Souris

Tapis roulant une semaine, test de préhension sur grille la suivante, et cela de la quatrième à la quarante-troisième semaine : 324 souris porteuses d'une forme lente de la maladie de Charcot vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent le lysat de plaquettes par ponction intrathécale, l'équivalent d'une ponction lombaire chez l'humain, et subissent six prélèvements sanguins étalés sur 300 jours. La mise à mort sert à prélever les tissus nerveux et à supprimer les animaux dont la pathologie a atteint son maximum. Le porteur décrit un modèle sans amyotrophie, sans perte de poids et sans signes de douleur, dont l'atteinte motrice ne se révèle que lorsqu'un effort est demandé.

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles striés. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 3 ans suivant l'apparition des symptômes. L’administration de lysats de plaquettes sanguines dans le cerveau de souris modèles de la maladie a déjà démontré ses effets thérapeutiques. Ce présent projet translationnel s’inscrit dans un projet global d’essai clinique ou une voie alternative efficace à l’administration directe dans le cerveau est explorée. La voie intrathécale est une approche peu invasive, simple et rapide qui permet aux médicaments administrés d'atteindre rapidement la moelle épinière. Notre objectif est donc d’évaluer l’effet thérapeutique de l’administration intrathécale de lysat de plaquettes dans des animaux qui présentent des signes de la maladie. Ce modèle est différent de celui qui a permis d’établir la preuve de concept, il permet de mimer l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le modèle que nous utilisons est un modèle léger de la maladie. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Le but est d’offrir une alternative thérapeutique peu invasive, plus accessible cliniquement, qui pourra s’intégrer ultérieurement dans une démarche clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans un programme de recherche hospitalo-universitaire qui doit aboutir à un essai clinique chez les patients atteints de la maladie de Charcot. Les expériences de notre partenaire ont démontré le pouvoir thérapeutique du lysat des plaquettes sanguines dans un modèle sévère de la maladie de Charcot. La preuve de concept s’est faite par une injection dans le cerveau qui est invasive. Notre objectif est d’évaluer une voie d’administration alternative peu invasive, simple et rapide dans un modèle moins sévère de la maladie de Charcot. Nos partenaires évaluent en parallèle cette même méthode alternative dans un modèle sévère de la maladie. Notre projet permettra de consolider cette approche thérapeutique avant de réaliser les premiers essais cliniques. L’utilisation d’un modèle différent de celui utilisé par nos collaborateurs permet de mimer l’hétérogénéité clinique de la maladie et représente donc un autre point fort de cette étude. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et l’application directe vers la clinique. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et un/des dépôts de brevet et la participation à la réalisation d’un essai clinique.

Procédures

Le projet implique de délivrer du lysat plaquettaire par voie intrathécale et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celui d’une piqûre. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture et ne durent pas plus de 5 min. Trois tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices. Le test du tapis roulant évalue l’endurance à l’effort. Ce test n’excède pas 20 min. Lorsque ce test est réalisé aucun autre test n’est réalisé dans la semaine afin de permettre une bonne récupération. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal.

Impact sur les animaux

La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Le modèle murin que nous utilisons a été déjà phénotypé dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le modèle de souris que nous utilisons perd très lentement ses capacités à effectuer des taches motrices et certains individus peuvent tardivement présenter une posture anormale (dandinement) qui est stable, et ne gêne pas l’accès à la nourriture et eau, pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise de poids. Ce modèle présente une atteinte motrice qui est principalement révélée lors d’une demande d’effort. Ce modèle ne présente pas une espérance de vie plus courte et la pathologie n’est pas associée à une amyotrophie et une perte de poids. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par une approche d’administration intra-thécale qui est une piqure de courte durée. Cette administration est standardisée, simple, rapide et sure pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. 2) L’autre nécessité, qui est liée à la pathologie elle-même, est d’euthanasier des animaux à phénotype dommageable une fois la manifestation de la pathologie est maximale.

