Rats

648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun hébergé seul en cage pendant 77 jours après la pose d'un cathéter intraveineux. Chaque rat enchaîne vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration de nicotine de six heures, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter une enzyme qui dégrade le cholestérol, puis une séance de test de rechute. Chacun reçoit une trentaine d'injections intraveineuses en condition vigile. Les retombées annoncées, une meilleure prise en charge des personnes dépendantes et de futurs médicaments contre la rechute, sont formulées au conditionnel, quand l'isolement de 77 jours figure, lui, parmi les nuisances attendues.

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie comportementale et psychiatrique chronique avec une prévalence croissante, au coût élevé sur le plan médical, social et économique . Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts chaque année dans le monde. Sur ces 8 millions, 7 millions sont dus à la consommation directe de tabac, et environ 1,3 million de ces morts subviennent chez des non-fumeurs, qui sont involontairement exposés à la fumée du tabac (selon l’OMS). L’une des caractéristiques de l’addiction est le risque durable de nouvelles consommations même après une abstinence prolongée. Ce risque serait lié à des adaptations durables laissées par les drogues dans le cerveau. La découverte de stratégies pour aider les personnes addicts dans leur désir d’abstinence est une réelle nécessité. Plusieurs évidences suggèrent que le cholestérol cérébral pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique pour traiter l’addiction. En effet, la littérature scientifique indique que le cholestérol pourrait participer aux modifications neuronales persistantes, qui sous-tendent les risques durables de rechute vers une addiction. Ce projet a pour premier but d'identifier chez le rat, une structure cérébrale dans laquelle la manipulation du cholesterol cérébral réduit la recherche de nicotine chez des rats addicts. Quand une structure sera identifiée, nous chercherons à identifier les mécanismes neurobiologiques associés à ces effets comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet innovant permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la vulnérabilité à la rechute en particulier à l’addiction au tabac. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute (nouvelle consommation) de nicotine.

Procédures

Tous les rats (648) suivront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (durée : 15minutes) afin d'implanter un cathéter intraveineux permettant les injections de nicotine pendant les sessions d’auto-administration. Après la chirurgie et jusqu’à la fin du projet, ces 648 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de nicotine concernera tous les rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 6 semaines pour tous les rats. Pour modifier la quantité de cholestérol cérébral, tous les rats suivront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale gazeuse pour permettre l’injection d’une enzyme dégradant le cholestérol ou son contrôle dans une région cérébrale précise (environ 2 heures sous anesthésie générale). Après les 6 semaines d’abstinence, tous les rats sont replacés dans la cage d’auto-administration pour une session de test de rechute (1 session, 4 heures). Tous les rats auront 1 injection sous-cutanée avant et les 2 jours après les chirurgies (3 injections par rat) et une injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (30 injections), en condition vigile.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, douleur minimisée par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress avec certaines drogues mais non observé avec la nicotine. -Isolement : stress modéré (pendant 77 jours)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement de rechute, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux au maximum et pouvoir faire des analyses statistiques de type ANOVA, le nombre d’animaux requis a été calculé par un test dit de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures. Ainsi, nous avons trouvé que 18 animaux par lots seront nécessaires avec 36 lots au total soit 648 animaux maximum. Le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Le projet est conçue dans une démarche "pas à pas" où certaines expériences ne seront réalisées que si les résultats des expériences précédentes sont concluantes.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 2 fois par semaine. Lors des procédures de chirurgie un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec la souris, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans l’ensemble de nos projets de recherche afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

1 440 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chaque animal recevant trois injections de vaccin à ARN messager espacées de quinze jours et cinq prises de sang, toutes sous anesthésie générale. Les effets attendus reproduisent ceux de la vaccination humaine : rougeur, induration et douleur au toucher au point d'injection, fièvre, perte d'appétit et poils hérissés pendant un à deux jours. Tous sont tués pour prélever des tissus. Le projet vise à établir des corrélations entre modèles cellulaires et réponse du rongeur, le porteur annonçant que ces modèles pourraient à terme remplacer ou réduire fortement l'utilisation d'animaux non-humains, ce qui suppose d'en utiliser 1 590 pour le démontrer.

