Rats

Chaque animal peut être soumis à huit sessions d'ultrasons et d'imagerie, espacées d'au moins une semaine, sur un an pour les souris et deux ans pour les rats. 532 souris et 112 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs organes. La tête rasée et dépilée à la crème, ils reçoivent des microbulles par voie intraveineuse puis des ultrasons à travers le crâne, pour ouvrir la barrière qui protège le cerveau, avant des IRM de 45 minutes ou des examens TEP d'une heure sous anesthésie. Le porteur cite parmi les risques l'œdème cérébral, l'hémorragie et une légère brûlure cutanée due à la crème dépilatoire, et justifie l'effectif par des études antérieures similaires, sans donner de calcul.

Objectifs

L’efficacité et l’émergence de traitements innovants contre les pathologies cérébrales sévères (tumeurs, maladie d’Alzheimer…) sont restreintes par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protége le cerveau mais bloque le passage de plus de 95% de médicaments du sang vers les cellules pathologiques. Les ultrasons (US) peuvent être utilisés à travers le crâne pour délivrer des molécules dans le cerveau. En effet, combinés à l’injection de microbulles par voie intraveineuse, les US peuvent induire une perméabilisation localisée, non invasive et réversible de la BHE. Depuis 2015, plusieurs essais cliniques portant sur l’évaluation de l’innocuité et la validation du bénéfice des US pour le traitement de tumeurs cérébrales ou de maladies neurodégénératives sont menés. De nombreuses interrogations demeurent néanmoins quant à l’optimisation des protocoles ultrasonores ainsi que leur impact sur le tissu cérébral. La mise en place de techniques spécifiques de neuroimagerie quantitative permettrait de répondre à ces iquestions. L’IRM est l’examen de référence pour s’assurer de l’efficacité et la sécurité de l’ouverture de la BHE. L’imagerie nucléaire (TEP) et l’échographie peuvent être exploitées pour évaluer l’intégrité de la BHE, quantifier la dose de médicaments délivrés et observer les micro changements vasculaires. Le projet consiste à utiliser les modalités d’imagerie IRM, TEP et échographie afin d’améliorer nos protocoles de délivrance de médicaments par ultrasons, et de comprendre et maîtriser leurs effets sur le cerveau de rongeurs. Ainsi, le projet répondra à trois objectifs qui sont : (i) l’optimisation et le contrôle des protocoles thérapeutiques, (ii) la compréhension des mécanismes et effets des US sur l’environnement cérébral, (iii) valider le passage de différents médicaments. Ce projet nécessite l’utilisation d’équipements présents sur plusieurs sites. Ainsi, 2 établissements sont concernés. Les tâches impliquant la TEP et l’échographie seront réalisées dans un établissement utilisateur et les tâches impliquant l’IRM seront réalisées dans le deuxième établissement. .

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de développer une méthodologie transférable au niveau clinique. Le bénéfice, à terme, sera de proposer une meilleure prise en charge des pathologies cérébrales. Une telle approche serait profitable pour le traitement de maladies aujourd’hui incurables telles que certaines tumeurs cérébrales agressives, les maladies neurodégénératives ou encore les maladies génétiques. Ce projet a comme but principal d’établir, optimiser et valider des protocoles de thérapie du cerveau par ultrasons en tirant profit des outils d’imagerie dont nous disposons. En particulier, nos approches de neuroimageries quantitatives permettront de développer les modèles prédictifs de délivrance de médicaments par ultrasons. Par ailleurs, les outils d’imagerie que nous développons au laboratoire seront exploités pour étudier l’influence des ultrasons sur l’environnement cérébral. Ainsi les bénéfices attendus peuvent se résumer aux cinq points suivants : 1/ Amélioration des protocoles thérapeutiques pour perméabiliser la BHE et délivrer des médicaments dans le cerveau de manière non invasive. 2/ Elaboration de protocoles personnalisés. Les doses ultrasonores et les volumes traités seront adaptés à la morphologie de l’animal et à la pathologie visée. 3/ Quantification de la dose de médicaments délivrés dans le cerveau par neuroimagerie. 4/ Compréhension de l’impact des ultrasons sur l’environnement cérébral. Nous établirons notamment la relation entre la dose ultrasonore et la réversibilité de l’approche (temps de passage des médicaments). 5/ Validation de nouveaux traceurs et de séquences d’imagerie cérébrale.