Remplacement

L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système qui permet de valider l’effet thérapeutique d’une biothérapie qui bloque différents processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la maladie de Charcot. Les résultats précédents ont démontré le pouvoir thérapeutique du lysat des plaquettes sanguines dans un modèle souris de la maladie de Charcot quand celui-ci est administré directement dans le cerveau. Une étude à plus grande échelle prévoit une administration continue chez des patients atteints de la maladie de Charcot à un stade précoce. Notre mission est de proposer une voie d’administration alternative qui est peu invasive et rapide. L’administration intrathécale, qui correspond chez l’humain à réaliser un geste de ponction lombaire, de biomolécules répond à ces critères et offre un moyen de délivrer facilement les molécules thérapeutiques dans le système nerveux. Le modèle vivant demeure donc nécessaire pour évaluer une nouvelle voie d’administration et pour développer tout transfert thérapeutique vers la clinique.

Réduction

Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et de limiter les faux positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Chaque cohorte est composée de 16 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histologiques. Nous utilisons également des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.

Raffinement

Une connaissance extensive du modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc d’anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. La lignée de souris utilisée ne présente une forme légère de la maladie de Charcot qui se caractérise principalement par un défaut à effectuer un effort moteur. Ces souris ne présentent pas d’amyotrophie, pas de perte de poids et n’ont pas une durée de vie limitée. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, un igloo et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration intrathécale est une approche rapide, peu invasive et peu douloureuse, et qui est conforme aux recommandations de la littérature. Afin de réduire le nombre de gestes le jour de l’injection, nous rasons la zone d’injection la veille. Avant l’injection intrathécale, nous injectons un anesthésique. Afin de s’assurer d’une injection efficace de la solution thérapeutique et d’ainsi optimiser le nombre d’animaux par cohorte, nous utilisons lors de l’injection deux marqueurs visuels de la bonne réalisation du geste : un mouvement reflexe de la queue et la présence temporaire de quelques minutes de membres postérieurs flaccides induit par la présence d’un anesthésique. De plus, les animaux sont suivis régulièrement après chaque administration. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée.

Choix des espèces

Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons présente un phénotype léger de la maladie avec une progression lente. Pour l’étude comportementale, les animaux vont alterner d’une semaine à l’autre un test moteur. Les tests débuteront la 4ème semaine (30 j) avec le tapis roulant, la semaine suivante les animaux effectuerons le test de préhension d’une grille. Ce jusqu’à la 43ème semaine (300 jours). Les prélèvements sanguins sont effectués à 6 temps qui comprennent le stade avant l’administration (60 j), au début de l’administration (90j) et durant la progression des déficits moteurs (120, 190, 240 jours) et la fin de l’étude (300 jours). Cette fréquence assure le suivi longitudinal des paramètres sanguins étudiés. Pour l’étude des tissus, certains seront prélevés à des stades correspondant au début de l’administration (90 j), à la phase précoce et au pic de la progression (120 et 240 j) et au stade terminal de l’étude (300 j).

Une perte de poids supérieure à 20 %, ou une douleur qui résiste aux analgésiques, fait sortir la souris de l'étude et la fait tuer. 600 souris vont être utilisées dans ce second établissement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Elles passent douze semaines sous une alimentation à 60 % de lipides, reçoivent une mini-pompe implantée par chirurgie, deux injections dans la trachée et deux dans une veine chaque semaine pendant un mois, une échographie cardiaque hebdomadaire et un test de tolérance au glucose de deux heures. Les animaux font le trajet à pied entre les deux établissements, dans des sacs opaques, et les retombées annoncées pour des personnes de 70 à 80 ans sont renvoyées au long terme.

