Rats

Pour savoir si la présence d'un congénère modifie la consommation d'héroïne, 1 910 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit au moins une chirurgie sous anesthésie générale, injection intracérébrale d'une heure trente, implantation d'électrodes ou de fibres optiques de trois heures, pose de cathéter d'une heure, puis porte un capuchon de ciment dentaire sur le crâne. Une partie s'auto-administre l'héroïne, d'autres sont placés en position d'observateurs. Le porteur indique que la surconsommation peut conduire à une overdose et à la mort, que les rats sont isolés après l'opération et que leur alimentation reste contrôlée pour les garder motivés. Il justifie le recours au rat par le fait qu'il "s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'humain" et par l'interdiction, en France, de fournir des drogues d'abus dans une expérimentation humaine.

Objectifs

Le rôle du contexte social dans la consommation de drogue n’est pas bien déterminé. Chez le rat, la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques, que les rats émettent pour communiquer les uns avec les autres, diminue la consommation de cocaïne, de même que la présence physique d’un congénère avec lequel il peut interagir. Cette diminution est d’autant plus forte lorsque le congénère est inconnu plutôt que familier (c’est à dire le partenaire de cage). Ces effets peuvent varier en fonction du type de drogue ou de son mode d’administration. On observe ainsi à l’opposé une augmentation de la consommation d’alcool chez le rat mis en présence d’un congénère. Ce projet vise à évaluer l’impact de ces contextes sociaux sur la consommation d’un autre type de drogue, l’héroïne. Le noyau subthalamique (NST) est impliqué dans les comportements de recherche et consommation de drogue et son implication dans l’influence de la présence d’un congénère ou la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques a été mis en évidence. Ses connections avec d’autres structures cérébrales, pourraient, elles aussi, être impliquées dans ces processus. Le but de ce projet est donc de caractériser les réseaux cérébraux liés au NST responsables des modulations de la prise d’héroïne dans les contextes sociaux décrits précédemment. Nous utiliserons différentes techniques afin d’évaluer sélectivement le rôle de chaque connexion. Notre objectif est également de mettre en évidence d’éventuelles différences en fonction du sexe des individus, en étudiant à la fois des rats mâles et femelles. Dans son ensemble, ce travail conduira à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques d’un effet du contexte social, déterminant pour la réduction des risques de consommation de drogues.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du NST et de son réseau pour mieux comprendre les processus émotionnels en lien ou non avec la prise de drogue, notamment l’effet du contexte social, qui peut être protecteur ou non en fonction de la drogue consommée. Pour cela, nous utiliserons la présence d’un observateur, qui permet une approche plus écologique et plus réaliste de la consommation de drogue chez l'humain. L’identité du congénère variera en fonction de sa familiarité, de son sexe et de son historique de consommation afin de déterminer l’impact de chaque paramètre social sur la consommation d’héroïne. En plus d’améliorer les modèles animaux d’addiction, ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, des potentiels effets réducteurs de risques des interactions sociales et confirmera le potentiel de la manipulation du NST pour le traitement de cette pathologie. Il permettra aussi de mieux comprendre les potentiels effets secondaires de la manipulation du NST. De plus, il permettra de mettre en évidence le rôle du NST dans la motivation et les comportements sociaux, et d’appréhender de nouvelles bases neurales de certains troubles liés, comme celui du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisée sous anesthésie générale. Ces interventions peuvent être de différents types : injection intracérébrale (1h30), implantation d’électrodes ou de fibres optiques (3h), pose de cathéter (1h).

Impact sur les animaux

* Les nuisances attendues sont les conséquences « classiques » à court terme des interventions chirurgicales. Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, de même que celle des électrodes, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. * Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. * Les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters ou fibres optiques ou électrodes, peuvent parfois engendrer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu * La consommation d’héroïne n’induit pas d’augmentation générale de l’activité de l’animal, mais au contraire peut avoir un effet sédatif. Ces effets diminuent rapidement (environ 1h) après la dernière dose auto-administrée. * La surconsommation de drogue peut conduire à une overdose et la mort de l’animal. * Après une perte de contrôle de la consommation de drogue (protocole d’escalade de la consommation), l’animal n’ayant pas accès ad-libitum à la drogue, il peut présenter des symptômes de manque. * Les injections éventuelles d’analgésiant et d’anesthésique, de même que l’entretien du cathéter peuvent également engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort après les études comportementales afin de vérifier que les injections des virus et implantations de fibres optiques et le cas échéant, d’électrodes d’enregistrement aient été correctement localisées. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude. Le recours à des méthodes invasives exclut de fait les études chez le sujet humain, d’autant qu’il est interdit en France de fournir des drogues d’abus dans le cadre d’expérimentation humaine.