Objectifs

La vaccination basée sur l’utilisation d’ARN messager complexé dans des particules lipidiques s’est imposée comme une technique efficace lors de la pandémie de Covid-19. Les vaccins ARNm sont basés sur l’utilisation d’un ARN messager, molécule naturellement présente dans les cellules qui est traduit en protéine par la machinerie cellulaire. Néanmoins, la vaccination par ARNm entraîne chez l’homme des effets secondaires indésirables liés au déclenchement d’une réponse immunitaire excessive. Cette réaction immunitaire se traduit par l’apparition de douleur et/ou rougeur et gonflement localisés au site d’injection mais également de fièvre. Elles sont la conséquence de l’activation du système immunitaire. Notre projet a pour but de trouver de nouveaux vaccins ARNm qui ne déclencheraient pas toutes ces réactions secondaires tout en permettant d’obtenir une réponse immunitaire optimale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but premier d’établir des corrélations entre les réponses obtenues sur nos modèles cellulaires et la réponse immunitaire chez le rongeur après vaccination par ARNm. Ceci permettra de ainsi mieux comprendre les voies de l’immunité innée nécessaires à activer (ou bloquer) pour obtenir la réponse immunitaire optimale tout en limitant les effets secondaires. Il est essentiel de mieux comprendre la composante adjuvante de la vaccination ARNm, afin de pouvoir la moduler pour obtenir la réponse immunitaire la plus adéquate. Si des corrélations claires sont mises en évidence sur ce modèle, alors nos modèles cellulaires pourront être utilisés par la communauté scientifique pour optimiser les vaccins ARNm en cours de développement. La validation de nos modèles cellulaires pour prédire notamment les effets secondaires des candidats vaccins pourra donc conduire à améliorer la sécurité des vaccins pour l’homme, mais aussi réduire le nombre d’animaux utilisé pour mettre au point ces candidats vaccins.

Procédures

Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Concrètement, le modèle utilisé repose sur l’injection chez le rongeur de vaccins ARNm. Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et les effets secondaires de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 48 souris, soit au maximum 8 groupes de 6 souris. Ceci dans le but de ne pas engendrer de différences artéfactuelles liées à la difficulté de réaliser une expérience avec un trop grand nombre d’animaux au total. Le nombre de 6 animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminera un ou 2 vaccins ARNm optimisés qui seront ensuite testé chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 15 rats, à savoir 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de pouvoir gérer techniquement l’expérimentation tout en gardant suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Néanmoins, une réaction locale au niveau du site d’injection ou généralisé à tout le corps (fièvre) peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Pour détecter l’apparition éventuelle de cette réactogenicité, Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Nous avons établi une grille de « scoring » permettant de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. La grille de « scoring » prend en compte 1) l’état général comprenant l’apparence, la posture, la mobilité, le comportement de l’animal dans la cage, 2) l’inspection de l’aspect au niveau des sites d’injection et 3) le suivi de poids de l’animal. Grace à cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude (cible vaccinale Ovalbumine) est le modèle immunologique de référence chez la souris, tous les réactifs et les outils d’étude sont donc disponibles. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.

Une heure trente de chirurgie intracérébrale pour injecter un virus qui fera exprimer une protéine toxique dans les cellules de soutien du cerveau, puis quatre à cinq prises de sang à la queue : 320 rats Sprague-Dawley subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leur cerveau. L'induction de la maladie ralentit leur activité locomotrice et dégrade leur motricité fine. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de l'atrophie multisystématisée, maladie neurodégénérative sans traitement, et d'identifier des marqueurs sanguins qui seront ensuite vérifiés chez des patients. Le porteur annonce deux tests comportementaux répétés quatre à six fois sur des rats vigiles, l'un de trois minutes sur trois jours, l'autre d'une heure, sans indiquer à aucun moment lesquels.

Objectifs

L'atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative fatale avec un handicap moteur sévère. Il n'existe actuellement aucun traitement disponible pour atténuer la gravité des symptômes ou la progression clinique de cette maladie orpheline. Elle se caractérise au niveau cellulaire par l'accumulation et l'agrégation d’une protéine dans les oligodendrocytes (cellule de soutien essentielle à la fonction et à la survie des cellules nerveuses) entrainant une neurodégénérescence. Dans ce projet, des rats recevront une injection de virus permettant l’expression de cette protéine spécifiquement dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires responsable du dysfonctionnement des oligodendrocytes et aboutissent à leur perte de fonction dans le cerveau en utilisant des approches comportementales (évaluation motrice), histologiques et cellulaires. De plus les prélèvements de sang réalisés chez les animaux à différentes étapes du développement de la maladie permettront d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour lesquelles des stratégies pourraient être développées afin de prévenir ou de corriger les altérations qui touchent les oligodendrocytes, dans le but de restaurer leur fonctionnement normal. Les marqueurs d'oligodendrocytes qui pourront être identifiés dans le modèles précliniques seront ensuite validés chez des patients atteint d’atrophie multisystématisée.