Objectifs

Avec l’âge, le cœur perd progressivement sa capacité à se remplir correctement, ce qui peut conduire à une forme fréquente d’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement contribue à cette maladie. En particulier, nous nous intéressons à des cellules dites « sénescentes » qui s’accumulent dans le cœur avec l’âge et impactent la fonction cardiaque. Le projet testera également de nouvelles approches pour éliminer ou neutraliser ces cellules nuisibles, dans le but d’améliorer la santé cardiaque. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux prévenir ou traiter cette forme d’insuffisance cardiaque, pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. À long terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des personnes âgées souffrant de maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée riche en graisse (60% kcal) pendant 12 semaines ; une chirurgie pour implanter une mini-pompe sur animal anesthésié (intervention de 10min) ; des injections intra-trachéales 2x par semaine d’une durée de quelques secondes à 1 min chacune (temps d’intubation et injection, sur animal anesthésié) et intra-veineuse 2x par semaine (quelques secondes par injection, sur animal vigile), pendant 4 semaines; des examens du coeur par échographie 1x par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié; des exercices physiques adaptés (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en fin de protocole (intervention de 2h).

Impact sur les animaux

Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire.

Devenir

L’étude implique des analyses tissulaires nécessitant le prélèvement d’organes. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sans mise à mort.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des expériences sur cellules ont été menées et ont permis d’identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre l’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Mais pour comprendre les effets du vieillissement sur un organisme entier, les animaux sont indispensables. Ils permettent d’évaluer le fonctionnement du cœur dans un contexte proche de la réalité humaine.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous nous limiterons aux seules expériences indispensables et chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de paramètres. Le nombre d’animaux minimum a été déterminé par approche statistique sans compromettre les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Toutes les interventions potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie appropriée : - Anesthésie : l’induction et l’entretien seront adaptés en fonction du protocole expérimental. Les souris anesthésiées sont maintenues sur tapis chauffant et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Analgésie préventive et post-opératoire : administration de médicaments analgésiques, avec un suivi attentif des animaux pour ajuster les doses si nécessaire. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, diminution de la prise alimentaire. - Des points limites stricts ont été définis pour mettre fin à l’expérimentation en cas de souffrance excessive. Un animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié si une perte de poids > 20 % est observée ou une douleur persistante ou non contrôlable est détectée malgré l’administration d’analgésiques. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied, pour une durée inférieure à 10 minutes, à l’écart du public, dans des cages de transport sécurisées, placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées car elles développent avec l’âge des signes d’insuffisance cardiaque similaires à ceux des humains, comme un cœur plus rigide ou des troubles de la relaxation cardiaque. Les jeunes souris représentent des adultes jeunes, tandis que les plus âgées correspondent à des personnes de 70 à 80 ans.

Cent cinq jours de régime gras, quarante-huit heures enfermées seules dans une cage de mesure sans le moindre enrichissement, une pression artérielle relevée chaque semaine sur animal conscient : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un inhibiteur métabolique ajouté à leur eau de boisson, associé au régime, leur fait prendre du poids, rigidifie leurs vaisseaux et abîme leur cœur, ce que le projet cherche justement à observer. Le porteur reconnaît que les injections répétées exposent à une péritonite, l'anesthésie à une détresse respiratoire, et l'isolement à un stress social. Les souris sont décrites comme viables, fertiles, immunocompétentes et sans pathologie spontanée, l'atteinte étant entièrement fabriquée, et toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes.

