potentiels effets secondaires liés au traitement (perte de poids, comportement modifié…etc.). Nous prévoyons de contrôler chaque semaine le poids, la glycémie et le comportement des animaux. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection aux cours des tests métaboliques, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. Le prélèvement de moelle osseuse peut également générer des douleurs post-opératoires. Nous utiliserons un anti-douleur pour limiter ces effets. Dans la procédure 2, les potentielles nuisances sont liées aux effets secondaires possibles lors du prélèvement de sang. Cela peut entrainer une perte de sang incontrôlée, une anémie ou encore détresse respiratoire. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés tout au long de la procédure. Nous prélèverons un petit volume sanguin et un point de compression sera réalisé jusqu’à l’arrêt du saignement. De plus, les animaux seront surveillés pendant et après la réalisation du geste pour s’assurer de leur bien-être.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque nous souhaitons étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (moelle osseuse, circulation sanguine et pancréas), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. De plus, les animaux utilisés pour les prélèvements sanguins sont les mêmes animaux utilisés pour les prélèvements d’îlots pancréatiques au vu des expériences ex vivo, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux total utilisé. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 10 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies (matériel de nidification, abris), dans des conditions contrôlées de température, d’humidité et de cycle lumineux. Un suivi hebdomadaire sera assuré afin d’évaluer leur état général (poids, glycémie, comportement, aspect du pelage, posture, mobilité). Des points limites prédéfinis permettront d’interrompre rapidement une procédure en cas de signe de souffrance excessive. De plus, une anesthésie et/ou une analgésie adaptée sera utilisée chaque fois que nécessaire. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Les rats que nous utilisons dans ce projet développent une maladie proche du diabète de type 2 observé chez l’Homme. Ils permettent d’étudier en même temps le fonctionnement du pancréas, du système immunitaire et du métabolisme, ce qui n’est pas possible avec des cellules cultivées seules. Les animaux utilisés seront de jeunes rats de 5 semaines, pas encore totalement diabétiques ainsi que des adultes de 3 mois ayant déjà bien développé le diabète. Cela nous permettra d’étudier la manière dont évolue la maladie au cours du temps et de déterminer les effets du traitement en effet préventif (avant que le diabète ne s’installe totalement) et curatif (effet du traitement sur la maladie déjà déclarée).

Jusqu'à deux injections sous-cutanées par jour, trois injections intraveineuses par semaine, et selon les protocoles une injection dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine : 1 185 souris et 1 185 rats, soit 2 370 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est provoquée par immunisation, avec des atteintes motrices progressives allant de la faiblesse de la queue à une paralysie partielle, une perte de poids et une baisse de la vision. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre la sclérose en plaques et la névrite optique qui l'accompagne. Le porteur donne d'abord des raisons anatomiques et physiologiques au recours aux rongeurs, puis indique que "les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de névrite optique chez le rongeur dans le but de tester des traitements potentiels. La névrite optique (NO) est une inflammation aiguë du nerf optique qui entraîne une altération de la transmission des signaux visuels entre la rétine et le cerveau, elle survient essentiellement chez les jeunes adultes. Les symptômes sont une perte visuelle chez le jeune adulte, des douleurs optiques modérées qui sont amplifiées par des mouvement oculaires, chez l’homme les symptômes ne touchent généralement qu’un seul œil. Dans la majorité des cas la névrite optique est une manifestation de la sclérose en plaque. C'est une maladie auto-immune inflammatoire du SNC, dans laquelle des lymphocytes T et B auto-réactifs dirigés contre des antigènes de la myéline sont activés, traversent la barrière hémato-encéphalique, et produisent une inflammation du nerf optique avec une démyélinisation prédominante. D’autres causes sont possibles comme des maladies infectieuses (virales ou bactériennes), maladies auto-immunes (lupus, sarcoïdoses), toxiques ou médicamenteuses (plomb, tabac, antibiotiques). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour le développement préclinique de candidats médicaments destinés au traitement de la sclérose en plaques (SEP) et de la névrite optique associée en reproduisant de manière concomitante l’activation immune systémique, l’inflammation du SNC, la démyélinisation et la dégénérescence axonale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer au développement de traitements thérapeutiques destinés aux maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et les névrites optiques associées, en évaluant l’efficacité de candidats dans un contexte physiopathologique complexe intégrant inflammation, démyélinisation et atteinte neuro‑axonale.

Procédures

L'induction de la pathologie se fait par injection sous-cutanée en début d'étude, accompagnée de 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile pour stimuler le système immunitaire et déclencher la maladie auto-immune. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Le nombre d’administration varie en fonction du traitement à tester et du mode d’injection, avec un maximum de 2 injections par jour en sous cutané, une administration orale ou intrapéritonéale par jour ou de 3 injections intraveineuses par semaine. Si le produit doit être administré par injection au niveau de l’œil, l’animal sera anesthésié de façon générale et locale. La fréquence sera plus limitée, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle d’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale (EAE) et à l’évolution de la maladie. L’induction par immunisation induit un inconfort transitoire lié aux injections avec une réaction inflammatoire locale modérée au site d’injection. Au cours du développement de l’EAE, les animaux vont présenter des altérations motrices progressives, pouvant aller d’une faiblesse de la queue ou des membres postérieurs à une paralysie partielle, évaluée quotidiennement par un score clinique standardisé. Une diminution de l’activité spontanée et de la mobilité est observée, ainsi qu’une perte de poids liée à l’inflammation systémique et à la diminution de l’activité. La sévérité du projet est classée modérée, des points limites (score moteur, altération de l’état général, perte de poids excessive) permettront d’éviter l’apparition de cas sévères. Les animaux auront également une altération de la vision, d'après notre expérience pour d'autres modèles expérimentaux, les rongeurs qui ont une baisse de la vision, ont un comportement comparable aux animaux naifs, en terme de mobilité dans la cage, acces à la nourriture et l'eau.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procedure pour réaliser des évaluation ex vivo des tissus, histologie, immuno marquage, dosage de biomarqueurs.