Bénéfices attendus

Le projet actuel propose d’identifier les mécanismes moléculaires responsables du dysfonctionnement des oligodendrocytes et la mise en évidence de biomarqueurs au niveau sanguin. Ces résultats de recherche amélioreraient considérablement la compréhension de la physiopathologie de l’atrophie multisystématisée d’une part et auraient des implications considérables pour les soins aux patients et le développement thérapeutique et de biomarqueur dans l’atrophie multisystématisée d’autre part.

Procédures

- Pour 320 animaux : test comportemental 1 d’une durée de 3 minutes sur 3 jours et test comportemental 2 d’une durée d’1h sur une journée. Ces tests comportementaux sont réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (4 à 6 fois maximum en fonction des lots de rats) sur animaux vigiles. - Pour 320 animaux : prélèvement sanguin au niveau de la queue sur animaux anesthésiés d’une durée de 3 minutes (4 à 5 fois maximum en fonction des lots de rats) - Pour 320 animaux : chirurgie intracérébrale réalisée sur animaux anesthésiés et sous couverture antalgique périphérique et locale, d'une durée d'1 heure 30. - Pour 160 animaux : perfusion intracardiaque réalisées sur animaux anesthésiés par une double dose d'un mélange d'anesthésique et antalgique permettant également une couverture antalgique périphérique.

Impact sur les animaux

- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil, la douleur occasionnée est soulagée par des antalgiques pendant et après la chirurgie. - L’induction de l’AMS va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. - Prélèvements de sang peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale. - Petit inconfort de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récuperer les ceveaux et de réaliser des analyses histologiques, cytologique et transcriptionnel.

Remplacement

Malgré des recherches sur des modèles cellulaires dans l’atrophie multisystématisée, dans le cadre de ce projet basé sur la compréhension du développement de la maladie et de ces effets comportementaux ainsi que l’analyse de biomarqueurs sanguins le modèle animal entier ne peut pas être substitué car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro, ni in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 20 animaux par condition expérimentale par suivi longitudinal et par sexe soit 320 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post- opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage autant que possible (isolement de maximum 7 jours après la chirurgie restant une démarche de soin exceptionnelle), avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement (bâtons à ronger et baguette de papier compressé) est disposé dans les cages d'hébergement. Un tunnel sera également rajouté si les animaux nécessitent un isolement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude de l’atrophie multisystématisée. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison des données déjà disponibles dans la modélisation de la maladie et de la similitude avec la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de l’atrophie multisystématisée.

Tous tués pour prélever leur sang, leur rate, leurs ganglions, leur moelle osseuse, leur foie, leurs intestins et leur thymus, 150 rats immunodéficients sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux à quatre jours, les ratons sont séparés de leur mère et irradiés quatre minutes, avec un risque qu'elle les rejette ensuite, puis reçoivent une injection de cellules humaines directement dans le foie. Trois prélèvements de sang derrière l'œil suivent, à douze, dix-huit et vingt-quatre semaines, en alternant œil droit et œil gauche. Le porteur présente ce rat "humanisé" comme une alternative aux souris humanisées, plus grande et plus proche de l'être humain, pour éprouver des médicaments agissant sur le système immunitaire.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Les résultats in vitro seuls ne peuvent présumés du potentiel réel et efficace d'une molécule. Afin de pouvoir répondre à ce type de problème, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" (souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre mais on y trouve la présence de cellules humaines) permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Principalement due à la taille du modèle, permettant de réaliser des modèles de greffes vasculaires mais également dû à la différence de pourcentage au niveau des cellules humaines. Ce projet expose donc la procédure utilisée afin de produire des rats dits humanisés à partir de rats immunodéficients (qui sont des animaux ne possédant pas de cellules au niveau du système immunitaire).

