Souris

Des tâches de locomotion de dix secondes, répétées pendant une heure au cours d'une unique séance : 412 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde. Elles subissent avant cela une ou deux chirurgies d'une à deux heures pour injection virale et implantation d'un dispositif d'enregistrement, certaines étant isolées vingt-quatre à quarante-huit heures. Le porteur reconnaît que ces chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs, avec une perte de poids et un risque que l'animal endommage sa cicatrice à force de se gratter. Il s'agit d'enregistrer l'activité de neurones inhibiteurs pendant la marche libre, et l'effectif de 412 animaux est présenté comme "défini mathématiquement au plus juste", sans que le calcul soit donné.

Objectifs

Pour marcher, courir ou simplement bouger, notre système nerveux doit constamment ajuster la communication entre les neurones sensoriels (qui perçoivent les mouvements) et les motoneurones (qui les déclenchent). Dans la moelle épinière, des neurones appelés GABApré jouent un rôle clé dans ce réglage fin, en modulant les signaux entre les muscles et les motoneurones. Mais on connaît encore mal comment ces neurones agissent pendant le mouvement, car la plupart des recherches ont été faites ex vivo, dans des conditions peu naturelles. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des neurones GABApré pendant la marche libre chez la souris, en enregistrant leur activité en temps réel. Nous verrons aussi comment le blocage de ces neurones affecte la capacité de l’animal à s’adapter à des mouvements plus complexes. Enfin, une étude anatomique nous aidera à savoir si certains GABApré ont des rôles différents selon leur position dans la moelle, ce qui pourrait révéler une spécialisation fine dans le contrôle moteur.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera plusieurs bénéfices, à court et à long terme. À court terme, il permettra de mieux comprendre comment la moelle épinière ajuste les signaux sensoriels pour produire des mouvements fluides et adaptés. Grâce à des techniques innovantes, nous pourrons observer pour la première fois l’activité de certains neurones en temps réel, chez des animaux en mouvement libre. Ce travail contribuera aussi au développement de nouvelles méthodes de recherche combinant enregistrements neuronaux, manipulations ciblées et mesures précises du comportement. À long terme, ces avancées pourraient avoir des retombées pour la recherche médicale. En comprenant mieux les mécanismes naturels de filtrage sensoriel, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour traiter certaines affections neurologiques, comme la spasticité, les douleurs neuropathiques ou les troubles moteurs liés à des lésions de la moelle épinière.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie, une chirurgie d’environ 1 à deux heures pour injection virale et/ou implantation de dispositif d’enregistrement (2h quand il s’agit des deux objectifs combinés) ou bien 2 chirurgies d'une heure avec un délai de récupération de 2 à 4 semaines. Deux semaines après la ou les chirurgies, ou 1h après dans le cas d’expériences terminales, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h. Une seule session comportementale est prévue. Tous les animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélèvement de tissus.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entraîner une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparaît également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux, ainsi que les contentions et les injections effectuées pendant les tests. Certains animaux devront être isolés pendant 24 à 48h, ce qui est également un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur le rôle de l’inhibition présynaptique dans le contrôle de la locomotion, c’est-à-dire un circuit comprenant une sortie physiologique complexe. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini mathématiquement au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement fiables et robustes. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de finaliser les expériences de mise au point des différents outils avant d’effectuer les expériences de comportement, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les chirurgies sont espacées d’au moins 2 semaines. Un temps d’habituation à la pièce et au dispositif d’enregistrement est prévu, sur 20-30 minutes pendant deux jours consécutifs. Pendant les tests comportementaux, une couverture de 5cm de mousse souple est placée sous le dispositif expérimental, afin d’amortir une éventuelle chute de l’animal. Les animaux sont manipulés grâce à une petite coupelle en plastique, afin d’éviter la préhension répétitive par la queue. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests.

Choix des espèces

Pour étudier comment certains neurones contrôlent les mouvements, nous utilisons la souris. Ce choix est justifié car la souris permet de cibler très précisément des neurones grâce à des outils scientifiques avancés. Cela aide à comprendre comment les signaux qui freinent ou modulent les mouvements fonctionnent. La souris permet aussi d’enregistrer l’activité des neurones tout en observant les animaux bouger librement, ce qui est difficile à faire avec d’autres animaux. De plus, beaucoup d’études existent déjà sur les circuits nerveux de la moelle épinière de la souris, ce qui facilite l’analyse des résultats. Nous travaillons avec des souris d’au moins 21 jours, car à cet âge les circuits de contrôle des mouvements sont complètement développés et stables. Cela garantit que les résultats ne sont pas influencés par la croissance.

