Rats

Injectées tous les deux jours pendant neuf jours avec une molécule qui déclenche une crise migraineuse, 320 rates subissent ensuite l'application d'un filament sur la face pour mesurer leur hypersensibilité à la douleur. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les rates sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus nerveux. L'objectif porte sur le rôle des astrocytes dans le déclenchement de l'allodynie, avec la perspective annoncée de nouvelles cibles contre la douleur chez l'être humain. Les nuisances attendues sont estimées à partir de travaux menés sur des rats mâles, alors que le projet porte sur des femelles.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation. En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.

Procédures

Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min/ sans réveil) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux (test d'allodynie suite à l'application d'un filament au niveau de la face) seront réalisés (habituation+test: 35min/ test de la face tous les 2 jours).

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec le modèle NTG ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Ce modèle a été réalisé sur des rats mâles, dont les nuisances sont le développement de l'allodynie mécanique au niveau de la zone péri orbitale après l'application de filament de vF (modérée). Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de NTG.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

Des anticorps prélevés chez des patients sont injectés dans le cerveau de rats, par une chirurgie de trente minutes qui pose aussi une pompe délivrant un traitement en continu pendant dix à quinze jours. 480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'exposition est répétée à trois stades, au douzième jour de gestation, au douzième jour après la naissance et à l'âge adulte, pour voir si la kétamine protège des convulsions et des troubles du comportement provoqués par ces anticorps. Le porteur écrit que les tests comportementaux employés "ne provoquent pas de douleurs et sont peu contraignants", sans en nommer un seul, alors qu'ils servent à mesurer des convulsions et des séquelles.

Objectifs

Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour assurer la sécurité de l’organisme et lutter contre les infections. Malheureusement, dans certaines situations, la production par le système immunitaire d’anticorps anormaux qui attaquent des protéines présentes à la surface des neurones entraînent des maladies neurologiques et psychiatriques graves. L’expression aberrante d’anticorps s’attaquant aux certains récepteurs du glutamate est par exemple la cause d’une forme très sévère encéphalite (inflammation du cerveau). Ces anticorps provoquent de l’épilepsie, des maladies mentales, et de l’autisme chez l’enfant. Ils peuvent entraîner des séquelles irréversibles. La prise en charge actuelle de cette maladie repose sur l’administration d’immunosuppresseurs et d’antiépileptiques qui restent malheureusement peu efficaces. L’administration de kétamine, un anesthésique qui bloque ces mêmes récepteurs, pourrait représenter un traitement prometteur de cette maladie grâce à son activité antiépileptique et ses effets contre l’anticorps lui-même. Malheureusement, les mécanismes d’action de la kétamine et son efficacité dans le traitement des encéphalites sont encore mal connus. L’objectif de ce travail est d’étudier à différents stades du développement neurologique, l’effet protecteur potentiel de la kétamine sur les convulsions et les troubles du comportement causés par les auto-anticorps. Pour mimer la maladie, nous allons exposer le cerveau de rats à des anticorps de patients à trois stades différents du développement cérébral: au 12ème jour de gestation pendant le développement embryonnaire (correspondant au 2ème trimestre de grossesse chez l’Homme), au 12ème jour postnatal pendant la période critique du développement cérébral, et à l’âge adulte après le 60ème jour post-natal. L’administration de kétamine en parallèle permettra de tester son effet protecteur potentiel. Nous analyserons pour cela l’impact des anticorps et les bénéfices escomptés de l’administration conjointe de kétamine sur le comportement et la survenue de convulsions chez les animaux traités. Les approches comportementales de ce projet pour mesurer les séquelles nécessitent d’utiliser des animaux.

Bénéfices attendus

La prise en charge actuelle de cette maladie repose sur l’administration d’immunosuppresseurs et d’antiépileptiques qui restent malheureusement peu efficaces. L’administration de kétamine, un anesthésique qui bloque ces mêmes récepteurs, pourrait représenter un traitement prometteur de cette maladie grâce à son activité antiépileptique et ses effets contre l’anticorps lui-même.

