Souris

Toutes mises à mort pour prélèvement de tissus, 16 000 souris vont être utilisées dans l'étude des noyaux cérébelleux, 12 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 4 000 un niveau modéré. Les nouveau-nés subissent une biopsie de queue sans anesthésie avant leur huitième jour de vie. Les autres reçoivent une ou deux chirurgies crâniennes, jusqu'à quatre-vingt-dix minutes avec implantation d'une plaque de tête et d'une fibre optique, puis des sessions comportementales pouvant durer trois heures et se répéter pendant un à cinq mois, avec des restrictions d'eau ou de nourriture allant jusqu'à trois semaines consécutives, renouvelables cinq fois. Le porteur attribue à ces sessions un stress léger à modéré, sans jamais préciser en quoi consistent les tests, et n'avance aucun calcul pour justifier les 16 000 animaux.

Objectifs

Le cervelet joue un rôle essentiel dans notre capacité à bouger de manière coordonnée et à apprendre des mouvements nouveaux, mais beaucoup reste à découvrir. En particulier, nous cherchons à mieux comprendre une partie centrale du cervelet, les Noyaux Cérébelleux (CN), qui sont cruciaux pour ajuster nos mouvements et planifier nos actions. Notre objectif est de percer le mystère de ces noyaux en étudiant comment ils traitent et intègrent les informations venant de différentes parties du cerveau. Notre recherche se penche sur la manière dont ces informations sont traitées par les noyaux cérébelleux, en observant comment ces zones fonctionnent lors de diverses activités. Nous pensons que les CN jouent un rôle majeur dans la coordination précise de nos mouvements. Notre approche combine ces techniques de pointe avec des méthodes d'imagerie innovantes pour observer en détail l'activité des noyaux cérébelleux pendant que les animaux effectuent divers mouvements. Cette recherche nous permettra de mieux comprendre le rôle vital des noyaux cérébelleux dans la coordination de nos actions.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'enrichir notre connaissance des mécanismes qui régissent les mouvements et le fonctionnement cérébral, mettant l'accent sur le cervelet, une composante essentielle de notre cerveau que nous partageons avec de nombreux êtres vivants. Il explore également l'interaction de cette structure avec certaines zones du cortex. À court terme, cette recherche élargira notre compréhension des rôles du cervelet dans la coordination des mouvements et l'apprentissage de nouvelles habiletés motrices. Les découvertes issues de ce travail pourraient avoir des retombées significatives à long terme, tant pour les humains que pour les animaux. Les maladies touchant le cervelet, comme les troubles du mouvement et certaines conditions plus complexes telles que l'autisme ou la schizophrénie, pourraient être mieux comprises et, à terme, mieux traitées grâce aux connaissances acquises. Cette recherche pourrait ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies. Au-delà de son impact en médecine, ce projet a également un potentiel considérable dans le domaine de la technologie. Le cervelet est souvent étudié comme un modèle pour l'intelligence artificielle et la robotique, ce qui signifie que nos découvertes pourraient inspirer de nouvelles avancées dans ces domaines, menant à la création de technologies plus intuitives et plus adaptatives. Enfin, les succès de cette recherche pourraient permettre d'explorer plus profondément d'autres structures clés du cerveau, comme l'hippocampe et l'amygdale, offrant des outils et des méthodes précieux pour la communauté scientifique internationale et contribuant à une meilleure compréhension du cerveau dans son ensemble.

Procédures

La biopsie de queue sera réalisée sur nouveaux nés vigiles une seule fois. Les animaux subiront une ou occasionnellement deux chirurgies d'une durée d'environ 30 minutes chacune sur animal anesthésié. Si deux chirurgies, une période de récupération de 10 jours a lieu entre les deux. Les souris vigiles seront soumises à des tests comportementaux d'une durée maximale de 3 heures par session. La fréquence maximale des sessions dépend de leur durée, avec des temps de repos plus long après des sessions plus longues. Les sessions 2h sont suivies de 48h de repos. Les sessions peuvent être répétées pendant 1 à 5 mois, mais avec un repos d’une semaine toutes les 3 semaines. Les souris pourront être soumises à une restriction alimentaire ou hydrique avant chaque session comportementale avec une durée maximale de 3 semaines pour une session, répétable jusqu’à 5 fois, après récupération totale de l’animal, Les animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement.