Soumises à une laparotomie de quarante-cinq minutes pour une électroporation in utero du placenta, 72 souris gestantes sont utilisées dans ce projet, qui compte 1 008 souris au total, toutes tuées à l'issue dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur descendance passe des tests sensorimoteurs quotidiens, avec un test moteur de trente minutes à quinze puis quarante-cinq jours. L'objet est de réprimer deux facteurs placentaires pour reproduire les effets d'une exposition prénatale à l'alcool sur la migration des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le porteur écrit que l'électroporation in utero n'entraîne "aucune nuisances ou effets indésirables sur l'embryon", alors que le projet consiste à provoquer chez ces embryons des troubles du neurodéveloppement.

Objectifs

Le projet présenté répond à un problème de santé public majeur, à savoir l’exposition prénatale à l’alcool. En effet, l’alcool présente de nombreuses cibles et notamment les vaisseaux sanguins. Il a été mis en évidence que l’exposition prénatale à l'alcool désorganise les vaisseaux sanguins et perturbe l’expression de certains acteurs importants dans la mise en place des vaisseaux, comme le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome. Cette dérégulation des vaisseaux retentie sur la mise en place des cellules neurales qui utilisent les vaisseaux comme support de migration. En effet, les oligodendrocytes et les neurones inhibiteurs, qui migrent de manière vasculo-associée, présentent un défaut de positionnement à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool. Enfin, l’exposition prénatale à l'alcool entraine des troubles du neurodéveloppement à la fois au niveau cognitif et moteur qui pourrait s’expliquer par le défaut de positionnement des cellules neurales. Le placenta est un organe transitoire présent au cours de la grossesse qui assure des fonctions endocrines, immunitaires et métaboliques. Il synthétise le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome indispensables au bon développement du fœtus. En effet, la diminution au niveau du placenta de ces acteurs entraine une désorganisation des vaisseaux dans le cerveau, à l’image de celle observée à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool et apporte une nouvelle preuve d’un axe placenta-cerveau fonctionnel. Cependant aucune étude ne fait le lien entre les acteurs placentaires et l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Ce qui fait l’objet de cette étude. Le premier objectif ayant pour but d’étudier les effets de la diminution au sein du placenta du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur la mise en place des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le second objectif est d’étudier les conséquences sur le comportement sensorimoteur de la jeune descendance et le comportement moteur du jeune adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’une part de comprendre l’impact de l’environnement fœtal (notamment l'exposition prénatale à l'alcool) sur le devenir des individus et d’autre part d’identifier dès la naissance de potentiels cibles permettant de prédire l'apparition de troubles du neurodéveloppement. Nous nous attendons a observé qu’une diminution au niveau placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome ait un impact sur le développement du cerveau et le comportement des souriceaux en réponse à l'exposition prénatale à l'alcool, notamment dans la mise en place et la maturation des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs : soulignant le rôle important de l’axe placenta-cerveau. De plus, ce projet permettra le suivi à long terme des individus dont l’environnement fœtal aura été modifié par l'exposition prénatale à l'alcool.

Procédures

Les femelles gestantes (72 femelles) subiront une chirurgie d’électroporation in utero d’une durée de 45 minutes par femelle. La descendance suivra des tests sensorimoteurs, d’une durée maximale d’une minute par test, par animal et par jour. Le test moteur à P15 et P45 sera réalisé une fois par animal pour une durée de 30 minutes.

Impact sur les animaux

L’électroporation in utero n’entraine aucune nuisances ou effets indésirables sur l’embryon, l’injection dans le placenta peut provoquer une petite gène de quelques secondes lors de l’insertion de l’aiguille. La laparotomie réalisée sur la femelle gestante pourrait entraîner une douleur d'une durée estimée à 24 heures qui sera contrôlée par une analgésie pré- et post-opératoire.