Procédures

Injection dans le péritoine d’anticorps (5minutes) et de traitements(21 jours). 1 chirurgie d’injection Intra-cérébrale et implantation d’un système de délivrance de traitement en continu.1 chirurgie (durée 30 min) d’injection Intra-cérébrale et implantation d’un système de délivrance de traitement en continu (delivrance pendant 10 à 15 jours).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie 2/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental

Devenir

Mise à mort à l'issue des procédures pour effectuer les études histologiques

Remplacement

L’objectif du projet est de comprendre le rôle néfaste joué par les anticorps dirigés contre des protéines présentes à la surface des neurones, et d’évaluer l’effet protecteur de la kétamine sur les symptômes causés par ces anticorps. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d’administration intracérébrales et sous-cutanées, avec des tests comportementaux, des enregistrements cérébraux, et de l’imagerie et l’activité des neurones. Le recours à l’animal est indispensable pour répondre à ces objectifs.

Réduction

La règle des 3R a été mise en place dans la conception de notre projet et une planification précise des expériences a été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides. Nous proposons ainsi un projet portant sur 480 rats (réduction), avec un nombre de 12 animaux par groupe

Raffinement

Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux avant et tout au long des protocoles (raffinement), notamment en assurant un enrichissement adéquat de leur milieu: papier tressé pour les mères, tunnels en carton dans des cages d’hébergement conçues pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement par des personnels compétents et formés. Les douleurs consécutives à la chirurgie seront soulagées à l’aide des molécules les plus adaptées au protocole et à l'état des animaux. Aucune des données recueillies sur les molécules à visée thérapeutique injectées par voie intrapéritonéale ne prédisent que ces injections seront douloureuses. Néanmoins, l’état des animaux sera particulièrement surveillé durant le temps de ces injections et des mesures adaptées seront prises dans la cas contraire. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet ne provoquent pas de douleurs et sont peu contraignants pour les animaux. Des points limites suffisamment prédictifs sont définis pour limiter la souffrance tout au long de la vie de l'animal. En cas de souffrance ou de détresse persistante, les animaux seront mis à mort dans des conditions qui évitent souffranc

Choix des espèces

Le rat est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. L’impact des anticorps contre une population des protéines à la surfaces des neurones excitatrices et le potentiel protecteur de la kétamine seront évalués à trois stades du développement cérébral: - entre le 10ème et le 18ème jour de gestation, correspondant au 2ème trimestre de grossesse chez l’Homme où se forment les réseaux neuronaux. - entre le 10ème et le 15ème jour post-natal, correspondant à une fenêtre critique du développement cérébral chez l’enfant. - chez l’adulte de plus de 60 jours, à un stade ou le cerveau est arrivé à maturité. Les conséquences de ces expositions seront systématiquement caractérisées à l’aide de tests comportementaux appropriés à l’âge adulte.

Les rats reçoivent dans la vessie une instillation d'isothiocyanate d'allyle, principal composé de l'huile de moutarde, qui y provoque une inflammation sur laquelle l'établissement teste les candidats médicaments de ses clients. 1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'instillation dure une trentaine de minutes sous anesthésie, la sensibilité abdominale est mesurée en appliquant des filaments de Von Frey pendant deux à trois minutes, et les animaux reçoivent des administrations quotidiennes de molécules dont le porteur écrit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles". L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur invoquant son expérience pour fixer dix animaux par groupe et annoncer cinq études par an, soit 1 500 rats sur cinq ans.

Objectifs

L'inflammation joue un rôle important dans la plupart des pathologies de la vessie et représente une réaction de défense à une lésion physique, des substances chimiques, des micro-organismes ou d'autres agents pathogènes. Cette inflammation entraîne notamment une augmentation de la perméabilité vasculaire vésicale. Le projet proposé permettra d’évaluer l’effet de candidats médicaments sur l’œdème vésical et la douleur associée à l’inflammation. Dans la littérature, il est décrit que l’instillation intravésicale d’huile de moutarde ou de son principal constituant, l'isothiocyanate d'allyle (AITC) provoque une forte réaction inflammatoire dans les tissus de la vessie, entraînant une extravasation.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les pathologies vésicales.