Procédures

Selon les lots, les animaux subiront les actes suivants : 1/ Thérapie par ultrasons : injection de microbulles gazeuses et applications des ultrasons (532 souris et 112 rats, durée du protocole 10 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée. 2/ Administration de médicaments : anesthésie et injection (140 souris, durée de l’acte 10 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée. 3/ IRM : anesthésie et injection de produits de contraste (427 souris et 70 rats, durée du protocole 45 min) Lieu : EU dédié à l’IRM. 4/ TEP : anesthésie et injection de produits de contraste (175 souris et 42 rats, durée du protocole 60 min) - Lieu : EU dédié à la TEP. 5/ Echographie : anesthésie et injection de produits de contraste (28 souris, durée de l’acte 20 min) Lieu : EU dédié à la TEP. 6/ Prélèvement des organes en fin de protocole (532 souris et 112 rats, durée de l’acte 20 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée Afin de limiter le nombre d’animaux, les animaux pourront répétés les actes 1, 3, 4 et 5 décrits ci-dessus jusqu’ à 8 sessions maximum avec un espacement minimum entre les sessions de 1 semaine entre les sessions. La durée maximum totale de cette procédure sera d’un an pour les souris et de deux ans pour les rats. Les animaux recevant l’administration de médicaments (acte 2) auront jusqu’à 6 traitements dans un intervalle de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sur les animaux pourraient être : • Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou d’hémorragie. • L’injection des microbulles et médicaments en intraveineux peut induire une courte douleur (moins de 5 min). • Les animaux seront endormis lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientés et stressés. • Le transport des animaux entre les deux sites d’expérimentation (15 min de transport) peut induire un stress chez les animaux. • Les animaux seront rasés et épilés (application d’une crème dépilatoire) sur la tête pour permettre la transmission des ultrasons. Cet acte peut causer une légère brûlure cutanée. Selon la dose, les traitements (chimiothérapie, immunothérapie, nanoparticules et virus adéno-associés) peuvent avoir une toxicité pour l’organisme et induire des effets indésirables (comme par exemple : perte de poids, troubles digestifs). La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux sont euthanasiés afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'histologie et de dosages. Les objectifs sont de : 1/ s’assurer de l’innocuité de la méthode (pas de dommages dans le tissu cérébral causé par l’exposition aux ultrasons) 2/ vérifier la toxicité des composés injectés dans le cerveau et les organes d’élimination (e.g., foie, rein) 3/ quantifier la dose de médicaments présents dans le cerveau

Remplacement

En amont de ce projet, nous avons réalisé des études in vitro préliminaires (bancs de mesures et culture cellulaire) pour affiner les paramètres ultrasonores, caractériser les microbulles gazeuses utilisées pour ouvrir la BHE et limiter le nombre d’expériences in vivo. Cependant, la BHE et son microenvironnement cérébral ne sont pas reproductibles in vitro à ce jour. Ni la modélisation in silico, ni l’expérimentation in vitro ne permettent de prédire l’efficacité (délivrance de molécule intracérébrale) et l’impact du traitement ultrasonore sur le tissu cérébral (dynamique d’ouverture et de refermeture, neuroinflammation, perturbations vasculaires). Il est donc indispensable d’utiliser des modèles animaux. L’expérimentation animale permet également d’évaluer la variabilité inter-individus de l’approche thérapeutique en fonction de l’âge et du sexe de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour chaque groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en étant statistiquement valide, en se basant sur des études antérieures similaires et sur des données de la littérature.

