Rats

Le protocole revient à faire passer à des rongeurs l'équivalent préclinique des essais de phase 1 menés sur des volontaires humains sains, pour établir la dose à laquelle une molécule en développement devient toxique. 1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les uns pour des prélèvements, les autres parce qu'ils ont reçu des substances dont le porteur ignore les effets à long terme. En douze semaines, un même animal peut recevoir jusqu'à 336 administrations, subir 64 prélèvements sanguins et passer 60 tests comportementaux, censés mesurer la motricité, la cognition, la douleur, l'anxiété et la dépression, sans qu'aucun de ces tests soit nommé. Le porteur affirme que ces modèles ont une "prédictivité reconnue", au motif qu'ils "répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché".

Objectifs

La nécessité d’évaluer la sécurité des médicaments et des molécules en cours de développement est apparue suite aux accidents thérapeutiques du début du XXème siècle voire aux tragédies comme ce fut le cas pour la thalidomide. Dans ce cadre, l’étude de l’index thérapeutique et de l’innocuité d’une molécule est primordiale. Il s’agit de déterminer les doses à administrer afin d’obtenir la concentration sanguine permettant l’effet recherché mais également d’évaluer la dose à laquelle les premiers effets secondaires apparaissent. Ces études sont fréquemment réalisées sur des rongeurs et pourraient être également considérées comme l’équivalent préclinique des études de phase 1 en développement clinique impliquant des volontaires sains. Dans ce projet, nous proposons d’administrer des composés en cours de développement à des rongeurs puis d’adresser jusqu’à 3 questions interdépendantes : - La première interrogation est de savoir comment le composé se comporte vis-à-vis de l’organisme - Ce projet permet également d’évaluer les éventuels effets secondaires d’une molécule lors de son administration aux doses que l’on souhaite utiliser pour traiter la maladie. Pour cela, des animaux sains sont traités par le composé à tester et leur comportement est observé pour détecter des effets non souhaités. - Finalement, ce projet permet de déterminer la dose d’apparition des effets indésirables. Ceci est réalisé en administrant un composé à une dose supérieure à la dose thérapeutique et à étudier leur comportement pour détecter des effets non souhaités.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la connaissance des effet secondaires des nouveaux médicaments et à la sélection de nouveaux traitements ayant une balance bénéfice/risque la meilleure possible.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront sur une période de 12 semaines un maximum de 336 administrations, de 64 prélèvements sanguins ( en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) et de 60 tests de comportements, ces tests de comportements permettront de mesurer l’impact de la molécule sur le système moteur, cognitif, nociceptif mais aussi sur le niveau d’anxiété ou de dépression des animaux. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les tests de comportement sont généralement courts (entre 30 sec et 5 min) et ne dépasse pas 30 min pour le plus long.

Impact sur les animaux

LLes administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les tests de comportement peuvent induire un inconfort thermique, un stress, une légère désorientation ou des douleurs de courte durée.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu’il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses globales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les analyses du présent projet nécessitent des observations uniquement possibles chez l’animal vivant. De plus, les effets secondaires sont par nature imprévisibles. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 50 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 25 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Une grille de score permet de surveiller les points limites préalablement défini et le devenir de l’animal est évaluer à l’aide d’un arbre décisionnel permettant d’éviter les souffrances inutiles.Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de leur mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des raffinements spécifiques pour chaque procédure seront mis en place.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat. De plus, tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (souris de 4 à 5 semaines et des rats de 6-7 semaines au début du projet). Il s’agit de s’adresser à des animaux dont l’activité spontanée est suffisante pour réaliser les tests proposés.

Un trou percé au dremel dentaire dans le tibia, un implant de titane posé au contact, une solution bactérienne inoculée dans la plaie : 29 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'opération dure dix minutes sous anesthésie fixe, et l'infection osseuse qui suit, une ostéomyélite localisée, fait partie des effets recherchés. Le porteur veut savoir si des bactériophages, seuls ou associés à la vancomycine, viennent à bout d'un staphylocoque résistant à la méticilline, et il précise que cinq des 29 rats sont utilisés uniquement pour que l'opérateur s'entraîne au geste. Le rat a été retenu parce que son tibia est plus gros que celui de la souris, "trop petite" pour que l'implant tienne.