Impact sur les animaux

Les chirurgies (60 minutes selon le nombre d'injections, jusqu'à 90 minutes avec implantation de headplate/fibre optique) entraînent des douleurs transitoires (24-72h), des inflammations (3-7 jours) et une perte de poids temporaire (récupération en 7-10 jours). La biopsie de queue (réalisée une seule fois avant P8, durée

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissus et analyse

Remplacement

La coordination des mouvements est régie par des processus extrêmement sophistiqués. Ils impliquent une multitude de connexions qui interagissent en temps réel et répondent constamment à de nouvelles informations venues de notre environnement. Actuellement, aucun modèle en laboratoire ou ordinateur ne peut reproduire cette complexité avec la fidélité nécessaire pour nos recherches. Ceci nous amène à utiliser un modèle in vivo. Le cervelet, la région du cerveau que nous examinons, est remarquablement similaire chez tous les mammifères, y compris les humains. Cela signifie que les découvertes faites chez les souris peuvent souvent nous éclairer sur le fonctionnement du cerveau humain. Des modèles évolutivement plus éloignés ne sont en revanche pas utilisables pour cette étude (invertébrés, amphibiens…) Nous utilisons des techniques qui nous permettent d'étudier le cerveau de manière très précise et réversible, réduisant ainsi au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Ces techniques ne sont possibles qu'avec des organismes vivants pour lesquels nous avons déjà développé des lignées génétiques spécifiques. Si possible, nous aurons recours à des modèles informatiques si certains aspects peuvent être adressés de cette façon, mais l’accès aux données expérimentales reste nécessaire pour tout validation de modèle.

Réduction

Notre initiative adopte des technologies innovantes qui permettent d'ajuster de manière précise et réversible l'activité des cellules nerveuses, contrairement à des méthodes plus classiques nécessitant des lésions et donc des changements irréversibles. Ces techniques avancées offrent la possibilité de réaliser des études répétées sur un seul et même animal, permettant ainsi des analyses plus fines et plus fiables. Cela réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires, en harmonie avec notre engagement envers des pratiques responsables et éthiques. Nous employons des outils analytiques pour déterminer le nombre exact d'animaux nécessaires pour nos études, garantissant que chaque animal contribue de manière significative à nos découvertes. Nous analysons les données au fur et à mesure des ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire. Nous mettrons en places des stratégies d’élevage pour réduire autant que possible les animaux surnuméraires. De plus, nous valorisons fortement la collaboration et le partage de données au sein de la communauté scientifique. En mutualisant nos ressources et nos découvertes avec d'autres groupes de recherche, nous maximisons l'impact de chaque animal impliqué dans nos études, évitant ainsi des expériences redondantes.

Raffinement

Les animaux résident dans un environnement spécialement adapté à leur confort, où les interactions sociales sont encouragées pour leur bien-être psychologique. De plus, un environnement enrichi leur est fourni, comprenant des matériaux pour nidifier et des éléments pour stimuler leur activité naturelle. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées. Les protocoles post-opératoires sont conçus pour assurer une récupération rapide et confortable, avec des évaluations régulières pour adapter les soins en fonction des besoins individuels de chaque animal. Ces interventions restent relativement modérées, et un délai adapté permettant une récupération totale est prévu après chaque procédure. Des points limites ont été établis de façon à soustraire l’animal à la souffrance. Dans les situations où les protocoles nécessitent des adaptations particulières, comme les lors des sessions d'enregistrement, une attention particulière est portée à l'habituation progressive des animaux. Cela permet de réduire leur stress et d’optimiser leurs performances. Les sessions sont minutieusement surveillées pour détecter tout signe d'inconfort, avec des pauses ou des arrêts si nécessaire.