Réduction

L’expertise acquise dans l’équipe sur ce type d’expérience nous a permis de fixer a priori le nombre d’animaux nécessaires. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et optogénétique et electrophysiologiques, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements des fibres ou électrodes. Pour la photométrie, 5 animaux par groupes sont suffisants. Les rats observateurs naïfs à la drogue pourront venir d’autres protocoles de l’équipe après accord de la SBEA (Structures chargées du Bien Etre des Animaux) afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. Les rats observateurs non naïfs à la drogue seront les mêmes que les rats sujets qui s’auto-administreront la drogue.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. Une grille de score sera utilisée systématiquement en période post-opératoire, ainsi que tout au long de l’expérimentation pour le suivi du bien-être des animaux, afin de surveiller au mieux les animaux et prendre les décisions les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Les animaux seront hébergés si possible par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain. De plus le rat est un animal social dont le comportement se rapproche de l’humain, avec mise en place d’un système hiérarchique et organisé, un communication visuelle, olfactive, auditive et tactile. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rats adultes (>7-8 semaines), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

56 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un capteur cardiaque implanté sous anesthésie, puis subit échocardiographies, mesures de pression artérielle et prélèvements sanguins répétés, et vingt-quatre d'entre eux une ligature de l'artère coronaire gauche que le porteur reconnaît potentiellement létale. L'intoxication par la ciguatoxine peut provoquer diarrhées, troubles neurologiques et cardiovasculaires, les rats perdant plus de 15 % de leur poids étant alors mis à mort. Le porteur revendique de vouloir "exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole" et prévoit le prélèvement des tissus cardiaques, neuronaux, adipeux et musculaires après la mise à mort.

Objectifs

La ciguatera (CG) est une maladie induite par les ciguatoxines (CTXs), naturellement prduites par certaines algues (microscopiques). Elles sont responsables d'intoxication alimenatire non bactérienne aux fruits de mer la plus courante dans le monde. L'explosion du trafic maritime, s'accompagnant de l'augmentation du volume des eaux de ballast transportées et mélangées, contribue considérablement à la propagation du plancton des zones tropicales contaminées, plus particulièrement d'Asie et d'Asie du Sud-Est, vers les côtes tempérées sujettes au réchauffement climatique. La CG, pourrait largement se propager, nottamment en méditérranée et prendre la forme d'une pandémie. L'absence de tests de détection rapide augmente l’exposition à la CG. De plus, aucun traitement ciblé n'est actuellement disponible en raison d'un manque d'identification précise des mécanismes moléculaires, physiologiques et pathologiques associés. La CG se manifeste par de multiples symptômes indéfinis (gastro-intestinaux, cardiaques, neuronaux, cutanés et inflammatoires), accentués en cas d'antécédents cliniques. Plusieurs cibles de canaux ioniques (canaux sodiques, potassiques et calciques), protéines essentielles au bon fonctionnement des cellules sont suspectées dans la CG. Les CTXs seraient capables de moduler l’activité de ces protéines canal pour modifier, notamment, les flux ioniques responsables du fonctionnement cardiaque et neuronal. Notre objectif est de caractériser le mode d’action et conséquences des CTXs sur la fonction cardiaque/vasculaire et le système nerveux in vivo. Nous souhaitons savoir si les effets liés à une intoxication aux CTXs et nottament à la Ciguatoxine 1B (CTX1B), peuvent être modulés par différents traitements préventifs et curatifs. Dans un second temps, ceci pourrait permettre de déterminer de nouveaux outils de diagnostic de la CG ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser in vivo la nature des effets induits par une intoxication à la Ciguatoxine 1B (CTX1B). En particulier, nous determinerons la nature des altérations cardiaques (structurelle et/ou fonctionnelle) et vasculaires ainsi que le rôle des atteintes du système nerveux autonome dans ces conséquences délétères. A partir ders pélèvements sanguins, nous determinerons si certains marqueurs sanguins sont augmentés/diminués après une contamination à la CTX1B. De récentes études cliniques ont montrées une augmentation de lactate dans le sang évoquant une hypoxie tissulaire en rapport avec une insuffisance cardiovasculaire. Le suivi ECG nous permettra de voir si la CTX1B module le rythme cardiaque chez les sujets contaminés. Les prélèvements post-mortem permettrons de faire une exploration plus approfondie des tissus cardiaques et neuronaux, afin de voir les effets directs de la CTX1B, mais aussi sur les tissus adipeux et du muscle squeletiques pour détecter le site de stockage de la CTX1B dans l’organisme.