Objectifs

Les infections ostéoarticulaires (ou ostéite) sont des infections qui touchent les os et/ou les articulations. Ce sont des pathologies graves susceptibles d’entraîner un handicap très lourd et parfois de mettre en jeu le pronostic vital. Elles peuvent survenir chez les patients porteurs de prothèse articulaire ou de matériel (clou, plaque, vis…) mais aussi à la suite de traumatismes (fractures ouvertes sans matériel), engendrant des ostéites chroniques. Actuellement, les infections ostéoarticulaires sont le plus souvent dues à des staphylocoques, avec une prédominance des Staphylocoques à coagulase négative et sont traitées par antibiothérapie. Cependant, l’antibiothérapie classique a montré ses limites pour diverses raisons : résistance des souches bactériennes, mauvaise diffusion des antibiotiques dans le tissu osseux, présence de matériel étranger (ex : prothèse) favorisant la formation de biofilm bactérien (lequel protège la bactérie de l’action des antibiotiques). Dans ce contexte, il est donc aujourd’hui nécessaire de trouver des solutions alternatives et/ou complémentaires aux antibiotiques, efficaces pour traiter ces infections. La phagothérapie (usage de bactériophages) apparait aujourd’hui comme une solution pertinente. Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries, d’être inoffensifs pour tous les organismes eucaryotes tels que les mammifères (humains, animaux) et d’être très spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Ils sont déjà largement utilisés chez l’homme en Europe de l’Est mais, s’agissant d’organismes vivants, leur développement en France se heurte à un cadre réglementaire peu clair et inadapté à la phagothérapie dans la conduite d’essais cliniques. De ce fait, les agences règlementaires demandent la réalisation d’études pré-cliniques préalables. Ce projet se déroulera de façon séquentielle et la première étape se divisera elle-même en deux parties : 1. Entrainement de la pose d’implant dans le tibia du rat non infecté. 2. Mise au point du modèle d’ostéite à Staphylococcus epidermidis résistant à la méticilline chez le rat avec matériel étranger ;

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement thérapeutique dans le traitement des infections ostéoarticulaires. L’efficacité de ce traitement permettra d’étendre le champ des possibilités dans la guérison de ces infections pouvant conduire à l’amputation de certains patients suite à l’échec de l’antibiothérapie seule.

Procédures

- Les rats recevront une injection intrapéritonéale (5 secondes) d’un mélange anesthésique. - Un acte chirugical de 10 min subit par l’animal sous anesthésie fixe : Une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué de façon à pouvoir placé l’implant dans un premier temps puis inoculé la solution bactérienne. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur. La phase pilote consistera à calibrer les différentes conditions expérimentales permettant d’induire une infection ostéoarticulaire avec un matériel étranger dans le tibia du rat. La première nuisance sera liée à l’administration du mélange d’anesthésiques. La deuxième nuisance principale est due à la chirurgie en elle-même. Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. Sous anesthésie fixe, une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué à l’aide d’un dremel dentaire de façon à pouvoir placé l’implant en titane. Dans un même temps, l’infection bactérienne sera effectuée au contact de l’implant. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie. Une troisième nuisance également attendue est le développement de l’infection, une ostéomyélite localisée.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (29))afin de récupérer les tibias et implants pour dénombrement bactériens.

Remplacement

Une étude a été réalisée in vitro sur l’efficacité de ce bactériophage sur un grand nombre de souches de S. epidermidis ainsi que dans des modèles de biofilm. Toutefois, l’efficacité de tels composés in vivo peut s’avérer très différente de celle obtenue in vitro tant sur le plan de l’efficacité elle-même que sur la cinétique des phages dans un organisme vivant au niveau du site de l’infection. Également, l’infection ostéoarticulaire est particulière dans le sens où toutes les conditions qui la caractérisent ne peuvent être rassemblées dans un modèle vitro. Enfin, les modèles pré-cliniques sont règlementaires pour le développement de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, au vu du peu d’informations existantes sur ce sujet.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Nos expériences passées nous permettent de tester qu’un seul inoculum pour la mise en place de l’infection ostéoarticulaire. 6 animaux par jour d’autopsie (J7, J12, J21, J28) seront nécessaires pour évaluer la charge bactérienne au cours du temps. De plus, pour la phase d’entrainement, seuls 5 animaux seront utilisés pour l’appréhension du geste technique de la pose d’implant dans le tibia du rat.

