Rats
Incidences des comorbidités tardives chez le modèle rat de la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Porteurs d'une mutation qui les prive de dystrophine, 330 rats voient leurs muscles dégénérer et, passé dix mois, développent pour environ un sur cinq une tumeur musculaire, le plus souvent au muscle de la mâchoire. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le protocole se limite à les laisser vieillir et à les palper chaque semaine sur tout le corps pour détecter la masse, l'animal étant tué au plus tard quinze jours après la découverte, pour prélever la tumeur. Le porteur signale que ces rats perdent la mobilité au point de ne plus pouvoir se toiletter, et qu'il les loge avec des rats sains qui s'en chargent, avant de conclure qu'ils sont "irremplaçables" pour ce travail.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l’absence d’une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d’insuffisance cardio-respiratoire. Dans des modèles animaux de DMD, notamment chez les rats, des complications sont observées de façon précoce lors de leur vieillissement. En effet, à partir de 10 mois, les rats DMD peuvent développer de manière spontanée une tumeur musculaire, pouvant se retrouver au niveau de tous les muscles squelettiques mais majoritairement au niveau du muscle masséter permettant de fermer la mâchoire. Suivant la localisation, les conséquences à l’échelle de l’organisme varient et peuvent impacter différentes fonctions comme la prise de nourriture, la locomotion et le toilettage. Le but de ce projet est donc de déterminer globalement les différents signes cliniques tardifs chez les animaux DMD, incluant le développement de tumeurs musculaires et de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l'apparition de ces tumeurs.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de caractériser au mieux la DMD et son histoire naturelle en vue de proposer des traitements innovants permettant de contrer les mécanismes pathogéniques. Comprendre les possibles comorbidités en vue de les traiter dans un contexte de réparation musculaire est donc un étape essentielle. À court terme, il est attendu une amélioration du suivi et de la prise en charge des comorbidités associées à l’évolution tardive de la maladie. À moyen terme, il s’agira de mieux investiguer le rôle de suppresseur de tumeurs de la dystrophine – et de ses variants de forme (longeur variable de la protéine) - pour, à long terme, aboutir à des tests de stratégies thérapeutiques ciblant de façon spécifique ou en parallèle les tumeurs musculaires dans les modèles animaux dystrophiques. Il est en effet crucial d’identifier la signalisation moléculaire conduisant au développement de ces tumeurs musculaires chez le rat et d’inclure ces connaissances dans le design des solutions thérapeutiques pour qu’elles visent d’emblée à traiter le syndrome dystrophique dans son ensemble, au-delà de la seule récupération fonctionnelle cardio-respiratoire et locomotrice.
Procédures
Pour la procédure décrite dans la présente saisine, les animaux ne subiront aucune intervention particulière à part une manipulation régulière par les zootechniciens pour leur suivi clinique. S’ils présentent une masse tumorale, elle sera prélevée au moment de leur mise à mort en accord avec la grille de score et au plus tard 15 jours après la détection de la tumeur.
Impact sur les animaux
Jusqu’à l’âge de 10 mois, il n'a été constaté aucune entrave à une qualité de vie globalement compatible avec une vie en cage autonome pour les animaux DMD. Au-delà de 10 mois en revanche, un suivi individuel s’impose. Dans cette étude, les animaux seront plus âgés que 10 mois et auront atteint un stade sévère de la pathologie qui s’accompagne d’un développement spontané de tumeurs pouvant toucher les muscles squelettiques. Un personnel compétent pratiquera alors de façon hebdomadaire un suivi individualisé et complet des animaux en plus du suivi classique dispensé par une zootechnicienne. Les animaux seront donc palpés manuellement sur l’ensemble de leur corps afin de détecter une éventuelle masse tumorale. La locomotion des animaux sera également observée afin de détecter un possible déficit engendré par une tumeur sur les muscles mobilisant les articulations des membres postérieurs. L’impact de la masse tumorale dépend de sa localisation (locomotion, prise alimentaire, toilettage, …). Une perte de mobilité générale est observée lors de la phase sévère de la maladie, pouvant empêcher les rats DMD d’effectuer certaines tâches essentielles à leur bonne santé comme le toilettage. Pour cette raison, les rats DMD sont systématiquement allotés avec un ou deux rats de génotype sauvage qui, nous l’avons constaté, prennent soin des rats handicapés, par exemple en les toilettant. Ainsi, le pelage des rats DMD demeure entretenu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires ainsi que la mise en culture.
Remplacement
Le rôle de la dystrophine en tant que suppresseur de tumeur est connu et décrit. L'objectif de cette saisine n’est pas de tester des molécules antitumorales, ce qui pourrait être réalisé en partie sur des cellules, mais 1) de calculer l’incidence de la tumeur du muscle dans des modèles dystrophiques, 2) de quantifier la variabilité de l'âge de démarrage du processus cancéreux dans un contexte biologique, et 3) d’initier la caractérisation des tumeurs au niveau ultrastructural du tissu et moléculaire. Le modèle du rat étant celui qui mime le plus fidèlement et en une seule année l’évolution chez l’humain, ces animaux sont irremplaçables pour remplir en un temps court les objectifs de ce projet.
Réduction
De nombreuses études sont menées sur les lignées DMDdel52 et DMDdup10-17. Dans ces deux modèles, la survenue de tumeurs musculairesa été observée de façon assez fréquente (20%). Jusqu'à présent, les animaux qui présentaient ces tumeurs étaient écartés des procédures dans lesquelles ils étaient inclus pour être mis à mort sans autre utilité, la présence de la tumeur pouvant potentiellement altérer les résultats de ces études. Comme ce type de tumeur a également été décrite chez les patients DMD, le présent projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent à l'apparition de ces tumeurs dans les modèles de rats dystrophiques, et nous proposons d'inclure dans nos analyses les tumeurs détéctées chez les animaux enrôlés dans d'autres saisines afin qu'ils ne soient plus mis à mort sans que leur tissus ne soient prélevés et analysés. Ainsi ces animaux fourniront également des données biologiques grâce à l'analyse de leurs tumeurs. Ces animaux étant par ailleurs décomptés dans d'autres saisines, leur utilisation dans ce projet permettra de réduire le nombre de rats sur la cohorte dédiée. En effet, dès lors que le nombre de sujets nécessaires aux analyses sera atteint, il n'y aura pas de nouveaux animaux inclus. De plus, la diversité des animaux utilisés permettra par ailleurs un résultat biologique de meilleure qualité puisqu’il intègrera des rats au parcours de vie différent : parfois peu manipulés notamment ceux de la présente saisine, parfois manipulés régulièrement, parfois soumis à un exercice musculaire, autant de situations proches de la variabilité des modes de vie de l’enfant atteint.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventiléesde grande taille, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluéesen permanence. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. En cas de score clinique élevé, les animaux affaiblis seront suivis de façon rapprochée via une procédure de gestion spécifique à ces animaux. Tout dépassement des points limites sera suivi d’une action correctrice et en cas d’absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Par ailleurs, les animaux provenant d'autres saisines ne subiront aucune procédure supplémentaire puiqu'ils seront mis à mort dès lors qu'une tumeur sera détéctée.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l’humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rats DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris mdx, mondialement utilisé, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 10 mois et plus, sans excéder 17 mois. L'étude de caractérisation montre que c’est à partir de 10 mois que les animaux entrent dans une phase de la maladie qui les rend prédisposés au développement de rhabdomyosarcome et éventuelles autres comorbidités.