Procédures

Tous les animaux vont recevoir des administrations de candidats médicaments (voie, fréquence dépendant de chaque protocole expérimental mais des administrations quotidiennes per os, intrapéritonéales, sous-cutanées ou intraveineuses seront classiquement les plus utilisées). Cependant, ces gestes étant réalisé par du personnel qualifié et avec de l’expérience, ces gestes seront très rapides (1 min). Les animaux seront anesthésiés et recevront une instillation vésicale de produit irritant la vessie. Lors de cette procédure, les animaux seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées (classiquement instillation de 30 min). Les animaux seront placés dans un set-up de Von Frey et des filaments de différentes forces seront appliqués sur l’abdomen (au niveau de la vessie). Cette méthode est non invasive et est très rapide (environ 2-3 min par animal). Les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique sans réveil car l’anesthésique utilisé est le seul qui n’a pas d’effet sur la contrcation de la vessie et auront des administrations de composés et des prélèvements sanguins (gestes très rapides 1-2 min).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ce modèle crée une inflammation vésicale donc les animaux pourront avoir les mêmes symptômes que chez l’Homme (sensation de « brûlure » lors des mictions, œdème vésical, gène pour uriner, mictions fréquentes…).

Devenir

L’anesthésique utilisé étant un anesthésique irréversible (l’animal ne peut pas se réveiller) tous les animaux de l’expérience sont mis à mort à la fin et des prélèvements de sang et des tissus seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes expérimentaux. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Nous pensons réaliser 5 études par an avec un total de 1500 animaux pour 5 ans.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. De plus un enrichissement (type tunnel et aspen brick) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux se feront en utilisant des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un mauvais état général (prostration, perte de poids importante, pâleur, plaie…), celui-ci serait observé plus attentivement, soigné s’il avait une blessure et séparé de ces congénères si son état le nécessitait, réhydraté si besoin. L’accès à la nourriture pourra être facilité (directement dans la cage). Si après les premiers soins, son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’instillation intravésicale d’huile de moutarde ou de son principal constituant, l'isothiocyanate d'allyle (AITC) provoquant une forte réaction inflammatoire dans les tissus de la vessie chez le rat est très bien décrite dans la littérature. Nous utiliserons des rats âgés d’au moins 7 semaines afin d’avoir des jeunes adultes matures en accord avec la littérature.

Un rat dont l'état se dégrade ou ne s'améliore pas après 72 heures de soins est tué sur-le-champ, par décapitation ou exsanguination s'il a déjà passé des tests comportementaux qui exigent le prélèvement de son cerveau. 1 920 rats mâles et femelles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Opérés pour recevoir un cathéter dans la veine jugulaire et, quand l'équipe enregistre leurs neurones, des injections dans le cerveau avec pose d'une fibre optique, ils prennent de la cocaïne, et les femelles subissent sept jours de prélèvements vaginaux quotidiens. L'équipe teste si les hormones sexuelles, dont la progestérone, les protègent de la rechute, sans décrire les tests comportementaux employés. Le porteur décrit une perte de poids et une hyperactivité liées à la cocaïne, tout en affirmant que la littérature "ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne".

Objectifs

Les objectifs de ce protocole sont triples : - Premièrement, tester l’effet des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne - Deuxièmement, étudier comment l’activité des neurones d'une partie du cerveau, appelée insula, est modulée par les hormones sexuelles lors de la rechute à la cocaïne - Troisièmement, étudier si la manipulation de l’activité des neurones de cette partie du cerveau influence la rechute à la cocaïne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones d'une partie du cerveaux (insula) dans l’effet protecteur des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne chez les rats mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement basé sur les hormones sexuelles qui sont déjà des molécules pharmacologiques approuvées par l’ANSM (Agence Nationale de la Santé et du Médicament).