Devenir

A chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. En effet, il est nécessaire d’étudier la mise en place des structures cérébrales des individus dont l’environnement maternel aura été modifié afin de mieux comprendre le rôle du placenta dans le neurodéveloppement et de pouvoir corréler ces observations avec les troubles du neurodéveloppement.

Remplacement

Dans ce projet visant à étudier l’impact de l’environnement fœtal sur le devenir des individus, les expériences in vivo ne peuvent à l’heure actuelle pas être remplacées par des études in vitro. Les études de l’interaction inter-organe placenta-cerveau ne peuvent se faire que sur des individus vivants et l’évaluation du devenir cognitif de ces individus dont l’environnement fœtal aura été modifié ne peut s’effectuer que par des études sur les animaux. Aucune approche de remplacement n’est aujourd’hui disponible dans les études pré-cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au minimum nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique de cette étude. Les procédures comportementales de ce projet sont non invasives et un même animal sera soumis aux différents tests dès que possible. Le nombre d’individu est de 14 (7 dans chaque groupe). Avec une perte estimée à 30%, le nombre de femelles gestantes nécessaire est de 10 par groupe. Des animaux des deux sexes issus de la descendance seront utilisés pour cette étude puisqu’il a été démontré un effet sexe au cours du neurodéveloppement et lors de la mise en place des comportements. Lors des analyses, si aucun effet sexe n’est détecté, alors les animaux seront regroupés afin de réduire au maximum. Selon les expérimentations et les comparaisons à effectuer les tests statistiques appropriés seront choisis.

Raffinement

Pour raffiner, les femelles gestantes dont les souriceaux seront prélevés après la naissance seront hébergées dans des cages individuelles avec enrichissement (nid en carton, lanières de papier kraft, tunnel). Cet hébergement individuel est nécessaire afin d'éviter le cannibalisme des femelles entre les portées à la naissance. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55 %, luminosité à 100 lux avec une durée de cycle jour/nuit 12h/12h). Après l’intervention, les femelles gestantes seront remises dans leur cage avec accès dans la cage à l’eau et à la nourriture. Elles seront par la suite surveillées par les porteurs du projet (suivi de la douleur, suivi des points de suture, prise de poids, évaluation du comportement). Si des points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde. A la naissance des souriceaux, ceux-ci seront manipulés lors des différents tests comportementaux et remis immédiatement, après chaque test, au contact de leur mère. Au jour 21, les souriceaux seront sevrés, séparés selon leur sexe et hébergés par 5 individus au maximum par cage contenant un environnement enrichi (nid, tunnel, lanières de papier kraft).

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit sur une volonté de mieux comprendre la communication placenta-cerveau et d’identifier des marqueurs diagnostics d’atteintes cérébrales liés au changement de l’environnement placentaire capables d’avoir des répercussions sur le devenir des individus. La souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes complexes comme ceux retrouvés au cours du neurodéveloppement. De plus, la maturation corticale des souriceaux est le reflet de la maturation corticale du cortex humain. Ainsi, l’étude chez le souriceau permet de répondre à la problématique de la neuroplacentologie. Ce choix se justifie également par l’abondante littérature et par l’expérience du laboratoire qui contribuent à réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les femelles gestantes seront utilisées au 13ème jour de vie embryonnaire afin de réalisée l’électroporation in utero placentaire. Ce stade développemental a été choisi sur la base des études précédentes et d’un point de vu neurodéveloppemental correspond au début des vagues de migration cellulaire des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera prélevée au 20ème jour de vie embryonnaire et au 2ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome, d’une part, sur le développement cortical du fœtus et sur son placenta apparié et d’autre part sur l’angiogenèse corticale et la migration vasculo-associée des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera étudiée en comportement et sera prélevée au 15ème jour après la naissance ou au 45ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur le comportement à court et moyen terme et sur le neurodéveloppement.

550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections de vaccin ARN sous anesthésie, une injection de cellules tumorales, un à trois prélèvements de sang, un lavage broncho-alvéolaire et un lavage nasal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une immobilité, un isolement, une cachexie et des douleurs. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne miment pas le microenvironnement muqueux pulmonaire, que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'"aucune méthodes alternatives n'existent", sa rubrique réduction tenant pour sa part en deux phrases générales.