Mise en place d’un modèle expérimental de cataracte sénile chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Des ratons de dix jours, dont le cristallin n'a pas fini de mûrir, reçoivent une injection sous la peau qui rend leur œil opaque. 810 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit ensuite des gouttes deux à trois fois par jour, ou des injections quotidiennes, ou des injections péri-oculaires hebdomadaires sous anesthésie, jusqu'à sa mise à mort vers trente jours de vie. Le porteur qualifie de "sénile" la cataracte ainsi obtenue chez des nouveau-nés. 720 rats sont tués pour l'analyse des tissus, les 90 mères gestantes écartées avant la fin pouvant être réutilisées dans d'autres procédures après avis du vétérinaire.
Objectifs
La cataracte est une affection oculaire très courante chez l'homme comme chez l'animal. Elle touche plus d’une personne sur cinq à partir de 65 ans et près de deux sur trois après 85 ans. Elle est en augmentation constante dans les pays développés du fait de l’allongement de l’espérance de vie. Il s’agit de la première cause de cécité chez l’homme, avec plus de 20 millions de personnes atteintes dans le monde. Elle est aussi l'une des causes principales de cécité chez l’animal domestique. Cette affection est caractérisée par une opacification du cristallin, la lentille naturelle de l'œil, qui entraîne une diminution de la vision, une vision trouble ou brouillée, une sensibilité accrue à la lumière et des difficultés à voir la nuit. La cataracte est souvent liée au vieillissement, mais peut aussi résulter de maladies, de traumatismes ou de traitements médicamenteux. À l’heure actuelle, la prise en charge médicale de la cataracte comporte des mesures préventives ou symptomatiques censées ralentir l’apparition de l’opacification du cristallin et son évolution. Chez l’homme comme chez l’animal, la chirurgie de la cataracte reste le seul traitement curatif disponible à ce jour. Actuellement plusieurs études étudient de nouvelles pistes de traitements. Ce projet s’inscrit donc dans ce courant et a pour objectif de mettre en place un modèle expérimental afin de tester et valider ces nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de la mise en place d'un modèle expérimental de cataracte sénile chez le rat sont multiples et visent principalement à améliorer la compréhension de cette maladie ainsi qu'à développer de nouveaux traitements. Ce projet pourra nous aider à : 1. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l'efficacité de nouveaux traitements potentiels ou de médicaments existants pour ralentir ou inverser la progression de la cataracte. 2. Observer comment les traitements sont absorbés, distribués, métabolisés et excrétés dans un organisme vivant, ce qui est crucial pour le développement de médicaments. 3. Fournir des données précliniques sur la sécurité et l'efficacité des traitements avant de passer aux essais sur l'homme.
Procédures
L'induction de la cataracte se fera par une injection sous-cutanée unique à 10 jours de développement. La durée de l’acte ne dépassera pas plus d’une minute par animal. La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 30 jours après la naissance. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 30 jours après la naissance. Là aussi, la durée des administrations et de la manipulation des animaux ne dépassera pas plus d’une minute par animal. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 30 jours de l'étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation au biomicroscope) seront généralement hebdomadaires et ne dureront pas plus de 5 minutes par animal. Tous les examens décrits ici sont également pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Ces examens sont totalement indolores et ne durent que cinq minutes tout au plus par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés à leur manipulation et à l’administration des produits. L'affection recherchée - la cataracte sénile - n'induit pas de douleur chez l'animal. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet secondaire en dehors de l'opacification du cristallin, d'une dégradation de la vision et d'une éventuelle sensibilité accrue à la lumière. La manipulation des animaux sera limitée au maximum et sera réalisée par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.
Devenir
A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques ; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus sur toute la période de l’étude dans un environnement enrichi (bouts de bois, coton pour le nid) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Dans le cas de l’administration de produits par injections péri ou intraoculaire, une anesthésie générale sera pratiquée et associée à une anesthésie locale. Dans le cas où des signes de douleur sont manifestés, un analgésique sera administré. Cette administration sera renouvelée au tant que nécessaire. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques depuis sa mise en place par Ostadalova et al. en 1977. Il est bien caractérisé. L'espèce choisie est le rat jeune, avant la fin de la période critique de maturation du cristallin. C'est l'espèce référence pour ce modèle, l'opacification du cristallin est très facile et rapide à mettre en place chez ces animaux avec une bonne reproductibilité et une bonne fiabilité De plus, ces animaux ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. L'induction se fera à 10 jours de développement du jeune rat avant la fin de la période critique de maturation du cristallin.
Administrations de candidats médicaments et collectes de sang répétées chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 270
Fournir à des clients de l'industrie pharmaceutique des échantillons de sang de rongeur : 2 160 souris et 270 rats vont être utilisés à cette fin, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé par gavage, injection ou voie intratrachéale, puis jusqu'à huit prélèvements de sang en vingt-quatre heures, ou deux par semaine pendant plusieurs semaines. Certains subissent une chirurgie de quarante minutes pour la pose d'un cathéter, et quand un gros volume de sang est commandé, la souris est anesthésiée, sa cage thoracique ouverte et le sang prélevé directement dans le cœur. Le porteur indique ne réaliser aucun test statistique sur les données produites, le protocole étant fixé par le mode d'administration, la fréquence et la durée que le client demande.
Objectifs
Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.
Bénéfices attendus
Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie orale (gavage), intrapéritonéale, sous-cutanée (durée inférieure à 1 minute) ou intraveineuse à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie intranasale, intratrachéale, topique (durée inférieure à 1 minute) ou intraveineuse à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.
Impact sur les animaux
Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.
Remplacement
Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.
Réduction
Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.