Raffinement

Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de l’implant au niveau articulaire sera réalisée sous anesthésie fixe. De plus, une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée. Le suivi post-chirurgical d’une récupération de la mobilité de l’animal sera mis en place. Durant toute l’étude, La nourriture sera placée directement à l’intérieur des cages et des biberons au bec plus long seront également installés afin de faciliter l’accès aux animaux. La litière sera également changée tous les deux jours Le suivi du poids sera effectué tous les deux jours. Enfin, un programme d’enrichissement de l’environnement (igloo, jouet …) sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal préférentiellement utilisé dans la littérature dans ce type d’expérimentation est le rat. En effet, la taille du tibia chez le rat permet un meilleur accès et une meilleure prise d’infection et d’implantation que chez la souris trop petite. Le tibia du rat permet une implantation plus stable et reproductible. Des rats mâles de 250 g seront nécessaires pour la phase pilote.

Vingt rats subissent l'ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes sous anesthésie, dix un simulacre d'opération, puis tous sont transportés trois heures par la route jusqu'au site d'expérimentation. 30 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent l'implantation d'une minipompe sous la peau, cinq séjours de deux jours en cage à métabolisme, quinze injections dans l'abdomen et cinq ponctions de la veine de la queue, pour savoir si des excès de calcium répétés abîment le rein. Le porteur énumère lui-même les atteintes attendues, douleur opératoire, hémorragie, infection de plaie, hypocalcémie, insuffisance thyroïdienne, angoisse en cage à métabolisme et douleur à chaque piqûre.

Objectifs

L’hypoparathyroïdie est une maladie endocrine rare et complexe, caractérisée par une concentration basse ou indétectable d’hormone parathyroïdienne (PTH) entrainant une hypocalcémie et une hyperphosphatémie lorsqu’elle n’est pas traitée. Le traitement conventionnel est une association de métabolite de la vitamine D et de sels de calcium. Un effet secondaire habituel de ce traitement est une hypercalciurie ainsi que des épisodes d’hypercalcémie. Les 2 sont dus à une augmentation de l’absorption intestinale de calcium et à une diminution de la réabsorption tubulaire rénale de calcium, due à l’absence de PTH. L’hypoparathyroïdie et/ou le traitement conventionnel sont associés à une augmentation de la morbidité rénale, sous forme d’une lithiase rénale et/ou d’un néphrocalcinose et/ou d’une insuffisance rénale. Selon les séries, la prévalence de l’insuffisance rénale s’étend de 14 à 41 pour cent, dans tous les cas beaucoup plus élevée que dans la population générale. Epidémiologiquement, le risque d’insuffisance rénale est associé au nombre d’évènements hypercalcémiques et à la durée de la maladie. L'objectif du projet est de déterminer expérimentalement s'il existe un lien de causalité entre la survenue d'épisodes répétés d'hypercalcémie et la survenue d'une insuffisance rénale, et, si oui, d'en déterminer le mécanisme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif principal de déterminer l'éventuel lien de causalité entre épisodes répétés d'hypercalcémie, induite par un surdosage thérapeutique (fréquent en médecine humaine) et la survenue d'une dégradation de la fonction renale, une des principales morbidités observées au cours du suivi des patient.es avec hypoparathyroïdie. La démonstration du lien de causalité aurait 2 conséquences -