Objectifs

Les vaccins ARN actuels sont capables d’induire une bonne immunité générale mais restent peu efficace pour limiter la transmission. Pour limiter la transmission il est nécessaire d’induire une immunité locale au niveau des sites barrières, comme par exemple au niveau des voies respiratoires. L’immunisation par la voie respiratoire permet d’induire des réponses immunitaires locales dans les poumons et les voies aériennes. Jusqu’à présent les vaccins ARN administrés par la voie respiratoire se sont révélés peu efficaces. Les principaux obstacles pour les vaccins ARN sont de traverser la barrière muqueuse et le risque de dégradation. Ce projet a pour objectifs : 1/de tester de nouvelles formulations de vaccins ARN capables de traverser la barrière muqueuse et moins sensibles à la dégradation. 2/ tester de nouveaux schémas et voies de vaccination qui optimiseraient la distribution du vaccin et l’induction de réponses immunes locales 3/ enfin évaluer leur efficacité dans 2 modèles de cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer de nouveaux vaccins ARN administrables par voie mucosale et capables d’induire des réponses locales pour traiter le cancer.

Procédures

3 injections de vaccin sur animaux anesthésiés ( durée injection 2-5 min, durée anesthésie: 5 et 30 min) ; 1 injection de tumeur sur animaux anesthésiés ( injection 2 min,durée anesthésie: 30min) ; 1 injection de tumeur sur animaux vigiles ( 5min); 1 à 3 prélèvements de sang sur animaux anesthésiés ( 5 min) ; 1 prélèvement de lavage broncho-alvéolaire (5min),1 prélèvement de lavage nasal (2min) et 1 perfusion sur animaux anesthésiés (2 min).

Impact sur les animaux

Les différentes injections peuvent induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration, une douleur légère de courte durée ou une irritation au niveau du site d’injection. La contention des souris peut générer un stress durant la durée de la contention. Les souris avec les tumeurs peuvent présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...), un aspect physique altéré (perte de poids, cachexie, ) et des douleurs associées à la présence de la tumeur.

Devenir

mise à mort pour analyses des tissus

Remplacement

L’analyse des cellules impliquées dans les réponses immunitaires, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthodes alternatives n'existent

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été déterminés selon des données déjà publiées. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les différentes injections et les prélèvements de sang sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Les vaccins sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Des points limites spécifiques ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des formulations de vaccins déjà validés dans cette espèce ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Les souris sont rendues anxieuses par un isolement social chronique et par un régime hyperlipidique, que le porteur présente comme un modèle de pathologie psychiatrique. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'une heure et demie pour implanter des fibres optiques dans le cerveau, parfois doublée de la pose d'une pompe sous-cutanée, puis une privation alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les tâches de conditionnement opérant. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant une mise à mort immédiate.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (800).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (800) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Des souriceaux reçoivent sept instillations nasales d'allergènes sous sédation à l'isoflurane, geste dont le porteur admet le risque de fausse route et d'étouffement, certains subissant en plus quatorze injections intrapéritonéales. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La mesure finale des paramètres respiratoires passe par une trachéotomie sous anesthésie, sans que les animaux soient réveillés, avant prélèvement des organes. Le porteur annonce que le modèle d'asthme pédiatrique n'entraîne aucune nuisance particulière et que sa symptomatologie est "sans conséquence sur le bien-être animal", tout en déclarant les 288 souriceaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) dans l’asthme pédiatrique sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du MLB chez les enfants asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules MLB de patients enfants asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules. Nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de prolifération des cellules MLB in vivo. Afin d’étudier le rôle du MLB dans l’asthme pédiatrique, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet de combiner l’exposition de deux aérocontaminants impliqués dans la sévérité de la maladie chez l’Homme. Les objectifs du projet sont donc les suivants : 1) Mettre en place un modèle d’asthme pédiatrique qui permettra d’évaluer le remodelage du MLB in vivo. 2) Interférer avec le développement du MLB en traitant les animaux avec des molécules d’intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes de mise en place du remodelage du MLB. L’équipe de recherche travaille déjà in vitro en utilisant des cellules de patients pédiatriques asthmatiques mais l’asthme est une maladie mettant en jeu différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules MLB et cellules inflammatoires) qui ne peuvent à ce jour pas être étudier in vitro. Le modèle murin apparaît donc comme indispensable à la compréhension des mécanismes cellulaires. Le projet permettra également de tester des molécules d’intérêts thérapeutiques, mis en évidence sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques et de tester leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales (IN) sous sédation à l’isoflurane (7 IN d’une durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (IP) (14 IP). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. En revanche, nous ne nous attendons pas à observer de nuisance particulière liée à la création du modèle d’asthme pédiatrique. La collaboration scientifique menée à Gent a permis de montrer qu’il n’y a pas de mortalité suite à ce protocole ni de modification du comportement ni stress ou perte de poids, il n’y a donc pas d’incidence sur le bien-être animal. Les allergènes utilisés dans le cadre du protocole ne sont pas des molécules toxiques pour l’animal, elles permettent uniquement de développer la maladie asthmatique dont la symptomatologie est sans conséquence sur le bien-être animal.

