Souris
Effets de l’enzyme méthioninase de la bactérie Thermobrachium celere sur le métabolisme de la méthionine
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour doser les acides aminés dans leur sang, leurs muscles et leur foie, 316 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections par jour pendant deux jours sous sédation à l'isoflurane, et sont mises à jeun, ce que le porteur rapproche du jeûne physiologique. L'objet est de vérifier qu'une enzyme bactérienne fait baisser la méthionine dans le sang et de mesurer combien de temps elle agit, la privation de cet acide aminé bloquant la croissance des cellules cancéreuses. L'effectif se décompose en une étude pilote de 56 souris puis 260 ou 130 selon qu'un effet du sexe apparaît, sans que le résumé indique ce qu'il advient des 130 souris d'écart entre ces deux scénarios.
Objectifs
La restriction en un acide aminé la méthionine (Met) induit l’arrêt de croissance et la mort des cellules cancéreuses, les cellules normales y étant beaucoup moins sensibles. Cet effet est décrit depuis des décennies. La méthionine étant un acide aminé indispensable pour l’homme, il est difficile de mettre en place un régime sans cet acide aminé. On peut obtenir efficacement une diminution du stock de Met avec une enzyme bactérienne absente chez l’homme et présente dans certaines espèces de bactéries. Certaines enzymes bactériennes ont été étudiées mais n’ont pas pu être développées car elles étaient rapidement dégradées dans le corps humain, Cette insuffisante stabilité est une limitation générale pour l’utilisation des enzymes bactériennes décrites jusqu’ici. Nous avons recherché des candidats d’intérêt thérapeutique plus stables, et nous avons caractérisé une enzyme, qui dégrade la méthionine. Elle présente des paramètres cinétiques favorables, avec une bonne efficacité de dégradation de la méthionine et qui est plus stable à des concentrations compatibles avec une administration en clinique. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de cette enzyme à induire une diminution des concentrations sanguines en méthionine et à étudier sa durée d’action in vivo chez la souris. Ceci permettra d’une part, d’un point de vue scientifique, de mieux comprendre les déterminants importants pour l’activité de l’enzyme sur des mammifères. Et il s’agira d’autre part d’une étape indispensable dans la poursuite du développement de cette enzyme comme candidat pour la thérapie anticancéreuse humaine.
Bénéfices attendus
Ces études fournissent des informations sur le métabolisme de la méthionine, dont les concentrations élevées jouent un rôle significatif et important dans le développement des tumeurs cancéreuses. Ces résultats sont importants pour évaluer la pertinence de poursuivre des études sur l’utilisation de l’enzyme en tant que médicament anticancéreux humain potentiel.
Procédures
Deux injections par souris sont prévues par jour, pendant 2 jours, durant la période expérimentale sur toutes les souris. Les injections seront réalisées en quelques secondes sous sédation pour réduire le stress.
Impact sur les animaux
Deux injections par souris sont prévues par jour, pendant 2 jours, durant la période expérimentale. Ces injections seront réalisées sous sédation à l’isoflurane et pourraient entrainer une légère douleur pour l’animal. Le jeune ne devrait entrainer qu’un stress léger puisqu’il correspond au jeûne physiologique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour mesurer les concentrations en en acides aminés sanguines, musculaires et hépatiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ont déjà été réalisées : dans du tampon, dans du plasma humain, et sur des lignées de cellules cancéreuses. Le développement de la nouvelle enzyme bactérienne qui dégrade la méthionine pour en faire un candidat utilisable en thérapie anticancéreuse nécessite des expériences in vivo chez l’animal pour étudier son efficacité et sa durée d’action. En effet, les résultats obtenus dans le plasma humain in vitro ne reflètent pas la stabilité de l’enzyme in vivo. Ces expériences sont nécessaires pour envisager l’utilisation de l’enzyme dans des traitement anti-cancéreux humains.
Réduction
Étant donné qu'aucune étude n'a encore été menée avec l’enzyme qui dégrade la méthionine, nous proposons donc de réaliser une première étude pilote avec 56 souris (première expérience n=8 par groupe, 4 mâles et 4 femelles) afin de déterminer la dose optimale de l’enzyme à injecter pour induire une diminution des concentrations plasmatiques en acide aminé. Pour la seconde étude, qui a pour objectif d’étudier la durée d’action de l’enzyme, nous estimons que le nombre doit être de 260 souris si un effet sexe est observé dans l’étude pilote ou 130 souris si aucun effet sexe n’est observé. Les effets du traitement seront étudiés à différents temps :2,3 et 8 jours. Un total de 316 souris sera nécessaire pour mener ce projet. Afin de déterminer la taille optimale de l’échantillon, nous avons utilisé des tests statistiques en prenant en compte l’effet attendu et le seuil de significativité. En utilisant ces paramètres, le calcul indique qu’un effectif d’environ 10 animaux par groupe est nécessaire.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 en cage collective. Les cages seront enrichies avec des tunnels transparents. L’expérimentateur ou le personnel animalier passera tous les jours pour vérifier l’état de santé des animaux et détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement, ainsi que la disponibilité de la nourriture et de l’eau de chacune des cages. Les injections seront effectuées par un manipulateur expérimenté sous sédation. Les points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’homme, la souris a un régime alimentaire très diversifié et est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie du système digestif de la souris présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. En outre, les souris sont les modèles utilisés dans les études de cancérologie et de toxicologie. L’espèce retenue pour ce projet est donc la souris qui sera le même modèle qui sera utilisé dans les études ultérieures pour étudier les effets de l’enzyme dégradant la méthionine sur le développement du cancer. Les animaux arriveront à l’âge de jeunes adultes (6 semaines, 25g), âge auquel les systèmes métaboliques sont matures, les besoins en methionine ne correspondent qu’au besoin d’entretien, ce qui nous permettra d’étudier vérifier la stabilité et l’efficacité de l’enzyme sur la dégradation de la méthionine.
Thérapie cellulaire dans la sclérodermie systémique à l’aide de modèles murins précliniques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
2 487 souris vont être utilisées, dont 1 617 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. La sclérodermie est induite par injections répétées cinq jours par semaine pendant six semaines, ce qui provoque une fibrose de la peau au point d'injection dans le bas du dos et une fibrose pulmonaire dès la deuxième ou la troisième semaine, et 580 souris subissent en plus une biopsie cutanée au punch de 5 mm. 750 souris sont tuées sans avoir servi à l'étude, leur génotype ne convenant pas. Le porteur écrit ne pas s'attendre à un inconfort ou une souffrance liés au développement de la fibrose pulmonaire, et ne prévoit donc pas d'antalgique pour cette atteinte.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie auto-immune rare et hétérogène qui est caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau pouvant aussi atteindre les organes internes (poumons) et par l’apparition d’anomalies vasculaires. C’est la maladie auto-immune avec la plus grande mortalité individuelle au sein des maladies systémiques. La première cause de mortalité associée à la SSc est l’atteinte pulmonaire. Les progrès thérapeutiques et de gestion des complications ont permis au cours des dernières décennies une amélioration de la survie liée à cette pathologie. Néanmoins, la mortalité reste trop élevée : 15% à 5 ans du diagnostic et 30 % à 10 ans. Le développement de nouvelles thérapeutiques est donc une nécessité. La thérapie cellulaire basée sur l’injection de cellules souches (CSM) est une approche thérapeutique prometteuse. En effet, les CSM sont des cellules plastiques (capables de se différencier en plusieurs types cellulaires), capables d'atténuer la réponse immunitaire et avec des propriétés anti-fibrotiques, qui peuvent améliorer la pathogénie de la SSc et ses manifestations cliniques. L’utilisation croissante des CSM provenant de différents tissus (moelle osseuse, tissu adipeux ou cordon ombilical) dans diverses pathologies, fournit des preuves cohérentes de leur innocuité chez l’homme. Dans ce projet, nous souhaitons ainsi étudier les effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire) des CSM issues du tissu adipeux nommées ASCs (Adipose-derived Stem Cells), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et les mécanismes impliqués dans leurs effets thérapeutiques dans 2 modèles pré-cliniques de souris sclérodermiques. L’intérêt de l’utilisation des ASCs est lié à leur fréquence dans le tissu adipeux et donc à leur disponibilité mais aussi à leur plus grande capacité de prolifération et des propriétés immunosuppressives supérieures.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l’efficacité de la thérapie cellulaire par injection d’ASCs pour contrer les troubles majeurs de la SSc que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et dans une moindre mesure la production d’anticorps mais également d’apporter de nouvelles connaissances sur l’effet thérapeutique des ACSs en s’intéressant plus particulièrement à leur impact sur les cellules stromales et les cellules immunitaires telles que les monocytes-macrophages et les lymphocytes B.