Objectifs

Certaines maladies métaboliques chroniques peuvent fragiliser les vaisseaux sanguins et le cœur. Elles surviennent souvent après une alimentation déséquilibrée, trop riche en graisses, et en raison de troubles de la régulation vasculaire. Ces désordres augmentent le risque de maladies cardiovasculaires, qui se manifestent notamment par une prise de poids excessive, une élévation de la pression artérielle, une baisse de la tolérance à l’effort et, à long terme, par une plus grande vulnérabilité à l’insuffisance cardiaque. Ces complications représentent aujourd’hui un problème majeur de santé publique, car leur fréquence augmente dans la population et elles sont associées à une forte morbidité et mortalité. L’origine exacte de ces atteintes reste encore mal comprise. Les interactions entre alimentation, métabolisme, système vasculaire et cœur sont complexes et ne peuvent pas être étudiées uniquement avec des approches cellulaires. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à ces complications cardiovasculaires. Pour cela, un modèle expérimental chez la souris sera utilisé afin de reproduire les effets d’un régime alimentaire déséquilibré associé à une altération de la régulation vasculaire. L’objectif est de déterminer si certains processus biologiques naturels peuvent limiter ou prévenir la prise de poids excessive, la rigidité des vaisseaux et les altérations cardiaques observées. À terme, ces recherches permettront d’identifier de nouvelles pistes pour protéger le cœur et les vaisseaux dans des contextes métaboliques défavorables. Elles pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des maladies cardiovasculaires en agissant sur leurs causes profondes.

Bénéfices attendus

Les maladies du cœur et des vaisseaux sanguins sont parmi les plus fréquentes dans la population. Elles sont souvent favorisées par une alimentation trop riche en graisses ou par un déséquilibre du métabolisme. Ces situations entraînent progressivement une perte de souplesse des vaisseaux et une baisse de la performance du cœur. Ce projet cherche à comprendre comment ces déséquilibres se développent et à trouver des moyens de les prévenir. Des études réalisées chez la souris permettront d’observer les effets d’une alimentation déséquilibrée sur l’organisme et d’identifier des mécanismes naturels capables de protéger le cœur et les vaisseaux. Les bénéfices attendus sont les suivants : – améliorer les connaissances sur les liens entre alimentation, métabolisme et santé cardiovasculaire ; – identifier des processus biologiques qui aident le cœur à résister aux effets d’une mauvaise alimentation ; – ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de prévention des maladies du cœur ; – à long terme, réduire le nombre de personnes atteintes d’hypertension, d’insuffisance cardiaque ou de rigidité artérielle. Ces recherches devraient ainsi contribuer à améliorer la qualité de vie et à diminuer la charge médicale associée aux maladies cardiovasculaires.

Procédures

Certaines souris recevront, pendant cinq jours consécutifs, une injection quotidienne réalisée sur animal vigile, chaque administration durant seulement quelques secondes. À partir du début du protocole, les animaux seront répartis entre deux types d’alimentation, maintenus pendant toute la durée du protocole distribués ad libitum pendant toute la durée du protocole (105 jours). À intervalles réguliers, des prélèvements sanguins seront recueillis chez chaque animal, chaque manipulation ne durant que quelques secondes. Les animaux disposeront d’un temps de récupération complet d’au moins quatre semaines entre deux prélèvements. La pression artérielle sera mesurée chaque semaine (environ 10 minutes) sur animaux vigiles, après une courte phase d’habitation. Les fonctions cardiaques et vasculaires seront évaluées à trois reprises (jours 35, 70 et 105) grâce à des examens d’imagerie réalisés sous anesthésie légère, d’une durée d’environ 30 minutes chacun. Entre les jours 90 et 92, les animaux seront hébergés individuellement pendant une durée maximale de 48 heures afin de mesurer en continu leur activité, leur dépense énergétique et leur consommation alimentaire et hydrique.