Procédures

Les animaux subiront deux types d’intervention chirurgicales, la pose d’un cathéter dans la veine jugulaire qui durera 30 minutes et des injections intracérébrales ainsi qu’une implantation de fibre optique (durée 1h30) quand nécessaire pour enregistrer d’activité des neurones. Enfin, chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal (durée 10 secondes) quotidien. Les males seront manipulés de la même façon sans prélèvement pour éviter tous biais expérimentaux.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de matériel (crâne, cou, abdomen). La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors des premières sessions, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent un poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivité des animaux qui disparaît 1 heure après la fin de la prise de drogue. La littérature ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne et il n’y a pas de syndrome de sevrage (tremblement, perte de poids) dans les modèles animaux de prise de cocaïne.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous avons utilisé un logiciel statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous utiliserons ainsi 1920 animaux sur cinq ans.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives, pour limiter le stress de l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales. Les cages seront enrichies en nids en coton et bois. Avant la chirurgie et après anesthésie, un antalgique sera administré en sous-cutané afin d’éviter la souffrance opératoire. Un anesthésiant local en crème sera appliqué (en plus de l’anesthésie) 10 minutes avant l’incision. La chirurgie sera effectuée en conditions stériles. Si infection, le vétérinaire référent mettra en place un traitement antibiotique approprié. Après chirurgie, l’expérimentateur suivra quotidiennement l’animal (prise alimentaire, qualité du poil, locomotion) et le pèsera pendant 4 jours jusqu’à stabilisation du poids. Du baume cicatrisant sera appliqué sur les sites d’incision si mauvaise cicatrisation. Si douleur post-opératoire, nous procèderons ainsi : Points limites et les critères d’arrêt : Stade 1 : Normal (pas d’action). Si perte de poids jusqu’à 10% du poids initial une injection sous-cutanée (s.c.) de saline sera réalisée et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 2 : Perte de poids qui persiste 24h post chirurgie avec des signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Une injection s.c. d’antalgique et de saline seront réalisées et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 3 : Perte de poids qui persiste 48h avec des signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Une injection s.c. de d’antalgique, de saline, et de glucose en intrapéritonéale (i.p.) seront réalisées et de la nourriture humidifiée sera au sol. Une seconde injection de d’antalgique et de saline pourra être réalisée à 72h si pas d’amélioration. L’animal sera euthanasié si son état est prolongé au-delà de 72h sans amélioration. Stade 4 : Etat de l’animal ne pouvant être pris en charge par médication et engendrant de la souffrance, ou état qui ne s’améliore pas voire se dégrade au-delà de 72h même avec une prise en charge. Conduit à une euthanasie immédiate par décapitation ou exsanguination si animal a déjà réalisé des tests comportementaux nécessitant le prélèvement du cerveau pour analyses histologiques. Dans les deux, une injection s.c. d’antalgique puis i.p. d’euthanasiant seront réalisées avant le sacrifice.

Choix des espèces

Les rats sont un modèle largement utilisé pour l’étude des neurones impliquées dans les troubles de la consommation de drogues. L’administration de cocaïne est utilisée depuis de nombreuses années et largement décrit dans la littérature, et l’injection d’hormones sexuelles est une manipulation facile à conduire. De plus, les régions cérébrales d’intérêt de notre étude possèdent la même structure chez le rat que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones des aires cérébrales ciblées matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux âgés de 10 semaines.

12 050 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque rat subissant jusqu'à onze prélèvements sanguins et chaque souris jusqu'à sept. Les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant sept jours au maximum, par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, et jusqu'à quatre prélèvements par ponction rétro-orbitale ou submandibulaire sont pratiqués sous anesthésie gazeuse. Une partie des animaux arrive déjà cathétérisée, d'autres reçoivent une pompe osmotique implantée, et la collecte des excreta impose un séjour en cage à métabolisme dont le porteur reconnaît qu'il induit un stress. Le bénéfice mis en avant est de "réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie", pour un projet qui en mobilise lui-même 12 050.

Objectifs

L’objectif du projet est la mesure des paramètres pharmacocinétiques chez le rat et la souris. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Les informations obtenues impactent la progression des produits dans le projet, le design par les chimistes d’analogues ayant des meilleures propriétés pharmacocinétiques, ou les protocoles d’études de pharmacologie in vivo (choix de la dose, de la voie d’administration, et de la fréquence d’administration (une fois ou deux fois par jour).

Bénéfices attendus

La connaissance des propriétés pharmacocinétiques d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. Ces études permettront un lien avec les prévisions faites à partir des modèles in vitro. Ce lien entre données in vivo et données in vitro est critique pour prédire la pharmacocinétique chez l’homme, où seulement des données in vitro sont disponibles aux stades précoces de la recherche. Les données fournies permettront la sélection de meilleurs candidats pour les tests précliniques. Toutes les données obtenues sur les produits d’un projet permettront aux chimistes de concevoir des molécules ayant des propriétés pharmacocinétiques optimisées donc de réduire le nombre d’animaux utilisés avant d’obtenir un candidat médicament.

Procédures

Administration des composés à tester, par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour jusqu’à 7 jours : durée quelques secondes (ou quelques minutes de perfusion) à chaque administration, sur animaux vigiles sauf dosages IV (anesthésie isoflurane). Prélèvement sanguin, 7 fois maximum pour la souris et 11 fois maximum chez le rat pendant l’étude, durée quelques secondes sur animaux vigiles si prélèvements en veine caudale, saphène ou submentale. Les prélèvements en veine submandibulaire ou rétro-orbital (maximum 4 sur la durée de l’étude) sont effectués sous anesthésie isoflurane. Pose de pompes osmotiques sous anesthésie Isoflurane chez la souris : 15 min par animal avant le début de l’étude.