Procédures
Des souris vigiles (n=1737) seront soumises à une injection (30 secondes, 5 jours/semaine) pendant 6 semaines maximum et à une autre injection 1 fois (environ 90 secondes). Des souris vigiles (n=1415) seront soumises à 3 injections (chacune d'une durée maximum de 30 secondes) maximum pendant 6 semaines maximum. Des souris anesthésiées (n=120) seront soumises à 1 injection (30 secondes) au maximum 3 fois en 3 jours. Des souris anesthésiées (n=580) seront soumises à une biopsie cutanée (punch de 5 mm, réalisé entre 1 à minutes). Des souris vigiles (1200) seront soumises à une biopsie (environ 30 secondes, à l'oreille ou la queue) pour le génotypage.
Impact sur les animaux
L'induction du modèle de sclérodermie systémique par injection peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des irritations cutanées qui pourront être apaisées par l'application d'un spray anti-démangeaisons et d'anti-inflammatoires d'action localisée. Les souris développent une fibrose cutanée au point d'injection (bas du dos) et une fibrose pulmonaire modérée à partir de la 2ème ou de la 3ème semaine. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n’avons pas non plus observé de signes de difficultés ou de souffrances respiratoires dans ces 2 modèles murins. C'est pourquoi, nous ne nous attendons pas à avoir d'inconfort ou de souffrance animale liés au développement de la fibrose pulmonaire, nécessitant le recours à des antalgiques. Toutefois, un stress lié à la contention pour réaliser une injection des ASCs et un prélèvement saguin est attendu. Par ailleurs, une gêne (inflammation, démangeaison) est possible après le réveil des souris ayant eu une biopsie cutanée. Pour les souris génotypées, la biopsie au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer du stress et/ou de la douleur chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau) soit 1737 souris ou euthanasiés en raison d'un génotype ne permettant pas l'étude (750 souris)
Remplacement
L’étude des effets thérapeutiques des ASCs sur la physiopathologie de la SSc nécessite l’utilisation d’animaux et l’accès aux différents tissus impactés (peau, poumons, organes lymphoïdes) par la pathologie. Cette étude n’est pas possible sans l’utilisation de l’animal car cette pathologie auto-immune complexe touche simultanément de multiples organes et est caractérisée par la présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine, atteintes non reproductibles in vitro. L’utilisation du modèle murin est pertinente car cette espèce possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Notre expertise et nos précédents projets sur ces modèles murins nous ont permis de dimensionner nos groupes d’animaux à 10 individus afin de garantir l’obtention de données exploitables et de réaliser toutes les analyses nécessaires sur les différents tissus qui permettront de caractériser l’effet thérapeutique obtenu et d’investiguer les mécanismes d’action du traitement testé.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et de leur permettre de se construire un « nid ». Un suivi comprenant une évaluation de l'apparence physique, de la posture et du comportement des animaux sera réalisé quotidiennement et une mesure de leur poids sera réalisé deux fois par semaine. Des points limites adaptés ont été mis en place ce qui permettra de contrôler l'état de santé des animaux et d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux et à l’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui possède de nombreuses caractéristiques physiologiques et pathologiques communes avec l’homme et qui est nécessaire pour l’extrapolation des résultats. Parmi les rongeurs, seul un modèle murin de SSc est déjà développé. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés de 8 à 12 semaines, correspondant à des souris adultes dont le système immunitaire est mature. L’utilisation de souris adultes est nécessaire pour mimer la SSc humaine qui affecte seulement les adultes et dont les cellules immunitaires participent à la physiopathologie.
Formation niveau personnels assurant les soins aux animaux
- Formation professionnelle
Rats : 100
Réformés parce que trop âgés et déjà destinés à la mise à mort, 100 souris et 100 rats vont être utilisés pour apprendre à des stagiaires les gestes de contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est saisi par des opérateurs en apprentissage, une à deux minutes par geste, cinq fois au maximum. Le porteur affirme qu'aucun modèle inerte ne reproduit l'apprentissage de la contention sur animal vigile, et qu'il utilise en amont des vidéos pédagogiques pour remplacer une partie des manipulations. Les mêmes individus sont ensuite tués et disséqués pour les travaux pratiques d'anatomie, une double utilisation que le porteur compte au titre de la réduction du nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre l’acquisition des compétences pratiques nécessaires au personnel travaillant avec des animaux de laboratoire, conformément aux exigences réglementaires en matière de bien-être animal et de formation des personnels. Le projet vise à former les personnes à la manipulation des rongeurs de laboratoire dans des conditions garantissant la sécurité et le respect du bien-être animal, et leur permettra de maîtriser des gestes techniques de base. De plus, les stagiaires développeront des compétences en anatomie des rongeurs des laboratoires, leur permettant d’adopter des gestes sûrs sur l'animal.
Bénéfices attendus
Les apprenants pourront reconnaître les signes comportementaux de stress et assurer une contention efficace sans induire de douleur ni de peur pour l'animal. Ceci permettra de réduire les incidents lors des manipulations, et assurera une meilleure conformité aux exigences réglementaires et éthiques relatives à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. La dissection réalisée permettra aux stagiaires de développer une vision globale de l’animal en tant qu’être vivant, et d'avoir des repères anatomiques claires lors des contentions, ce qui renforce la sensibilité au bien-être animal.
Procédures
Les animaux ne subiront qu'une contention légère. Le geste de contention par animal sera de 1 à 2 minutes. L'animal ne subira pas plus de 5 contentions.
Impact sur les animaux
Les nuisances consistent en un stress léger et transitoire lié à la contention et à la manipulation par des opérateurs en apprentissage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après les manipulations de contention, parce que ces mêmes animaux serviront pour les travaux pratiques d'anatomie.
Remplacement
Aucun modèle inerte ne permet à ce jour de reproduire de manière réaliste l'apprentissage de la contention sur animal vigile ainsi que de l'anatomie. Des supports alternatifs (vidéos pédagogiques, démonstrations filmées) sont toutefois utilisés en amont pour familiariser les stagiaires avec les gestes et remplacer ainsi certaines manipulations sur animaux vivants. Le recours à l’animal n’intervient qu’en dernière étape du cursus, lorsque la maîtrise théorique et la préparation technique sont acquises.
Réduction
Le nombre d’animaux est minimisé en travaillant par binôme et en permettant à chaque animal d’être manipulé par plusieurs stagiaires. Par an, 8 lots de 5 animaux (1 lot par formation de 10 personnes). Au total, sur 5 ans, 200 animaux seront utilisés : 50 rats femelles, 50 rats mâles, 50 souris femelles et 50 souris mâles. De plus, les animaux seront des animaux de réforme, ce qui évite l’élevage spécifique d’animaux à des fins de formation. Enfin, ce sont les mêmes animaux qui sont utilisés dans l'apprentissage des gestes de contention qui seront utilisés pour les travaux pratiques d'anatomie.