Procédures

La totalité des animaux (soit 56 animaux) seront tous soumis aux mêmes gestes techniques : échocardiographie (environ 15 min/ animal), électrocardiogramme (ECG, recueil des données pendant 24h/animal de façon non invasive) par télémétrie, prélèvement de sang (quelques secondes/animal), mesure non invasive de la pression artérielle (environ 15 minutes/animal). Ces gestes techniques seront chacun réalisés à 3 reprises sur la durée du protocole expérimental (19 jours pour 32 animaux et 24 jours pour 24 animaux). Vingt-quatre animaux seront soumis à ces gestes techniques à 4 reprises ainsi qu'à une chirurgie via la ligature de l'artère coronaire gauche. Il existe un risque que cette chirurgie nécessaire à l'induction d'une sensibilisation aux arythmies cardiaques soit léthale. Cette chirurgie, d'environ 1 heure/ animal, nécessitera une anesthésie générale des animaux. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire. De plus, la totalité des animaux sera soumise à une chirurgie nécessitant une anesthésie générale pour l'implantation du capteur permettant le recueil des paramètres ECG d'une durée d'environ 25 min/ animal. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire afin d'éviter toute douleur de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront d'une part ressentir les symptômes classiques de la CG chez l’Homme, tels que : - Troubles gastro intestinaux (48-72h post infection) - Troubles neurologiques (48-72h post infection) - Troubles cardiovasculaires. (48-72h post infection). Ces troubles, notamment gastro intestinaux, peuvent induire des phénomènes de diarrhées pouvant mener à une perte de poids de l’animal. Si une perte de poids > 15% du poids initial est constatée, alors le point limite de l’expérimentation sera atteint et nécessitera la mise à mort de l’animal. Les groupes d'animaux sensibilisés pour les arythmies cardiaques via la ligature d'une artère coronaire ont un risque élevée de mortalité inhérent à la procédure. Le projet necessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique uniquement pendant l'enregistrement de l'ECG (24h/ acquisition).

Devenir

A la fin des protocoles expérimentaux tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires).

Remplacement

La CG est une pathologie syndromique incluant de nombreux effets systémiques. Il n’existe pour l'heure pas de modèle in vitro sur lequel ont été relevés les effets cardiaques, effets vasculaires et effets sur le système nerveux autonome grâce à un modèle capable de mimer les conditions physiopathologiques induites par la Ciguatoxines 1B (CTX1B). .

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux via l'utilisation d'outils statistiques et en couplant plusieurs approches (echocardiographie, ECG par télémétrie, prélèvement de sang, mesure non invasive de pression arterielle), compatibles entre elles, et effectuables sur un même animal. Un suivi dans le temps sera également éffctué. L'ensemble des animaux sera prélevé post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires) pour exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole.

Raffinement

Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés par groupes de 3 par cages dans un environnement calme, sous contrôle de luminosité, de l'hygrométrie et de la température, de manière appropriée avec un enrichissement du milieu (barre de bois, cabane, carré de ouate) permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Après chirurgie pour mise des télétransmetteurs, les animaux seront placés en couveuse thermorégulée et surveillés pendant un minimum de 3 heures. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites établis dans ce projets seront appliqués. Nous allons fournir les soins per- et post-opératoires appropriés via l'administrations d'anesthésiques et d'analgésiques. Nous évaluerons entre autres les critères de souffrance animale communément utilisés (rythme cardio- respiratoire, reprise de mouvement, un état de prostration, l’hydratation). En cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, après analgésie.

Choix des espèces

Le modèle de rat Wistar est un modèle largement caractérisé sur le plan cardio-vasculaire, dont un nombre important de travaux est décrit dans la littérature (inculant ceux du laboratoire). La physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme (régulations et structure morpho-fonctionnelle, régulation par le système nerveux autonome). Le modèle rat a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo selon les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les animaux entreront dans le protocole à un stade mature pour éviter tout problème lié au développement.