Choix des espèces

Pour ce projet explorant les fonctions motrices et d'apprentissage du cervelet, le modèle murin est optimal pour plusieurs raisons. Tout d'abord, le cervelet est une structure très conservée chez les mammifères, ce qui permet une transposition pertinente des découvertes vers l'humain. Ensuite, la souris est un modèle de choix pour les études génétiques, avec de nombreuses lignées transgéniques disponibles, essentielles pour nos approches optogénétiques. Concernant les stades de développement, nous travaillons principalement avec des souris adultes jeunes (entre 1 et 2 mois) car les circuits cérébelleux sont alors matures et stables, permettant une étude fiable des fonctions motrices. En effet, avant 3 semaines, ces circuits sont encore en développement. Cependant, pour certaines questions spécifiques nous serons amenés à utiliser des jeunes âgés de 3-16 jours afin de cibler des zones difficilement accessibles chez l'adulte. Cette approche permet d'étudier des circuits spécifiques tout en travaillant sur un cervelet mature.

Inoculées avec le VIH ou les virus des hépatites B, C et D, 3 600 souris subissent des injections de plasmides, des prélèvements sanguins répétés et des prélèvements vaginaux quotidiens pendant au moins cinq jours, parfois plusieurs semaines. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 200 d'entre elles et modéré pour les 3 400 autres. Les animaux sont des souris immunodéficientes greffées de cellules humaines, dont certaines portent un foie humanisé, que le porteur met à disposition des laboratoires pharmaceutiques et biotechnologiques pour tester leurs candidats médicaments. Sur l'effectif, il indique qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et que l'estimation repose sur les études des années antérieures, en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) est une cause majeure de mortalité dans le monde, et aucun traitement curatif n’est actuellement disponible pour les patients. Par ce projet, nous souhaitons mettre à disposition des laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques un modèle d’étude spécifique de l’espèce humaine permettant d’étudier l’impact du virus et des traitements sur le système immunitaire humain, et ainsi d’améliorer la connaissance de ce pathogène, d’évaluer l’efficacité prophylactique (vaccinale ou non) et thérapeutique de candidats médicaments et d’analyser les phénomènes de résistance aux traitements. Bien qu’un vaccin et des traitements anti-viraux existent contre le virus de l’hépatite B (VHB) et de l’hépatite C (VHC), plus de 250 millions de personnes dans le monde vivent avec une infection chronique, ce qui les exposent à un risque grave de cirrhose voire de cancer. La recherche de nouveaux traitements pour ces maladies est donc essentielle. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d'étude de l'hépatite B et de l’hépatite C ainsi que de la co-infection avec les virus de l’hépatite B et D, en inoculant le virus à des souris, en particulier des souches possédant un foie humanisé. Ce modèle sera utilisé, non seulement pour la compréhension de cette pathologie, mais aussi pour le développement de candidats médicaments. Dans ces projets, nous utiliserons des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Ces modèles permettront non seulement d’évaluer l’effet du candidat thérapeutique mais également d’analyser sa toxicité.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T humains constitue un atout pour suivre les mécanismes d’infection, de persistance virale et de destruction progressive des cellules immunitaires. Cela permet d’analyser les étapes précoces de l’infection, l’établissement du réservoir viral et la dynamique de la réponse immunitaire humaine. L’utilisation de souris au foie humanisé ouvre des perspectives comparables pour l’étude des infections chroniques par les virus de l’hépatite B et C. Ces modèles reproduisent fidèlement les principales caractéristiques physiopathologiques d’une infection hépatique humaine grâce à la présence d’hépatocytes humains infectés, constituant une plateforme adaptée à l’évaluation des réponses antivirales et des mécanismes de pathogénicité. Ils fournissent un outil indispensable pour mieux comprendre les mécanismes de persistance virale, l’inflammation chronique et la progression vers des complications graves telles que la cirrhose ou le carcinome hépatocellulaire. Ce projet met à disposition une gamme de modèles précliniques de haute valeur translationnelle offrant la possibilité d’étudier l’impact des virus sur les populations immunitaires humaines et de tester dans des conditions proches de la clinique l’efficacité et la tolérance de candidats médicaments. Cela permet de réduire le fossé entre les résultats obtenus en laboratoire et leur transposition à l’homme, en apportant des données prédictives plus robustes pour guider le développement clinique. L’intérêt est d’ouvrir la voie à la validation accélérée de nouvelles stratégies thérapeutiques, qu’il s’agisse d’antiviraux innovants, de combinaisons thérapeutiques visant à éliminer les réservoirs viraux, ou d’approches vaccinales de nouvelle génération. Ils constituent un outil précieux pour identifier et comprendre les mécanismes d’échappement immunitaire, facilitant le développement de traitements capables d’améliorer durablement la prise en charge des patients. Le VIH et les hépatites virales chroniques sont responsables de millions de cas et de décès chaque année, et représentent un fardeau économique et social. En fournissant des modèles précliniques fiables et transposables, il contribue à accélérer l’arrivée de nouvelles solutions thérapeutiques et préventives pour réduire la morbi-mortalité associée à ces infections et améliorer la qualité de vie des patients à l’échelle internationale.