Remplacement

L’étude de la pathologie et des effets de potentiels traitements nécessitent l’analyse intégrée et dynamique des interactions entre le système immunitaire, le système nerveux central, la barrière hémato‑encéphalique et les cellules gliales, ainsi que l’évaluation de conséquences fonctionnelles et structurelles au niveau du nerf optique et de la rétine. À ce jour, aucune méthode alternative non animale (modèles in vitro, ex vivo, organoïdes, approches in silico) ne permet de reproduire la complexité de la réponse auto‑immune systémique impliquée dans l’EAE, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central, la démyélinisation inflammatoire in vivo, ni l’évolution temporelle des atteintes neuro‑axonales et visuelles. Les approches in vitro et ex vivo disponibles sont utiles pour l’étude de mécanismes cellulaires isolés ou pour le criblage préliminaire de composés, mais ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale et la tolérance d’un candidat médicament dans un contexte physiopathologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse de puissance, sera systématiquement réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Un test statistique sera utilisé pour conclure sur la significativité des résultats. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. L’induction de l’EAE repose sur un protocole standardisé et maîtrisé, largement validé dans la littérature et par l’expérience de l’équipe, afin de limiter la variabilité et la sévérité excessive du modèle. L’accès facilité à l’eau et à la nourriture sera facilité pour les animaux présentant des troubles moteurs (abreuvoirs et nourriture placés à hauteur accessible). La durée d’exposition à la maladie est strictement limitée aux temps nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques. Des points limites précoces et clairement définis sont appliqués (score moteur élevé, perte de poids excessive, altération marquée de l’état général). En cas d’atteinte sévère ou de dépassement des points limites, une mise à mort anticipée est réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs qui seront dejà formés aux techniques de manipulations, d'injections ou d'administration de substances avant d'intervenir sur le projet, ainsi qu' à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, dans le contexte de l’étude de névrite optique. Les rongeurs sont bien caractérisés pour l’étude de l’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale modèle de référence des maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central. Les mécanismes d’inflammation du système nerveux central, la démyélinisation et l’atteinte axonale secondaire du nerf optique est bien documentée. Les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat. Les rongeurs sont adaptés aux administrations systémiques, péri-oculaires et intra-oculaires, potentiellement utilisées dans les tests d’efficacité de traitement. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes. Les publications indiquent un âge de 8 à 10 semaines pour les souris et 8 à 12 semaines pour les rats au moment de l’induction. Le système immunitaire est alors pleinement mature pour obtenir une induction fiable et reproductible. Le système nerveux central est complètement développé et permet d’étudier la démyélinisation, d’inflammation et d’atteinte neuro‑axonale au niveau du nerf optique, de la rétine et de la moelle épinière. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils portent une altération génétique qui supprime la calpaïne-3, une protéine musculaire absente dans une forme de dystrophie des ceintures, et reçoivent des molécules par voie orale ou par injection dans l'abdomen jusqu'à cinq fois par semaine, avec des prélèvements sanguins et des tests fonctionnels qui peuvent léser leurs griffes. Les bénéfices médicaux annoncés, ralentir la maladie et préserver la force musculaire, sont renvoyés au conditionnel et au long terme, quand l'objectif immédiat reste d'identifier quels points du fonctionnement des mitochondries cibler. Sur le remplacement, le porteur explique que la calpaïne-3 n'apparaît qu'à un stade tardif de la maturation des cellules musculaires et qu'aucune culture cellulaire disponible ne reproduit correctement cette apparition tardive.

Objectifs

Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont des maladies génétiques qui touchent surtout les muscles proches du tronc, comme ceux des hanches et des épaules. Elles entraînent une fragilisation progressive des muscles, ce qui peut provoquer une diminution de la force et des difficultés à marcher, se lever ou lever les bras. Selon les familles, la maladie peut se transmettre de différentes façons : parfois un seul parent porteur du gène suffit à transmettre la maladie (forme dite « dominante »), et parfois il faut que les deux parents transmettent chacun une copie du gène modifié (forme dite « récessive »). Dans notre laboratoire, nous étudions notamment la LGMD R1, une forme liée à des anomalies d’un gène appelé CAPN3. Ce gène permet normalement de produire une protéine présente dans le muscle (la calpaïne-3). Quand cette protéine manque ou fonctionne mal, la maladie apparaît, mais les mécanismes exacts qui expliquent comment cela abîme le muscle ne sont pas encore totalement compris. Plusieurs observations réalisées à partir d’échantillons de muscle de patients suggèrent cependant que les mitochondries pourraient être impliquées. Les mitochondries sont des structures présentes dans les cellules, souvent décrites comme des « centrales énergétiques », car elles aident à produire l’énergie nécessaire au bon fonctionnement du muscle. Pour mieux comprendre la maladie et tester des pistes de traitement, un modèle de rat dépourvu de calpaïne-3 (appelé rat C3) a été développé au laboratoire. De manière intéressante, ce modèle présente des anomalies des mitochondries comparables à celles observées chez les patients : leur structure et leur fonctionnement sont altérés. L’objectif final de ce projet est de déterminer si des stratégies visant à améliorer le fonctionnement des mitochondries peuvent apporter un bénéfice thérapeutique en cas de déficit en calpaïne-3. Le projet se déroulera en deux étapes : 1) D’abord, identifier précisément quels « points d’action » dans le fonctionnement des mitochondries seraient les plus utiles à cibler pour améliorer la situation ; 2) Ensuite, tester des molécules connues, déjà autorisées chez l’être humain, et qui agissent sur ces points, afin d’identifier celles qui montrent un effet bénéfique dans le modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment un mauvais fonctionnement des mitochondries peut contribuer à la faiblesse et à la dégradation des muscles dans certaines dystrophies musculaires. Les mitochondries sont de petites structures présentes dans les cellules, souvent comparées à des « centrales énergétiques », car elles produisent l’énergie dont le muscle a besoin pour fonctionner. Les bénéfices attendus sont de deux ordres. D’une part, sur le plan de la recherche, ce travail apportera de nouvelles connaissances sur la façon dont les mitochondries s’adaptent et se régulent dans un muscle malade. D’autre part, sur le plan médical, il aidera à repérer des cibles thérapeutiques pertinentes et à évaluer des traitements potentiels, y compris des molécules déjà autorisées chez l’être humain. À terme, les résultats pourront guider le développement de traitements visant à préserver la force et la fonction musculaires, à ralentir l’évolution de la maladie et, ainsi, à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de dystrophies musculaires