Procédures

Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (ou un simulacre) est réalisée, sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes, 1 fois). Les animaux sont transporté du site d'élevage (où a lieu la chirurgie) au site d'expérimentation, par transport routier agréé (3 heures, 1 fois). Un traitement par hormone thyroïdienne dans l'eau de boisson est apporté aux animaux ayant subi une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes pendant 71 jours. Une minipompe sous cutanée est implantée sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes, 1 fois). Les animaux subissent une acclimatation à l'hébergement en cage à métabolisme pour habituation (animal vigile, 3 jours, 1 fois). Dix animaux reçoivent un régime riche en calcium (animal vigile, 3 jours, 5 fois). Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne (animal vigile (1 minute par injection), 3 jours de suite, 5 fois). Les animaux sont hébergés en cage à métabolisme pour recueil d’urine (animal vigile, 2 jours, 5 fois). Un prélèvement sanguin par ponction de la veine de la queue est réalisé chez les animaux (animal vigile, 1 minute, 5 fois); le volume prélevé est conforme aux recommandations. Une euthanasie est pratiquée chez les animaux sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire (10 minutes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissent une chirurgie cervicale : il s’agit d’une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (thyroparathyroïdectomie) chez 20 d’entre eux et d’un simulacre chez 10 d’entre eux. La plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort, la thyroparathyroïdectomie cause une hypocalcémie et une insuffisance thyroïdienne. La chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont transportés du site de l’éleveur au site d’expérimentation par transport routier, ce qui peut induire un stress. Les animaux de tous les groupes subissent une chirurgie sous anesthésie pour implantation de la pompe sous-cutanée : la plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort. Par ailleurs, la chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont hébergés périodiquement en cage à métabolisme : cet hébergement peut être à l’origine d’une perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, d’angoisse et d’intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme. Des injections intrapéritonéales de calcitriol ou de placebo, et d’anesthésiques sont réalisées chez les animaux, causant une douleur au point d'injection. Des ponctions veineuses sont réalisées de manière itérative chez tous les animaux : ces ponctions causent une douleur et peuvent causer une hémorragie.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus pour analyse moléculaires (ARNm et protéines)

Remplacement

La complexité des mécanismes contrôlant la valeur de calcium dans le sang et la fonction rénale est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences des épisodes d'hypercalcémie sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.

Réduction

Trente (30) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.

Raffinement

Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. L’anesthésie est encadrée par une analgésie lors de l’implantation des pompes ; après la chirurgie, l’analgésie est maintenue systématiquement pendant 48 heures. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Lorsqu'un hébergement en cage à métabolisme est nécessaire, les animaux sont préalablement acclimatés à cet environnement, et la durée d'hébergement est réduite au strict nécessaire. Des soins peuvent être mis en place en fonction des signes de souffrance observées (soins médicamenteux, raffinement des conditions d’hébergements, et des techniques de chirurgie etc…). Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande

Choix des espèces

L'espèce étudiée est le rat chez qui l’homéostasie du calcium est proche de celle de l’humain et chez qui la thyroparathyroïdectomie est techniquement réalisable. La stade de développement est celui du jeune adulte, ce qui correspond à l’âge auquel sont souvent réalisées les thyroparathyroïdectomies chez l’humain.

Soumis à une chirurgie du cerveau de 45 à 90 minutes, puis à des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines et à des tests comportementaux d'une heure par jour pendant neuf semaines, 612 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neurotoxine leur est injectée pour reproduire une maladie neurodégénérative, et certains auront besoin d'une alimentation enrichie pour continuer à se nourrir. Tous sont tués à l'issue pour que leur cerveau soit observé au microscope et que l'activité de leurs neurones soit enregistrée sur des tranches, dans un projet portant sur les troubles de l'humeur associés à la maladie de Parkinson. Le porteur qualifie les nuisances des tests comportementaux de "très modérées" et ses gestes chirurgicaux de "très bien maîtrisés", sans nommer aucun des tests qu'il fait subir aux rats pendant ces neuf semaines.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser l’implication d’une communication neuronale entre deux structures cérébrales chez le rat dans les effets délétères sur l’humeur d’une maladie neurodégénérative et de l’un de ses traitements. Ce projet met en œuvre des approches de biologie moléculaire, des approches électrophysiologique et des approches comportementales chez des animaux sains et des animaux malades