Impact sur les animaux

L’administration prolongée d’un régime alimentaire riche en graisses, associée à l’exposition à un inhibiteur métabolique dans l’eau de boisson, peut induire une prise de poids excessive, une diminution de la tolérance à l’effort et une altération de la mobilité. Ces modifications s’accompagnent d’un risque de déséquilibre alimentaire pouvant entraîner une diminution de l’appétit ou une perte de poids excessive. Elles peuvent également induire des perturbations cardiovasculaires progressives, responsables de fatigue accrue et d’une moindre activité locomotrice. Les injections nécessaires à l’induction génétique sont susceptibles de provoquer une douleur transitoire au point d’administration ainsi qu’un risque rare d’irritation locale ou d’inflammation et, en cas d’injections répétées, un risque rare de péritonite. L’anesthésie brève requise pour les examens échocardiographiques peut entraîner une perturbation de la thermorégulation, une récupération plus lente, et exceptionnellement une détresse respiratoire. Ces épisodes sont transitoires mais génèrent un stress physiologique et une sensation d’inconfort. Le placement temporaire en hébergement individuel, limité à 48 h, s’accompagne d’une réduction des possibilités d’enrichissement et peut induire un stress social ou environnemental. De même, les prélèvements sanguins effectués sur animaux vigiles peuvent provoquer une douleur brève, un risque de petit hématome et un stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre équipe privilégie chaque fois que possible le recours à des méthodes alternatives pour limiter l’utilisation d’animaux. Dans les phases préparatoires, nous utilisons des modèles in vitro (cultures cellulaires) ainsi que des approches in silico (modélisation informatique et analyses prédictives). Ces méthodes permettent de formuler des hypothèses et de tester certaines pistes de recherche sans recourir directement à l’animal. Cependant, l’avancée de ce projet nécessite l’utilisation de modèles animaux. En effet, il s’agit d’évaluer les conséquences de déséquilibres métaboliques prolongés sur le cœur et les vaisseaux. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre plusieurs systèmes de l’organisme (métabolique, vasculaire, cardiaque, nerveux, immunitaire) qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire dans leur globalité. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de simuler de manière fidèle l’impact chronique d’une alimentation déséquilibrée et ses effets sur l’ensemble du corps. Seul un organisme vivant permet d’intégrer et de mesurer ces réponses, dans des conditions proches de la situation pathologique humaine. L’expérimentation animale est donc indispensable à ce stade du projet, car elle seule permet de valider les observations, de comprendre les mécanismes en jeu et d’évaluer le potentiel de nouvelles approches préventives ou thérapeutiques.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 720 souris. Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures sont mises en place. Les suivis sont réalisés de manière longitudinale, ce qui signifie que les mêmes animaux sont observés à différents moments de l’étude. Cette approche permet d’obtenir plusieurs informations successives chez un même individu et donc de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. De plus, chaque animal fournit plusieurs organes et tissus qui sont analysés selon différentes approches. L’exploitation multiple des échantillons maximise ainsi les informations recueillies pour un même animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec nos collaborateurs, ce qui contribue à limiter encore davantage le recours à de nouveaux animaux dans le cadre d’autres projets. Le nombre d’animaux a été défini sur la base d’une analyse statistique préalable, afin de garantir que les effectifs soient suffisants pour obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. L’équilibre entre mâles et femelles sera respecté afin de rendre les conclusions plus transposables. L’ensemble de ces mesures vise à optimiser l’utilisation des animaux, à réduire leur nombre au strict nécessaire et à maintenir la robustesse scientifique des résultats obtenus.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur, à l’exception de périodes très courtes encadrées par une autorisation spécifique, lors des séjours temporaires dans des cages de mesure où aucun matériel d’enrichissement ne peut être ajouté. L’environnement habituel sera enrichi avec du matériel permettant la construction de nids et des abris, favorisant les comportements naturels et limitant le stress. Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter précocement tout signe de mal-être, tel qu’une activité réduite, un pelage terne, un isolement ou une posture inhabituelle. Des critères précis sont définis pour interrompre la participation à l’étude si l’état d’un animal se détériore, notamment en cas de perte de poids importante, de baisse durable de l’appétit ou de signes de faiblesse. Les zones d’injection seront suivies pour repérer toute irritation. L’utilisation d’aiguilles fines et l’alternance des côtés permettront de réduire les effets locaux. Pour les examens nécessitant une anesthésie, une durée courte sera privilégiée afin de limiter l’impact sur l’animal. La respiration et la température corporelle seront surveillées, et les animaux resteront sur une surface chauffée jusqu’à leur réveil complet. En cas de baisse d’appétit, une alimentation adaptée sera proposée. Lors des séjours temporaires dans les cages de mesure, la durée sera limitée à deux jours, avec une attention particulière portée au comportement et à l’état général des animaux. Le personnel participant à ces procédures est formé et suit une formation continue. Les ajustements nécessaires pourront être décidés avec le vétérinaire ou le responsable du bien-être animal pour améliorer les conditions sans compromettre la validité scientifique du projet.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont viables, fertiles, immunocompétentes et ne présentent pas spontanément de pathologie. Le phénotype étudié est induit par l’association d’un régime alimentaire déséquilibré et d’un traitement perturbant la fonction vasculaire. Les animaux développent alors une prise de poids, une rigidité des vaisseaux, des anomalies cardiaques et une diminution de la tolérance métabolique, reproduisant certaines caractéristiques des maladies cardiovasculaires liées à une mauvaise alimentation et à une altération de la fonction endothéliale. Le choix de la souris repose sur sa pertinence scientifique et méthodologique. Ce modèle est bien établi, largement utilisé pour l’élevage, les manipulations et le suivi clinique. L’existence de lignées génétiquement modifiées ciblées permet d’explorer la contribution spécifique de certains tissus à la physiopathologie étudiée. Le modèle murin présente ainsi une transposabilité pertinente pour comprendre les interactions entre métabolisme, cœur et vaisseaux. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines, âge correspondant à la maturité physiologique et métabolique, notamment cardiaque. Ce stade permet d’évaluer de façon fiable l’impact d’un régime alimentaire gras associé à une dysfonction vasculaire, tout en évitant les biais liés à la croissance ou au développement.