Procédures

Des injections sont réalisées par voie intra-veineuse une seule fois dans la durée de l’étude en moins de 5 minutes sur animaux vigiles. L’administration des molécules se fait soit par injection intra-péritonéale sur animaux vigile (durée d’injection : 1 minute) ou par voie orale (durée d’administration 2 à 5 minutes), maximum 5 fois par semaine

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés aux manipulations, aux injections, aux administrations répétées de molécules, aux prélèvements sanguins et aux tests fonctionnels. Ils peuvent se traduire par un stress transitoire lié à la contention, une douleur de courte durée au site d’injection ou de prélèvement, ainsi qu’un risque limité d’irritation locale. L’administration répétée de molécules par voie orale ou par injection peut également être source d’inconfort. Les tests fonctionnels peuvent exceptionnellement entraîner des lésions locales mineures au niveau des griffes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser des prélèvements d’organes et de muscles.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet sont limitées aux questions qui nécessitent d’observer le muscle dans son environnement réel, avec ses tissus, sa vascularisation, ses interactions biologiques et sa fonction. Ces éléments sont essentiels pour comprendre la maladie et évaluer l’effet d’un traitement, et ils ne peuvent pas être reproduits de manière fiable avec les modèles alternatifs disponibles. Par ailleurs, la calpaïne 3 n’apparaît qu’à un stade tardif de la maturation des cellules musculaires. À ce jour, nous ne disposons pas d’un modèle in vitro qui reproduise correctement cette expression tardive. Il n’est donc pas possible, à ce stade, d’étudier de façon pertinente les conséquences d’un déficit en calpaïne 3 uniquement sur des cellules en culture.

Réduction

Le choix des gènes et des molécules étudiés dans ce projet repose sur une analyse approfondie de données scientifiques déjà publiées, ainsi que sur l’exploitation de bases de données existantes et d’analyses informatiques. Cette démarche permet de formuler des hypothèses solides avant de commencer les expérimentations et d’éviter de tester un trop grand nombre de pistes de manière exploratoire. Grâce à ce travail préparatoire, seules les pistes les plus pertinentes sont retenues pour être étudiées chez l’animal. Cette stratégie permet de limiter au maximum le nombre de gènes et de molécules à évaluer et contribue ainsi à réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet. Le nombre d’animaux par groupe a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux possible. Pour évaluer l’efficacité des approches testées, un indicateur précis de l’atteinte musculaire est utilisé. Les données déjà disponibles montrent que ce paramètre est mesurable de manière reproductible dans le modèle étudié. Les calculs statistiques réalisés indiquent qu’un petit nombre d’animaux par groupe est suffisant pour détecter une amélioration significative de cet indicateur. Les groupes contrôles sont partagés entre plusieurs expériences lorsque cela est possible, afin de limiter encore le nombre total d’animaux utilisés

Raffinement

Les animaux sont suivis tout au long de l’étude : ils sont observés au minimum une fois par semaine et lors des pesées ainsi qu’à chaque administration. En cas d’administration répétée, de perte de poids, d’altération de l’état général ou de signe clinique, la surveillance est renforcée jusqu’à deux fois par jour. Le poids sert notamment à ajuster la quantité de produit administrée. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Pour les administrations sur animaux vigiles, une contention douce et adaptée est utilisée pour limiter le stress et les mouvements, ces administrations peuvent nécessiter une phase d’habituation. Les prélèvements sanguins sont réalisés en privilégiant une technique rapide et la moins contraignante possible (moins de 5 minutes). Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer leur confort. Par exemple, lors des anesthésies, un gel protecteur pour les yeux est appliqué afin d’éviter le dessèchement des tissus. En cas de difficulté à s’alimenter, la nourriture est placée au sol facilement accessible. Enfin, des « points limites cliniques » (critères d’arrêt) sont appliqués grâce à une grille d’évaluation : si un animal présente des signes indiquant qu’il pourrait souffrir ou se dégrader, des mesures appropriées sont prises sans attendre.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons un modèle de rat appelé « rat C3 ». Ce modèle a été développé et bien décrit dans notre laboratoire. Il présente notamment des anomalies au niveau des mitochondries, de petites structures des cellules qui participent à la production d’énergie. Ce modèle est donc particulièrement adapté pour étudier le rôle des mitochondries dans la maladie et mieux comprendre leur implication dans la dystrophie musculaire des ceintures de type LGMDR1 Dans cette étude, les animaux seront inclus lorsqu’ils sont de jeunes adultes. À partir du sevrage, leurs muscles ont une taille et un fonctionnement suffisamment établis pour permettre des mesures fiables. Cela rend possible l’évaluation de l’impact du fonctionnement des mitochondries sur les muscles squelettiques, dans des conditions proches de la physiologie normale