Raffinement

L’ensemble des actes effectués chez les animaux seront faits par des personnes formées. Chaque acte de la procédure sera réalisé sous anesthésie gazeuse et l’animal sera maintenu sous un dispositif chauffant (tapis, lumière ou flux d’air) pour assurer son bien-être lors des manipulations. L’apparition de tout signe de détresse respiratoire sera particulièrement surveillée durant la procédure. Lors des sessions de thérapie, les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse après avoir préalablement appliqué une anesthésie locale 10 min avant l’injection. Les souris seront hébergées en groupe de 4 ou 5 par cage avec un milieu enrichi. Les rats seront hébergés par groupe de 2 par cage avec un milieu enrichi. Le suivi quotidien par les zootechniciens assurera d’éviter toute souffrance. Les examens d’imagerie seront réalisés sur deux sites (distants de 15 min). Les transports des animaux seront anticipés afin de laisser une semaine complète d’acclimatation sur chacun des sites lorsque cela sera possible. Les animaux seront acheminés dans un véhicule dédié aux transports des animaux doté d’une climatisation à l’intérieur, de cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le suivi régulier du poids permettra de favoriser leur manipulation pour les sessions d’imagerie et de thérapie et ainsi limiter tout stress. Une analgésie sera mise place après accord du vétérinaire si des signes de douleur sont mis en évidence. Des points limites seront définis en amont des interventions, ceux-ci auront vocation à limiter et surtout éviter une souffrance animale. Une grille de score basée sur ces points limites sera utilisée.

Choix des espèces

Dans une première approche, le choix du modèle souris se justifie par sa simplicité , sa forte reproductibilité inter-individus et la possibilité d’administrer de petits volumes de médicaments. Une majeure partie des expérimentations sera réalisée sur ce modèle. Toutefois, nous souhaitons également évaluer nos protocoles thérapeutiques sur un modèle rat plus complexe et proche de l’espèce humaine afin de tester notre approche de thérapie personnalisée. En effet, compte tenu de la forte atténuation du crâne chez le rat et de son inhomogénéité, la dose ultrasonore doit être ajustée selon l’individu, comme c’est le cas chez l’espère humaine. L’utilisation efficace de ce modèle requiert donc une maîtrise avancée du protocole ultrasonore qui sera évalué sur un nombre moins important d’animaux. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. La présence du crâne joue un rôle prépondérant dans la transmission des ultrasons. Afin de passer outre un biais expérimental, il est nécessaire d’atteindre la maturité de l’animal (au-delà de 8 semaines) et la formation complète du crâne. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, les souris (18g à 25g au début de l’étude) pourront être étudiés sur une période de 1 an maximum après la première session du protocole. Nous utiliserons également des rats adultes jeunes ( 200g à 300g au début de l’étude). Les rats pourront être étudiés sur une période de 2 ans maximum après la première session du protocole. Cet âge a été choisi pour intégrer dans l’étude des animaux pour lesquels le vieillissement induit un effet sur le crâne (calcification osseuse) et la transmission des ultrasons. La validation de nos protocoles sur des animaux âgés est particulièrement pertinente en vue d’utilisation postérieure de modèles de maladies neurodégénératives (Alzheimer). Les résultats obtenus et les paramètres ultrasonores optimisés seront corrélés à l’âge des animaux.

Pour tester si une molécule empêche la douleur du visage déclenchée par une inflammation, 130 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour le prélèvement de tissus nerveux. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq à huit jours sous anesthésie gazeuse, plus une injection sous-cutanée, puis passe chaque jour un test d'allodynie où un filament est appliqué sur sa face. Le porteur qualifie ces mesures de peu douloureuses au motif que l'animal peut se soustraire au filament, et attend de l'expérience qu'elle produise l'hypersensibilité douloureuse recherchée. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont mis à mort.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau de la face sont peu connus.Nos résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution d'un type de canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Le projet étudiera s’il est possible de prévenir les inflammations sur les canaux astrocytaires et par conséquent la douleur, à l’aide d'une molécule capable de moduler l’expression du gène correspondant à la protéine du canal astrocytaire. Il combinera des approches moléculaires et comportementales, et sera réalisé sur des rats adultes mâles, âgés entre 4 et 8 semaines.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : • Injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une prériode d’adaptation suite à la livraision suivie d'une période d’habituation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tout ces éléments. C’est pourquoi il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections systémiques,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à parti de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 5 à 8 semaines (125 à 250 g), pour comparer avec les données du laboratoire.