Procédures

L’administration de composés de recherche destinés au traitement des pathologies pourra être réalisée selon différentes voies. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal, sans réveil de l’animal, sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Les administrations effectuées pour induire les modèles infectieux seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.

Impact sur les animaux

-Identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. - Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : hématome, troubles cardio-respiratoires, altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Prise de température rectale : stress transitoire, inconfort ou légère douleur à l’insertion du thermomètre, risque minimal de blessure rectale. - Prélèvements vaginaux : irritation locale, inflammation ou stress temporaire. - Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). - Infection par le VIH ou les virus des hépatites B, C et D : peuvent induire une perte de poids et une détérioration de l’état général. - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). - Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. - Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux en fin de projet, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire, et de mimer son interaction avec les virus, tout en objectivant les effets que pourra avoir un traitement sur un patient humain. Les études précliniques reposant sur des souris humanisées (qu’il s’agisse de modèles à système immunitaire humanisé, de modèles à foie humanisé ou de modèles double humanisés combinant foie et système immunitaire humains) constituent une approche scientifiquement robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes contre les virus tels que le VIH, le VHB, le VHD et le VHC.

Réduction

Un total de 3600 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 72 études précliniques de 5 à 10 souris par groupe avec l’utilisation d’un groupe contrôle positif et contrôle négatif et au moins 3 doses du candidat médicament testé. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant toute procédure potentiellement douloureuse (par exemple : intervention chirurgicale, implantation de certains dispositifs ou cathéters, manipulations invasives des tissus, injection répétées). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis, perte de poids dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

Les souches immunodéficientes, hautement permissives à la greffe de cellules humaines, permettent la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel ou d’un tissu hépatique humain, selon le type de modèle développé. Elles offrent la possibilité de mettre en place des modèles prédictifs adaptés à l’étude des infections virales humaines, qu’elles ciblent le système immunitaire (VIH) ou le foie (VHB, VHC, VHD). Concernant le VIH, la souris humanisée représente une alternative éthique et scientifiquement pertinente à l’utilisation de primates non humains, qui ne peuvent être infectés que par le VIS. Pour le VHB, les modèles de souris à foie humanisé se sont révélés efficaces pour évaluer l’activité thérapeutique de candidats médicaments. Ces approches garantissent une transposition plus fiable des résultats précliniques vers l’homme et soutiennent le développement de traitements innovants. Selon les besoins des études, des animaux immunocompétents pourront être utilisés, historiquement utilisés dans ces modèles infectieux. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines.

78 souris déficientes en dysferline vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses histologiques et moléculaires de leurs organes. Sous anesthésie d'une dizaine de minutes, chacune reçoit deux injections, dont une en rétro-orbitaire, avant application d'ultrasons focalisés destinés à ouvrir les membranes des fibres musculaires par cavitation de microbulles de gaz. Le porteur prévoit d'arrêter avant l'apparition des signes cliniques de la myopathie, qui ne se déclarent qu'après treize mois, et reconnaît que les souris pourront souffrir des injections malgré l'anesthésie. Sur les 78 souris comptées, 30 seulement entrent dans les groupes expérimentaux, les 48 autres relevant de l'élevage de la lignée, et le porteur conclut que l'approche "ne peut éviter un essai sur un modèle in vivo".