Choix des espèces
Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester
Étude de couronne protéique et de la pharmacocinétique de nanomédicaments innovants chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
1 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun anesthésié, rasé, injecté par voie intraveineuse, une partie d'entre eux subissant en plus huit prélèvements de sang en trois jours. Ils sont tués entre un et trois jours après l'injection, pour récupérer le sang et les organes. L'objet est de savoir quelles protéines du sang se fixent sur des nanomédicaments et comment ces particules circulent, connaissances dont le porteur situe l'exploitation par les laboratoires un an après chaque série de travaux. Il indique travailler avec quatre rats par groupe, sans dire ce qui conduit de ce chiffre au millier d'animaux demandés.
Objectifs
La connaissance et la compréhension des mécanismes fondamentaux régissant les interactions de biomolécules avec des nanomédicaments et l’impact sur le devenir biologique ont été très peu explorées. L'hypothèse du projet est que la modification des propriétés de nanomatériaux aura un impact significatif sur la composition et la conformation de la couronne protéique et, par conséquent, sur leur comportement biologique. Dans ce contexte, ce projet a deux objectifs principaux : Objectif 1 : comprendre les mécanismes fondamentaux régissant les interactions de biomolécules avec des nanomédicaments après leur administration dans le sang. Objectif 2 : étudier les conséquences biologiques de ces interactions sur le devenir biologique, notamment la pharmacocinétique. Ainsi, nous espérons obtenir des profils de pharmacocinétiques maitrisés en fonction des propriétés des nanomédicaments utilisées.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, plusieurs études ont montré que les interactions de nanomédicaments avec les protéines étudiées in vitro sont différents des interactions de ces mêmes nanomédicaments étudiés chez le petit animal. L’utilisation de modèles animaux pour ce type d’étude est incontournable. Quant à la pharmacocinétique, elle nécessite l’utilisation de modèles animaux ce qui permettra de mimer de la manière la plus proche possible ce qui se passerait lorsque ces nanomédicaments seront administrés chez l’humain. Ce projet apportera de nouvelles connaissances scientifiques fondamentales à travers la compréhension des relations entre les propriétés physicochimiques de nanomédicaments innovants et leurs comportements vis-à-vis des protéines du sang ainsi que la pharmacocinétique. Plus précisément, de nouveaux paramètres des nanomédicaments tels que la conformation au niveau de la surface des nanomédicaments, la morphologie des nanomédicaments ainsi que leur composition sur les interactions avec les protéines du sang et la pharmacocinétique seront mieux compris. Ces connaissances conduiront à de nouvelles applications pour exploiter la couronne protéique et ouvriront la voie pour des stratégies alternatives pour le ciblage. Contrôler l'adsorption des protéines par une conception rationnelle de nanomédicaments avec une identité synthétique spécifique qui favorise la sélection de protéines endogènes apportera des avantages thérapeutiques prometteurs. Ces connaissances conduiront à de nouvelles applications pour exploiter les propriétés des nanomédicaments et ouvriront la voie pour des stratégies alternatives pour contrôler le devenir biologique des nanomédicaments. Ainsi, cette compréhension apportera des avantages thérapeutiques prometteurs et permettra de développer les nanomédicaments du futur de manière rationnelle. L’échéance à laquelle le projet sera profitable est estimée à 1 année après la fin de chaque série de travaux. Ainsi, les publications scientifiques permettront d’exploiter rapidement ces résultats par la communauté scientifique et par les industriels.
Procédures
Les rats seront anesthésiés par une anesthésie gazeuse, une identification individuelle sera effectuée puis ils seront rasés afin de réaliser une injection intra-veineuse (durée environ 5 minutes) puis réveillés. Une partie des animaux du projet seront également impliqués dans 8 prélèvements sanguins effectué sur animal vigile sur une durée de 3 jours. Enfin, après la période de maintien prévu (entre 1 et 3 jours) les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu que les formulations elles-mêmes soient toxiques pour l’animal. Les principales nuisances sont dues aux manipulations des animaux pourront qui pourraient induire un stress. Les prélèvements sanguins pourraient induire un saignement. L’anesthésie pourrait induire une baisse de la thermorégulation et une détresse respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures. La réutilisation des animaux n’est pas possible car les effets des procédures que les animaux ont subies pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable/confondre les résultats de toute étude ultérieure. De plus, les animaux seront euthanasiés pour récupérer le sang et collecter les organes.
Remplacement
Nous avons préalablement évalué, par des expériences in vitro, la stabilité dans au cours du temps et le comportement cytotoxique éventuel de nos formulations. Ces études préalables nous ont permis de sélectionner les formulations à tester chez l’animal. La souris est le meilleur modèle animal permettant d’étudier les interactions avec les protéines et la pharmacocinétique. Ce modèle relativement petit est un ensemble de systèmes biologiques proches de ceux de l’humain, qui permet d’étudier assez précisément les effets indésirable potentiels d’une formulation ou une molécule. Cependant, il a été démontré par des travaux antérieurs que le temps de circulation de nanomédicaments dans le sang du rat est plus long que celui de la souris. Ainsi, il est primordial d’étudier ces comportements biologiques sur le rat. Un exemple pertinent est celui du système du complément du rat qui est proche de celui du porc (considéré comme le meilleur modèle animal pour étudier la couronne protéique et la pharmacocinétique).
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés est de 1000 rats. Les procédures expérimentales ont été réfléchies. Ces procédures ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en ayant des résultats statistiquement satisfaisants. En effet, nous avons préalablement réalisé des études bibliographiques pour sélectionner les meilleures procédures. Nous avons également évalué par des études in vitro plusieurs formulations pour ne tester chez l’animal que les formulations finales, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre stratégie statistique consiste à réaliser des tests statistiques pour les échantillons de faible taille. Le nombre d’animaux doit être de 4 rats par groupe pour les expériences qui présentent une variabilité comme la couronne protéique et la pharmacocinétique.
Raffinement
L’hébergement des animaux est conforme à la réglementation et leur cage contient deux enrichissements. Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des rats. Les procédures d’administration seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera l’euthanasie anticipée de l'animal. Chez le rat anesthésié, tout signe de souffrance induira un arrêt de la procédure, une analgésie et une nouvelle induction de l’anesthésie. Après l’anesthésie, le rat sera placé dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération interventionnelle et post examen. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Dans ce cas : un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage et la justification d’isolement sera validée. Les blessures seront le cas échéant désinfectées.