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir une compréhension de certains troubles de l’humeur dans une maladie neurodégénérative. Ce projet conduira à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à ces troubles suite, ou non, a un traitement. L’identification des circuits impliqués dans ces troubles permettra ensuite d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Intervention numéro 1: Une chirurgie cérébrale d'une durée de 45 minutes. Un enregistrement électrophysiologique in vivo sous anesthésie. Intervention numéro 2: chirurgie cérébrale d'une durée de 45 minutes. Des injections quotidiennes (1 par jour, quelques secondes) dans l'abdomen pendant 2 semaines. Des tests comportementaux d'1h par jour environ pendant 9 semaines au total. Intervention numéro 3: chirurgie cérébrale d'une durée de 60 minutes. Intervention numéro 4: chirurgie cérébrale d'une durée de 90 minutes). Des injections quotidiennes intrapéritonéales pendant 2 semaines (1 par jour, quelques secondes). Des tests comportementaux d'1h par jour environ pendant 9 semaines au total.

Impact sur les animaux

Suite à la mise en place de la pathologie neurodégénérative, certains animaux nécessiteront une assistance particulière avec supplémentation en nourriture riche. Les injections dans l'abdomen, individuellement très bien tolérées et peu douloureuses, pourraient par leur répétition entraîner une souffrance légère et des hématomes bénins. Les approches comportementales induiront des nuisances très modérés (stress) en cas de contention temporaire. Les procédures chirurgicales et suites opératoires peuvent induire des nuisances modérés comme une perte de poid légère et passagère, mais ces approches sont très bien maitrisées au sein de l'équipe. Enfin, l'isolement de certains groupes d'animaux peut être lié à un stress modéré de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour les analyser au microscope et enregistrer l’activité des neurones sur des tranches de cerveau.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront à,la fois l’évaluation comportementale et électrophysiologique. De plus, de telles expérimentations chez l'homme sont impossibles

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables, en se basant sur des procédures similaires réalisées auparavant. L’utilisation des outils statistiques appropriés nous permettra également de gagner en puissance statistique et donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des expérimentations se feront sur des cohortes distinctes plus petites. Ainsi, à l’issue de la première session, si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives des différents paramètres étudiés, il ne sera pas nécessaire de faire appel à une seconde session.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée et ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress lié à l'isolement relatif et aux manipulations. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi et les pesées quotidiennes des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et de points limites adaptés. Un analgésique pourra également être injecté si nécessaire. Les animaux nécessitant une assistance particulière suite à l’injection de la neurotoxine seront supplémentés en nourriture riche.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux neuronaux sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les comportements explorés et les tests associés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Les animaux utilisés sont des animaux adultes de 8 à 10 semaines, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales.

Gavés une fois d'une dose de pyréthrines ou de pipéronyl butoxide diluée dans de l'huile végétale, après quatre heures de jeûne suivies de six autres, 50 rats Wistar mâles passent 72 heures en cage métabolique individuelle pour que leurs urines et leurs fèces soient recueillis à huit reprises. La procédure implique un niveau de souffrance modéré, et c'est le séjour en cage métabolique et le jeûne de dix heures qui la classent ainsi, non la substance testée. Le projet vise à décrire pour la première fois le devenir des pyréthrines chez un mammifère, préalable annoncé à une biosurveillance humaine. Tous les rats restent vivants et sont ensuite réutilisés en travaux pratiques d'enseignement, sans que le RNT dise ce qui leur arrive à ce stade, ni pourquoi seuls des mâles sont utilisés au-delà de la mention de "recommandations en vigueur".