Raffinement
Les stagiaires sont encadrés en permanence par des formateurs expérimentés, ce qui garantit la qualité et la douceur des gestes de contention. Les animaux sont manipulés dans un environnement calme, et ceci afin de réduire les réactions de stress. Chaque contention sera de courte durée (1 à 2 minutes), La méthode de contention sera modulée selon la réactivité et le niveau de docilité de l’animal. Des périodes de repos de 15 à 20 minutes seront respectées entre deux manipulations d'un même animal.
Choix des espèces
Les espèces choisies correspondent aux espèces manipulées et utilisées dans l'établissement. Les animaux utilisés sont des adultes destinés à la mise à mort due à leur âge.
Rôle de la Protéine de Transfert des Phospholipides et de la Protéine de Transfert des Esters de Cholestérol dans la biodistribution des lipoprotéines dans des modèles murins de sepsis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
672 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et l'autre moitié un niveau sévère, toutes tuées par ponction intracardiaque. Une injection de lipopolysaccharide bactérien déclenche chez elles un choc septique expérimental, avec hypothermie profonde, douleurs diffuses et perte de mobilité pouvant les empêcher d'atteindre l'eau et la nourriture, et elles subissent jusqu'à cinq prélèvements sanguins à la queue, immobilisées en tube de contention pour les injections intraveineuses. L'objet est de suivre où vont les lipoprotéines dans l'organisme pendant un sepsis et si deux protéines de transfert modifient ce trajet. Le porteur écrit que l'usage d'animaux est "indispensable" et qualifie d'"essentielles" ses deux lignées de souris, l'une privée d'une protéine, l'autre porteuse d'une protéine humaine.
Objectifs
La septicémie, ou sepsis, est une complication grave d’une infection. Elle survient lorsque la réponse de notre organisme face à une infection devient excessive et incontrôlée, entraînant des lésions sur différents organes. C’est un véritable problème de santé publique : en 2017, on estime qu’elle a été responsable d’environ 11 millions de décès dans le monde, soit près d’un cinquième de la mortalité annuelle. Malgré les progrès de la médecine, le sepsis reste l’une des principales causes de décès en soins intensifs. Une des clés de cette maladie est la présence dans le sang de substances issues de certaines bactéries, appelées lipopolysaccharides (LPS). Ces molécules, très inflammatoires, déclenchent une réaction de défense généralisée de l’organisme. Heureusement, notre corps possède aussi des systèmes de protection qui permettent de neutraliser et d’éliminer ces LPS. Les lipoprotéines, particules qui transportent les graisses dans le sang, jouent un rôle central dans ce processus : elles captent les LPS, réduisent leur toxicité et les transportent jusqu’au foie où ils peuvent être éliminés. Certaines protéines associées aux lipoprotéines, comme la PLTP (protéine de transfert des phospholipides) et la CETP (protéine de transfert des esters de cholestérol), pourraient aussi influencer ce mécanisme. La PLTP, par exemple, est capable de fixer directement les LPS et d’aider à leur neutralisation. La CETP, bien connue pour son rôle dans les échanges de graisses entre les lipoprotéines, pourrait également modifier la manière dont ces particules transportent les LPS, même si son rôle exact dans le sepsis reste encore mal compris. Le but principal de notre projet est donc de comprendre comment les lipoprotéines se répartissent dans l’organisme et comment leur circulation dans le sang évolue au cours d’un sepsis expérimental chez la souris. Nous chercherons aussi à déterminer si la PLTP et la CETP influencent ce processus, et si leur rôle change lors d’une inflammation sévère.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre ce qu’il advient des lipoprotéines dans le sang et les organes au cours de la septicémie, et pourquoi leur fonctionnement est perturbé. Plus précisément, il pourrait : - Permettre de mieux comprendre les causes des perturbations observées. Déterminer si elles sont dues à une dégradation accélérée des lipoprotéines, à des fuites vers les tissus ou à une redistribution vers certains organes sous l’effet de l’inflammation. - Éclairer des observations cliniques. Expliquer pourquoi certains patients présentent, lors d’infections sévères, des modifications rapides et importantes de leur cholestérol sanguin, et en quoi cela peut aggraver la maladie. - Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques en étudiant le rôle de protéines comme la PLTP et la CETP, qui pourraient moduler la manière dont les lipoprotéines neutralisent les endotoxines, le projet pourrait mettre en évidence de nouvelles cibles pour améliorer la défense naturelle contre l’infection. - Contribuer à une vision globale du sepsis en reliant la circulation des lipoprotéines, leur distribution dans l’organisme et leur rôle dans la neutralisation des toxines bactériennes, ce projet aidera à mieux comprendre les mécanismes qui rendent la septicémie si dangereuse.
Procédures
- Prise de sang (5 prélèvements ponctuels, de moins de 1 min chacun) - Injection intraveineuse caudale (1 ou 2 selon le groupe, injection bolus,
Impact sur les animaux
De faibles douleurs, de courte durée, peuvent survenir lors des prélèvements sanguins par voie caudale ou des injections intraveineuses et intrapéritonéales. Pour les injections IV, les souris seront placées dans un tube de contention afin d’éviter les mouvements brusques, de réduire le temps de manipulation et de garantir la précision de l’injection. Cette contention peut provoquer une gêne transitoire et un stress modéré, limité à quelques minutes. - L’injection de LPS à faible dose entraine généralement des signes modérés et transitoires, comparables à un syndrome pseudo-grippal, comprenant hypothermie modérée, douleurs diffuses, inflammation locale et généralisée. - L’injection de LPS à forte dose est associée à des effets plus marqués, correspondant à un état de choc septique expérimental comprenant hypothermie profonde, douleurs diffuses, diminution importante de la mobilité pouvant limiter l’accès spontané à l’eau et à la nourriture, inflammation locale et généralisée prononcée.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour l’analyse de la biodistribution des lipoprotéines au sein des différents organes. Un grand volume sanguin est nécessaire à la fin de l’expérimentation pour réaliser les cinétiques de clairance des lipoprotéines, l’analyse de l’inflammation sanguine et enfin l’analyse des lipides plasmatiques.
Remplacement
La septicémie est une maladie systémique complexe qui ne peut pas être reproduite fidèlement par des modèles cellulaires. Elle résulte d’interactions multiples entre les composants bactériens, comme le lipopolysaccharide (LPS), et l’organisme hôte. Ces interactions impliquent de nombreux acteurs : les cellules immunitaires (macrophages, neutrophiles, lymphocytes, cellules dendritiques) qui déclenchent l’inflammation, les cellules vasculaires responsables des altérations de la perméabilité, mais aussi des organes comme le foie, la rate et le tissu adipeux, essentiels pour le métabolisme lipidique et l’élimination des endotoxines. De plus, la distribution et l’élimination des lipoprotéines, vecteurs clés de neutralisation du LPS, reposent sur des mécanismes globaux (circulation sanguine, drainage lymphatique, excrétion biliaire) impossibles à reproduire in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces processus dans leur globalité. Dans ce projet, deux modèles murins complémentaires sont employés. Les souris déficientes pour la PLTP permettent d’évaluer le rôle de cette protéine dans le transfert et la neutralisation du LPS. Les souris transgéniques CETP, exprimant la protéine humaine CETP (absente naturellement chez la souris), afin de reproduire plus fidèlement la situation humaine et d’étudier son rôle dans le remodelage des lipoprotéines en contexte inflammatoire. Ces modèles sont donc essentiels pour comprendre le rôle respectif de la PLTP et de la CETP dans la biodistribution et le devenir des lipoprotéines au cours du sepsis, et pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
En raison des variations naturelles entre les animaux et des effets attendus des modifications génétiques, 7 souris par groupe seront utilisées. Ce nombre a été calculé grâce à un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires pour obtenir des résultats fiables et pouvoir comparer correctement les différences entre les groupes. Les différences attendues concernent la vitesse à laquelle les lipoprotéines sont éliminées de l’organisme.