Devenir

A la fin du protocole d’asthme, chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du MLB. Une fois mis à mort, les organes d’intérêt seront également prélevés ex vivo pour des analyses notamment d’immunofluorescence.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme pédiatrique permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB. Parallèlement à ce protocole in vivo, des études in vitro sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques pourront être réalisées afin de valider les observations réalisées chez les animaux.

Réduction

Chaque protocole nécessite la comparaison de plusieurs paramètres de la fonction respiratoire et ce entre différents groupes de souriceaux exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en conservant la significativité des résultats. Chaque groupe de souris doit être composé de 12 souriceaux minimums afin de mettre en évidence une différence significative entre les groupes sur les différents paramètres analysés notamment la résistance bronchique. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Les expériences seront répétées trois fois afin de s’assurer de leur reproductibilité et de s’assurer d’un éventuel effet bénéfique d’une molécule thérapeutique. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement des animaux. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés si nécessaire en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. Pour éviter cela, on limitera au maximum le nombre d’expérimentateur au cours du protocole et ils veilleront à toucher la sciure de la cage avant manipulation des animaux. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. Pour éviter cela, l’administration des molécules sera réalisée sous sédation à l’isoflurane avec un volume d’injection réduit au maximum. Le choix d’un volume minimal associé à la bonne gestion de la profondeur de l’anesthésie gazeuse permettra de réduire considérablement un éventuel risque de fausse route. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. Pour éviter cela, l’expérimentateur placera la boite d’induction d’isoflurane sous un tapis chauffant pour maintenir les animaux à la bonne température. De plus, le procédé est très cours, moins de 2 minutes avec l’induction de l’anesthésie gazeuse comprise. Les souriceaux seront surveillés par des expérimentateurs qui ont l’habitude des protocoles murins d’asthme jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. L’asthme est une maladie touchant différents composants, qui interagissent de façon étroite, tels que le muscle lisse bronchique, l’épithélium bronchique et les cellules inflammatoires. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister ces différents types cellulaires. Par ailleurs, nos travaux chez l’homme montrent une augmentation de la prolifération des cellules musculaires lisses bronchique chez les patients enfants asthmatiques. Grâce à un modèle de souris pédiatrique asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. De plus, le stade de maturation pulmonaire des souriceaux correspond à la catégorie asthme de l’enfant pré-solaire. Au total, le modèle murin apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme pédiatrique et pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

4 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des métabolites bactériens par gavage jusqu'à une fois par jour pendant six semaines, ou par injection sous-cutanée jusqu'à huit semaines, avec un risque d'irritation locale, de perte de poils et de fausse route. Suivent des tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d'anxiété, dont le test du champ ouvert, et des évaluations de la physiologie intestinale allant jusqu'à six heures, pour reproduire chez la souris des traits associés à l'autisme. Le porteur écarte le rat au motif qu'il est plus grand, a besoin de plus d'espace et "ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d'animaux prévus".