Tués au terme d'une dernière intervention menée sous anesthésie sans réveil, pour que leurs organes soient prélevés, 720 souris et 720 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont ovariectomisées à quatre semaines pour reproduire une ménopause, reçoivent des hormones jusqu'à six mois, subissent de deux à quatre chirurgies et passent des séjours de vingt-quatre heures en cage métabolique individuelle, jusqu'à deux fois par semaine. S'y ajoutent jusqu'à vingt-quatre prélèvements de sang, à la queue ou à la veine saphène, sur animal vigile. Le porteur teste des molécules dont ses clients ne lui communiquent ni la nature ni les effets secondaires possibles, prévoit trente études sur cinq ans, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer la taille des groupes, arrêtée à huit animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.

Procédures

Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. Si un animal présentait des symptômes pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière, isolé et soigné si besoin selon les symptômes. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h ou si un point limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux lors des contentions.

Choix des espèces

Ces procédures seront effectuées chez des animaux « normaux » et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes, de l’un de ses sous-types, ou de l’une de ses voies d’action (nucléaire ou membranaire). Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter toute imprégnation hormonale. Le traitement hormonal sera administré 1-2 semaines après l’ovariectomie et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.

Tuées à la fin des expérimentations pour que leurs tissus soient prélevés, 96 rates Lewis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suspendues par un harnais qui décharge leurs pattes arrière pour reproduire un alitement, ce qui peut provoquer sur les premières quarante-huit heures une perte de poids et des bouchons d'urine. S'y ajoutent trois prélèvements de sang à la veine de la queue et, trois fois au cours du protocole, un test de vitesse maximale aérobie sur tapis roulant d'une vingtaine de minutes, un test d'endurance de trente à soixante minutes et un test de force d'agrippement. Le porteur écrit que ces procédures "n'entraînent pas de douleurs spécifiques" et qualifie le recours aux rates d'"étape obligatoire" mais aussi d'"extrêmement enrichissante du point de vue scientifique", pour évaluer un extrait de romarin contre la fonte musculaire.

Objectifs

Le romarin est connu depuis quelques décennies pour avoir des effets antioxydants et anti-inflammatoires pouvant être bénéfiques pour l’être humain dans certaines circonstances. Le projet vise à tester les effets d’une substance naturelle extraite du romarin et de ces dérivés afin de prévenir la perte de masse musculaire et d’endurance lors d’une immobilisation prolongée ou bien résultante d’une maladie musculaire. Ce projet présente plusieurs objectifs. Dans un premier temps, il s’agira de tester l’efficacité des composés contre la perte de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le modèle de suspension par harnais chez le rat. Il s’agira aussi de compléter la connaissance des mécanismes de fonctionnement du composé principal. Dans un second temps, l’objectif de ce programme est de développer des substances dérivées mais avec des propriétés sur la masse musculaire et sur l’endurance plus importantes. Ces substances seront développées et d’abord testées sur des cultures de cellules musculaires humaines. La ou les molécules les plus efficaces seront ensuite testées pour lutter contre la diminution de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le même modèle de suspension). L’ensemble de ce projet vise donc à la fois des aspects fondamentaux mais aussi appliqués avec le développement d’une nouvelle stratégie de prévention de la perte de masse musculaire et d’endurance. Les effets du modèle de suspension par harnais qui sera utilisé se rapprochent énormément de ceux retrouvés lors d’un alitement clinique chez l’humain et par conséquent la réussite de ce projet pourrait avoir un impact important chez les patients alités et par extension dans les diverses situations entrainant une diminution de l’activité physique (plâtrage, sédentarité) ou dans diverses maladies musculaires impliquant les cibles du composé et de ses dérivés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et l’inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est un réel problème en matière de santé publique. Ces expérimentations portent donc sur un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine.