Chaque rat reçoit un cathéter dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie sous anesthésie gazeuse pouvant durer une heure, avant onze prélèvements de sang étalés sur huit heures, un toutes les trente minutes. 48 rats Wistar mâles vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs organes. Ils sont hébergés seuls jusqu'à cinq jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. Il annonce qu'entre l'administration de la dose unique et la mise à mort aucun effet indésirable n'est attendu, tout en indiquant qu'un des deux pesticides testés est classé cancérogène, tératogène et susceptible de nuire à la fertilité.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un projet plus large qui consistera à étudier les effets de l’exposition périnatale à un cocktail de 2 pesticides administrés par voie alimentaire. En effet, les études de toxicologie sur les pesticides sont le plus souvent réalisées sur chaque substance séparément. Or combinées, même à faible dose, certaines molécules peuvent conduire à l’apparition ou à l’amplification d’effets toxiques. De plus, ces études sont très largement menées en utilisant la voie orale en gavant l’animal. Le gavage pouvant être traumatique pour l’animal mais aussi pour l’expérimentateur, de plus en plus, les études de toxicologie sont réalisées en utilisant un vecteur alimentaire pour exposer les animaux (eau, croquette, pâte, gelée, etc). Nous souhaitons ainsi étudier la toxicité lors d’une administration par voie alimentaire d’un cocktail de 2 pesticides. Pour pouvoir valider notre méthode d’administration et déterminer les quantités de pesticides distribués dans différents organes, il est nécessaire de pouvoir comparer les concentrations sanguines à différents temps de chacune des 2 substances après leur entrée dans l'organisme, seules ou en association via l’alimentation avec les profils obtenus par gavage. Pour cela, 9 groupes de 5 rats mâles adultes Wistar seront répartis ainsi: un groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte, un groupe contrôle gavage (gavé seulement à l'huile), un groupe contrôle alimentation (seulement la pâte), un groupe exposé au cocktail de pesticides par alimentation, un groupe exposé au cocktail par gavage, un groupe exposé au pesticide 1 par alimentation, un groupe exposé au pesticide 1 par gavage, un groupe exposé au pesticide 2 par alimentation et un groupe exposé au pesticide 2 par gavage. Une procédure préliminaire sera réalisée pour mettre au point la technique de prélèvement de sang sur deux rats qui pourront selon les résultats être intégrés au groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra faire progresser les connaissances scientifiques sur le comportement des substances étudiées dans l'organisme afin d’améliorer les modèles de modélisation basés sur la physiologie liée à une exposition aux mélanges de pesticides et l’évaluation des risques sanitaires associés. Il permettra aussi d’avoir des informations essentielles pour la mise en place de méthodes d’exposition plus représentatives de l’exposition humaine et tout aussi efficace que le gavage. Les résultats de ce projet pourront ainsi, être une base intéressante pour d’autres expérimentations réalisées sur des animaux plus sensibles au gavage comme les rates gestantes.

Procédures

Chaque animal sera tondu une fois au niveau de la nuque et une fois au niveau de la gorge (durée inférieure à 5 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés en utilisant un cathéter. Celui-ci sera installé dans la veine jugulaire dans le cadre d’une chirurgie (une fois par animal) effectuée sur les animaux anesthésiés par un gaz. Cette chirurgie durera au maximum 1h. Au maximum, 11 prélèvements de sang seront réalisés sur 8h (toutes les 30 minutes). Chaque prélèvement durera moins d'une minute. Les animaux exposés par gavage, recevront une seule fois de l'huile de colza avec ou sans pesticides directement dans l'oesophage. Le gavage durera moins d'une minute. Les animaux exposés par voie alimentaire, mangeront volontairement une seule pâte avec ou sans pesticides. L'ingestion durera au maximum 30 minutes (si l'animal mange une partie puis pose la pâte avant de la reprendre). Les animaux seront isolés à partir de l'installation du cathéter jusqu'à la fin de chaque procédure soit au maximum 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à une dose unique de pesticides inférieure à la dose induisant la mort. De plus, un pesticide est de catégorie 2 pour la reproduction et le système nerveux et c'est un cancérogène/tératogène dû à la susceptibilité de nuire à la fertilité. Le deuxième pesticides de catégorie 3 est toxique en cas d'ingestion à de forte dose (supérieur à la dose induisant la mort). Les autres mentions de toxicité concerne les organismes aquatiques exposés chroniquement. Ainsi, entre le moment où les animaux recevront cette dose unique et leur mise à mort, aucun effet indésirable n'est attendu. Toutefois, les manipulations, comme la contention, et les manipulations lors des prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress chez le rat. L’hébergement individuel des rats pourrait également être une nuisance causant du stress chez les animaux.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à la fin des prélèvements sanguins dans le but de prélever post mortem différents organes cibles pour effectuer des dosages afin de déterminer la pharmacocinétique.