Raffinement
Afin de favoriser le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés en groupe (5 à 10 par cage) dans un environnement enrichi (tunnels, coupelles, matériel de fouissage). Les souris recevant du LPS pouvant présenter des difficultés d’accès à l’eau et à la nourriture, une alimentation adaptée type Geldiet sera systématiquement mise à disposition afin d’assurer une hydratation et un apport nutritionnel adéquats. L’étude est limitée à une durée de 24 h après l’injection de LPS. Les animaux ne seront donc pas maintenus dans un état septique prolongé, ce qui limite le risque de souffrance importante. Les doses de LPS retenues sont basées sur la littérature et nos expériences antérieures. Elles permettent de reproduire un état de sepsis léger à sévère, tout en évitant une mortalité précoce. Les animaux seront suivis régulièrement (posture, mobilité, respiration, température corporelle). Des critères d’arrêt prédéfinis seront appliqués immédiatement en cas de signes de souffrance excessive. Les prélèvements sanguins caudaux seront réalisés après application d’un anesthésique local, via une légère incision, et le volume total prélevé n’excédera pas 3 % du poids corporel. Le prélèvement terminal par ponction intracardiaque sera effectué sous anesthésie générale (isoflurane), sur plateau chauffant pour maintenir la température corporelle. Une analgésie locale (lidocaïne) sera appliquée au point de ponction. Afin d’exclure toute douleur résiduelle, l’euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale immédiatement après le dernier prélèvement.
Choix des espèces
Le protocole vise à élucider des mécanismes complexes impliquant plusieurs tissus et types cellulaires : détoxification et clairance des endotoxines bactériennes (LPS), distribution des lipoprotéines dans l’organisme, réponse immunitaire et inflammatoire. Ces processus ne peuvent être étudiés de manière pertinente à l’aide de modèles in vitro ou d’organismes inférieurs, dont le métabolisme lipidique et le système immunitaire diffèrent trop fortement de ceux des mammifères. Le modèle murin est couramment utilisé depuis de nombreuses années pour l’étude du métabolisme des lipoprotéines et des mécanismes de l’inflammation en contexte infectieux. Il offre des outils expérimentaux largement validés et une physiopathologie proche de celle de l’Homme. Toutefois, une différence majeure réside dans l’absence de CETP active chez la souris sauvage, alors que cette protéine joue un rôle clé dans le remodelage des lipoprotéines humaines. Pour pallier cette limite, des lignées transgéniques exprimant la CETP humaine sont disponibles et constituent une alternative robuste à l’expérimentation sur d’autres mammifères plus proches de l’Homme. Concernant l’âge des animaux, seuls des adultes jeunes (2 à 5 mois) seront utilisés. En effet, la réponse inflammatoire chez la souris varie fortement avec l’âge : les animaux plus âgés présentent une tolérance accrue aux endotoxines, un état d’inflammation chronique et une diminution de la production de cytokines pro-inflammatoires. L’utilisation d’animaux jeunes et d’âge homogène est donc nécessaire pour garantir la pertinence et la reproductibilité des résultats.
Élevage des souris transgéniques nécessaires aux recherches portant sur les sarcomes osseux et le remodelage des tissus calcifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Cet élevage fait naître des souris génétiquement modifiées porteuses de défauts du squelette, pour alimenter des protocoles d'étude des tumeurs osseuses. 3 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, un prélèvement d'un millimètre de queue à quatre semaines servant à les génotyper. Certaines lignées naissent sans éruption dentaire et sont nourries de liquide toute leur vie, d'autres présentent un retard de croissance. Une partie des souris quitte l'élevage pour d'autres protocoles autorisés, les autres sont mises à mort passé douze mois quand elles ne se reproduisent plus, le porteur affirmant que la souris transgénique est l'"unique outil" disponible et qu'aucune technique alternative n'existe.
Objectifs
Le développement de nouveaux outils thérapeutiques nécessite une bonne connaissance des mécanismes impliquées dans la pathologie. L’objectif du projet est l’élevage de souris génétiquement modifiées qui montrent un défaut dans le développement ou maintien du système squelettique pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement des tumeurs osseuses et le remodelage des tissus calcifiés.
Bénéfices attendus
Le projet est basé sur l’élevage et la production des animaux jeunes ou adultes génétiquement modifiés associés à des défauts du système osseux. L’objectif est de mieux comprendre le remodelage des tissus calcifiés en l’absence de certains facteurs clés du métabolisme osseux. De même, ces animaux pourront être utilisés dans des protocoles expérimentaux ayant reçu une autorisation pour l’étude des sarcomes osseux et leur microenvironnement qui permettra de mieux comprendre le rôle de ces facteurs dans l’initiation et le développement de la maladie tumorale.
Procédures
Un prélèvement de 1mm de queue pour génotyper les souris à l’âge de 4 semaines est réalisé sous anesthésie volatile.
Impact sur les animaux
Difficultés de prise alimentaire par l’absence de dentition chez certains mutants, retard de croissance des jeunes souris.
Devenir
Sortie de l’élevage pour intégrer un protocole autorise par le MESR. Euthanasie des animaux trop âgés pour la reproduction (âge maximum de 12 mois) et ne pouvant pas intégrer un autre protocole autorise par le ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche.
Remplacement
Les souris transgéniques sont l’unique outil pour l’analyse in vivo des la fonction (perte ou sur expression) d’un gène. Aucune technique alternative n’est actuellement disponible.
Réduction
Les différentes colonies seront maintenues avec le minimum d’animaux pour permettre la viabilité des colonies. Afin d’éviter un nombre élevé d’animaux, les accouplements seront initiés seulement quand les animaux seront utilisés dans une procédure expérimentale ou quand un renouvellement des progéniteurs sera nécessaire. La production et nombre des animaux à utiliser par expérience reposera sur une analyse statistique. Des systèmes de veille bibliographique et d’alerte seront mis en place pour l’obtention des nouvelles données dans les domaines d’intérêt et éviter la répétition des études déjà publiées. A chaque expérience, nous échangerons avec nos collaborateurs afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et réduire la production des individus (ex : collecte de tous les organes).
Raffinement
Pour le bien être des souris, des frisottis en papier seront additionnés aux cages afin de permettre aux femelles gestantes de préparer les nids. Un enrichissement sous forme d’igloo en papier sera ajouté à chaque cage pour permettre aux souris de s’isoler. Un régime adapté aux besoins sera utilisé lors de la gestation et la lactation. Certaines mutations induisent une ostéopétrose et consécutivement une absence d’éruption dentaire. Une alimentation liquide adaptée sera mise à disposition aux animaux sans éruption dentaire dès le sevrage et tout au long de la vie de la souris. Une attention particulière sera apportée à tous les animaux mutants ostéoporotiques obtenus dans notre élevage afin de détecter et traiter au plus vite toute douleur qui pourrait apparaitre.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal qui reproduit de façon fidèle les maladies osseuses diagnostiquées chez l’être humain. Les lignées de souris transgéniques à élever sont déjà existantes. Animaux adultes sauf si besoin d’animaux jeunes pour un projet ayant reçu une autorisation du ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche.
Evaluation de la mégacaryopoïèse dans les souris drépanocytaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
La queue sectionnée, le saignement mesuré pendant une trentaine de minutes sous anesthésie, puis l'abdomen ouvert pour ponctionner l'aorte : 128 souris drépanocytaires vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, tuées avant tout réveil. Une injection est pratiquée sur animal vigile entre ces deux temps. L'objet déclaré est de comprendre comment la drépanocytose dérègle la production et l'activation des plaquettes sanguines, une piste vers de nouveaux traitements. Le porteur indique que la ponction à l'aorte prélève un volume de sang incompatible avec le maintien en vie, et que les souris utilisées pour le temps de saignement ne sont pas réveillées non plus parce que leurs organes sont récupérés.