Pour tester des molécules et des dispositifs censés accélérer la cicatrisation des plaies chroniques, 3 870 individus vont être utilisés, 1 770 souris, 1 960 rats et 140 lapins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvements. Après des plaies ou des brûlures pratiquées sur le dos, un aimant implanté sous la peau permet de provoquer une ischémie d'une à deux heures suivie d'une reperfusion, jusqu'à trois cycles par jour pendant cinq jours, puis un cycle quotidien jusqu'au quatorzième jour. Les changements de pansement se font sous anesthésie tous les deux jours, dix à onze séances sur trois semaines, et chez les lapins une incision à la base de l'oreille permet la ligature de deux artères et une dénervation locale avant que quatre à six plaies soient réalisées. Le porteur énumère les méthodes de remplacement dont il dispose, cultures de kératinocytes, peau reconstruite en trois dimensions, organoïdes, organ-on-chip, précise qu'elles serviront en amont à sélectionner les molécules candidates, et conclut que "l'utilisation d'animaux vivants reste indispensable".

Objectifs

Les plaies cutanées aiguës et chroniques représentent un enjeu majeur de santé publique, en raison de leur prévalence élevée, de leur impact sur la qualité de vie et du coût important de leur prise en charge. Les plaies chroniques, telles que les ulcères diabétiques, les escarres ou les ulcères vasculaires, se caractérisent par un défaut de cicatrisation lié à des altérations complexes des processus biologiques, incluant une inflammation persistante, une hypoxie tissulaire, une altération de la vascularisation et, dans certains cas, une atteinte nerveuse locale. Malgré les progrès réalisés, les options thérapeutiques disponibles restent limitées et souvent insuffisantes, avec des taux d’échec élevés et des délais de cicatrisation prolongés. Dans ce contexte, le développement de nouvelles approches thérapeutiques, qu’il s’agisse de médicaments, de biomatériaux ou de stratégies innovantes, constitue un besoin important de recherche et développement. L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées à améliorer la cicatrisation cutanée dans des contextes physiopathologiques variés, incluant des conditions normales, ischémiques, inflammatoires et neuro-ischémiques. Pour répondre à cet objectif, plusieurs modèles animaux complémentaires sont mis en œuvre chez la souris, le rat et le lapin, permettant de couvrir un large spectre de situations cliniques et de niveaux de complexité biologique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent à la fois l’avancée des connaissances scientifiques sur les mécanismes de cicatrisation et le développement de nouvelles solutions thérapeutiques pour l’Humain, en particulier dans le domaine des plaies chroniques pour lesquelles les options actuelles restent limitées. À court terme, le projet permettra d’identifier et de caractériser de nouvelles molécules et dispositifs médicaux capables d’améliorer la cicatrisation cutanée dans différents contextes physiopathologiques, notamment en conditions d’ischémie, de reperfusion, d’inflammation ou de dénervation. L’utilisation de modèles animaux complémentaires permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces candidats thérapeutiques, en analysant leurs effets sur l’inflammation, la vascularisation, la régénération tissulaire et la perfusion. Le projet générera également des données robustes sur l’efficacité comparative de différentes stratégies d’administration (topique, systémique, locale) et sur leur tolérance. Ces résultats contribueront à la sélection des candidats les plus prometteurs pour une poursuite du développement préclinique et réglementaire. À long terme, ce projet vise à favoriser l’émergence de nouvelles thérapies innovantes pour le traitement des plaies chroniques chez l’Humain, telles que les ulcères diabétiques, les escarres ou les plaies ischémiques. Les molécules et dispositifs médicaux validés dans ce cadre pourraient conduire à des traitements plus efficaces, réduisant les délais de cicatrisation, les complications infectieuses et le recours à des interventions lourdes (amputations, chirurgies). Cela pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients, tout en diminuant les coûts de prise en charge pour les systèmes de santé. Enfin, les connaissances générées sur les mécanismes de cicatrisation dans des conditions pathologiques complexes contribueront à orienter le développement futur de thérapies ciblées et personnalisées.