Remplacement

Pour évaluer les temps de rétention de certaines substances chimiques dans l’organisme, des modèles mathématiques ont été mis en place à partir d'exposition chez l'animal (principalement chez le rat). Cependant, ces modèles n'existent pas pour les molécules étudiés dans ce projet, ni pour des mélanges de substances avec pour méthode d’exposition, le gavage et l'ingestion d'une alimentation contenant des pesticides. Une approche par des modèles physiologiques ne permettra pas de prendre en compte tous les organes impliqués dans la métabolisation y compris les compartiments éventuels de stockage tels que les tissus adipeux. L'espèce choisi sera le rat car les organes seront suffisamment gros pour effectuer tous les dosages nécessaires (il faudrait le double d'animaux si l'étude était réalisée chez la souris). La souche Wistar est une espèce docile et facile à apprivoiser ce qui facilitera les manipulations notamment lors du gavage et des prélèvements sanguins. Cette étude nécessite donc une approche in vivo.

Réduction

Pour ce type de test, au minimum 4 animaux sont nécessaires pour évaluer les différents temps de présence et l’imprégnation des organes à des substances chimiques (cf essai n° 417 de l'Organisation de coopération et de développement économiques). Dans ce projet, nous étudierons 4 animaux par groupe plus un animal supplémentaire afin de pallier au risque qu’un animal présenterait des effets pouvant impacter les résultats et devant alors être exclu de l’étude, soit 5 animaux par groupe pour l'étude la cinétique. Ainsi, le projet sera composé de 4 groupes exposés par gavage, un groupe contrôle non gavé et 4 groupes exposés par voie alimentaire. Trois animaux maximum permettront de mettre au point la méthode de prélèvement et pourront être inclus dans le groupe contrôle non gavé.

Raffinement

Les animaux seront quotidiennement observés selon différents critères établis dans une grille. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques permettant de déterminer un score. Selon le score obtenu, une action sera mise en place pour soulager au mieux l’animal. Les animaux seront hébergés plusieurs par cage et leur environnement sera enrichi (cylindres en carton, lanières de papier krafts, bâtons de bois à ronger) pour limiter le stress de l’animal tout le long de chaque procédure. Puis après la pose du cathéter, les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter toute blessure liée au cathéter entre congénères qui pourrait induire une infection et compromettre les résultats. Lors de la pose du cathéter, du sérum physiologique contenant de l’héparine sera injecté pour s'assurer du bon fonctionnement du cathéter et éviter la formation d'un caillot sanguin puis un bouchon sera placé pour éviter des possibles "fuites" de liquide biologique. L'extrémité du cathéter sera extériorisé pour réaliser des prélèvements de sang 3 jours plus tard. Pendant la période de récupération post-chirurgicale (3 jours), les animaux seront étroitement surveillés afin d'écarter toute douleur liée à l'installation du cathéter. Pour cela, en début et fin de journée, un examen clinique sera réalisé (selon les critères de la grille). En parallèle, afin de s'assurer du bon fonctionnement du cathéter, du sérum physiologique hépariné sera injecté dans le cathéter par un expérimentateur pendant que l'animal sera maintenu par un autre expérimentateur (contention classique). Une partie des animaux sera gavé avec une canule spécifique pour cette technique afin d'éviter tout dommage sur l'animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés par le cathéter préalablement installé. Si l'animal est docile et apprivoisé, il sera seulement maintenu par un expérimentateur pendant d'un autre expérimentateur réalise le prélèvement.

Choix des espèces

Le modèle rat est une espèce de référence en toxicologie. En effet, il est un bon indicateur pour prédire les effets toxicologiques et le temps de présence dans le sang afin de définir des valeurs de référence pour éviter d’éventuels effets chez l’Homme. Les animaux étudiés seront des adultes (environ 2 mois pour un poids compris entre 300 et 400g) pour garantir un poids suffisant des organes d’intérêt et pouvoir comparer les résultats de l’étude avec les données disponibles dans la littérature qui sont majoritairement obtenues sur des adultes.