Objectifs
L’objectif de notre étude porte sur la compréhension des mécanismes qui gouvernent la production de plaquettes sanguines ainsi que les fonctions des plaquettes en cas de drépanocytose une maladie génétique héréditaire qui affecte la fonction des globules rouges du sang. En effet, dans la drépanocytose, la production excessive des plaquettes sanguines et leur activation anormale augmentent la survenue d’occlusions des vaisseaux, une complication majeure de cette pathologie. Les plaquettes activées favorisent alors la formation d'agrégats (caillot) avec les leucocytes et les globules rouges drépanocytaires, aggravant l'occlusion des vaisseaux. Actuellement, la prise en charge des patients atteints de drépanocytose repose sur la transfusion sanguine pouvant entrainer des effets secondaires tels que des réactions immunitaires pouvant mettre en jeu la vie des patients. Comprendre comment les plaquettes sont produites et par quels mécanismes et comment cette pathologie impacte les fonctions des plaquettes est important pour trouver de nouveaux traitements pour cette pathologie.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la production de plaquettes et les fonctions des plaquettes lors de la drépanocytose afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de drépanocytose.
Procédures
Les animaux seront soumis à une section de la queue pour un temps de saignement dont la procédure dure 30 minutes environ (animal anesthésié), à une injection (animal vigile) qui prend environ 1 minute, puis à un prélèvement de sang terminal nécessitant l’ouverture de l’abdomen (animal anesthésié) qui prend quant à lui environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les complications attendues peuvent être un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) et un risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang.
Devenir
Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante et non compatible avec un maintien en vie des animaux. Les animaux utilisés pour le temps de saignement ne seront pas non plus réveillés car ils seront utilisés pour récupérer les organes et observer l’impact de la drépanocytose.
Remplacement
Les différentes étapes de la formation des plaquettes sanguines ne sont pas suffisamment caractérisées chez l’homme alors qu’elles le sont dans le modèle murin. En effet, si certaines cellules souches peuvent être utilisées pour reproduire des mutations retrouvées chez l’Homme, les techniques de culture cellulaires actuelles ne sont pas encore suffisamment efficace pour réaliser des études approfondies de la formation des plaquettes, ce qui nécessite l’utilisation de modèles murins. Concernant l’arrêt des saignements, les processus mis en jeu sont particulièrement complexes et font intervenir plusieurs types cellules ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin). Les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’hémostase in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs ont été déterminés en amont par une approche statistique.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la contention et à la manipulation, tous les jours pendant 5 jours est prévue, avant le début de l’expérimentation. Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées. Nous avons ajouté des matériaux tels que des carrés de cellulose, des bâtonnets de coton et des morceaux de papier froissé pour qu’ils puissent organiser leur environnement comme ils le souhaitent. Nous avons également veillé à ce qu’ils ne se sentent pas seuls en les plaçant en groupes sociaux. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure). De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi de limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Les procédures sont sans réveil et l’animal sera anesthésié pendant la totalité des procédures.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Les données bibliographiques démontrent que la souris est le plus adapté pour adresser les questions relatives à l’étude de la formation des plaquettes sanguines. En effet, les cellules responsables de la production des différentes cellules du sang chez la souris sont très semblables aux cellules responsables de la production des cellules du sang humain. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris humanisées qui récapitulent la pathologie humaine de la drépanocytose et nous permettent de l’étudier. Les souris seront utilisées entre 10 et 14 semaines, correspondent à des souris adultes qui ne présentent pas encore de signes de vieillissement. Les modèles réalisés nécessitent des souris adultes de minimum 20-22g. Il n’est cependant pas nécessaire de laisser vieillir les souris donc nous les utilisons dès que possible.
Etude spatio-temporelle au long terme de l’implication de l’environnement neurochimique sur la régulation de l’excitabilité neuronale chez un modèle de souris épileptique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une à deux chirurgies du crâne sous anesthésie, puis des crises d'épilepsie généralisées provoquées ou une épilepsie du lobe temporal installée durablement : 300 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie d'entre elles est en outre privée de sommeil ou exposée à un stress, sous surveillance vidéo continue, pour mesurer l'effet de ces facteurs sur les crises. Le porteur décrit les crises comme source d'un "stress de courte durée", tout en signalant l'atonie fréquente qui les suit et une perte de poids par malnutrition pendant les 24 à 48 heures suivant l'induction. Toutes les souris sont tuées puis perfusées pour prélever leur cerveau.
Objectifs
L’épilepsie touche environ 1% de la population mondiale et, dans 30% des cas, aucun médicament ne permet le contrôle des crises. Cette forme de la maladie dite pharmaco-résistante est souvent associée à de nombreuses comorbidités et complications (ex. troubles cognitifs). Son coût pour la société est estimé à 14 milliards d'euros par an en Europe et, malgré l’accès à plus d’une quinzaine de nouveaux médicaments anti-crises, le taux d’épilepsie réfractaire n’a pas changé en 30 ans. Ce constat difficile est en partie dû au fait que nous ne comprenons pas bien les mécanismes de déclenchement des crises épileptiques dans le cerveau. De plus, la plupart des patients souffrent de crises présentant une certaine rythmicité, suggérant l’existence de mécanismes biologiques sous-jacents liés au temps, comme des fluctuations cycliques dans l’activité cérébrale. Ces observations soulèvent l’hypothèse que l’excitabilité neuronale pourrait être modulée par des variations lentes de certains neurotransmetteurs et neuromodulateurs. Notre étude vise précisément à explorer cette hypothèse, en étudiant comment le cerveau contrôle l’excitabilité neuronale à long terme à travers les fluctuations de ces molécules.
Bénéfices attendus
L’observation des fluctuations de l’environnement neurochimique survenant dans une multitude de zones cérébrales, que nous permet notre approche expérimentale, apportera un regard nouveau non seulement sur les mécanismes de genèse des crises d’épilepsie, mais aussi, plus largement, sur la manière dont le cerveau régule l’excitabilité neuronale. Ce projet ambitieux permettra d’établir une carte spatio-temporelle de l’environnement neurochimique lié aux états cérébraux physiologiques et épileptiques, et aura donc un impact important pour les communautés neuroscientifique et médicale et à plus long-terme pour le developpemnet de nouvelles cibles therapeutiques.
Procédures
Les animaux subiront une à deux chirurgies sous anesthésie générale et avec analgésie.. De plus, la plupart des animaux vont subir soit une ou plusieurs crises aiguës généralisées (une crise dure quelques secondes à une minute) soit développer une épilepsie du lobe temporal. Tous les animaux seront suivis de près après chirurgie et induction d’une crise, et le cas échéant traités avec des soins adaptés (ex : analgésique pour la douleur, anti-convulsant pour la crise). Un certain nombre de souris sera également soumis soit à une privation de sommeil courte soit à un stress de courte durée de faible intensité, accompagnés d’un monitoring vidéo continu pour analyser les comportements et comprendre la place du manque de sommeil ou d’un événement stressant dans l’influence des crises épileptiques.