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement, comme les troubles du spectre de l’autisme (TSA), concernent environ 1 % de la population mondiale. Ces troubles se manifestent par des difficultés d’interaction sociale, des comportements répétitifs, mais aussi par des troubles associés comme l’anxiété ou l’hyperactivité. Les patients atteint de la maladie présentent également des problèmes digestifs (constipation, diarrhée, douleurs abdominales), souvent associés à un déséquilibre de leur flore intestinale. Les causes exactes des TSA restent mal comprises, mais de plus en plus de travaux suggèrent un lien entre le cerveau, l’intestin et les milliards de microbes qui le peuplent : le microbiote intestinal. Le microbiote intestinal aide à réguler nos défenses immunitaires, notre digestion, et même à communiquer avec le cerveau, notamment grâce à certaines petites molécules produites par les bactéries intestinales- appelées métabolites. Chez les patients autistes, plusieurs études ont observé des anomalies dans certains métabolites présents dans leur corps. Par exemple, des métabolites issus de la dégradation par le microbiote intestinal d’un acide aminé appelé phénylalanine, sont retrouvés en quantité plus élevée dans les urines et le sang des patients. Le but de ce projet est d’identifier des métabolites capables de déclencher chez la souris des altérations du comportement (sociabilité, comportements répétitifs, anxiété) et/ou des troubles gastro-intestinaux (transit, perméabilité, inflammation), et d’explorer leur mode d’action, notamment par des approches pharmacologiques ciblant le système nerveux. Nous testerons également l’effet de traitements ciblant le microbiote, susceptibles de contrebalancer ces effets. Nous utiliserons un modèle murin, permettant la manipulation de nombreux outils génétiques, une bonne reproductibilité et une forte sensibilité aux variations du microbiote. Néanmoins, ce modèle ne reflète pas toute la complexité des TSA humains (cognition, langage) et les différences interespèces limitent l’extrapolation. Ce projet générera donc des données utiles pour guider de futures recherches cliniques.

Bénéfices attendus

Cette étude est conçue pour générer des connaissances fondamentales qui pourront être utiles pour la recherche chez l’humain. Elle permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans les TSA, en particulier le rôle du microbiote intestinal. Ce projet contribuera à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant le microbiote, et à tester leur efficacité dans des modèles animaux avant de les envisager pour une application chez l’humain, en vue d’améliorer la santé et la qualité de vie des personnes autistes. Ces résultats seront accessibles à court terme, à l’issue des différentes étapes expérimentales, c’est-à-dire dans les 2 à 3 ans suivant le début du projet. En revanche, leur application en santé humaine nécessitera des étapes supplémentaires, notamment des validations dans d’autres modèles expérimentaux, puis des essais cliniques. Ainsi, même si ce projet contribue à poser les bases de futures approches thérapeutiques, une application concrète chez l’humain ne pourra être envisagée qu’à moyen ou long terme.

Procédures

Identification par injection de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement sanguin après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 6 semaines en fonction de la procédure. • Injections : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 4 à 8 semaines en fonction de la procédure. • Anesthésie gazeuse : durée 10 min ; fréquence 1 fois sur la procédure.

Impact sur les animaux

Certains des métabolites administrés pourraient impacter le métabolisme ou provoquer des troubles digestifs chez les souris, comme de la constipation, de la diarrhée, ou un inconfort intestinal (ballonnements, douleurs abdominales). Ces effets seront surveillés par l’observation du comportement des animaux, leur poids et leur consommation d’eau et de nourriture. Les substances seront parfois administrées par gavage, une méthode qui peut engendrer un stress temporaire et/ou une légère irritation de l’œsophage, mais la réalisation du geste par du personnel formé limite l’inconfort. Il est à noter que lorsque pratiqué quotidiennement, ce geste est susceptible entraîner un stress modéré lié à la contention répétée des animaux pour chaque gavage, bien que celui-ci tende à diminuer avec l’habituation. L’administration quotidienne de substances sous la peau, au niveau de la nuque, peut entraîner de la même manière, un stress modéré lié à la contention répétée des animaux. Une irritation locale, une perte de poil et une modification de la peau sont susceptible d’apparaitre au site d’injection. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée (comme le test du champ ouvert qui évalue les comportements anxieux) et n’induisent pas de douleur ni de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). Enfin, un petit prélèvement de sang sera effectué en coupant l’extrémité de la queue. Cette méthode entraîne un léger saignement, rapidement stoppé par une pression douce (hémostase), et ne laisse pas de séquelle à long terme.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des alternatives non animales pourraient apporter des informations précieuses mais aucune ne permet actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni ses interactions avec le système digestif et le système nerveux et l’impact sur la cognition. Par exemple, l’utilisation de cultures cellulaires intestinales permet d'étudier la perméabilité intestinale et l’inflammation mais s’affranchit de la complexité du microbiote et de ses interactions avec le système immunitaire ou nerveux. Les cultures de cellules neuronales ne permettent pas d'étudier les circuits neuronaux fonctionnels ni les comportements associés. L’utilisation de modèles informatiques (in silico) permettrait de simuler des voies de signalisation, des paramètres d'absorption intestinale, ou la distribution des métabolites dans l’organisme. Néanmoins, ces modèles dépendent fortement de données expérimentales préexistantes et sont incapables de prédire des effets émergents à l’échelle comportementale.