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation des rats humanisés immunodéficientes reconstitués avec un système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'irradiation de ratons mâles et femelles âgés de 2 à 4 jours qui se déroule en seule fois et cela pendant 4 min, une seule injection intrahépatiques de cellules humaines sera effectuées sur des animaux anesthésiés (anesthésie rapide avec une durée de procédure n'éxcédant pas 5 min) ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont: le stress du à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales ( l'injection intrahépatique, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux ...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Ce modèle d'étude du mécanisme d'action d'anticorps et/ou médicaments chez le rat ayant un système immunitaire humain permettra de reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme. Ces expérimentations in vivo sont les seules à pouvoir répondre à nos questions, le modèle des rats humanisées étant le seul à pouvoir juger dans des conditions physiologiques du rôle des molécules X et Y sur l'efficacité de la réponse immunitaire. Des résultats positifs in vitro seraient insuffisants pour être convaincu de la pertinence physiologique des observations et leur transposition à la clinique seraient freinés.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été déterminée de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur le mécanisme d'action sur les T régulateurs.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter la souffrance. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Au moment des injections du traitement, une application au préalable de Lidocaïne sous forme de gel sera effectuée comme analgésie . Afin de limiter au minimum l’impact de la séparation maternelle, celui-ci est réduit grâce à l'imprégnation des gants de l’expérimentateur et d’une boite de Petri (qui sera mise dans la cage d’irradiation) avec la sciure de la cage maternelle Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). Lors du prélèvement de sang par des sinus rétro orbitaire (effectuée totes les 6 semaines avec alternance œil droit/gauche) sur des rats anesthésiés, l'utilisation de tétracaïne 1% en collyre permettra une anesthésie locale. Nous procédons à l’euthanasie des rats en cas d’atteinte des points de limite préétablis.

Choix des espèces

Le choix du rat repose essentiellement sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris et que les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés Nous utiliserons des ratons âgés de 2 à 4 jours afin de faciliter la reconstitution du système immunitaire par des cellules humaines.

Jusqu'à huit sessions d'ultrasons et d'imagerie par animal, étalées sur un an pour les souris et deux ans pour les rats, la tête rasée puis épilée à la crème dépilatoire au risque d'une brûlure cutanée, 532 souris et 112 rats subissent ces procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont tous tués pour prélever leurs organes. Le porteur décrit un risque d'œdème cérébral ou d'hémorragie en cas de surdose ultrasonore, des séances d'imagerie sous anesthésie allant jusqu'à une heure et demie, et des transports de quinze minutes entre deux sites d'expérimentation. L'objectif déclaré est d'optimiser l'ouverture de la barrière protégeant le cerveau, une approche déjà en essai clinique chez l'être humain depuis 2015. Les rats servent pour leur crâne plus épais et moins homogène, qui oblige à ajuster la dose individu par individu, comme chez les patients.

Objectifs

L’efficacité et l’émergence de traitements innovants contre les pathologies cérébrales sévères (tumeurs, maladie d’Alzheimer…) sont restreintes par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protége le cerveau mais bloque le passage de plus de 95% de médicaments du sang vers les cellules pathologiques. Les ultrasons (US) peuvent être utilisés à travers le crâne pour délivrer des molécules dans le cerveau. En effet, combinés à l’injection de microbulles par voie intraveineuse, les US peuvent induire une perméabilisation localisée, non invasive et réversible de la BHE. Depuis 2015, plusieurs essais cliniques portant sur l’évaluation de l’innocuité et la validation du bénéfice des US pour le traitement de tumeurs cérébrales ou de maladies neurodégénératives sont menés. De nombreuses interrogations demeurent néanmoins quant à l’optimisation des protocoles ultrasonores ainsi que leur impact sur le tissu cérébral. La mise en place de techniques spécifiques de neuroimagerie quantitative permettrait de répondre à ces iquestions. L’IRM est l’examen de référence pour s’assurer de l’efficacité et la sécurité de l’ouverture de la BHE. L’imagerie nucléaire (TEP) et l’échographie peuvent être exploitées pour évaluer l’intégrité de la BHE, quantifier la dose de médicaments délivrés et observer les micro changements vasculaires. Le projet consiste à utiliser les modalités d’imagerie IRM, TEP et échographie afin d’améliorer nos protocoles de délivrance de médicaments par ultrasons, et de comprendre et maîtriser leurs effets sur le cerveau de rongeurs. Ainsi, le projet répondra à trois objectifs qui sont : (i) l’optimisation et le contrôle des protocoles thérapeutiques, (ii) la compréhension des mécanismes et effets des US sur l’environnement cérébral, (iii) valider le passage de différents médicaments. Ce projet nécessite l’utilisation d’équipements présents sur plusieurs sites. Ainsi, 2 établissements sont concernés. Les tâches impliquant la TEP et l’échographie seront réalisées dans un établissement utilisateur et les tâches impliquant l’IRM seront réalisées dans le deuxième établissement. .