Choix des espèces
Pour notre projet d’étude du comportement des nanomédicaments vis-à-vis des protéines circulantes dans le sang des animaux et la pharmacocinétique, seul un système complexe tel que l’animal peut permettre de répondre à cette question. La souris est le meilleur modèle animal permettant d’étudier les interactions avec les protéines et la pharmacocinétique. Ce modèle relativement petit est un ensemble de systèmes biologiques proches de ceux de l’humain, qui permet d’étudier assez précisément les effets indésirable potentiels d’une formulation ou une molécule. Cependant, il a été démontré par des travaux antérieurs que le temps de circulation de nanomédicaments dans le sang du rat est plus long que celui de la souris. Ainsi, il est primordial d’étudier ces comportements biologiques sur le rat. Un exemple pertinent est celui du système du complément du rat qui est proche de celui du porc (considéré comme le meilleur modèle animal pour étudier la couronne protéique et la pharmacocinétique). Nous utiliserons des rats Wistar adultes de 6 semaines. Les expérimentations nécessitent l’utilisation de rats au stade adulte. Les rats ont une bonne immunité permettant de refléter ce qui se passe chez l’Homme.
FluoThyro: Caractérisation de la fluorose induite par des substances exogènes et sa conséquence sur l’homéostasie de la thyroïde
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Soumis chaque semaine à un prélèvement de sang dans la veine sublinguale sous anesthésie générale, pouvant atteindre 7,5 % de leur volume sanguin, 70 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils ingèrent un composé fluoré dont le porteur indique qu'il peut blanchir et casser les dents, pour comprendre la part du fluor dans une toxicité déjà relevée sur la thyroïde lors d'études réglementaires antérieures. Tous sont tués en fin d'étude pour l'autopsie, à l'exception des animaux écartés après randomisation, qui peuvent être replacés ou versés à la formation du personnel aux gestes techniques. Le composé n'est jamais nommé, désigné d'un bout à l'autre comme le "composé d'intérêt", et le nombre de rats concernés par cette mise à l'écart n'est pas donné.
Objectifs
Le projet vise à caractériser la fluorose induite par un composé d’intérêt en vue de mieux comprendre d’un point de vue mécanistique les effets adverses observés lors d’études règlementaire portant sur ce produit.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ces études sont de caractériser la toxicocinétique du composé d’intérêt (métabolisation/biotransformation) et la cinétique d’apparition du fluor libre plasmatique (participant à la fluorose). Ainsi les études subséquentes pourraient tenter de répondre à la question suivante : quelle part prend le fluor dans les effets toxiques observés notamment sur la thyroïde (perturbation des hormones thyroïdiennes, histopathologie de la thyroïde) lors de l’administration du composé d’intérêt ? Ces études apporteront des informations sur la méthodologie à utiliser pour prédire l’origine d’effets toxiques mixtes observés sur des études long terme notamment pour des composés présentant un risque d’induction de fluorose.
Procédures
Au cours de leur vie les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins en accord avec les recommandations éthiques (via la veine sublinguale, pour un volume maximal de 7.5% du volume sanguin total de l’animal, après anesthésie générale en respectant une fréquence maximum de 1 fois par semaine et pour une durée d'intervention de moins de 3 minutes). Tous les autres prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet. La sélection des doses est fondée sur les résultats des études précédentes notamment de l’étude de 90 jours chez le rat. Une attention particulière sera portée sur la possible apparition d’effets toxiques notamment liés à la présence de fluor libre dans l’organisme (fluorose) peuvent induire le blanchiment et la cassure des dents. La forte dose choisie ne doit pas excéder la dose maximale tolérée chez l’animal (et définie au préalable). En cours d’étude, des échantillons de sang peuvent être prélevés via la veine sublinguale (pour un volume maximal de 7.5% du volume sanguin total de l’animal) après anesthésie générale en respectant une fréquence maximum de 1 fois par semaine. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de légères blessures au point de prélèvement ainsi qu’une perte de sang un peu plus importante que prévue.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin d’étude pour évaluer l’effet des composés sur les organes d'interêt lors de l'autopsie. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.
Remplacement
Des essais in vitro et in vivo ont été réalisés pour déterminer le profil toxicocinétique et le profil toxico-dynamique de la molécule d’intérêt et de certains métabolites mais ces essais ne permettent pas d’évaluer la contribution du fluor aux effets toxiques mixtes observés notamment au niveau de la thyroïde. Les résultats des essais mécanistiques in vivo seront analysés en regard des résultats des essais in vivo exploratoires et réglementaires, notamment des résultats des études 90 jours.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. Un total de 70 rats est estimé nécessaire en se fondant sur l’expérience des tests réalisés récemment avec la molécule et sur le site. Ce nombre d’animaux permettra de collecter assez de sang pour quantifier le fluor avec une méthode assez sensible pour couvrir le niveau basal de fluor couramment observé dans un groupe contrôle (60 ng/mL). Des tests statistiques adaptés seront utilisés pour valider scientifiquement les résultats. Un seul sexe sera utilisé les mâles car basé sur la littérature et l'expérience du laboratoire les éventuels effets attendus devraient être plus ou moins similaires entre les deux sexes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés tous les jours (week-ends compris). Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés par le laboratoire, qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en administrant les produits à des doses appropriées : la forte dose sera définie sur la base des résultats observés dans les études 28 et 90 jours avec administration du produit par voie orale en mélange nourriture. Aucun signe de toxicité impactant le bien-être global de l’animal (notamment cassure des dents) n’a été observé pendant l’étude 28 jours. On retiendra des doses inférieures à la dose maximale tolérée chez l’animal utilisé.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites dans ce document sont réalisées chez le rongeur pour permettre d’avoir le bon niveau d’information sur la cinétique du produit. Le rat est l’espèce la plus appropriée pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées sur notamment sur le rat. Le rat mâle adulte est le modèle privilégié dans ce projet. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes (à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.
Etude d’hydrogels théranostiques en cancérologie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Pour tester un réservoir de médicament injecté au cœur d'une tumeur cérébrale, 513 rats reçoivent une greffe intracrânienne de cellules tumorales, dont 504 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'injection de cellules ou d'hydrogel dure dix minutes, suivie de trois séances d'imagerie IRM et rayons X d'une heure à une heure trente sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale provoque une douleur modérée et une perte de poids à partir de deux semaines après l'implantation, et prévoit d'injecter des deux côtés du cerveau quand c'est possible pour que chaque animal apporte deux informations au lieu d'une. Tous sont tués pour prélever les cerveaux, une grille de cotation de la douleur déclenchant la mise à mort de ceux qui atteignent un point limite.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer une nouvelle stratégie de traitement des tumeurs cérébrales. Celle-ci consiste à injecter au cœur de la tumeur un réservoir à médicament qui permet de libérer le médicament au fil du temps. La réponse au traitement anti-cancéreux est suivi par imagerie en temps réel. Ce suivi par imagerie pendant le traitement anti-cancéreux pourrait permettre d’obtenir une évaluation immédiate de l’effet du médicament.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est que ce nouveau mode de traitement directement dans la tumeur du cerveau devrait maximiser l’efficacité thérapeutique du médicament anti-cancéreaux tout en minimisant les effets secondaires. Les cancers du cerveau (tumeurs cérébrales) sont parmi les cancers les plus fréquents chez les enfants. Ils sont une cause de mortalité et de morbidité importante tant chez l’enfant que chez l’adulte. La mortalité des tumeurs cérébrales agressives (type glioblastome) est systématique et rapide. La durée de survie de patients atteints de tumeur cérébrale aggressive est d’environ 15 mois, et il n’existe aucune stratégie thérapeutique efficace à ce jour. Il est donc urgent de développer de nouveaux traitements, permettant de mieux prendre en charge les patients.