Impact sur les animaux

Au cours des études de ce projet, les composés sont en général testés pour la première fois sur l’animal entier. Tous les signes cliniques sont donc surveillés et enregistrés. Au cours des administrations ou prélèvements, les animaux seront manipulés avec douceur afin de leur éviter le stress de la manipulation. L’injection IV peut provoquer un inconfort passager de 30 secondes qui sera limité par l’anesthésie gazeuse légère de la souris. La toxicité cellulaire des composés est évaluée en amont des études in vivo et seuls les composés ne présentant pas de toxicité à la dose administrée en vivo seront testés chez l’animal. Dans ce contexte, nous n’attendons pas de réaction important lors de l’administration de nos composés en in vivo. Des points limites ont été établis, permettant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés. Le volume de sang prélevé et le nombre de prélèvements sera adapté en fonction du poids des animaux inclus dans l’étude. La collecte des excreta implique de mettre les animaux en cage à métabolisme, ce qui induira un stress pour ces animaux.

Devenir

A la fin de nos études, tous les animaux sont mis à mort de façon ethique. Pour des raisons éthiques, les animaux cathétérisés ne peuvent pas être réutilisés dans nos procédures pendant plus d’une semaine après réception. Pour les animaux non cathétérisés, nous prélevons des organes à la fin de nos administration afin d'évaluer la concentration des nos composés dans les tissus. De plus, nous pourrions observer des risques pour la validité des résultats car les animaux, réutilisés après la periode de réccuperation, seront décalés en poids, en âge et en physiologie par rapport à ceux utilisés dans les modèles de pharmacologie, donc moins prédictifs.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et établir des corrélations in vivo/in vitro qui permettront d’avoir une prévision fiable des propriétés pharmacocinétiques chez l’homme.

Réduction

Les composés testés in vivo ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés in vitro. Un grand nombre de composés synthétisés sont donc éliminés sur la base des résultats des tests in vitro et ne sont pas évalués in vivo. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable pour l’objectif de l’étude. Ainsi dans le premier test d’un nouveau composé en pharmacocinétique, 2 animaux sont utilisés pour la voie intraveineuse et 3 animaux pour la voie extravasculaire pour décrire la pharmacocinétique des produits. Une étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples, qui permet aussi une réduction du nombre des animaux impliqués dans les études. Des mélanges de produits peuvent être administrés pour sélectionner les meilleurs produits en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (exemple : 3 produits administrés en mélange à 2 animaux au lieu de 3 fois 2 animaux si les composés sont administrés séparément).

Raffinement

A l’arrivée des animaux : Contrôler que le dispositif des animaux cathétérisés est bien mis en place et qu’il n’y a pas de lésion particulière. Si c’est le cas, mis à mort sur avis du vétérinaire. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi dès leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Cet enrichissement sera adapté pour les animaux cathétérisés (pas de maison, risque de dommages au cathéter). Afin de minimiser l'inconfort du au procédures, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée. Pour favoriser la vasodilatation de la veine caudale au moment des prélèvements, les souris pourront être placées quelques minutes dans une thermocage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction 4% et maintien de 2%).

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat qui sont les espèces utilisées pour les modèles précliniques de notre établissement. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature.

Opérés deux heures sous anesthésie puis injectés d'une substance inflammatoire dont la douleur n'est pas soulagée, parce qu'elle est l'objet même de l'étude, 1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement. Les chirurgies peuvent provoquer inflammation, infection des points de suture, hypothermie et perte de poids. Le projet cherche à savoir si la présence d'un congénère atténue la douleur, et par quels circuits neuronaux l'ocytocine y participe. Les tests comportementaux, deux par animal et vingt minutes chacun, ne sont désignés que par ce terme, sans qu'aucun ne soit nommé.