Procédures

Les animaux sont opérés sous anesthésie générale. La zone dorsale est tondue, dépilée et désinfectée, puis 1–2 plaies cutanées sont réalisées chez la souris et jusqu’à 4 chez le rat ou 2 à 4 brûlures sont induites (~6 min). Un splint (anneau en plastique) peut être suturé et un pansement appliqué. L’intervention dure ~20 min. Une analgésie sous-cutanée est administrée 2 fois/jour pendant 48 h (< 1 min/injection). Un pansement est posé pour les brûlures du 3e degré. Un aimant est implanté sous la peau pour induire des cycles d’ischémie/reperfusion. Pendant 5 jours, un aimant externe provoque une ischémie de 1–2 h suivie d’une reperfusion de 2–4 h (jusqu’à 3 cycles/jour). Puis, jusqu’au jour 14, un cycle quotidien d’ischémie de 1–2 h est réalisé. Tous les 2 jours, les animaux sont anesthésiés pour le changement de pansement, l’examen clinique, les photographies et le nettoyage des plaies (10–11 séances sur 3 semaines, 8–12 min chacune). Une imagerie de fluorescence et/ou Doppler laser est réalisée 1 fois/semaine (≤3 sessions). Des prélèvements sanguins hebdomadaires sont effectués sous anesthésie (~5 min). Chez le lapin, après pré-anesthésie (20–30 min), une anesthésie injectable est induite. Une incision à la base de l’oreille permet la ligature de deux artères (ischémie partielle) et une dénervation locale. L’incision est suturée et 4 à 6 plaies sont réalisées (~20 min). Une collerette est portée jusqu’à 10 jours, avec pansements quotidiens. Le suivi dure jusqu’à 28 jours avec évaluations 3 fois/semaine (~10 min) et une imagerie Doppler hebdomadaire sous anesthésie légère (~30 min). Les animaux seront soumis traités selon les voies d’administrations suivantes :voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse caudale jusqu’à 1 fois/jour pendant 3 semaines ; voie topique tous les 2 jours sous anesthésie légère (10–11 applications) ; voie sous-cutanée périlésionnelle ponctuelle (≤4 sites). Chaque administration dure < 2 min.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales impliquent l’induction de plaies cutanées (excisionnelles ou par brûlure), des interventions chirurgicales (ischémie, neuro-ischémie) et des manipulations répétées, susceptibles d’entraîner des nuisances transitoires chez les animaux. Une douleur post-opératoire est attendue après l’induction des plaies et les gestes chirurgicaux, notamment dans les modèles de brûlures et de neuro-ischémie. Cette douleur est généralement modérée à aiguë dans les premières 24 à 72 heures, puis décroît progressivement avec la cicatrisation et la mise en place d’une analgésie adaptée. Une gêne locale liée aux plaies (inflammation, œdème, sensibilité) peut persister pendant plusieurs jours à semaines, en fonction du modèle et de la profondeur des lésions. Une perte de poids transitoire peut être observée dans les jours suivant l’intervention, liée au stress, à la douleur ou à une diminution de la prise alimentaire. Cette perte reste généralement limitée et réversible en quelques jours avec une prise en charge adaptée. Une diminution temporaire de l’activité ou une mobilité réduite peuvent également être observées, en particulier après les procédures chirurgicales ou en présence de lésions douloureuses. Les manipulations répétées, incluant les anesthésies, les soins de plaies et les administrations de traitements, peuvent générer un stress modéré, bien que celui-ci soit limité par l’utilisation d’anesthésies adaptées et de techniques de contention minimisées. Dans certains cas, des comportements anormaux tels que le léchage ou le grattage des plaies peuvent survenir, nécessitant la mise en place de dispositifs de protection (pansements, collerettes). Dans les modèles d’ischémie ou de neuro-ischémie, des complications locales peuvent apparaître, telles qu’une cicatrisation retardée, une nécrose partielle ou une altération de la perfusion tissulaire, pouvant s’étendre sur plusieurs jours à semaines. De rares signes généraux, tels qu’une hypothermie ou une altération de l’état général, peuvent également survenir. L’ensemble de ces effets indésirables est encadré par une surveillance quotidienne et des mesures d’analgésie et de soins adaptées, permettant de limiter leur intensité et leur durée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car des prélèvement seront réalisés.

Remplacement

La stratégie de remplacement a été soigneusement évaluée en amont du projet. Des approches alternatives non animales existent dans le domaine de la cicatrisation cutanée, telles que les cultures cellulaires (kératinocytes, fibroblastes), les modèles 3D de peau reconstruite, les organoïdes ou encore les dispositifs « organ-on-chip ». Ces systèmes permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires et moléculaires, ainsi que le criblage préliminaire de composés. Ils seront utilisés en amont pour sélectionner et caractériser les molécules candidates. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme vivant, notamment les interactions dynamiques entre vascularisation, inflammation, système immunitaire, innervation et remodelage tissulaire, qui sont essentielles dans les processus de cicatrisation normale et pathologique, en particulier en conditions d’ischémie ou de neuro-ischémie. De plus, l’évaluation de dispositifs médicaux, de voies d’administration (topique, systémique) et de la pharmacocinétique/pharmacodynamie nécessite un organisme intégré. Ainsi, l’utilisation d’animaux vivants reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet, qui visent à évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles molécules et dispositifs dans des conditions physiopathologiques proches de l’Homme. Les modèles animaux sélectionnés permettent d’intégrer l’ensemble des paramètres biologiques impliqués et de générer des données translationelles robustes, non accessibles par des méthodes alternatives à ce jour.