Gavages quotidiens, prélèvements sanguins répétés, injections dans le sinus rétro-orbitaire deux fois par œil : 1 500 souris et 750 rats vont subir ces gestes pour que des personnels apprennent à les exécuter, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'inexpérience des apprenants peut causer une perforation de l'œsophage, une fausse route mortelle, une nécrose ou une brûlure de la queue, une section de la queue au scalpel, une éraflure de l'œil rendant l'animal borgne. L'objectif affiché reste pourtant de garantir le bien-être des animaux non-humains par la maîtrise du geste, pour cinq personnes formées par an pendant cinq ans. La mise à mort sert elle aussi d'exercice : le porteur indique qu'elle permettra à la personne formée d'apprendre la dislocation cervicale et l'appareil à hypoxie au CO2.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de permettre au personnel de notre laboratoire de pouvoir se former aux gestes et techniques de base de notre métier. Ces procédures menées sur les animaux de laboratoire doivent être accomplies avec une maîtrise parfaite des gestes techniques pour garantir leur bien-être ou pour réduire au maximum l’inconfort résultatnt de l'expérimentation. La période d’apprentissage de l’expérimentateur est importante car elle va conditionner la qualité du travail qui sera fourni ultérieurement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu par ce projet est de former un personnel et de transmettre un savoir-faire en expérimentation animale à des personnels novices ou nécessitant une remise à niveau.

Procédures

Les administrations intra gastriques (gavages) ne doivent pas prendre plus de 15 secondes par animal que ce soit pour les souris ou pour les rats. Ils peuvent être répétés quotidiennement pour s’assurer que le geste est bien maîtrisé et qu’il n’entraîne pas de perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront être faits jusqu’à 4 fois par animal avec un temps de récupération d'une semaine nécessaire avant de procéder à un nouveau prélèvement. Ce sera aussi l'occasion pour l'expérimentateur d'apprendre à utiliser le système dédié à l'anesthésie volatile gazeuse. Lorsque le prélèvement est maitrisé, un ultime prélèvement terminal pourra être fait en fin de procédure, il sera d’un volume plus important. S'ensuivra toujours sous anesthésie gazeuse, la mise à mort de l'animal par dislocation cervicale, toujours sous la surveillance d'une personne habilitée et expérimentée au sein de notre établissement utilisateur. Pour les souris, les administrations en sous-cutané, en intra-péritonéale, en intra-musculaire et intraveineuses pourront être faites jusqu’à 3 fois avec un minimum de 3 jours entre chaque injection. Dans le cas de l'injection intra veineuse au sinus rétro-orbitaire, chaque animal ne pourra être utilisé que 2 fois par œil injecté avec un délai de repos de 5 jours entre 2 injections. Chaque geste d’injection durera environ 10 secondes. Tous ces gestes sont effectués sous la surveillance d'une personne expérimentée au sein du laboratoire.

Impact sur les animaux

Lors des apprentissages certains effets néfastes peuvent être rencontrés dûs à l'inexpérience des utilisateurs. Lors des gavages, une irritation de l'oesophage voire la perforation est possible entrainant pour le premier une perte de poids et pour le second la perte de poids précédent la mort de l'animal. De même une fausse route entraînera la mort de l'animal. Lors des administrations intraveineuses à la veine caudale, l'injection d'une bulle d'air bien que ne devant pas se produire, pourrait arriver entrainant la mort de l'animal. Les injections répétées et/ ou ratées peuvent engendrer des lésions sur la queue de l'animal pouvant aller jusqu'à la nécrose, de même lorsque la queue est trempée dans de l'eau chaude pour dilater les veines, la brulûre de la queue est à envisager. Lors d'administrations intraveineuses au sinus retro orbitaire, une mauvaise insertion de l'aiguille peut entraîner une eraflure de l'oeil entrainant une cécité de l'oeil concerné. Une anesthésie gazeuse ou injectée mal maîtrisée peut entrainer l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal et la mort. Lors des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire l'éraflure de l'oeil avec le capilaire peut entrainer une cécité de l'oeil concerné, de même une mauvaise compression de l'oeil suivant le prélèvement peut engendrer un hématome entrainant l'exorbitation nécessitant la mise à mort de l'animal. Lors des prélèvements de sang à la veine caudale, une mauvaise maîtrise du geste de scarification au scalpel peut entrainer le sectionnement de la queue. Toutes des interventions sont qualifiées de modérées.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés soit par dislocation cervicale, soit par hypoxie au CO2. On estime que ces animaux auront vieilli et ne seront plus suffisamment naïfs pour participer à d'autres études. De plus, ce sera l'occasion pour la personne formée d'apprendre à utiliser l'appareil à euthanasie par hypoxie au CO2 et d'apprendre la technique de dislocation cervicale sous le contrôle d'une personne habilitée et expérimentée.