Réduction

Pour garantir l’obtention de résultats fiables et statistiquement exploitables, nous avons défini des tailles d’échantillons optimales à l’aide de calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié. Ces calculs ont permis de déterminer qu’un effectif de 12 animaux par groupe est suffisant pour détecter des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus adaptés à nos données, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous intégrerons à la fois des mâles et des femelles dans notre étude, ce qui permet de couvrir les deux sexes dans une même expérimentation, réduisant ainsi le nombre global d’animaux nécessaires. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide de logiciels statistiques spécialisés. Au total, 4768 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes d’au moins quatre, dans des conditions contrôlées (température, humidité) et surveillés quotidiennement par les expérimentateurs. La plupart des procédures n’induiront qu’un inconfort léger et bref. Celles pouvant affecter le bien-être feront l’objet d’un suivi renforcé basé sur une grille de score permettant d’identifier toute souffrance et d’appliquer des points limites précoces. Pour limiter stress et douleur, les gavages répétés seront effectués avec des canules souples à bout rond de sorte à limiter au maximum une irritation de l'oesophage, et les animaux seront habitués avant au geste de contention et à l'introduction d'un cône dans la cavité bucale. En cas de fausse route,l'animal recevra un analgésique injectable toutes les 8–12 h. Si les signes de détresse (difficultés respiratoires, prostation) apparaissent ou persistent 24h après, l'animal sera euthanasié. Les injections seront réalisées en alternant les sites et avec des aiguilles fines. En cas d’inflammation locale, le site sera surveillé et traité si besoin. Les prélèvements sanguins seront effectués par incision de l’extrémité de la queue, méthode permettant de collecter rapidement du sang sans anesthésie et avec un stress minimal. En cas de saignement prolongé, une compresse stérile sera appliquée, et un stylet hémostatique utilisé si nécessaire. Les animaux seront systématiquement surveillés après le prélèvement. Les tests comportementaux seront précédés d’habituation aux dispositifs expérimentaux ; les sessions seront espacées pour favoriser la récupération et réalisées dans un environnement calme par les mêmes expérimentateurs autant que possible. Les procédures nécessitant une anesthésie seront conduites avec soin : le puçage se fera sous anésthésie gazeuse, assurant une intervention rapide et indolore ; avant les prélèvements d’organes, une analgésie préventive injectable sera administrée 30 min avant l’anesthésie générale injectable. Une surveillance clinique renforcée sera assurée tout au long de l’étude. Les points limites incluent : perte de poids > 20 %, altération de l’état général, troubles locomoteurs, blessures persistantes, refus de s’alimenter ou stress prolongé. Tout animal présentant ces signes sera examiné et, sans amélioration rapide, retiré de l’étude et euthanasié conformément aux recommandations.

Choix des espèces

L’autisme entraîne des troubles du comportement importants, et ces troubles peuvent être reproduits chez le rongeur grâce à des séries de tests comportementaux adaptés aussi bien aux jeunes souris qu’aux adultes. La souris est un modèle particulièrement pertinent car son système nerveux et son développement cérébral partagent de nombreuses similitudes avec ceux des humains, ce qui n’est pas aussi bien le cas chez d’autres espèces comme le poisson. En outre, la physiologie intestinale, notamment la perméabilité et la motilité de l’intestin et du côlon, ne peut être étudiée que chez un animal vivant, et la souris offre un bon compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Notre institut a une animalerie avec des rats et des souris, mais les rats sont plus grands et ont besoin de plus d’espace, ce qui ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d’animaux prévus. Puisque notre projet porte sur les effets des métabolites produits par les microbes sur le développement du cerveau, nous avons choisi d’étudier les souris à des stades où leur système nerveux garde une certaine capacité d’adaptation, notamment à l’adolescence (vers 4 semaines), ainsi que pendant la gestation, afin de mieux comprendre comment l’exposition précoce influence le développement ultérieur. Ces choix permettent d’étudier les mécanismes liés aux troubles du neurodéveloppement dans un modèle fiable, pertinent et bien caractérisé, indispensable pour développer des traitements adaptés.