Procédures
L’étude implique une injection de cellules tumorales et / ou une injection d’hydrogel (durée de l'injection : 10 min). L’étude implique également la réalisation de 3 sessions d’imagerie durant entre 1h et 1h30 (imagerie IRM et rayons X), réalisées sous anesthésie également.
Impact sur les animaux
La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée – La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) – la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses des tissus.
Remplacement
Aucune préparation in vitro ne permet de reproduire une tumeur cérébrale dans son environnement dans le cerveau avec les différentes cellules, les vaisseaux sanguins, la pression cérébrale, le système immunitaire.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Nous réaliserons, lorsque cela est possible, des injections des deux côtés du cerveau afin que chaque animal apporte deux informations au lieu d'une, ce qui permet là aussi de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des rats avant toute expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Des points limites de douleur ont été définis. En cas d'atteinte d'un point limte, les animaux seront euthanasiés. La chirurgie et l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. De plus, concernant la chirurgie et afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée ainsi qu’une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures si l’état de l’animal le requière. La croissance tumorale implique une perte de poids, notamment à partir de deux semaines après implantation. Les animaux auront accès à une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain. De plus, le cerveau du rat est suffisamment gros pour permettre d’obtenir des images assez résolues et de réaliser des implantations de tumeur puis d’hydrogels dans de bonnes conditions de préservation des tissus sains. Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur un plus petit nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante en imagerie. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons représentent un modèle validé pour étudier les effets de la chimiothérapie sur l'environnement tumoral. Nous validerons nos protocoles de traitement (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) sur quatre modèles tumoraux, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Enfin, l’ensemble des animaux utilisés seront adultes afin de travailler sur un cerveau mature et stable. Nous avons l’expérience sur les modèles de tumeur et sur les injections d’hydrogel à cet âge.
Evaluation de l’efficacité d’une formulation administrée par voie orale à 2 doses sur le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tués à l'issue d'une procédure unique pour qu'on prélève leur côlon et les matières fécales qu'il contient, 40 rats vont être utilisés dans cette étude. Trente-deux d'entre eux subissent sous anesthésie une induction d'ulcération colique de quarante minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les huit autres recevant une substance neutre. Suit un gavage quotidien pendant six jours, puis cinq minutes en isolement dans un dispositif mesurant l'activité exploratoire pour évaluer la douleur ressentie. Le porteur décrit un inconfort et une douleur "notoires", avec perte de poids et posture prostrée, et indique qu'aucun antidouleur ne sera administré parce qu'il interférerait avec les résultats de l'étude.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité distale du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’une formulation ayant des propriétés anti-inflammatoires et antidouleur, administré par voie orale à 2 doses, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets d’une formulation à 2 doses différentes chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec cette nouvelle formulation sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec cette formulation, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 32 des 40 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 8 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 6 jours sur les animaux vigiles, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. Le traitement avec la formulation à évaluer devrait limiter cet inconfort et cette douleur ressentie et donc les effets sur les différents paramètres mesurés, tout comme le traitement anti-inflammatoire intestinal de référence comme nous l’avons démontré dans de précédentes études. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps..
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 40 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner la formulation ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal..
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront placés à 2 par cage dans des cages transparentes avec des briques d’Aspen et du papier kraft comme enrichissement, et ils auront accès à la nourritue et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur de la formulation testée sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires de la formulation qui sera testée, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale, et pour les études sur le comportement. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative.
Evaluation de l’efficacité de composé dans des modèles de maladies auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une injection sous anesthésie déclenche chez des rats une forme de sclérose en plaques ou de polyarthrite rhumatoïde, avec une faiblesse de la queue et une paralysie des membres passagères, une inflammation des articulations, une perte de poids et parfois une nécrose au point d'injection. 2 940 rats vont être utilisés, tous tués à la fin de l'expérience, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun peut recevoir en 35 jours jusqu'à 140 administrations et 73 prises de sang. Les composés testés sont en développement, et des molécules déjà commercialisées ou en essai clinique servent à juger, écrit le porteur, la "prédictivité des modèles mis en œuvre". Il évoque des tests comportementaux sans les nommer, et ne décrit un traitement contre la douleur que pour deux des quatre procédures.
Objectifs
Les maladies auto-immunes résultent d’un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s’attaquer aux constituants normaux de l’organisme. L’ensemble de ces pathologies touchent environ 5 à 10% de la population mondiale avec une forte prévalence pour les femmes (80%). Ces maladies évoluent de façon chronique tout au long de la vie, avec des alternances de phases de crises et de rémissions. A ce jour, plus de 80 maladies auto-immunes ont été décrites. Parmi les plus fréquentes, on peut citer la sclérose en plaque et la polyarthrite rhumatoïde. En première intention, les principaux traitements sont basés sur des médicaments appelés immunosuppresseurs. Malheureusement, ces traitements entravent également les réponses immunitaires physiologiques destinées à lutter contre les infections et ont d’autres effets secondaires potentiellement sérieux. Actuellement, l’objectif de la recherche médicale reste de mettre au point des traitements efficaces avec moins d’effets secondaires. Des biothérapies se développent, elles sont le plus souvent utilisées lorsque la maladie ne répond pas suffisamment aux immunosuppresseurs. Cette recherche se concentre sur le développement de thérapies qui ciblent spécifiquement le processus pathologique concerné et qui interférent avec des fonctions précises de la réponse immunitaire, fonctions qui sont impliquées dans la pathogénie de la maladie. Afin de modéliser ces pathologies, différents modèles animaux sont validés par la communauté scientifique. Ces modèles permettent d’étudier les mécanismes physiopathologiques des maladies auto-immunes et permettent ainsi de développer de nouveaux traitements. Ils sont en général basés sur la stimulation d’une réponse immunitaire connue de la maladie. Dans ce projet, nous nous proposons d’utiliser différents modèles de maladies auto-immunes pour tester des composés en cours de développement. Les procédures mettrons en oeuvres des modèles de sclérose en plaque ou des modèles de polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les maladies auto-immunes que sont la sclérose en plaque et la polyarthrite rhumatoïde. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité des modèles mis en œuvre.