Remplacement

Dans un premier temps, des vidéos ainsi que nos protocoles qualités seront mis à disposition des personnes devant se former aux gestes d'expérimentation sur les animaux. Ensuite, les apprentissages de préhension, injections et identifications par puces pourront se faire sur modèle inerte type CurVet Rat ou Mimicky Mouse. Une fois que la personne se sent suffisamment en confiance avec ses gestes, celui-ci pourra passer sur animaux vivants. L'utilisation de cadavres n'est envisageable que pour certaines actions ne nécessitant pas de visualiser une veine ou de nécessiter d'un reflux sanguin comme pour les intraveineuses. Ainsi, les cadavres pourront être utilisés pour les intra-péritonéales, les sous-cutanés ainsi que pour s'exercer à l'insertion d'un capillaire ou d'une aiguille dans le sinus rétro-orbitaire. Ils pourront également être utilisés pour les incisions de queue au scalpel ce qui permettra à l'apprenant d'appréhender le geste et les limites pour ne pas sectionner complètement la queue d'un animal vivant.

Réduction

Bien que n'ayant pas de vision à long terme du nombre de personnes à recruter et / ou former, nous estimons que la formation de 5 personnes par an est envisageable, en considérant aussi bien les besoins humains des projets en expansion que le "turn over" de la profession. En considérant 1 lot de 20 souris (ou 10 rats) pour l'apprentissage des gavages, 1 lot de 20 souris (ou 10 rats) pour les intraveineuses et un lot de 20 souris (ou 10 rats) pour les autres gestes qui peuvent être répétés tels que les IP, les sous-cutanés, cela par an pour 5 personnes en apprentissage, cela fait 15 lots de 20 souris par an et 15 lots de 10 rats par an soit 300 souris et 150 rats par an pour un total de 1500 souris et 750 rats pour la globalité du projet. Cette estimation est le maximum que nous pourrons utiliser sachant que parmi ces animaux, certains peuvent subir plusieurs gestes comme un gavage et un prélèvement sanguin. L'utilisation d'animaux de réforme n'est pas envisagée car nous n'avons pas d'élevage au sein de notre établissement utilisateur et les animaux de nos autres projets sont prévus pour une procédure précise et doivent être euthanasiés une fois la procédure achevée, il n'est pas prévu de réutilisation de ceux-ci.

Raffinement

Les apprentissages se feront dans un premier temps par le biais de vidéo éducative, puis par l'utilisation de modèle d'animaux inerte. Puis dans un second temps lorsque l'utilisation d'animaux vivants se trouvera nécessaire, une démonstration des gestes par 2 personnes du laboratoire habilitées et expérimentées sera faite. Lors de la phase d'exercice par la personne formée, celui-ci sera accompagné de personnes du laboratoire. Le formé s'occupera de ses propres animaux (change et soins) et procèdera à la pesée de ceux-ci afin de vérifier qu'ils s'alimentent et qu'il n'y pas de perte de poids nécessitant une mise à mort. Cela permettra également de former le nouvel entrant à repérer les signes de mal-être animal et de l'y sensibiliser. De plus, lorsque la personne formée se sent à l'aise avec les gestes qu'elle a acquis, une évaluation sera faite en présence du responsable du laboratoire vivo de l'établissement utilisateur ainsi que d'un assistant de recherche.

Choix des espèces

Le choix des espèces rats et souris pour ce projet de maintien de compétences et d'apprentissage de techniques est justifiée par le fait qu'il s'agit des espèces utilisées dans les programmes de recherches sur la sphère hépatointestinales effectuées au sein de notre établissement utilisateur. Les souris adultes et les rats matures seront employés car ils présentent les caractéristiques idéales pour l'apprentissage de personnel novices ou peu expérimentés