Impact sur les animaux
La procédure implique deux chirurgies sous anesthésie générale. Cette intervention entraîne une douleur modérée qui sera atténuée par un analgésique avant et pendant l’opération et des analgésiques pendant les 3 jours postopératoires. De plus, cela entraîne une déshydratation légère de courte durée qui sera prévenue par une dose de sérum physiologique durant la chirurgie. Crises épileptiques induites ou spontanées : les crises peuvent entraîner un stress de courte durée. Pendant la période post-crise, les animaux présentent très souvent une atonie et tout sera fait pour éviter de perturber les animaux pendant cette période critique. De plus, l’induction de l’épilepsie entraîne un stress métabolique/malnutrition chez beaucoup d’animaux avec une perte de poids durant les 24 à 48h post-induction que la plupart vont récupérer rapidement au cours de prochains jours. Nous avons mis en place un protocole de suivi spécifique post-induction pour suivre le bien-être de nos animaux durant cette période critique. Les animaux seront généralement hébergés avec leurs congénères mais séparés par des parois perforées, permettant un contact visuel, olfactif et auditif.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés puis perfusés, afin de collecter leurs cerveaux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative tangible pour ce projet. En effet, notre étude utilise des méthodologies impossibles à utiliser chez l’homme/patients. Des modèles de simulations informatiques compléteront notre étude mais nous devons d’abord avoir une compréhension plus claire du rôle du stress sur les crises épileptiques.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux requis pour ce projet, nous mettrons en place des contrôles internes (mesures répétées) chaque fois que cela sera possible. Cette approche présente un double avantage : elle permet de réduire le nombre de groupes expérimentaux nécessaires, tout en augmentant la puissance statistique (observations répétées sur le même animal) de l’étude grâce à une meilleure maîtrise de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Les animaux seront tous hébergés en groupe avec un suivi hebdomadaire renforcé sur l'état de chaque individu en termes de bien-être. Pour le modèle d’épilepsie utilisé, un protocole de suivi de la crise épileptique a été optimisé. En effet, comme pour les patients, si la crise dure moins de 5 minutes, l’animal n’est pas traité pour cette crise sauf être mis au calme. En revanche, si la crise dure plus de 5 minutes, l’animal se verra administrer un anti-convulsif. Pour toutes chirurgies, les animaux seront anesthésiés de manière générale avec l'administration d'analgésiques appropriés en amont, durant et après l'opération pendant plusieurs jours. De plus, tous les animaux seront suivis post-chirurgie induction d'épilepsie pendant plusieurs jours de manière renforcée pour limiter au maximum stress et douleur à l'aide de grille d'évaluation. Enfin, les points limites stricts propres au projet seront appliqués afin d'apporter des soins adaptés le cas échéant.
Choix des espèces
Ce projet utilise des modèles de souris adultes épileptiques pour étudier au mieux les épilepsies du lobe temporal chez les patients adultes. En effet, l’étude proposée ainsi que les méthodologies utilisées ne sont pas applicables aux patients. De tous les modèles expérimentaux, le cerveau de souris offre un grand nombre d'avantages : il est structurellement très proche du cerveau humain, et il est assez gros pour permettre l’utilisation de méthodes d’enregistrements précises. De plus, par rapport au rat ou au primate, la souris permet d’utiliser un éventail très large d’outils génétiques, développés dans cette espèce. Enfin, Il existe un très grand nombre de modèles d’épilepsie acquise et génétique qui reproduisent fidèlement différentes épilepsies qui pourraient être utilisés dans de futurs projets précliniques.
Lien entre activation des macrophages et l’emplacement des cellules B de la rate via un lipide naturel
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole tient en deux injections de moins d'une minute, pour savoir si les macrophages règlent la position des lymphocytes B dans la rate. Les retombées évoquées, réduire l'activité immunitaire dans la sclérose en plaques ou l'arthrite rhumatoïde, restent au conditionnel et supposent une longue chaîne d'hypothèses. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer les animaux", les mécanismes du système immunitaire ne pouvant selon lui être reproduits en culture cellulaire.
Objectifs
Le contexte global du projet est de mieux comprendre la distribution des lymphocytes B dans la rate. Ceci est important car les lymphocytes B jouent un rôle clé dans l’initiation de la réponse immunitaire et dans la réponse immune elle-même par la production d’anticorps. Dans ce projet nous cherchons à comprendre si les macrophages, une autre cellule immunitaire, régulent la distribution des lymphocytes B et, si oui, par quel moyen.
Bénéfices attendus
Comprendre le mécanisme de la régulation du positionnement des lymphocytes B dans la rate aura des implications pour la manipulation de la réponse immunitaire. Ainsi, si –grâce à la compréhension du mécanisme- l’on était capable de réguler leur positionnement par des moyens pharmacologiques, l’on pourrait alors utiliser ces molécules pour diminuer l’activité immunitaire dans les maladies autoimmunes, par exemple la sclérose en plaque ou encore l’arthrite rhumatoïde.
Procédures
Les souris adultes sont soumises à deux injection (durée < 1 min).
Impact sur les animaux
Les injections nécessitent une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. Il n’y a pas de nuisance provoqué par les produits injectés.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le fonctionnement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles assurent une bonne réponse aux traitements. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Les souris sont observées par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris. En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet, car la souris est très bien étudiée du point de vue du système immunitaire. La procédure emploie des souris adultes >6 semaines, un âge où le système immunitaire est mature.
Conséquences de la maladie d’Alzheimer sur le système vasculaire cérébral dans un modèle souris et effet d’un agent neuroprotecteur sur les défauts mis en évidence
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
488 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune recevant une injection par jour du quatorzième jour après la naissance jusqu'à l'âge de trois ou six mois, soit plus de cent cinquante piqûres pour les animaux menés au terme le plus long. Dès le dixième jour, les souriceaux sont retirés quelques minutes du nid pour habituer les portées à la manipulation, ce qui perturbe le nid et peut stresser les animaux. Le jour de la mise à mort, un traceur est injecté dans la circulation, puis le cerveau prélevé sous anesthésie terminale. Le porteur attend de ce projet de situer le stade auquel la barrière entre le sang et le cerveau perd son étanchéité dans la maladie d'Alzheimer, bénéfice qu'il formule au conditionnel, quand les injections quotidiennes commencent, elles, avant le sevrage.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une dégénérescence lente mais progressive des neurones, affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Le cerveau est par ailleurs fortement irrigué par des vaisseaux sanguins hautement imperméables, formant une barrière étanche entre le sang circulant et les neurones. Dans la maladie d’Alzheimer, des atteintes à l’intégrité de la barrière ont été identifiées, et ces défauts pourraient participer à l’évolution de la dégénérescence neuronale. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la désorganisation de la barrière dans la maladie d’Alzheimer, et en particulier définir précisément les modifications de la perméabilité des vaisseaux sanguins au cours de l’évolution de la maladie d’Alzheimer. De plus, nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Les molécules médicament, administrées quotidiennement, ont un effet bénéfique sur les marqueurs précoces de la maladie d'Alzheimer au niveau des neurones mais nous ne savons pas si cela permet également d'améliorer l'étanchéité des vaisseaux sanguins. Ce projet nous permettra donc de mieux caractériser les effets de ce potentiel nouveau médicament de la maladie d’Alzheimer sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
La perte d’étanchéité de la barrière vasculaire dans le cerveau pourrait largement participer à la perte neuronale, et son rôle dans cette maladie est encore mal défini. Le projet pourra permettre d’identifier à quel stade de la maladie la barrière perd son étanchéité. De plus, il permettra d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une molécule médicament, testée en phase pré-clinique sur la restauration de l’étanchéité de la barrière. Intervenir sur l'étanchéité des vaisseaux est une stratégie supplémentaire importante qui permettrait d'améliorer encore plus le bien-être des patients et leur qualité de vie.