Objectifs

Les dysferlinopathies sont un groupe de maladies musculaires rares et héréditaires caractérisées par des mutations dans un gène impliqué dans la réparation des fibres musculaires, ce qui entraîne une altération de cette fonction. Les atteintes cliniques dans les dysferlinopathies incluent généralement une faiblesse musculaire progressive qui affecte principalement les muscles des membres ; en particulier les épaules, les hanches et les cuisses. Les patients présentent aussi avec l’évolution de la maladie une perte de la force et de la fonction musculaire ce qui entraîne des difficultés à effectuer des activités quotidiennes telles que monter les escaliers, se lever d'une chaise, ou porter des objets lourds. Ces atteintes cliniques peuvent varier en gravité d'un individu à l'autre. Les souris ayant une mutation dans ce gène présentent une atteinte musculaire très progressive avec un impact clinique pour l'animal au-delà de 13 mois. Notre objectif est donc de délivrer le gène entier dans le muscle squelettique des souris. Ce gène étant trop grand pour passer les membranes, nous allons utiliser la technique de FUS (ultrasons focalisés) pour permettre à l'ADN de rentrer dans les cellules musculaires murines. En effet, des microbulles de gaz seront injectées dans la circulation sanguine et grâce aux ultrasons focalisés, ces microbulles vont s’agiter et provoquer un effet de cavitation qui va permettre l’ouverture des barrières biologiques. Au cours de tests préliminaires, nous avons démontré l’efficacité des ultrasons focalisés pour le passage de molécules à travers les membranes des fibres musculaires. Ce nouveau projet a pour objectif de tester l'efficacité de délivrance de notre gène à l’aide du FUS dans un modèle de souris déficient ; le but final étant de développer une thérapie génique efficace et sûre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce travail seront principalement pour les patients atteints de ce type de myopathie. En effet si notre hypothèse s’avère valide, la thérapie par remplacement de gène entier va pouvoir éviter la dégénérescence des fibres musculaires et réduire l’inflammation observée chez les patients ainsi que d’améliorer potentiellement d’autres phénotypes métaboliques sans utiliser de vecteur viral.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie d’environ 10 minutes afin de procéder aux deux injections et à l'application des ultrasons focalisés.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés au cours de ce projet vont développer une atteinte musculaire progressive ayant surtout un impact histologique puisqu'aucun animal ne sera gardé au-delà de l'âge auquel la myopathie clinique se déclare. Malgré l'anesthésie gazeuse, les souris pourraient ressentir des douleurs suite à la procédure comprenant deux injections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures afin de récupérer les organes qui seront analysés d'un point de vue histologique et moléculaire.

Remplacement

Les techniques in vitro ne peuvent être utilisées qu’afin de voir un effet à l’échelle cellulaire de l’administration de la dysferline entière. L’efficacité de transduction de la dysferline entière dans le muscle squelettique grâce à la technique des ultrasons focalisés ne peut être explorée que sur des modèles vivants. Les premières étapes de notre projet ont démontré que cette approche était fonctionnelle ; nous devons maintenant étendre cette étude à des injections dans le muscle. Malheureusement, l’approche envisagée ne peut éviter un essai sur un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utilisons une approche statistique qui nous permet de conclure qu'au moins 4 souris par groupe sont nécessaires. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15% ; nous arrivons donc à un total de 5 souris par groupe, soit au total 30 souris (15 pour la première phase et 15 pour la deuxième). En prenant en compte les souris pour l’élevage (procédure 1), ce nombre atteint 78 souris.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 3 à 5 avant d’entrer en procédure. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft, de dômes en carton et/ou de buchettes de bois. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress. Le modèle que nous allons utiliser a été caractérisé d’un point de vue phénotypique et connaissant l’âge d’apparition des signes de souffrance ou de détresse qui est très tardif, nous étudierons les animaux avant l’apparition des phénotypes dommageables. Pendant la procédure qui se fera sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un anesthésique local en collyre avant l'injection retro-orbitale. Les points limites nous permettront de limiter au strict minimum l’apparition de souffrance.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction des muscles squelettiques sont proches des muscles humains. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes du système neuromusculaire, de leurs physiopathologies et de leurs causes génétiques. Afin d'étudier l'évolution naturelle de la pathologie, les animaux seront étudiés de l'âge de 1 mois jusqu'à l'âge de 4 mois (3 mois post-injections).