Réduction

La stratégie de réduction du nombre d’animaux s’inscrit pleinement dans le principe énoncé au 2° de l’article R-214- 105 du code rural et de la pêche maritime, visant à utiliser le nombre minimal d’animaux compatible avec des résultats scientifiquement valides et robustes. Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base d’une analyse de puissance statistique intégrant une variabilité attendue de 25 à 30 %, une différence minimale détectable de 20 à 30 % entre groupes et une puissance d’environ 70 %, conduisant à des effectifs réduits, notamment grâce à des mesures répétées sur un même animal. Plusieurs approches sont mises en œuvre pour limiter le nombre d’animaux. Chaque animal constitue sa propre référence interne lorsque cela est possible, par exemple via des comparaisons intra-individuelles entre zones traitées et témoins, ce qui réduit significativement la taille des groupes. Le recours à des études pilotes permet d’optimiser les conditions expérimentales et d’éviter la mise en œuvre d’études de plus grande envergure non informatives. L’utilisation d’imagerie non invasive, incluant le suivi photographique longitudinal, l’imagerie de fluorescence et le Laser Doppler, permet de réaliser des mesures répétées dans le temps chez les mêmes individus, réduisant ainsi le besoin en animaux supplémentaires. Des approches de modélisation et des tests in vitro sont utilisés en amont pour sélectionner les candidats les plus prometteurs et limiter les essais in vivo. Le partage et la valorisation des tissus prélevés pour des analyses multiples maximisent l’information obtenue par animal. Les plans expérimentaux sont conçus selon des schémas randomisés avec groupes parallèles limités au strict nécessaire. Les analyses statistiques reposent sur des tests adaptés aux donnéespermettant une exploitation optimale des données tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La stratégie de raffinement appliquée dans ce projet s’inscrit dans le principe défini au 2° de l’article R.214-105 du code rural et de la pêche maritime et vise à réduire au maximum la douleur, la souffrance, l’angoisse et les dommages durables infligés aux animaux, tout en garantissant la qualité scientifique des données. Les procédures sont réalisées sous anesthésie générale adaptée à chaque espèce, avec une prémédication permettant de réduire le stress, potentialiser les agents anesthésiques et limiter les sécrétions. Une analgésie multimodale est mise en place de manière préventive et curative, incluant opioïdes, anti-inflammatoires et anesthésiques locaux, avec réévaluation régulière et ajustement si nécessaire. Des soins post-opératoires rigoureux sont assurés, incluant surveillance rapprochée, maintien de la température corporelle, hydratation, nettoyage des plaies et renouvellement des pansements. Des dispositifs de protection (pansements, collerettes souples) sont utilisés pour prévenir l’auto-mutilation. Une surveillance clinique quotidienne, voire biquotidienne en phase aiguë, permet de détecter précocement tout signe de douleur ou de détresse, sur la base de scores incluant comportement, posture, prise alimentaire, état des plaies et poids corporel. Des points limites prédéfinis, précoces et prédictifs, sont appliqués afin d’intervenir rapidement ou d’euthanasier l’animal si nécessaire. Les conditions d’hébergement sont optimisées avec enrichissement du milieu (abris, matériaux de nidification, objets manipulables), limitation du stress social et adaptation des manipulations. Une habituation progressive des animaux aux manipulations est réalisée lorsque possible afin de réduire l’anxiété. Le recours à des techniques d’imagerie non invasive, telles que le suivi photographique, l’imagerie de fluorescence ou le Laser Doppler, permet un suivi longitudinal des animaux sans procédures invasives répétées, réduisant ainsi les nuisances et le nombre d’interventions. Enfin, un processus d’amélioration continue est mis en place tout au long du projet, intégrant les retours d’expérience, les recommandations de la littérature scientifique et les échanges avec le vétérinaire et la structure du bien-être animal. Toute nouvelle technique validée permettant de réduire l’impact des procédures (nouveaux protocoles analgésiques, méthodes d’imagerie, conditions d’hébergement) sera intégrée de manière proactive afin d’améliorer en continu le niveau de raffinement.

Choix des espèces

Les espèces choisies (souris, rats et lapins) sont complémentaires et adaptées aux objectifs du projet. Les rongeurs permettent un criblage rapide, reproductible et bien caractérisé des mécanismes de cicatrisation et des effets pharmacologiques, avec de nombreux outils biologiques disponibles. Le rat offre une taille compatible avec des procédures plus techniques et des suivis répétés. Le lapin présente une peau, une vascularisation et une cicatrisation plus proches de l’Homme, particulièrement pertinentes pour les modèles d’ischémie et de neuro-ischémie ainsi que pour l’évaluation de dispositifs médicaux. Cette approche multi-espèces permet d’optimiser la transposabilité des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux de plus grande taille aux étapes nécessaires. Chez la souris, les animaux utilisés seront des adultes jeunes, âgés de 5 à 12 semaines au moment des procédures. Ce stade correspond à un organisme mature avec un système immunitaire et des capacités de cicatrisation pleinement fonctionnels, tout en limitant la variabilité liée au vieillissement. L’utilisation d’animaux adultes permet également une meilleure reproductibilité des modèles de cicatrisation et une comparaison pertinente avec des données de la littérature. Les stades fœtaux, nouveau-nés ou non sevrés ne sont pas adaptés aux procédures prévues, notamment en raison de leur fragilité et de l’immaturité des systèmes physiologiques impliqués. Chez le rat, les animaux seront également utilisés au stade adulte jeune, généralement entre 5 et 12 semaines. Ce choix permet la réalisation de procédures techniques (chirurgie, suivis répétés, imagerie) dans des conditions optimales, grâce à une taille corporelle suffisante et une physiologie stabilisée. Comme pour la souris, ce stade garantit une réponse inflammatoire et une cicatrisation représentatives, tout en évitant les biais liés au développement ou au vieillissement. Chez le lapin, des animaux adultes seront utilisés, âgés de 6 à 12 semaines. Ce stade est choisi pour assurer une taille et une anatomie compatibles avec les procédures de neuro-ischémie auriculaire et les prélèvements répétés. Il permet également d’obtenir une cicatrisation cutanée et une vascularisation proches de celles observées chez l’Homme, renforçant la pertinence translationnelle du modèle. Les stades précoces ne sont pas retenus en raison de contraintes techniques et physiologiques incompatibles avec les objectifs du projet.