Procédures
L’injection du produit médicament est rapide (quelques minutes) mais peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal. L'injection du médicament est quotidienne, du 14ème jour après la naissance jusqu'au prélèvement du cerveau à 3 mois et 6 mois. Le jour de la mise à mort, certains animaux seront injectés avec un traceur dans le système circulatoire. 30 minutes après cette injection, on procède à l'anesthésie générale avec mise à mort par prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
L’injection de la molécule médicament a montré l’absence d’effets indésirables associés à l’injection quotidienne de cette molécule par injection intra-péritonéale à des souris pendant 6 mois. La nuisance sera donc liée à la préhension quotidienne de l'animal et l’injection de la substance (équivalente à une piqure d’aiguille). La préhension des animaux commencent dès le 10ème jour après la naissance pour habituer les petits à être séparés quelques minutes de la mère ce qui perturbe le nid et peut stresser les animaux.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient mis à mort, afin de récupérer le cerveau pour des examens post mortems
Remplacement
Nous nous intéressons à l’activité d’une structure complexe, impliquant de nombreux acteurs cellulaires et aux conséquences sur les vaisseaux sanguins au cours du développement de la maladie d’Alzheimer. Le développement de la maladie fait appel à de nombreuses interactions qui ne peuvent pas être reproduites in vitro. La souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Nous avons utilisé les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Ce nombre a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en garantissant la validité statistique des résultats.
Raffinement
Chez les souris adultes transgéniques, aucun trouble de mémoire n’a été rapporté aux stades précoces de la maladie de notre étude et nous ne maintiendrons pas d’animal vieillissant en élevage. Lors des expériences de perfusion chirurgicale, la mise à mort se fera lors d'une anesthésie terminale avec une antalgie appropriée. Nous utilisons pour les injections des seringues microfines pour induire le moins de lésion et de douleur possible. Les seringues sont changées entre chaque animal pour prévenir l'émoussement des aiguilles. Les animaux sont habitués à la préhension quelques jours avant le début des injections, et pour éviter le rejet des petits par la mère, ils seront mis en contact avec un peu d'urine maternelle avant d'être replacés dans leur cage d’origine. Des points limites ont été mis en place concernant la souffrance liée aux manipulations et injections des animaux, ainsi que pour évaluer la progression de la maladie .
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces (sans symptômes). Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémorisation, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront traités dès 14 jours après la naissance et jusqu’à l'âge de 3 ou 6 mois.
Etude du flux sanguin au cours du développement des valves dans un modèle souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées au gaz pour une échocardiographie, 105 souris femelles sont tuées sans reprendre conscience, des cœurs étant prélevés pour analyse histologique. Le projet mesure la vitesse du flux sanguin dans les valves aortiques aux stades embryonnaire et fœtal, afin de proposer un modèle des forces de frottement qui s'exercent pendant le développement. Le porteur décrit l'échocardiographie comme une procédure indolore ne nécessitant pas d'analgésique, l'unique nuisance déclarée tenant au stress de l'anesthésie. Il ne précise ni le nombre d'embryons concernés, ni les stades retenus, ni le nombre d'examens par femelle, l'effectif restant présenté comme "un nombre minimal" défini statistiquement.
Objectifs
Les maladies des valves cardiaques, appelées aussi valvulopathies, peuvent entraîner une dysfonction cardiaque d’apparition progressive. Certaines valvulopathies touchent spécifiquement la valve aortique, qui assure une circulation unidirectionnelle entre le ventricule gauche et l’aorte. La valve aortique joue le rôle de clapet empêchant ainsi le reflux du sang de l’aorte vers le ventricule gauche. Notre projet a pour objectif de mesurer la vitesse du flux sanguin au niveau des valves au cours du développement embryonnaire. L’enregistrement de ces flux, parallèlement à une analyse de l’anatomie à différents stades du développement, permettra de proposer un modèle des forces de frottement exercées au cours du développement. Cette étude ouvrira la voie à l’identification du ou des modes de signalisation cellulaire répondant aux forces qui contrôlent le développement normal de la valve aortique.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’augmenter nos connaissances sur le développement des valves cardiaques et d’identifier les voies de signalisation importante pour el développement normal de cette structure du cœur.
Procédures
Les animaux seront soumis à échocardiographie sous une anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Au cours de cette procédure, les nuisances sont liées au stress de l’anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement des coeurs et analyse histologique.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la physiologie cardiaque aux stades embryonnaire et fœtal. Malheureusement, le développement embryonnaire ne peut pas être reproduit in vitro et nous devons maintenir une analyse d’un modèle in vivo.
Réduction
Un nombre minimal de souris femelles sera inclus dans le projet. Ce nombre a été défini à l'aide d'une approche statistique permettant d'obtenir des données d'échographies significatives, fiables et reproductibles.
Raffinement
Dès l’importation des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal sur l’ensemble de nos individus. Les animaux seront hébergés en groupe. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelle et tunnels). L’échocardiographie est une procédure indolore, ne nécessitant pas de recours aux analgésiques. Afin de limiter le stress des animaux lié à une contention prolongée, elle sera systématiquement réalisée sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Le modèle souris est un bon modèle d’étude du développement du cœur et de la conséquence hémodynamique sur le développement des valves. Différents stades embryonnaires et foetaux seront nécessaires pour étudier de façon linéaire la vitesse du flux sanguin au cours du développement
Immunisation chez la souris par voie intrapéritonéale ou intramusculaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à huit anesthésies générales au maximum sur un an, à quatre injections intramusculaires suivies d'une électroporation ou à quatre injections dans l'abdomen, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 100 d'entre elles et modéré pour 200. L'objectif déclaré est de vérifier que des antigènes candidats et les voies d'administration retenues déclenchent une réponse immunitaire, en vue de vaccins antiparasitaires et de sérums antivenimeux. Toutes sont tuées en fin d'expérience, le porteur prévoyant de prélever "la totalité du sang" pour disposer du maximum d'anticorps. Il écrit par ailleurs que le protocole "n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales", alors que 200 de ces souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
Ce projet se situe dans le domaine de l'immunisation. Le but est, d'une part, obtenir des anticorps contre certaines protéines néfastes pour la santé (par exemple, des toxines), et d'autre part, d'identifier des antigènes candidats à un vaccin dans le cas de maladies infectieuses. L'immunisation peut se faire sous forme de vaccin génétique (comme dans le cas des vaccins contre la COVID-19), ou de vaccin à base de protéine (comme dans le cas par exemple du vaccin contre l'hapétite B). Dans ce contexte, le but de ce projet est de nous permettre de vérifier que les antigènes que nous avons identifiés et les voies d'administration que nous avons choisies permettent une réponse immunitaire efficace, (c'est à dire que les anticorps produits protègent de la toxicité ou de l'infection))
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point de nouveaux vaccins contre des maladies parasitaires, et de la production d'anticorps protégeant contre des protéines toxiques (comme c'est le cas par exemple des produits que l'on se procure en pharmacie contre les morsures de serpent). Il est donc attendu d'une part l'identification d'antigènes permettant au système immunitaire de générer cette réponse protectrice, et de vérifier que les voies d'administration choisies le permette.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à 8 anesthésies générales au maximum, d'une trentaine de minutes. Certains animaux subiront 4 injections intramusculaires au maximum suivies d'une électroporation (application d'un champ électrique faible pendant moins de 5 secondes). D'autres animaux subiront 4 injections péritonéales au maximum, ce qui dure de l'ordre de 5 à 10 secondes Les animaux subiront également sous anesthésie des prises de sang (5 au maximum sur un an, de 100 µl chacune), ce qui dure environ 15 secondes
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à 8 anesthésies générales ou injections péritonéales au maximum sur un an : Cela induit un stress léger du à la manipulation de l'animal, une douleur légère due à l'injection, et une hypothermie passagère, L'électroporation peut induire un certain raidissement au réveil
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort. En effet, afin de disposer du maximum d'anticorps pour les analyses fonctionnelles ultérieures, nous prélèverons la totalité du sang en fin d'expérience.
Remplacement
Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : en particulier, détermination sur ordinateur des antigènes candidats. Des tests sur culture cellulaire ont également été réalisé, ainsi que destests de toxicité sur culture cellulaire également. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant induire une réponse immunitaire.