Objectifs

L'étude des expositions alimentaires aux résidus de pesticides est un réel enjeu de santé publique. En étudiant comment les substances circulent dans notre organisme, sont transformées et sont éliminées (toxicocinétique) et en développant des méthodes pour mesurer ces produits de transformation (métabolites), on peut mieux estimer les risques liés à l'exposition. Les Pyréthrines sont des produits utilisés en agriculture biologique, fabriqués à partir de fleurs de pyrèthre de Dalmatie ou de certains chrysanthèmes. Leur mécanisme d’action cible le système nerveux des insectes, mais peut aussi être toxique pour les poissons. Aucune étude sur le devenir des pyréthrines chez les mammifères n'est disponible. Seule une étude réalisée chez l’Homme rapporte la présence de deux métabolites pouvant être ceux des pyréthrines. Ainsi cette étude a pour objectif de confirmer que ces deux métabolites identifiés sont bien spécifiques à l'exposition aux pyréthrines et d’en étudier la toxicocinétique, ce qui n’a jamais été réalisé. Cette étude représente une étape préliminaire au développement de méthodes de biosurveillance aux pyréthrines chez l’Homme, que ce soit pour les professionnels de l’agriculture ou la population générale. D’autre part, le Pipéronyl Butoxide (PBO) est une substance qui, lorsqu'elle est combinée avec des insecticides, les rend plus puissants en empêchant les insectes de s'en débarrasser facilement. Le PBO est le plus souvent utilisé avec les pyréthrines et les pyréthrinoïdes (dérivés synthétiques des pyréthrines). Ce projet vise également à évaluer la toxicocinétique du PBO chez le rat car à ce jour peu de données sont retrouvées dans la littérature scientifique (1 seule étude disponible ne permettant pas de caractériser les métabolites). Une meilleure connaissance de la toxicocinétique du PBO permettra d’identifier les métabolites formés et de mettre au point leur dosage. Les deux substances étudiées ici présentent des dangers potentiels pour la santé humaine telle des affections des systèmes endocriniens, nerveux et reproducteur. Il est donc primordial pour la prévention de la santé de l’ensemble de la population de mieux connaître leurs toxicocinétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la toxicocinétique et de caractériser les métabolites des Pyréthrines et du PBO. A notre connaissance, la toxicocinétique des pyréthrines n'a jamais été décrite dans la littérature. Celle du PBO n'a été réalisée que dans une seule étude mais elle n'a pas permis de caractériser les métabolites. Une meilleure connaissance de ces paramètres permettra d'adapter les mesures de prévention pour la santé des populations.

Procédures

Après 7 jours d’acclimatation à l’animalerie, les rats seront placés en cages métaboliques pendant 24h afin de les acclimater à la cage métabolique. Au 8ème jour, les rats seront mis à jeun pendant 4 heures puis une dose de pyréthrines ou de PBO leur sera administrée en une seule fois par gavage (durée du geste : 15 à 20 s). La substance d'intérêt sera diluée dans un volume d’huile végétale adapté selon le poids du rat. Le jeûne sera maintenu pendant 6 heures supplémentaires après le gavage. La durée de mise à jeun de 10 heures au total permet d’éviter la variabilité interindividuelle de l'absorption de substances en raison d'une consommation alimentaire variable d’un individu à l’autre. L’eau sera disponible à volonté durant cette période de jeûne. Après le gavage, les rats seront replacés en cages métaboliques pendant 48 heures, afin de pouvoir recueillir les fèces et urines à 30 minutes, 1 heure, 3 heures, 6 heures, 9 heures, 12 heures, 24 heures et 48 heures, ceci dans le but d’étudier la vitesse d’élimination des substances et des métabolites identifiés.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite un séjour des rats de 72 heures en cage métabolique (24h d'acclimatation à la cage métabolique et 48h pour l'étude et le recueil des fèces et urines). L'acclimatation de 24h en cage métabolique est nécessaire dans le cadre de notre étude pour ne pas influencer les excrétions d'urines et de fèces qui seraient liés au stress lié à la mise en cage métabolique juste après le gavage des animaux. De plus, une mise à jeun pour une durée totale 10 heures (4 heures avant et 6 heures après le gavage) est nécessaire afin de diminuer la variabilité inter-individuelle d'absorption. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

50 rats Wistar seront utilisés lors de cette étude et soumis à une procédure de gravité modérée. Tous les rats seront maintenus en vie à la fin de la procédure et seront réutilisés pour d'autres projets (enseignement/travaux pratiques).