Comprendre comment les cellules sénescentes rigidifient le cœur vieillissant, et tester des moyens de les détruire, conduit à utiliser 600 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant douze semaines une alimentation composée à 60 % de lipides, portent une mini-pompe implantée sous anesthésie, subissent quatre injections par semaine pendant un mois dont deux dans la trachée, une échographie cardiaque hebdomadaire, des séances d'exercice et un test de tolérance au glucose de deux heures. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids, ou dont la douleur résiste aux analgésiques, est retirée de l'étude et tuée. Le même protocole se déroule dans un second établissement sur 600 autres souris, l'ensemble étant tué à l'issue pour le prélèvement d'organes.

Objectifs

Avec l’âge, le cœur perd progressivement sa capacité à se remplir correctement, ce qui peut conduire à une forme fréquente d’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement contribue à cette maladie. En particulier, nous nous intéressons à des cellules dites « sénescentes » qui s’accumulent dans le cœur avec l’âge et impactent la fonction cardiaque. Le projet testera également de nouvelles approches pour éliminer ou neutraliser ces cellules nuisibles, dans le but d’améliorer la santé cardiaque. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux prévenir ou traiter cette forme d’insuffisance cardiaque, pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. À long terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des personnes âgées souffrant de maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris suivront plusieurs types d’interventions : alimentation modifiée riche en graisse (60% kcal) pendant 12 semaines ; une chirurgie pour implanter une mini-pompe sur animal anesthésié (intervention de 10min) ; des injections intra-trachéales 2x par semaine d’une durée de quelques secondes à 1 min chacune (temps d’intubation et injection, sur animal anesthésié) et intra-veineuse 2x par semaine (quelques secondes par injection, sur animal vigile), pendant 4 semaines; des examens du coeur par échographie 1x par semaine, environ 10 min, sur animal anesthésié; des exercices physiques adaptés (quelques minutes par séance) ; un test de tolérance à l’insuline et au glucose en fin de protocole (intervention de 2h).

Impact sur les animaux

Certains régimes peuvent entraîner une prise de poids, une fatigue ou une réduction de mobilité. Des traitements peuvent provoquer une tension élevée ou une inflammation. Les signes de douleur ou d’inconfort seront surveillés, et des mesures seront prises pour soulager les animaux ou les retirer de l’étude si nécessaire.