Réduction
Il s'agit ici d'examiner si les voies d'administration étudiées zet les antigènes identifiés peuvent, ou non, engendrer une réponse immunitaire importante. Des groupes de 4 animaux ont été prévus, la variation interindividuelle dans le domaine de la vaccination pouvant être importante. Lexpérience montre que plus d'animaux seraient inutiles. Des groupes plus réduits pourraient amener à devoir refaire l'expérience : en effet, il arrive fréquemment qu'un ou deux animaux ne produisent pas de réponse immunitaire.
Raffinement
Le protocole expérimental n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie générale pour éviter un stress trop important à l'animal. Par ailleurs, les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter d'éventuelles souffrance. Le cas échéant, un analgésique sera administré. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le but étant de mettre au point des systèmes vaccinaux pour l'humain, une étude sur mammifère est nécessaire. La souris est un mammifère adapté pour étudier en première intention une réponse immunitaire. Si les résultats sont positifs, des études ultérieures pourront être nécessaires sur d'autres mammifères. Les animaux utilisés devront avoir un système immunitaire fonctionnel : Ce seront des souris de 6 semaines, âge auquel nous avons toujours obtenu de bons résultats (en terme de qualité scientifique).
Rôle des microtubules dans les cellules souches musculaires pour le maintien et la régénération du muscle squelettique chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 300 d'entre elles et modéré pour 420. Chacune reçoit une injection quotidienne pendant quatre jours, et les 420 souris du second groupe subissent deux injections dans la même patte, destinées à léser le muscle pour en déclencher la régénération. Le porteur qualifie la suite de "gêne légère et transitoire", la patte blessée restant rétractée au réveil. Étudier les protéines qui donnent leur forme aux cellules souches musculaires exige selon lui l'animal entier, faute de pouvoir reproduire l'environnement du muscle in vitro, ce qui rend à ses yeux la mise à mort "indispensable" à chaque point de prélèvement.
Objectifs
Le muscle squelettique a une capacité remarquable de régénération grâce à la présence de cellules souches musculaires (CSM) en son sein. Les CSM du muscle sain sont dans un état de dormance. En revanche, suite à une lésion, les CSM s’activent, c’est-à-dire qu’elles se réveillent pour se multiplier, se différencier et fusionner pour réparer le muscle. C’est la régénération musculaire. En parallèle, quelques CSM s’auto-renouvellent et retournent en dormance pour maintenir leur stock tout au long de la vie. Lorsque les propriétés de dormance, multiplication, auto-renouvellement ou différenciation des CSM sont compromises, la régénération et la fonction musculaire sont altérées, ce qui conduit à des pathologies du muscle (myopathies). Toutes ces propriétés sont largement régulées par des facteurs extracellulaires, c’est-à-dire les autres types cellulaires du muscle (fibres musculaires, vaisseaux sanguins, nerfs et tissus conjonctifs). Elles dépendent également de la capacité de la CSM elle-même à adapter sa forme aux contraintes de l’environnement. Nos travaux visent à déterminer les rôles de protéines spécifiques de la cellule qui contrôlent la forme des CSM dans ces processus physiologiques. Nous proposons d’utiliser 3 lignées de souris qui permettent d’induire la perte d’expression, spécifiquement dans les CSM, de gènes codant ces protéines impliquées dans la stabilité cellulaire. La perte d’expression de ces gènes sera induite dans le muscle sain pour définir leurs rôles dans la dormance des CSM, et au cours de la réparation musculaire. A terme, nos travaux permettront d’identifier de nouveaux mécanismes qui contrôlent les activités des CSM et donc, la réparation du muscle squelettique.
Bénéfices attendus
Le muscle squelettique adulte est l’un des tissus les plus remarquables : il peut se régénérer en cas de lésion. À l’origine de cette capacité se trouve un réservoir de cellules souches musculaires (CSM). Les CSM ont une activité qui dépend largement de leurs interactions avec les autres types cellulaires présents dans le tissu et nécessaires à leur bon fonctionnement. Cependant, la possibilité que la CSM puisse auto-réguler ses activités, indépendamment de ses voisins cellulaires, commence juste à être exploré, révélant l’importance de protéines de l’architecture des cellules. Ces protéines d’architecture régulent la mobilité ou la forme des cellules. Dans ce projet, nous allons investiguer le(s) rôle(s) des protéines d’architecture indispensables au bon fonctionnement des CSM dans le muscle sain et en régénération. En utilisant 3 modèles de souris dont les gènes invalidés dans les cellules souches musculaires définissent l’architecture cellulaire, c’est-à-dire la forme des cellules, notre projet permettra d’établir leurs rôles i) pour le maintien en dormance des CSM et ii) pour la régénération du muscle squelettique adulte. D’un point de vue scientifique, ceci permettra d’accroitre les données fondamentales sur les mécanismes qui régulent la fonction des CSM. En santé humaine, nos résultats pourraient révéler de nouvelles voies thérapeutiques dans des contextes de maladies où ces mécanismes sont altérés. Par exemple, identifier des molécules qui maintiennent les cellules souches en dormance permettrait de préserver leur efficacité tout au long de la vie.
Procédures
Tous les animaux (720) recevront une injection quotidienne pendant 4 jours consécutifs d’une durée inférieure à 2 minutes pour chaque injection. Une partie des animaux (420) recevra une injection d’analgésique (durée = 1 minute) et deux injections dans la même patte (durée = 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections nécessitent la contention des souris qui peut induire un stress léger chez l’animal. Les injections qui induisent une lésion des groupes musculaires injectés peuvent engendrer une gêne légère et transitoire lors de la reprise de locomotion au réveil (patte blessée légèrement rétractée).
Devenir
Les analyses moléculaires et histologiques nécessitent le prélèvement complet des tissus musculaires (ceci est incompatible avec un suivi longitudinal du même individu tout au long de sa vie). Il est donc indispensable de mettre à mort les animaux à chaque point identifié au cours des procédures.
Remplacement
Ce projet porte sur l’analyse des cellules souches musculaires dont le comportement dépend largement de l’environnement tissulaire et des voisins cellulaires des cellules souches. Sans cet environnement, les cellules souches perdent leurs fonctions. De plus, le tissu musculaire est un tissu complexe dans lequel résident de nombreux types cellulaires comme les vaisseaux sanguins, les cellules du tissu conjonctifs ou les nerfs. Tous communiquent avec la cellule souche musculaire pour contrôler ses fonctions. A ce jour, il n’est pas possible de reproduire l’environnement tissulaire des cellules souches musculaires in vitro. Il n’est donc pas possible de se passer du modèle animal.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses, histologiques, cellulaires et moléculaires. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car les cellules souches musculaires ont un comportement similaire entre les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les personnes impliquées dans ce projet prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les injections seront réalisées par un seul expérimentateur pour que les animaux soient habitués à l’expérimentateur, afin de minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. L’injection permettant d’induire le processus de réparation musculaire est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux sont placés sur des tapis chauffants jusqu’au réveil complet de l’animal. Comme la locomotion des animaux peut être limitée dans les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutés au sein des cages pour leur permettre une alimentation et une hydratation constante. Des points limites adaptés à nos procédures ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Les animaux seront hébergés en groupe (2 à 5 animaux par cage) pour éviter l’isolement social. Ils auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture et en conditions de température et hygrométrie contrôlées. Les cages seront enrichies avec des abris en carton et des lanières de papier Kraft.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les modèles de souris présentés dans notre projet vont permettre de déterminer quels sont les rôles du squelette cellulaire pour réguler les fonctions de la cellule souche musculaire dans le muscle non blessé ou en régénération. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale du devenir et de la progression des cellules souches musculaires dans le muscle sain de souris jeune adulte, adulte et âgée ou dans le muscle lésé.