Procédures

Tous les animaux subiront 3 prélèvements de sang sur animal vigile en respectant les recommandations en termes de volume, de fréquence et de site de prélèvement. Les animaux réaliseront ensuite des tests non invasifs. Pour les qualités d'endurance, 2 tests seront réalisés sur tapis roulant à savoir le test de VMA (vitesse maximale aérobie) qui dure une vingtaine de minutes et le test de temps limite qui dure entre 30 et 60 minutes en général. L’étude de la composition corporelle dure 2 min. Le test de force d’agrippement dure une quinzaine de minutes (3 séries de 5 essais de 2-3 secondes entrecoupées de 5 minutes de récupération). L'ensemble des tests seront réalisés 3 fois au cours de la procédure à raison d'une fois par semaine sur 3 semaine distinctes (avant le début du traitement, après le traitement et après la suspension). L'ordre des tests au cours des 3 périodes de test sera la suivant. Le test de composition corporelle sera réalisé 3 fois au cours de la procédure. Il sera réalisé une fois le premier jour de chacune des 3 semaines de test. Le test d’agrippement est réalisé au jour 2. Le test de vitesse maximale aérobie est réalisé à 3 jours et le test d’endurance est réalisé à 5 jours pour permettre un repos complet de l’animal.

Impact sur les animaux

La principale nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera le stress lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension des pattes arrières qui peut entrainer sur les premières 48h une perte de poids ainsi que des bouchons d’urine. Les animaux seront aussi stressés lors des tests fonctionnels sur tapis roulant (3 tests de 20-30 minutes espacés de 2-3 semaines) et ou pendant l’évaluation de la force d’agrippement (3 tests de 5 répétitions d’agrippement durant 2-3 secondes chacune espacés de 2-3 semaines) ainsi que lors des 3 prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue. De plus, lors des 3 prélèvements sanguins, les animaux pourrait ressentir une légère douleur au moment de l'introduction de l'aiguille dans la veine caudale.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats pré-cliniques très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés aux moyens de trois axes de réductions. Le premier axe consiste à regrouper les procédures de 2 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 2 le nombre de rats qui aurait été classiquement employé. Le deuxième axe consiste à utiliser les mêmes animaux pour obtenir des données fonctionnelles et des données cellulaires et moléculaires permettant là encore de réduire le nombre de rats par 2 sans affecter la qualité des résultats. Enfin, le troisième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement avec un logiciel.

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour les tests physiques réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir. Les différents composés sont intégrés dans la nourriture pour éviter toute injection ou gavage. Les procédures de suspensions par harnais sont validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toutes complications. De plus, les rats seront hébergés par deux dans une même cage pour éviter l’isolement social. Pour éviter le refroidissement, la température de la pièce d'élevage sera de 24-25° et les animaux auront à disposition de la ouate pour réaliser leur nid. Chaque phase de l’étude possède également des points limites et critères d’arrêts strictes en cas d’évènements potentiellement néfaste du point de vue des animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être etc. Les suivis quotidiens des animaux, des poids corporels et la consommation de nourriture sera un paramètre intégré à nos protocoles. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt, les animaux sont anesthésiés avant d’être mis à mort pour éviter toute douleur.

Choix des espèces

Le rat Lewis est privilégié pour de plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculaire. Cette espèce est de même plus petite et moins lourde que les rats Wistar nous permettant d’utiliser le modèle de suspension par harnais en toute sécurité. Enfin, ces expérimentations se feront sur des rats femelles, afin de combler le manque de résultats sur ce sexe. Les animaux seront utilisés entre 11 et 22 semaines d’âge. L’expérimentation commencera à 12 semaines car à partir de cet âge la croissance musculaire des rats Lewis devient très lente.

45 rates adolescentes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées et pesées chaque jour, trente d'entre elles subissent trois semaines de restriction alimentaire pour reproduire une anorexie mentale, toutes passent deux examens d'imagerie de soixante minutes sous anesthésie après injection d'un produit radioactif, et quinze reçoivent en plus une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois semaines. Le porteur reconnaît que la restriction peut provoquer une constipation et que l'isolement peut stresser les rates, et fixe la sortie de l'étude à une perte de poids supérieure à 25 %. L'avancée espérée sur un sous-type de récepteur à la sérotonine "pourrait ouvrir la porte" à de nouveaux traitements, et le porteur affirme qu'un modèle animal est "nécessaire" parce qu'il veut suivre l'installation d'une maladie chronique.