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de développer une méthodologie transférable au niveau clinique. Le bénéfice, à terme, sera de proposer une meilleure prise en charge des pathologies cérébrales. Une telle approche serait profitable pour le traitement de maladies aujourd’hui incurables telles que certaines tumeurs cérébrales agressives, les maladies neurodégénératives ou encore les maladies génétiques. Ce projet a comme but principal d’établir, optimiser et valider des protocoles de thérapie du cerveau par ultrasons en tirant profit des outils d’imagerie dont nous disposons. En particulier, nos approches de neuroimageries quantitatives permettront de développer les modèles prédictifs de délivrance de médicaments par ultrasons. Par ailleurs, les outils d’imagerie que nous développons au laboratoire seront exploités pour étudier l’influence des ultrasons sur l’environnement cérébral. Ainsi les bénéfices attendus peuvent se résumer aux cinq points suivants : 1/ Amélioration des protocoles thérapeutiques pour perméabiliser la BHE et délivrer des médicaments dans le cerveau de manière non invasive. 2/ Elaboration de protocoles personnalisés. Les doses ultrasonores et les volumes traités seront adaptés à la morphologie de l’animal et à la pathologie visée. 3/ Quantification de la dose de médicaments délivrés dans le cerveau par neuroimagerie. 4/ Compréhension de l’impact des ultrasons sur l’environnement cérébral. Nous établirons notamment la relation entre la dose ultrasonore et la réversibilité de l’approche (temps de passage des médicaments). 5/ Validation de nouveaux traceurs et de séquences d’imagerie cérébrale.

Procédures

Selon les lots, les animaux subiront les actes suivants : 1/ Thérapie par ultrasons : injection de microbulles gazeuses et applications des ultrasons (532 souris et 112 rats, durée du protocole 10 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée. 2/ Administration de médicaments : anesthésie et injection (140 souris, durée de l’acte 10 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée. 3/ IRM : anesthésie et injection de produits de contraste (427 souris et 70 rats, durée du protocole 45 min) Lieu : EU dédié à l’IRM. 4/ TEP : anesthésie et injection de produits de contraste (175 souris et 42 rats, durée du protocole 60 min) - Lieu : EU dédié à la TEP. 5/ Echographie : anesthésie et injection de produits de contraste (28 souris, durée de l’acte 20 min) Lieu : EU dédié à la TEP. 6/ Prélèvement des organes en fin de protocole (532 souris et 112 rats, durée de l’acte 20 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée Afin de limiter le nombre d’animaux, les animaux pourront répétés les actes 1, 3, 4 et 5 décrits ci-dessus jusqu’ à 8 sessions maximum avec un espacement minimum entre les sessions de 1 semaine entre les sessions. La durée maximum totale de cette procédure sera d’un an pour les souris et de deux ans pour les rats. Les animaux recevant l’administration de médicaments (acte 2) auront jusqu’à 6 traitements dans un intervalle de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sur les animaux pourraient être : • Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou d’hémorragie. • L’injection des microbulles et médicaments en intraveineux peut induire une courte douleur (moins de 5 min). • Les animaux seront endormis lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientés et stressés. • Le transport des animaux entre les deux sites d’expérimentation (15 min de transport) peut induire un stress chez les animaux. • Les animaux seront rasés et épilés (application d’une crème dépilatoire) sur la tête pour permettre la transmission des ultrasons. Cet acte peut causer une légère brûlure cutanée. Selon la dose, les traitements (chimiothérapie, immunothérapie, nanoparticules et virus adéno-associés) peuvent avoir une toxicité pour l’organisme et induire des effets indésirables (comme par exemple : perte de poids, troubles digestifs). La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux sont euthanasiés afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'histologie et de dosages. Les objectifs sont de : 1/ s’assurer de l’innocuité de la méthode (pas de dommages dans le tissu cérébral causé par l’exposition aux ultrasons) 2/ vérifier la toxicité des composés injectés dans le cerveau et les organes d’élimination (e.g., foie, rein) 3/ quantifier la dose de médicaments présents dans le cerveau

Remplacement

En amont de ce projet, nous avons réalisé des études in vitro préliminaires (bancs de mesures et culture cellulaire) pour affiner les paramètres ultrasonores, caractériser les microbulles gazeuses utilisées pour ouvrir la BHE et limiter le nombre d’expériences in vivo. Cependant, la BHE et son microenvironnement cérébral ne sont pas reproductibles in vitro à ce jour. Ni la modélisation in silico, ni l’expérimentation in vitro ne permettent de prédire l’efficacité (délivrance de molécule intracérébrale) et l’impact du traitement ultrasonore sur le tissu cérébral (dynamique d’ouverture et de refermeture, neuroinflammation, perturbations vasculaires). Il est donc indispensable d’utiliser des modèles animaux. L’expérimentation animale permet également d’évaluer la variabilité inter-individus de l’approche thérapeutique en fonction de l’âge et du sexe de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour chaque groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en étant statistiquement valide, en se basant sur des études antérieures similaires et sur des données de la littérature.