À dix semaines de vie, le ménisque médial du genou droit est déstabilisé par une chirurgie d'un quart d'heure pour déclencher une arthrose. À douze semaines suivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, cinq jours de suite, sur 2 004 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrose qui s'installe peut faire souffrir les animaux, les conduire à la prostration, à s'isoler de leurs congénères et à cesser le toilettage social, et les injections de tamoxifène peuvent provoquer une péritonite. Toutes sont ensuite tuées pour prélever le sang, la colonne vertébrale, les pattes, la trachée, les poumons et l'aorte.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représentent des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongés et aux interventions) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections quotidiennes du composé d’intérêt de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose post-traumatique, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le cas du modèle chirurgical DMM, une douleur pourrait être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences multiples.

Devenir

L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communications cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientifique, les nombres de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe ont été calculés par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvements multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Deux semaines post-DMM, les souris seront à nouveau observées quotidiennement le temps des injections puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 90 d'entre elles soumises pendant vingt semaines à une alimentation riche en graisses destinée à les rendre obèses. Chacune est identifiée par poinçonnage de l'oreille, mise à jeun six puis douze heures avant deux tests métaboliques, gavée d'une solution sucrée puis d'huile, incisée au bout de la queue pour dix prélèvements de sang, puis reçoit une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie. Les tumeurs sont ensuite palpées chaque jour, puis mesurées sous anesthésie tous les trois jours. Le porteur espère qu'un régime riche en oméga-3 réduira l'inflammation liée à l'obésité et améliorera l'immunothérapie, en renvoyant toute application humaine à des recherches ultérieures.

Objectifs

Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.

Procédures

Une identification par poinçonnage de l’oreille pour les 120 souris. • 90 souris recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • 2 mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées dans un tube (- de 2 min/souris). 16 semaines entre les mesures. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6h avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces tests seront effectués avec une 1 semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi : - Avant l’injection des cellules, une injection d’anesthésiques sera réalisée chez toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur (toutes les souris vigiles, 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum) - Traitement : 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection d’anesthésique pour toutes les souris (quelques sec/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie pour toutes les souris (30 sec/souris). MODIFICATION DU 30-09-2025 : Après l’anesthésie locale et générale et avant l’injection des cellules tumorales, une incision de 3mm autour du mamelon sera réalisée afin de repérer précisément la glande mammaire pour injecter les cellules. L’incision sera refermée par 4 points de suture résorbables. Six heures après toutes les souris recevront une injection complémentaire d’un antidouleur.

Impact sur les animaux

La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 : Avant l'incision cutanée, un anesthésique sera appliqué au niveau de la zone d'incision. Les points de sutures peuvent entraîner une douleur post-opératoire localisée au niveau de l’incision et des sutures, ainsi qu’un tiraillement transitoire lié à la cicatrisation. L'injection supplémentaire d'un antidouleur après l’intervention implique une manipulation supplémentaire pouvant générer stress et douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.

Raffinement

Pour éviter les gavages, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont ajoutés à la nourriture. Seules 2 personnes expérimentées manipuleront les souris tout au long de l’étude. Une surveillance de tous les animaux sera mise en place 2X/semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7jrs/7 après injection. A chaque passage une vérification de l’état général des souris (apparence et comportement) sera réalisée. Un suivi du poids sera réalisé 1X/semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite 2X/semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un antidouleur. Ensuite, une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les 3 jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera 4 semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 L’incision est réduite au strict minimum (≈ 3 mm) et réalisée sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur pendant la procédure. Les sutures sont résorbables, évitant une intervention pour leur retrait. Un antidouleur est administré avant et après l’intervention. Une surveillance rapprochée des animaux est mise en place pour détecter toute complication locale.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.