Procédures
En fonction de la procédure réalisée les animaux subirons au maximum une injection sous anesthésie induisant la pathologie puis 35 scorages de leur état clinique (2 min) ou 15 scorages de l’inflammation et 15 mesures sous anesthésie du volume de l’oedème au niveau des pattes postérieures (3 min). Tous les scorages sont effectués sur animaux vigiles. Ils pourront être amenés à recevoir un maximum de 140 administrations (dont le traitement anti-douleur, sous anesthésie pour les administration intraveineuse) et de 1 à 73 prélèvements sanguins sur la période de 35j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire.
Impact sur les animaux
Les pathologies induite provoquent de façon transitoire une faiblesse de la queue et une paralysie des membres. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances à long terme.
Remplacement
Le développement des maladies auto-immunes et de leurs symptômes sont des phénomènes complexes qui mettent en jeu plusieurs acteurs (système immunitaire, microbiote, système nerveux, muscle, …) et différents processus. Actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier les problématiques du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle différence à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 10 à 15 animaux selon la procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi par un tunnel en carton pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les inductions, les mesures d’œdème et le prélèvement de sang sont réalisées sous anesthésie. Dans les procédures 1 et 2, dès le jour 7, de la nourriture en gel est mise à disposition des animaux afin de facilité la prise alimentaire lors du pic de la pathologie. Dans les procédures 3 et 4, dès l’apparition de l’inflammation jusqu’à la fin de l’expérience la douleur des animaux est prise en charge par un traitement biquotidien. De plus nous avons établis des points limites spécifiques à chaque procédure afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Les différents modèles décrits dans ce projet sont largement utilisés chez le rat pour lequel le matériel est adapté et les résultats pertinents. Les maladies auto-immunes peuvent apparaitre à tout âge mais la prévalence est la plus importante chez les jeunes adultes. Nous utiliserons donc des rats d’environ 10 semaines au début de l’expérience.
Formation et maintien des compétences du personnel pour la réalisation d’actes chirurgicaux chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 70
Tués à l'issue pour que la réussite du geste chirurgical puisse être évaluée, 140 souris et 70 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un anesthésique par voie intrapéritonéale, deux à trois injections sous-cutanées d'analgésique, puis subissent selon l'espèce la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire ou la ligature d'un uretère, opérations d'une quinzaine de minutes. Le porteur indique que les premières séances se font sur des animaux morts et qu'il utilise en priorité des animaux surnuméraires d'autres études, mais affirme que l'animal vivant reste "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques entre individus, leur force et leurs réactions. Le projet ne produit aucune connaissance, sept expérimentateurs d'une entreprise privée y entretenant deux gestes chirurgicaux, à raison de 20 souris ou 10 rats par compétence et par personne, pour satisfaire une exigence réglementaire de formation continue.
Objectifs
L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Dans notre entreprise, les techniciens doivent maitriser des techniques chirurgicales nécessaires à la réalisation de certains modèles, chez le rat et la souris. L’objectif de ce projet est de répondre à l’exigence règlementaire concernant la formation continue et le maintien des compétences du personnel. Ce projet vise à améliorer les pratiques expérimentales, à assurer la qualité scientifique et le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les gestes techniques chirurgicaux, chez le rat et la souris. L’apprentissage et le maintien des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal. De même l’ensemble des actes impliquant une incision sont réalisés sous couverture analgésique.
Procédures
Les gestes techniques traités dans ce projet se pratiquent sur rats et /ou souris : • Les administrations intrapéritonéales d’anesthésiques sont pratiquées sur animaux vigiles en contention manuelle, à raison d’une administration par animal. Cet acte concerne l’ensemble des animaux du projet et nécessite environ 10 sec de contention. • Les administrations sous cutanées d’analgésie sont pratiquées sur animaux vigiles en contention manuelle, à raison de deux à trois administrations par animal. Cet acte concerne l’ensemble des animaux du projet et nécessite environ 10 sec de contention. • Chirurgie avec pose de cathéter à la veine jugulaire chez le rat. Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Une seule chirurgie est réalisée tout au long de la vie de l’animal et dure 15 minutes environ. • Chirurgie avec ligature unilatérale de l’uretère. Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Une seule chirurgie est réalisée tout au long de la vie de l’animal et dure 15 minutes environ.
Impact sur les animaux
Les nuisances décrites ci-dessous représentent des cas rares qui sont évités par la réalisation d’un bon tutorat et d’un apprentissage progressif. De manière générale, quel que soit le type de chirurgie, les nuisances engendrées peuvent survenir durant les gestes péri-opératoires qui impliquent des administrations aux animaux, notamment par voie intrapéritonéale avec passage possible dans la vessie ou injection dans le caecum. La régulation de la température corporelle et l’hydratation des animaux peut, si elle est mal maîtrisée, engendrer des effets indésirables durant la phase de réveil et au-delà. Post-chirurgie, les nuisances pouvant être constatées sont de type perte de poids, piloérection et prostration. Ces effets sont quantifiés et constituent des points d’arrêt anticiper de l’expérimentation. Dans certains cas, il peut arriver que la chirurgie nécessite l’hébergement en individuel, cela peut engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir évaluer la réussite des actes chirurgicaux.
Remplacement
Avant toute manipulation des animaux, le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Les premières séances d’apprentissage et d’entraînement à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts, au préalable du travail sur animaux vivants anesthésiés. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci.
Réduction
Les premières étapes de formation sur ces techniques chirurgicales sont réalisées sur des animaux morts. Nous utilisons ensuite en priorité des animaux surnuméraires des études, des animaux issus de nos élevages non entrés en expérimentation plutôt que des animaux achetés à cette fin, chez des fournisseurs agréés. Le nombre d’animaux inclus est fonction du nombre de compétences à acquérir et à maintenir et du nombre de personnes concernées. A ce jour, ce projet concerne 7 expérimentateurs et englobe 2 techniques, l’une chez la souris et l’autre chez le rat, dont les compétences sont à acquérir et/ou maintenir. 20 souris et/ou 10 rats sont nécessaires pour acquérir et/ou maintenir une compétence pour une personne. Le nombre de souris nécessaires pour acquérir et/ou maintenir une compétence est plus important que le nombre de rat, du fait de sa plus petite taille.