Perte de poids excessive, incapacité fonctionnelle ou douleur persistante non soulagée déclenchent l'arrêt de l'expérience et la mise à mort anticipée. 1 050 rongeurs, 525 souris et 525 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue par prélèvement intracardiaque sous anesthésie profonde. Une lésion du genou leur est infligée sous anesthésie générale, par voie mécanique, par collagénase ou par arthrite infectieuse, puis viennent jusqu'à douze semaines d'administrations répétées, deux sessions d'imagerie toutes les deux semaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires. Les traitements testés visent à protéger ou réparer le cartilage, et le porteur revendique une réduction des effectifs par le suivi d'un même rongeur dans le temps, sans donner le chiffre auquel cette réduction se compare.

Objectifs

Les l?sions du cartilage articulaire repr?sentent une probl?matique majeure en m?decine r?g?n?rative et en rhumatologie, en raison de la faible capacit? de r?paration intrins?que de ce tissu. L?alt?ration progressive ou aigu? du cartilage peut conduire ? une perte de fonction articulaire, ? la douleur chronique et, ? terme, ? l?arthrose. ? ce jour, les options th?rapeutiques disponibles restent essentiellement symptomatiques ou palliatives et ne permettent pas de restaurer de mani?re durable l?int?grit? structurelle et fonctionnelle du cartilage. Les traitements actuels soulagent les sympt?mes mais ne r?parent pas le cartilage. Ce projet teste, chez la souris et le rat, de nouveaux traitements dans trois situations : une atteinte du cartilage due ? une blessure, une atteinte due ? une infection de l'articulation ou une usure progressive du cartilage.

Bénéfices attendus

Les l?sions du cartilage articulaire repr?sentent un enjeu majeur de sant? publique en raison de leur fr?quence, de leur ?volution souvent irr?versible et de l?absence de traitements r?ellement r?parateurs. Aujourd'hui, les traitements disponibles ne font que soulager la douleur sans r?parer l'articulation. Ce projet cherche des traitements capables de prot?ger ou r?parer le cartilage. Nous testerons plusieurs m?dicaments, et diff?rentes fa?ons de les pr?parer et de les administrer, pour trouver ceux qui agissent le plus efficacement. Les r?sultats pourraient d?boucher sur de nouveaux traitements pour les maladies articulaires.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis ? plusieurs types d?interventions exp?rimentales r?p?t?es et compl?mentaires, r?alis?es sur souris et rats et r?parties sur une dur?e maximale de 12 semaines. Les trois proc?dures reposent sur des interventions intra-articulaires r?alis?es au niveau d?un genou sous anesth?sie g?n?rale. Elles comprennent une unique induction de l?sion au niveau du genou (dur?e totale de 15 minutes maximum). Au cours de l??tude, les animaux recevront des administrations r?p?t?es de compos?s exp?rimentaux via diff?rentes voies. Ces administrations peuvent ?tre quotidiennes ou espac?es selon les sch?mas exp?rimentaux, sur toute la dur?e du suivi (jusqu?? 12 semaines). Une imagerie de fluorescence sera r?alis?e de mani?re r?p?t?e, ? raison de deux sessions toutes les 2 semaines, sous anesth?sie. Ces sessions permettent le suivi de la r?paration tissulaire et de l'?volution du mod?le. Chaque session implique une br?ve anesth?sie g?n?rale. Les animaux feront l?objet de pr?l?vements sanguins hebdomadaires sous anesth?sie respectant les conditions physiologiques et le bien ?tre animal. Ces pr?l?vements sont effectu?s ? intervalles r?guliers sur toute la dur?e exp?rimentale. Enfin, ? l?issue de l??tude, les animaux seront soumis ? un pr?l?vement terminal intracardiaque r?alis? sous anesth?sie profonde, imm?diatement suivi de la mise ? mort conform?ment aux proc?dures r?glementaires. L?ensemble des proc?dures est r?alis? sous anesth?sie et analg?sie appropri?es afin de limiter toute douleur, souffrance ou d?tresse.

Impact sur les animaux

Les proc?dures de ce projet peuvent induire des effets ind?sirables li?s aux mod?les de l?sions articulaires. Les animaux peuvent pr?senter une douleur post-proc?dure l?g?re ? mod?r?e, surtout en phase aigu?. Cette phase aigu? est g?n?ralement limit?e aux premiers jours. Une diminution temporaire de la mobilit? articulaire et de l?activit? spontan?e est attendue, principalement durant les premiers jours, avec une am?lioration progressive au cours de la premi?re semaine. Les animaux peuvent pr?senter un gonflement articulaire, une mobilit? r?duite et une diminution de la prise alimentaire. Une alt?ration de l??tat g?n?ral, incluant perte de poids et baisse d?activit?, peut survenir. Une surveillance rapproch?e permet de d?tecter toute aggravation. Des crit?res d?arr?t pr?d?finis sont appliqu?s afin de pr?venir toute souffrance prolong?e, notamment en cas de perte de poids excessive, d?incapacit? fonctionnelle ou de douleur persistante non soulag?e.

Devenir

L'ensemble des animaux utilis?s seront mis ? mort ? l'issue des proc?dures de ce projet.