Raffinement

L’ensemble des actes effectués chez les animaux seront faits par des personnes formées. Chaque acte de la procédure sera réalisé sous anesthésie gazeuse et l’animal sera maintenu sous un dispositif chauffant (tapis, lumière ou flux d’air) pour assurer son bien-être lors des manipulations. L’apparition de tout signe de détresse respiratoire sera particulièrement surveillée durant la procédure. Lors des sessions de thérapie, les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse après avoir préalablement appliqué une anesthésie locale 10 min avant l’injection. Les souris seront hébergées en groupe de 4 ou 5 par cage avec un milieu enrichi. Les rats seront hébergés par groupe de 2 par cage avec un milieu enrichi. Le suivi quotidien par les zootechniciens assurera d’éviter toute souffrance. Les examens d’imagerie seront réalisés sur deux sites (distants de 15 min). Les transports des animaux seront anticipés afin de laisser une semaine complète d’acclimatation sur chacun des sites lorsque cela sera possible. Les animaux seront acheminés dans un véhicule dédié aux transports des animaux doté d’une climatisation à l’intérieur, de cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le suivi régulier du poids permettra de favoriser leur manipulation pour les sessions d’imagerie et de thérapie et ainsi limiter tout stress. Une analgésie sera mise place après accord du vétérinaire si des signes de douleur sont mis en évidence. Des points limites seront définis en amont des interventions, ceux-ci auront vocation à limiter et surtout éviter une souffrance animale. Une grille de score basée sur ces points limites sera utilisée.

Choix des espèces

Dans une première approche, le choix du modèle souris se justifie par sa simplicité , sa forte reproductibilité inter-individus et la possibilité d’administrer de petits volumes de médicaments. Une majeure partie des expérimentations sera réalisée sur ce modèle. Toutefois, nous souhaitons également évaluer nos protocoles thérapeutiques sur un modèle rat plus complexe et proche de l’espèce humaine afin de tester notre approche de thérapie personnalisée. En effet, compte tenu de la forte atténuation du crâne chez le rat et de son inhomogénéité, la dose ultrasonore doit être ajustée selon l’individu, comme c’est le cas chez l’espère humaine. L’utilisation efficace de ce modèle requiert donc une maîtrise avancée du protocole ultrasonore qui sera évalué sur un nombre moins important d’animaux. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. La présence du crâne joue un rôle prépondérant dans la transmission des ultrasons. Afin de passer outre un biais expérimental, il est nécessaire d’atteindre la maturité de l’animal (au-delà de 8 semaines) et la formation complète du crâne. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, les souris (18g à 25g au début de l’étude) pourront être étudiés sur une période de 1 an maximum après la première session du protocole. Nous utiliserons également des rats adultes jeunes ( 200g à 300g au début de l’étude). Les rats pourront être étudiés sur une période de 2 ans maximum après la première session du protocole. Cet âge a été choisi pour intégrer dans l’étude des animaux pour lesquels le vieillissement induit un effet sur le crâne (calcification osseuse) et la transmission des ultrasons. La validation de nos protocoles sur des animaux âgés est particulièrement pertinente en vue d’utilisation postérieure de modèles de maladies neurodégénératives (Alzheimer). Les résultats obtenus et les paramètres ultrasonores optimisés seront corrélés à l’âge des animaux.

210 rats subissent chacun une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif d'enregistrement cérébral, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyser leur cerveau. Cent vingt d'entre eux reçoivent en plus un cathéter veineux, vivent seuls en cage jusqu'au terme du projet, puis s'administrent de la cocaïne au cours de 25 sessions de six heures, suivies de deux mois d'abstinence. Le porteur indique que la prise chronique de drogue peut provoquer un état émotionnel négatif, visible au poil hérissé et à l'irritabilité, et que l'isolement peut causer un stress modéré. Le projet ne teste aucun traitement, il sert d'abord à mettre au point la technique d'enregistrement par fibre optique.

Objectifs

Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.

Procédures

Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. 90 rats auront 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours), 120 rats auront 1 seule session de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.