Raffinement
Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée avant toute manipulation des animaux. Dans un premier temps, les séances d’apprentissage à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts. Dans un second temps ou pour des séances de maintien de la compétence, ces actes sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés, sans réveil post chirurgie. La réalisation de ces gestes avec réveil de l’animal n’est réalisée que lorsque leur maîtrise a été validée lors des étapes précédentes, par le tuteur et/ou le responsable des compétences. L’ensemble des gestes sont réalisés en condition de stérilité (matériel stérile, utilisation de stérilisateurs à bille, etc.) afin d’éviter tout risque d’infection. Une fois anesthésiés, les animaux sont installés sur des couvertures chauffantes pour assurer le maintien de leur température corporelle. Pour les mêmes raisons, des enrichissements de type coton sont ajoutés dans leur cage pour la phase de réveil, voire au-delà. Pour les chirurgies impliquant l’ouverture de la paroi abdominale, une réhydratation à l’aide de sérum physiologique est mise en place et des cubes d’eau gélifiée avec des granulés d’aliment sont ajoutés dans les cages. Pour les animaux devant être isolés, un enrichissement supplémentaire est apporté au sein de leur cage. Les consommables utilisés (aiguilles, cathéters, fils de suture) sont stériles et adaptés à la taille de l’animal et au type de tissu impliqué afin d’éviter toute douleur ou gêne inutile. L’état clinique des animaux est évalué plusieurs fois par jour par les personnes impliquées dans ces formations ou maintien des compétences (tuteurs, soignant, etc.). Un carnet de santé, traçant précisément tous les gestes réalisés, le cas échéant les signes cliniques observés ainsi que les soins apportés, est mis en place. L’atteinte des points limites conduit à la mise à mort des animaux concernés.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces utilisées pour mener à bien nos programmes de recherche précliniques. A ce jour, de par leurs similarités physiologiques avec l’homme, ces deux espèces de rongeurs sont les plus adaptées pour évaluer les propriétés pharmacologiques de molécules d’intérêt et d’en connaître les risques de toxicité avant les premiers essais chez l'homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car les études réalisées au sein de notre établissement le sont sur des individus adultes.
Effets cérébraux des vésicules provenant de cellules du foie exposées à des polluants environnementaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
30 rats mâles adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit huit injections dans la veine de la queue, deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis enchaîne une semaine de tests, activité locomotrice spontanée sur cinq minutes, mémoire immédiate sur dix minutes, deux mesures d'anxiété de cinq minutes chacune et une mémoire de travail évaluée trois matinées de suite. L'objet est d'observer si des vésicules produites par des cellules de foie en culture exposées à des polluants alimentaires provoquent anxiété et troubles de la mémoire, les biomarqueurs et les cibles thérapeutiques annoncés relevant de l'espoir que le porteur formule. Sur le remplacement, il indique avoir remplacé les animaux non-humains par des hépatocytes en culture pour produire les vésicules, et affirme que leur effet sur le cerveau ne peut pas l'être.
Objectifs
La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques associée à une inflammation. En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de cette maladie du foie. Les polluants qui seront étudiés ici sont présents dans l’alimentation et en raison de leurs propriétés lipophiles, ils s’accumulent dans le foie et le cerveau, où ils peuvent générer des troubles de l’anxiété et des altérations cognitives. L’exposition à ces polluants modifie également la quantité et les caractéristiques des petites vésicules produites par le foie, vésicules qui peuvent perturber le fonctionnement d’autres cellules de l’organisme. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons chez le rat adulte les conséquences hépatique et cérébrale de l'injection de ces vésicules libérées et isolées à partir de cellules de foie en culture et exposées à des conditions enrichies en gras et aux polluants étudiés.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des polluants choisis ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques en étudiant le rôle des vésicules dans la progression de cette maladie du foie et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : d’étudier l’impact au niveau du foie et du cerveau de l’administration de ces vésicules chez des rats.
Procédures
La seule intervention pouvant être à l’origine de mal-être est l’injection des vésicules à la veine de la queue, injection qui sera répétée 8 fois pour chaque animal tout au long des 4 semaines de traitement. Chaque animal sera donc injecté 2 fois par semaine pendant 4 semaines consécutives. Les tests comportementaux seront quant à eux effectués sur une période d’une semaine, entre 8h et 13h. Un premier test consistera à évaluer l'activité locomotrice spontanée de l’animal durant 5 minutes. La mémoire immédiate de l’animal sera également testée pendant une durée de 10 minutes. Deux tests complémentaires, chacun d’une durée de 5 minutes seront réalisés pour évaluer le niveau d'anxiété des animaux. Un dernier test se proposera d'évaluer la mémoire de travail des animaux. Il sera réalisé sur 3 jours consécutifs pendant 5 minutes par matinée. Ainsi chaque animal effectuera un à deux tests par jour pendant une semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus sont les suivants : stress de contention lié à l'injection des vésicules extracellulaires ainsi que le stress lié à l’introduction de l’aiguille dans la veine caudale . D’après les éléments de la littérature et l’expérience des porteurs du projet, aucun des tests comportementaux prévus ne provoque des signes de mal-être chez les animaux.
Devenir
Une fois les tests comportementaux réalisés, les animaux seront mis à mort et les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Nous avons remplacé l’utilisation d’animaux pour la production des VE par des hépatocytes en culture soumis à un environnement enrichi en graisse et/ou en polluants environnementaux. Cependant, l’impact de ces vésicules sur les fonctions du foie et du cerveau (activité, anxiété, mémoire de travail) ne peut pas être évalué sur des cellules de foie isolées, ni remplacé.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 27 animaux prévu a été déterminé pour une puissance statistique fixée a priori de 0,90, des effectifs égaux dans les 3 groupes expérimentaux (n=9/groupe) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. A ce nombre, nous nous laissons la possibilité d’ajouter 1 individu supplémentaire par groupe de manière à pallier à une éventuelle atteinte de seuils critiques irréversibles. Soit un total de 30 animaux au maximum (n=10 par groupe).
Raffinement
Les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation, placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires dans des portoirs ventilés avec des buchettes et frisure de papier kraft comme enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. En ce qui concerne les injections à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon avec un anti-douleur local et le stress induit par le tube de contention sera réduit par une habituation d'une durée d'une semaine.
Choix des espèces
Des rats adultes mâles ont été choisi pour être plus représentatif de la réalité humaine où les hommes présentent un taux d’incidence de stéatohépatite deux fois plus élevé que les femmes. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.