Une capsule contenant des larves ou des nymphes de tiques infectées, collée sur le dos sous anesthésie : 2 569 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet cherche à savoir comment le fond génétique de l'hôte modifie la sensibilité à un flavivirus neurotrope transmis par les tiques, et la capacité des souris à le retransmettre à des tiques saines. Chaque animal peut aussi recevoir une injection du virus, subir jusqu'à quatre prises de sang en quinze jours et rester isolé cinq jours pour éviter que ses congénères n'arrachent la capsule, le porteur admettant une perte de poids, une apathie et une paralysie possibles. Aucune souris ne sort vivante du protocole, parce qu'elles portent des pathogènes dangereux pour l'humain et parce que leurs tissus sont prélevés après la mort.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle du fond génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection par les virus transmis par les tiques, le virus étudié neurotrope émergent en Europe. Ce virus peut provoquer des atteintes neurologiques sévères chez l’humain, dont les mécanismes physiopathologiques demeurent encore largement méconnus. En particulier, les troubles neurocomportementaux pouvant survenir à la suite de l’infection, ainsi que les modalités de transmission du virus entre l’hôte et le vecteur, restent à élucider. Ce projet, prévu sur une durée de 5 ans, vise à mieux comprendre comment la variabilité génétique de l’hôte influence à la fois la gravité de l’infection et la dynamique de transmission du virus entre tiques et souris. Plus précisément, les objectifs scientifiques de ce projet sont les suivants : 1. Identifier les différences de sensibilité à l’infection systémique par les virus transmis par les tiques entre différentes lignées de souris, notamment en ce qui concerne la charge virale dans certains organes, les symptômes cliniques, la virémie et la survie. 2. Caractériser la variabilité de la réponse des souris à une infection par exposition à des tiques infectées, en reproduisant les conditions naturelles de transmission. 3. Déterminer la capacité des souris infectées à transmettre le virus à des tiques naïves, en fonction de leur fond génétique. 4. Mettre en évidence les variants génétiques de l’hôte associés à une forme grave ou légère de la maladie, ainsi qu’à une meilleure (ou moindre) transmission du virus aux tiques. 5. Identifier les lignées les plus pertinentes pour servir de modèles expérimentaux dans l’étude de la pathogénie et de la transmission des virus transmis par les tiques.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d’identifier des lignées de souris particulièrement sensibles ou résistantes à l’infection par les virus transmis par les tiques, qui constitueront des modèles pertinents pour étudier la physiopathologie de l’infection neuroinvasive induite par ces virus. Ces modèles pourront également être exploités pour le développement de stratégies préventives ou thérapeutiques, notamment dans le contexte du renforcement de la surveillance du virus étudié en Europe. Le projet apportera par ailleurs des informations précieuses sur l’impact du fond génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection et dans la capacité de transmission du virus aux tiques. L’analyse des profils génétiques des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes ou variants associés à la pathogénie ou à la transmission virale. À plus long terme, ces travaux contribueront à améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans les infections virales transmises par les tiques, en particulier ceux responsables de la neuroinvasion et des formes cliniques sévères. Si le virus étudié constitue le virus central de l’étude, les connaissances générées pourront également éclairer les processus pathogéniques d'autres virus neurotropes de la même famille transmis par les tiques, qui partagent des caractéristiques virologiques, écologiques et cliniques. Cela représente un enjeu de santé publique majeur, dans un contexte d’expansion géographique du virus étudié en Europe, favorisée par les changements environnementaux, la dynamique des populations de tiques et l’augmentation des cas humains autochtones. Les résultats obtenus pourront ainsi être transposés à d’autres virus apparentés ou à d'autres systèmes vecteur-hôte, apportant une valeur à la fois fondamentale et appliquée à l’ensemble du champ des maladies infectieuses émergentes. .