Remplacement

L'étude de la toxicocinétique des Pyréthrines et du PBO ne peuvent pas être évaluées sur des cellules ou tissus isolés car il est nécessaire d’étudier la réponse d’un organisme entier à ces substances. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports en pyréthrines et PBO en phase d'exposition ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives aux études de toxicocinétique chez les rongeurs. Ce protocole utilise trois doses de Pyréthrines afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Selon une évaluation statistique et ce qui a été décrit dans la littérature scientifique concernant la toxicocinétique du PBO seul et des pyréthrines seules, un nombre minimal de sujets nécessaires a été estimé à dix rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. Ce protocole n’utilisera que des rats mâles, des animaux de sexe féminin ne seront pas utilisés. Le choix du sexe est fait en fonction des recommandations en vigueurs.

Raffinement

Ce protocole ne fait appel qu'à des procédures légères ou modérées. Les rats seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Les rats seront nourris avec un régime standard qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ils seront hébergés dans des cages à 25°C et 30-50% d’hygrométrie, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum, sauf pendant la période de jeûne. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts définis. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi comme préconisé par les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques. De plus, le modèle de rat Wistar correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable et sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude. De plus, l'étude sur le Pipéronyl Butoxyde a été réalisée sur un modèle de rat. Réaliser cette étude dans des conditions similaires permettra de comparer et d’enrichir les données décrites dans la littérature scientifique avec l’analyse des résultats de cette étude. Les rats seront âgés de 6 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 7 semaines à la fin de l'étude. L'âge des animaux s'appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives à l'étude de la toxicocinétique chez les rongeurs. Suite à une décision de l'équipe, les rats utilisés dans cette étude sont le plus jeune possible afin de pouvoir être réutilisés sur un autre projet (enseignements/travaux pratiques).

Mis au régime gras avec leur mère, ou injectés d'un vecteur viral dans la veine jugulaire au premier jour de vie sans anesthésie, des ratons passent ensuite des échographies du cœur sous anesthésie, des ECG éveillés et, pour une partie, des gavages de glucose et sept prises de sang au bout de la queue en deux heures à chaque test. 1 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude cherche comment le déséquilibre métabolique de la mère altère le développement du cœur des petits. Le porteur décrit des actes "très rapides et peu douloureux", et signale par ailleurs que le vecteur viral peut provoquer une insuffisance cardiaque, que des mères rejettent ou mutilent les ratons manipulés et que certains rats meurent sous anesthésie sans pouvoir être réanimés malgré l'intubation.

Objectifs

L'obésité est un problème majeur de santé publique et sa prévalence croissante contribue à augmenter l’incidence de maladies cardiovasculaires. L'épidémie de surpoids touche les femmes enceintes et des études épidémiologiques rapportent que les enfants nés de mères obèses présentent un risque accru de cardiopathies congénitales et, à l’âge adulte, des taux plus élevés d'événements cardiovasculaires et de mortalité. Cependant, il existe une véritable lacune dans nos connaissances sur l’origine des mécanismes moléculaires conduisant au développement de ces pathologies cardiaques.Notre objectif est d’établir l’impact du dysmétabolisme périnatal sur le développement de l’insuffisance cardiaque d’origine congénitale. Nous proposons une étude longitudinale sur la descendance pour caractériser la chronologie des altérations cardiaques et les défauts d’organisation postnataux des cardiomyocytes. Nous étudierons les voies (moléculaires, métaboliques) impactées (précocement ou plus tardivement) par le dysmétabolisme maternel pouvant expliquer les altérations développementales du cœur et, pour in fine, identifier des signature spécifiques et biomarqueurs potentiels