Remplacement

La strat?gie de remplacement a ?t? int?gr?e ? la conception du projet, conform?ment au principe des 3Rs. Malgr? une analyse approfondie des alternatives, l?utilisation d?animaux reste n?cessaire en raison de la complexit? des pathologies ?tudi?es et du besoin d??valuer des r?ponses biologiques int?gr?es ? l??chelle de l?articulation, notamment les interactions entre le cartilage et les tissus peri-articulaires ainsi que les ph?nom?nes inflammatoires, immunitaires, le remodelage osseux et la r?paration tissulaire. Les m?thodes alternatives sont utilis?es en amont pour optimiser la s?lection des candidats et r?duire le recours ? l'animal : cultures de chondrocytes et d'explants cartilagineux, mod?les 3D/organo?des articulaires et tests de cytotoxicit? pour le criblage pr?liminaire des mol?cules et des doses ; exploitation des donn?es bibliographiques et in silico pour hi?rarchiser les hypoth?ses. Cependant, ces mod?les pr?sentent des limites importantes : ils ne reproduisent pas la complexit? des interactions entre cartilage, synovie et os sous-chondral, ni les contraintes m?caniques, la vascularisation ou les r?ponses immunitaires et inflammatoires syst?miques. Ils ne permettent pas non plus d??valuer de mani?re fiable la dynamique globale de d?gradation et de r?paration du cartilage. Les objectifs du projet n?cessitent l??tude de strat?gies th?rapeutiques dans des mod?les int?gr?s de l?sion m?canique, d?arthrite infectieuse et de d?gradation enzymatique. Ces situations impliquent des interactions tissulaires et immunitaires complexes ainsi que des r?ponses locales et syst?miques qui ne peuvent ?tre reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? d?termin? par des analyses de puissance bas?es sur la litt?rature et des donn?es internes, en tenant compte de la variabilit? des mod?les. Plusieurs mesures sont mises en ?uvre pour limiter les effectifs. Une phase pilote permet de valider les mod?les et d?affiner les param?tres exp?rimentaux, r?duisant les r?p?titions inutiles. L?imagerie in vivo constitue un levier majeur de r?duction. Des techniques non invasives (fluorescence ciblant le cartilage ou l?inflammation, bioluminescence bact?rienne) permettent un suivi longitudinal des l?sions et des traitements chez un m?me animal. Cette approche r?duit le recours ? des sacrifices interm?diaires et transforme des comparaisons interindividuelles en comparaisons intra-individuelles, augmentant la puissance statistique tout en diminuant les effectifs. D?autres mesures incluent l?exploitation maximale des tissus pr?lev?s pour des analyses multiples. Le partage des ?chantillons permet d?optimiser l?utilisation de chaque animal. En amont, des donn?es issues de mod?les in vitro ou de mod?lisation sont utilis?es pour affiner les hypoth?ses et limiter le nombre de conditions test?es. Les analyses statistiques seront effectu?es sur la dur?e sur chaque animal. L?ensemble de ces mesures permet de r?duire significativement le nombre d?animaux tout en garantissant la robustesse et la reproductibilit? des r?sultats.

Raffinement

Conform?ment ? la r?glementation en vigueur, ce projet est con?u afin de r?duire au maximum la douleur, la souffrance, l?angoisse et toute nuisance durable inflig?es aux animaux, tout en garantissant la validit? scientifique des r?sultats. Les animaux sont h?berg?s dans des conditions r?glementaires. Toutes les proc?dures invasives (chirurgie, injections intra-articulaires) sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale ? l'isoflurane (4 % induction, 2 % maintien) sur tapis chauffant, avec contr?le de l'absence de r?flexe nociceptif (retrait de la patte au pincement). Un traitement analg?sique est administr? en pre- & post-op?ratoire pour limiter la douleur aigu?, ? l'aide de bupr?norphine 0,05 mg/kg SC administr?e avant l'incision/l'injection intra-articulaire, puis toutes les 8?12 h pendant au moins 48 h, et au-del? selon l'?valuation clinique. Ce protocole s'applique aux trois proc?dures. Des grilles de score standardis?es et points limites pr?coces sont d?finis (?tat g?n?ral, poids corporel (r?f?rence = poids basal initial), mobilit?/boiterie, posture, toilettage, prise alimentaire/hydrique et aspect de l'articulation (rougeur, gonflement, ?coulement, aspect de la plaie), pouvant conduire ? une prise en charge adapt?e ou ? une mise ? mort anticip?e (cf annexe grille de scoring). Les soins post-op?ratoires incluent une surveillance rapproch?e, le maintien au chaud, la r?hydratation si n?cessaire et un suivi jusqu?? r?cup?ration fonctionnelle. L?utilisation de m?thodes non invasives, comme l?imagerie in vivo, permet de limiter les interventions.

Choix des espèces

La souris et le rat constituent les mod?les les plus pertinents pour ce projet en raison de la disponibilit? de mod?les bien caract?ris?s de l?sions cartilagineuses incluant les d?fauts m?caniques, la d?gradation enzymatique par collag?nase et l?arthrite infectieuse. Ces esp?ces pr?sentent une physiologie articulaire et des processus de r?paration du cartilage suffisamment proches des m?canismes humains pour permettre l??tude des pathologies d?g?n?ratives et inflammatoires. Elles offrent ?galement une grande richesse d?outils mol?culaires, immunologiques et g?n?tiques facilitant l?analyse des m?canismes d?action des candidats th?rapeutiques. Le recours au rat, en compl?ment de la souris, est justifi? lorsque la taille de l'articulation est un facteur limitant : la plus grande taille du genou du rat facilite la reproductibilit? de l'induction chirurgicale de la l?sion focale, les injections intra-articulaires pr?cises et le pr?l?vement de volumes sanguins suffisants pour certains dosages. Les animaux utilis?s dans ce projet seront des souris ou des rats adultes, ?g?es de 6 ? 12 semaines au moment de l?induction. Ce stade de d?veloppement correspond ? des animaux immunologiquement matures, physiologiquement stables, et adapt?s ? l??tablissement reproductible des mod?les d?atteinte du cartilage dans cette ?tude.

Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".

Objectifs

L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.

Procédures

Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.

Impact sur les animaux

Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).

Devenir

Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...

Remplacement

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Réduction

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.

Choix des espèces

La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.