Evaluation de l’efficacité de la combinaison de techniques innovantes en radiothérapie et immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
Les rats qui atteignent un point limite de la grille de score sont mis à mort, seuil d'autant plus proche que le critère d'évaluation retenu est la durée de survie après irradiation. 198 rats vont être utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour évaluation histologique. Une tumeur cérébrale leur est implantée sous quarante-cinq minutes d'anesthésie, puis le crâne est irradié deux semaines plus tard, ce qui provoque apathie, perte de poids et ulcérations du cuir chevelu pendant cinq à six jours. Le porteur écrit que la preuve de concept de ces techniques de radiothérapie existe déjà et situe le projet sur le chemin d'éventuels premiers essais cliniques.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale et une activation efficace du système immunitaire chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique de ces techniques innovantes qui utilisent du fractionnement spatial de la dose en les combinant avec des nouvelles substances immunomodulatrices telles que des gels polymères chargés de nanotransporteurs de gènes pour l’expression forcée de molécules immunostimulantes. Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur l’ augmentation de la survie des animaux
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), avec moins d’effets secondaires dans les tissus sains et permet un contrôle tumoral égal ou supérieur à la RT conventionnelle Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes comme les gliomes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
Dans un premier temps, des cellules tumorales seront implantées dans le cerveau de rats anesthésiés (anesthésie environ 45 minutes). 13 jours après l’implantation des cellules tumorales, les animaux recevront des injections de traitements 5 à 7 jours post irradiation, sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 30 minutes). 14 jours après l’implantation des cellules tumorales les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 20 minutes) au niveau du cerveau . Tous les rats implantés dans le cerveau avec des cellules tumorales seront imagés 1 fois 1 à 3 jours avant irradiation sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 3-4 minutes) afin de s’assurer de la présence de la tumeur.
Impact sur les animaux
L’implantation intracérébrale de cellules tumorales aura pour conséquence le développement d’une tumeur dans le cerveau. Suite à ces chirurgies et à l’irradiation, des signes d’ apathie peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort pour une évaluation histologique.
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser a été calculé à l'aide d'outils statistiques. Ce nombre est ajusté au plus bas mais permet tout de même de pouvoir conclure.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de la procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Pour y remédier, des aliments appétants seront ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Évaluation de l’effet de nanocomposites en bioverre et polyester ayant des propriétés ostéogénique, angiogénique et antibactérienne dans un modèle de défaut critique de calvaria chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Tester des biomatériaux censés combler une perte osseuse de la mâchoire chez l'humain passe ici par le crâne de 180 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux trous de quatre millimètres sont percés dans la voûte crânienne de chaque animal, un par os pariétal, ce qui permet au porteur de doubler le nombre d'implants testés sans augmenter l'effectif. Deux injections de colorant précèdent la mise à mort, qui sert à prélever les calvarias pour analyse, les cadavres étant ensuite évacués. Le suivi repose sur un décompte de signes cliniques, un signe déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique toutes les douze heures, trois la mise à mort.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester de nouveaux matériaux pour le comblement d’une perte osseuse mandibulaire avec une taille de défaut critique > 1 cm2 chez l’homme, tout en servant de support à la repousse osseuse, possédant des propriétés de revascularisation et antibactériennes. L’expérimentation que nous projetons, sera menée chez le rat. La zone d’étude (zone dans laquelle le défaut osseux sera créé) choisie est la calvaria (partie supérieure du crâne cérébral) plutôt que la mandibule afin, de simplifier la chirurgie et d’améliorer le bien-être et le taux de survie des animaux (risques de sous-alimentation, de douleur et d’infection plus élevés dans la zone buccale). A noter que la calvaria est un os dont l’origine embryonnaire est proche de la mandibule . Ces biomatériaux forment un réseau poreux constitué de polymère biodégradable (PLA ou acide polylactique) et de particules de bioverres plus ou moins supplémentés par un ion cationique (ion possédant des propriétés antibactériennes). Les biomatériaux possèdent une porosité orientée, bimodale et interconnectée ainsi que des propriétés mécaniques suffisantes pour supporter la manipulation par les chirurgiens et la repousse osseuse. Enfin, les propriétés biologiques des matériaux ont été évaluées telles que la dégradation en solution aqueuse, la cytotoxicité (propriété d'un agent biologique à être toxique pour les cellules) et les propriétés antibactériennes. Des essais préliminaires ont été réalisés dans un modèle de défaut critique chez le petit animal (calvaria de rat) avec des biomatériaux du même type que ceux qui seront utilisés dans ces prochaines expérimentations, en résulte aucun effet adverse.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de valider chez les animaux le potentiel de régénération osseuse et de revascularisation d’un matériau poreux constitué d’un réseau de bioverres (supplémentés ou non avec un ion cationique) et d’un polymère biodégradable. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement pour la reconstruction osseuse consécutive à l’ORN (ostéoradionécrose, une complication sévère de la radiothérapie, liée à un défaut de cicatrisation du tissu osseux). Ce matériau a pour objectif d’être pratique à utiliser pour les cliniciens et efficace pour la repousse osseuse, la revascularisation et ayant effet antibactérien (propriété de l’ion cationique).
Procédures
Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé ou non en cation au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Les animaux vigiles seront aussi soumis à deux injections intrapéritonéales de colorants vitaux de quelques secondes, 14 et 2 jours avant leur mise à mort. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (4 mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie, l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.
Devenir
En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort. Les cadavres des animaux seront évacués exceptés les calvarias qui seront prélevées, fixés et préparées pour réaliser les analyses radiologiques et histologiques au laboratoire qui permettront l’évaluation de la néoformation osseuse et des propriétés angiogéniques des biomatériaux.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux fonctionnalisés en termes de biocompatibilité et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou pas par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux. Des études in vitro de cytocompatibilité des composites ont été réalisées, il est maintenant nécessaire de tester in vivo sur le petit animal.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les biomatériaux utilisés ont été sélectionnés en amont et déjà testés in vitro et in vivo (expérience pilote) pour leur biocompatibilité. Lors de la procédure, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. De plus, l’étude de la bibliographie nous a permis de déterminer au nombre de 7 la quantité d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Cela nous permet ainsi de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, reproductibles et permettant à la valorisation des résultats de cette étude. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au strict minimum. Le logiciel Prism 10.0.0 sera utilisé pour mener à bien l'ensemble des analyses statistiques.
Raffinement
Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les rats sont anesthésiés par inhalation gazeuse durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 20 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les rats seront ensuite transférés dans une couveuse chauffante le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les rats seront hébergés en groupe sociaux de 2 individus par cage avec enrichissement physique sous forme de tunnel en carton, un bâton de bois à ronger et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum. De façon générale, un suivi hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-opératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois/semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration d'un analgésique en sous-cutanée toutes les 12h ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours).
Choix des espèces
L’utilisation du rat est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgés de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.