Procédures

Une partie des souris sera infectée avec un virus transmis par les tiques, par injection, réalisée une seule fois et d’une durée de quelques secondes. L’autre partie sera infectée par piqûre de tiques placées dans une capsule fixée sur le dos de l’animal. Enfin, des souris préalablement infectées seront équipées d’une capsule permettant l’exposition de tiques non infectées. La pose et la dépose de la capsule se feront sous anesthésie, pour une durée d’environ 20 minutes. Durant la période où la capsule sera placée sur les souris, les animaux seront hébergés individuellement pour une durée maximale de 5 jours. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 4 prélèvements sur 15 jours consécutifs, chaque prélèvement durant environ 30 secondes. Les volumes et la régularité des prélèvements seront adaptés en fonction du volume sanguin déjà prélevé par les tiques. Des pesées seront également réalisées au minimum tous les 3 jours afin de contrôler l’évolution de la courbe de poids, chaque pesée durant environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 3 procédures de sévérité modérée. Dans certains cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Un stress physique d’environ 5 minutes pourra être ressenti lors de la prise de sang et des injections, accompagné d’une douleur de type piqûre, de courte durée (environ 3 secondes) et d’intensité légère. Une anesthésie fixe par injection d'une durée d’environ 20 minutes sera induite, pouvant s’accompagner d’un stress physique transitoire au moment de l'injection. Une capsule destinée à contenir les tiques (larves ou nymphes) sera fixée sur la peau à l’aide d’une colle non toxique. Cette capsule pourra occasionner une gêne les 2 à 3 premiers jours, le temps que l’animal s’y habitue. Afin de prévenir le retrait de la capsule par un congénère, un hébergement individuel temporaire (maximum 5 jours) de l’animal sera nécessaire, ce qui pourra être à l’origine d’un stress social. Lors de la pose des tiques dans la capsule un stress physique ponctuel de quelques minutes pourra être observé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par des pathogènes dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l’organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) voire à l’interface entre deux organismes indépendants (transmission du virus entre la souris et la tique et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. Des approches alternatives, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modèles ex vivo, seront utilisées autant que possible en amont ou en complément des expérimentations in vivo. Ces méthodes permettent une analyse fine et contrôlée des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’infection, notamment l’entrée virale, la réplication, la réponse immunitaire innée ou encore les effets dans des tissus cibles comme le cerveau. Elles offrent également la possibilité de tester un grand nombre de conditions expérimentales en limitant l’usage d’animaux, conformément aux principes des 3R. Cependant, ces approches ne permettent ni de simuler la transmission naturelle du virus par la piqûre de tique, ni d’appréhender les effets systémiques de l’infection sur l’ensemble de l’organisme, en particulier les manifestations neurologiques complexes. Elles ne reproduisent pas non plus la diversité génétique des individus ni les interactions dynamiques entre vecteur, virus et hôte dans leur environnement physiologique complet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet, car elle constitue à la fois un modèle expérimental puissant grâce à la diversité génétique disponible et un réservoir naturel connu pour le virus étudié dans certaines régions. Cela en fait un modèle biologiquement pertinent pour étudier l’infection, sa transmission par les tiques, et les facteurs génétiques impliqués dans la sensibilité.