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhension du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines d'intérêt identifiées au laboratoire dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Une partie des animaux seront mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les génitrices (2 mois avant la reproduction et pendant la durée de reproduction et lactation). Les géniteurs seront sous régime riche en gras uniquement pour la reproduction. Les petits seront sous le régime maternel correspondant (riche en gras ou contrôle) jusqu’au sevrage (20 jours de vie). Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront réalisées sur animaux vigiles. Le gavage de glucose, procédure très rapide (quelques secondes) sera réalisé à deux stades : 20 et 60 jours de vie pour tester la tolérance au glucose. Le test de tolérance à l'insuline sera réalisé par injection intrapéritonéale aux 2 stades (20 et 60 jours de vie). Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue (quelques secondes) est effectué sur les animaux vigiles et permet de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte sera répété 7 fois en 2 heures pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le phénotypage cardiaque sera réalisé par échocardiographie (15 minutes), sous anesthésie gazeuse légère, pour d'obtenir de nombreux paramètres morphométriques et hémodynamiques. Les mesures seront effectuées aux 2 temps, 20 et 60 jours de vie (soit 2 fois pour chaque animal). L’électrocardiogramme (ECG) de surface sera réalisé aux mêmes temps à 20 et 60 jours de vie : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie (animaux vigiles) et sera réalisée dans la foule de l'échographie pour réduire le nombre d'interventions. Les animaux sont placés dans un tunnel en plexiglas aéré, les quatre pattes positionnées sur des plaques métalliques permettant de suivre le rythme cardiaque. Une seconde partie des animaux vigiles seront soumis à une injection de virus (AAV) par voie systémique à 1jour de vie (veine jugulaire facilement visible à ce stade). L'intervention est très rapide (quelques secondes). Ils seront phénotypes par ECG de surface et échographie, aux 2 stades (20 et 60 jours de vie). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation. Les tests métaboliques peuvent induire : une sensation de faim lors de la mise à jeun des animaux, une irritation de l'oesophage lors des administrations per os, une légère douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales et des prélèvements de sang. Les prélèvements peuvent induire également une irritation de la queue de l'animal.

Devenir

A l'issue de cette étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (n=1350) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 20 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablement frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont agrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, bâton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anesthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anesthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anesthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont très rapides et peu douloureux. Un analgésique est administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, déshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du cardiomyocyte, qui se fait en postnatal (d'où les stades 5, 20 et 60 jours de vie). - Afin d'étudier le rôle de la protéine d’intérêt sur le développement myocardique (d'où l'injection à 1 jour postnatal). Les rats sont utilisés dès le premier jour après la naissance, et euthanasiés à 2 mois post injection. Ce stade correspond au stade suffisant du développement du remodelage cardiaque. C'est également le stade de maturité totale du myocarde.

74 464 rongeurs, 59 624 rats et 14 840 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par voie orale chaque jour, les femelles subissent des lavages vaginaux avant accouplement, et les petits nés dans les études sont soumis à des tests de développement physique, sexuel et neurologique, à des examens ophtalmologiques, à des mesures du tibia et de la distance ano-génitale ainsi qu'à des prélèvements de sang et d'urine. Les effets attendus portent sur toutes les étapes de la reproduction : accouplement, nidation, gestation, mise bas, lactation, comportement maternel et développement des descendants. Le porteur présente ces essais comme "indispensables" dans un dossier de mise sur le marché et "nécessaires règlementairement", et note qu'aucun modèle in vitro ne couvre l'ensemble de la fonction de reproduction.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché d’un médicament ou d'enregistrement d'un produit chimique et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).

Bénéfices attendus

A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.

Procédures

Les animaux sont traités, le plus souvent par voie orale de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits issus des portées pourront être soumis à des tests non invasifs de suivi de développement physique, sexuel ou de maturité sexuelle et neurologiques/comportementaux, ainsi qu’à des observations ophtalmologiques. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur et pourront faire l’objet d’une mise à jeun préalable .

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. De l’inconfort et du stress liés aux procédures elles-mêmes (contention, administration, sédation/anesthésie, l’hébergement individuel (quand nécessaire), observations et mesures (lavages vaginaux, examens ophtalmologiques, mesure de la taille du tibia ou de la distance ano-génitale, tests de suivi de développement ou de maturité sexuel(le), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques) et/ou prélèvements) et des effets systémiques liés au produit administré (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont actuellement pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e) : poids corporel, évaluation de la consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée, revue par un vétérinaire (le cas échéant) et si un ou plusieurs points limites sont atteints, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Les rongeurs sont hébergés en groupe la plupart du temps à l’exception de certaines situations expérimentales ou sanitaires exigeant l’hébergement individuel.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces de choix, le rat étant celle qui est la plus fréquemment utilisée. En effet: - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits issus des portées, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance). Dans d’autres études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement et selon les lignes directrices/recommandations règlementaires) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).