Objectifs

Notre but sera de mieux comprendre les interactions entre les relations sociales et l'atténuation de la douleur. Pour ce faire, notre stratégie de recherche s'articule autour de deux objectifs successifs et complémentaires : Dans un premier temps, nous analyserons l’activité des réseaux neuronaux impliqué dans ces interactions puis, nous étirons la relation entre les interactions entre les relations sociale et la douleur grâce à différents tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à décrypter les mécanismes et les circuits neuronaux qui relient la modulation émotionnelle de la douleur par l'intermédiaire des interactions sociales, en mettant l'accent sur un modulateur endogène : l'ocytocine. La douleur chronique touche près de 8 % de la population mondiale, ce qui en fait un fardeau majeur dans notre société moderne. Il a été prouvé que l'ocytocine est au cœur des dysfonctionnements sociaux, ce qui a un impact sur les patients souffrant de douleur chronique et vice versa. Cependant, les circuits neuronaux médiant la régulation émotionnelle du comportement douloureux vis-à-vis des interactions sociales sont largement inconnus. Le bénéfice scientifique de ce projet est de fournir une compréhension détaillée des circuits neuronaux et des mécanismes permettant cette régulation émotionnelle de la douleur et des comportements sociaux..

Procédures

Les animaux seront soumis à principales intervention : 1. Une chirurgie de 2 heures sous anesthésie générale et analgésie générale et locale. 2. Une injection de subtance inflammatoire sur un animal anesthésié et analgésié d’une durée de 5 minutes. 3. Des tests comportementaux de 20 minutes (au maximum de 2 par animal) avec un intervalle de 1 jour entre chaque tests.

Impact sur les animaux

Le modèle inflammatoire ne peut être soulagé étant l’objet de l’étude. L’objectif de la recherche est d’évaluer si l’interaction sociale peut atténuer la douleur. Les chirurgies induisent des douleurs modérées et transitoires. Elles peuvent induire des inflammations, des infections notamment au niveau des points de suture mais aussi une perte de masse de l’animal. Une hypothermie des animaux est également attendue lors des chirurgies. La manipulation des animaux peut induire un léger stress, normalement atténué par la période d’habituation systématiquement appliquée, tant à l’expérimentateur qu’au geste technique effectué

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort pour prélèvement post-mortem afin de réaliser des analyses.

Remplacement

Pour étudier l'aspect complexe, sensoriel et émotionnel de la douleur, sa relation avec les interactions sociales et les mécanismes des circuits cérébraux sous-jacents, l'utilisation d'animaux dotés d'un cortex développé est indispensable. Il n'est donc pas possible d'utiliser des modèles in vitro tels que la culture cellulaire ou un modèle mathématique complet. À cette fin, les rongeurs sont les modèles animaux les plus appropriés en raison des conditions d'élevage et de la possibilité de comparer et de confronter les résultats obtenus avec la littérature et les données cliniques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au minimum selon les règles statistiques de façon à garantir des enregistrement fiables exploitables statistiquement. Les résultats seront comparés avec des tests statistiques appropriés permettant d’émettre en évidence le rôle de l’ocytocine dans le comportement douloureux en lien avec les interactions sociales

Raffinement

Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives (groupes sociaux) enrichies (bâtons, frisure, tunnel en carton) permettant ainsi aux animaux d’exprimer leur comportement naturel. Les animaux seront préalablement acclimatés à leur environnement (2 semaines avant l’expérimentation) et habitué à la présence de l’expérimentateur, aux différents tests le cas échéant, et à la contention. Les approches invasives seront réalisées sou anesthésie analgésie. La température corporelle de l’animal sera garantie par des tapis chauffant thermostaté et le dessèchement de la cornée sera prévenu par application d’un gel oculaire hydratant. Pour faciliter la récupération post-opératoire de l’animal un traitement analgésique sera mis en place et de la nourriture gélifiée appétante sera ajoutée sur le sol de la cage. L’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille de score et des points limites précoces permettant d’interrompre les procédures et de mettre fin à la souffrance animal ont été définis.

Choix des espèces

Le recours à l’animal est nécessaire dans l’étude des phénomènes complexes d’interactions douleur et interactions sociales ; à ce jour aucune approche alternative n’est existante. Le modèle expérimental chez le rat est un standard pour ce type d’expériences et comporte une série de symptôme superposable avec la pathologie humaine (syndrome de Pradder-Willy, anxiété chronique, douleurs inflammatoires …). De nombreuses études sont réalisées concernant les réseaux neuronaux ocytocinergiques chez les rats : les outils sont donc bien validés sur cette espèce, ce qui concourt à assurer la fiabilité des résultats obtenus, leur interprétation ainsi que leur comparaison avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 8 semaines. lorsque l’encéphale et donc les circuits neuronaux sont parfaitement mâtures.