Réduction

L’étude de la charge virale dans le sang ou les tissus d’une lignée donnée, comme nous l’avons observé dans de précédents travaux sur un autre virus, pourra généralement être menée avec 5 à 7 souris par groupe. La virémie du virus étudié étant légèrement plus faible, un effectif de 7 souris par groupe a été retenu. Celui-ci pourra néanmoins être ré-évalué au cours des procédures selon les premiers résultats et estimations de la variabilité observée. Les procédures impliquant la transmission par des tiques nécessiteront une planification rigoureuse, dans la mesure où l’efficacité de la transmission peut varier en fonction de la souche de souris, du nombre de tiques appliquées et du délai post-infection. Ces facteurs seront mesurés et pris en compte lors des analyses statistiques La conception expérimentale reposera systématiquement sur une analyse statistique préalable, afin d’optimiser le nombre et la répartition des animaux par groupe, tout en évitant les biais, liés à la cage et à la portée principalement. Les données obtenues seront analysées avec des tests statistiques appropriés, de type modèles mixtes afin de prendre en compte la structure des données. Lorsque nécessaire, des experts en biostatistique seront consultés pour affiner les plans expérimentaux ou nous accompagner dans l'analyse des données. Pour les modèles où une absence de différence entre sexes a déjà été établie, et afin de simplifier les manipulations, certaines procédures ne seront réalisées que sur un seul sexe. Les deux sexes seront néanmoins utilisés pour valider les résultats et dans les procédures où une différence pourrait être attendue. Certaines expériences pourront être répétées, mais uniquement si cela est indispensable pour valider des résultats ou confirmer une observation inattendue. Ces cas sont justifiés dans le détail de chaque procédure.

Raffinement

Toutes les procédures seront mises en œuvre avec une attention particulière portée à la limitation de la douleur et de la détresse des animaux. Les manipulations telles que les injections par voie systémique ou les prélèvements sanguins entraînent une douleur passagère et légère, ne justifiant pas l’usage d’anesthésie ou d’analgésie. Dans la plupart des cas, l’infection aura un impact très modéré sur l’état de santé des souris. Dans d’autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie ou des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatique, avec plusieurs points limites prédéfinis : un score clinique basé sur cinq critères, ainsi qu’un suivi de la perte de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages dès l’apparition de signes d’affaiblissement ou de paralysie, afin de garantir un accès facile à la nourriture pour les animaux les plus atteints. Lors des procédures impliquant des tiques, les souris seront anesthésiées pour permettre la pose d’une capsule contenant les tiques sur leur dos. Cette méthode permettra d’assurer une fixation efficace des tiques dans des conditions indolores et sécurisées, tout en empêchant leur dispersion et en limitant le stress des animaux. Les souris porteuses de tiques seront hébergées individuellement pendant la durée de l’exposition. Afin d’atténuer l’impact de cet hébergement individuel passager, un enrichissement environnemental adapté sera systématiquement mis en place. Chaque cage sera équipée de matériaux de nidification, d’objets à ronger et d’objets de manipulation, avec des aménagements renouvelés régulièrement afin de maintenir une stimulation suffisante, sans compromettre la fixation de la capsule. Après le repas sanguin des tiques, si besoin les souris seront réhydratées pour compenser la perte volémique. Les protocoles seront régulièrement réévalués afin d’intégrer les améliorations possibles en matière de bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle validé pour l’étude des virus transmis par les tiques, car elle reproduit fidèlement plusieurs aspects de la physiopathologie humaine, y compris les signes cliniques et les atteintes neurologiques. Espèce réservoir naturelle du virus étudié, elle permet d’explorer les interactions hôte–virus–vecteur et la dynamique de transmission entre tiques et mammifères. Ce modèle sert aussi à l’étude d’autres virus neurotropes de la même famille, responsables d’encéphalites chez les rongeurs. Il offre une approche comparative des mécanismes d’infection, de pathogénicité et de persistance virale. La souris facilite l’infestation expérimentale par tiques infectées, rarement réalisable dans d’autres modèles, et dispose d’outils génétiques avancés pour analyser l’impact du fond génétique sur la sensibilité à l’infection. Enfin, la manipulation du virus exige un confinement strict, techniquement plus simple avec la souris qu’avec des espèces animales plus grandes ou difficiles à gérer. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des souris jeunes adultes (5-7 semaines) ou adultes (8-16 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience concernant leur sensibilité au virus.