Objectifs

L’anorexie mentale fait partie des troubles alimentaires dont l'origine est multifactorielle. Ce trouble se caractérise par une restriction des apports alimentaires durant plusieurs mois, voire plusieurs années, conduisant à une perte importante de poids associée à un certain "plaisir de maigrir" et une peur intense de prendre du poids. La prise en charge de cette pathologie passe par différentes stratégies (soutien psychologique, renutrition, traitement antidépresseur) mais il n’existe pour le moment pas de traitement médicamenteux spécifique de l’anorexie mentale. Une étude a montré l’implication de la sérotonine (un neurotransmetteur impliqué dans de nombreuses fonctions physiologiques) à diminuer la prise alimentaire chez le rat entraînant une perte de poids significative. Ces résultats préliminaires laissent entrevoir un potentiel rôle du récepteur à la sérotonine dans la prise alimentaire et plus largement dans l’anorexie mentale. Nous proposons donc d’explorer l’évolution de la densité d’un sous type de récepteurs à la sérotonine chez des rats dont l’anorexie mentale aura été induite par un régime alimentaire et une activité physique adaptés à l’aide de la Tomographie par Emission de Positons (TEP).

Bénéfices attendus

L'anorexie mentale a été longtemps considérée comme un trouble principalement influencé par des facteurs socioculturels ; cependant, des études ont montré qu’elle est plus fréquente dans certaines familles ce qui suggère une influence génétique dans ce trouble. Le rôle de la sérotonine dans l'anorexie mentale découle en grande partie des données pharmacologiques établissant un lien entre le système sérotoninergique et la régulation de l'appétit. Le système sérotoninergique peut en effet médier la sensation de satiété et la motivation de la consommation de nourriture. L’avancée des connaissances sur les récepteurs impliqués dans l’anorexie mentale pourrait alors ouvrir la porte à la conception de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les rats (n=45) seront isolés et pesé quotidiennement. Deux groupes (n=30) seront soumis à un régime alimentaire restreint pendant trois semaines. Deux examens TEP sous anesthésie générale de 60 minutes, par injection intraveineuse, d’un radiopharmaceutique seront réalisés au début et en fin de procédure pour tous les rats (n=45). Un groupe (n=15) sera traité pendant trois semaines par injection intra péritonéale quotidienne d’un médicament.

Impact sur les animaux

Le régime hypocalorique pourrait induire une modification du transit intestinale avec apparition de constipation chez les rats. L'isolement des rats envers ses congénères pendant la période de l’étude pourrait provoquer des symptômes de stress chez les rats.

Devenir

Les rats seront mis à mort par utilisation d’un agent euthanasiant. En cas d’atteinte des points limites, la mise à mort d’un sujet sera envisagée. Les cerveaux pourront être extraits pour des analyses sur tissu frais congelé. D’autres organes pourront être prélevés si l’étude le nécessite.

Remplacement

Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons explorer l’évolution de certains récepteurs suite à l’apparition d’une maladie chronique. Une fois la preuve de concept obtenue chez l’animal, ce projet d’imagerie sera rapidement transférable chez l’Homme en utilisant le même radiotraceur.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi correspond au minimum acceptable afin d’analyser les données de façon pertinente d’un point de vue statistique. Ce nombre est fonction du nombre d’examens techniquement réalisables par notre équipe. Le suivi longitudinal des rats en imagerie permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le choix de rats comme modèle repose sur le fait qu’ils sont un modèle robuste et connu pour la maladie étudiée. Un monitorage rapproché sera appliqué chez les rats du groupe ABA chronique. Les points limites justifiant la sortie d’un sujet de l’étude seront l’observation d’un comportement de souffrance (selon l’apparence, les comportements naturel et provoqué, l’hydratation et les selles) et une perte de poids supérieure à 25%. Lors des examens d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale profonde permettant à l’animal de ne ressentir aucune douleur.

Choix des espèces

Dans cette étude potentiellement translationnelle chez l’Homme, le rat apparaît comme étant le plus adapté en termes de faisabilité, modélisation et translation. L’anorexie induite chez le rat est physiologiquement proche de celle retrouvée chez l’Homme : hyperactivité malgré la baisse de prise alimentaire, perturbation du cycle oestral. Le choix du rat est préféré à la souris pour la plus grande taille du cerveau, au regard de la résolution limitée de la TEP. Selon le modèle d’anorexie mentale chronique, des rats femelles de 8 semaines seront utilisées. Ainsi, nous pourrons suivre l’impact de la nourriture sur leur développement et influencer leur perte de poids permettant de créer un modèle d’anorexie mentale chronique se rapprochant de ce qui est observé chez l’humain. Le choix de rates adolescentes est motivé par le fait que l’anorexie mentale est fréquemment observée chez la femme entre 15 et 17 ans.