Devenir

L’étude implique des analyses tissulaires nécessitant le prélèvement d’organes. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sans mise à mort.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des expériences sur cellules ont été menées et ont permis d’identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre l’insuffisance cardiaque chez les personnes âgées. Mais pour comprendre les effets du vieillissement sur un organisme entier, les animaux sont indispensables. Ils permettent d’évaluer le fonctionnement du cœur dans un contexte proche de la réalité humaine.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous nous limiterons aux seules expériences indispensables et chaque animal sera utilisé pour mesurer un maximum de paramètres. Le nombre d’animaux minimum a été déterminé par approche statistique sans compromettre les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à réduire au maximum la douleur et la souffrance associées aux procédures expérimentales : - litière absorbante, renouvelée régulièrement, permettant les comportements naturels (fouille, creusage, nidification). De plus, les animaux obèses seront suivis plus régulièrement (remplissage des biberons, changement de litière plus fréquent si nécessaire). - interaction sociale préservée : les souris seront hébergées en groupes de 5 individus pour éviter l’isolement. - accès libre à l’eau et à la nourriture. Toutes les interventions potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie appropriée : - Anesthésie : l’induction et l’entretien seront adaptés en fonction du protocole expérimental. Les souris anesthésiées sont maintenues sur tapis chauffant et du gel oculaire sera appliqué pour prévenir la déshydratation. - Analgésie préventive et post-opératoire : administration de médicaments analgésiques, avec un suivi attentif des animaux pour ajuster les doses si nécessaire. - Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance, de détresse ou d’inconfort : poil ébouriffé, posture anormale, signes de déshydratation, détection de signes de douleur (respiration anormale, mouvements réduits, vocalisations inhabituelles), analyse du comportement : isolement, diminution des interactions sociales, réduction de l’activité locomotrice, diminution de la prise alimentaire. - Des points limites stricts ont été définis pour mettre fin à l’expérimentation en cas de souffrance excessive. Un animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié si une perte de poids > 20 % est observée ou une douleur persistante ou non contrôlable est détectée malgré l’administration d’analgésiques. Ces mesures permettront de limiter au maximum la souffrance animale tout en assurant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus dans cette étude. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied, pour une durée inférieure à 10 minutes, à l’écart du public, dans des cages de transport sécurisées, placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées car elles développent avec l’âge des signes d’insuffisance cardiaque similaires à ceux des humains, comme un cœur plus rigide ou des troubles de la relaxation cardiaque. Les jeunes souris représentent des adultes jeunes, tandis que les plus âgées correspondent à des personnes de 70 à 80 ans.

Jusqu'à deux administrations par jour, sept semaines de suite, par gavage, sous la peau ou dans l'abdomen, et jusqu'à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie : 994 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles développent dès deux semaines une obstruction du flux biliaire et une fibrose du foie, et servent à cribler des candidats-médicaments contre la cholangite sclérosante primitive. Le porteur qualifie de mineurs les symptômes attendus, léthargie et jaunisse transitoire, tout en indiquant que la mise à mort à douze semaines au plus tard leur évitera des symptômes sévères liés à leur modification génétique. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et de sang.

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive (PSC) fait partie des maladie auto-immunes du foie et est caractérisée par une dégénérescence des canaux biliaires internes et externes au foie, entrainant une accumulation de bile. Cette accumulation provoque du stress oxydant, de l’inflammation, de la fibrose (surproduction de fibres de collagène réduisant la fonctionnalité d’un organe) et mène ultimement à la cirrhose du foie et à une insuffisance hépatique (perte de fonctionnalité de l’organe). La PSC ne présente pas de symptômes au stade précoce, mais les personnes atteintes présentent progressivement un état de fatigue, des démangeaisons, de la jaunisse, des douleurs articulaires ou abdominales et des diarrhées. L’estimation de la survie moyenne à partir du diagnostic de la maladie est de 15 à 20 ans ; celui-ci est le plus souvent posé chez des hommes entre 30 et 40 ans, mais 15 à 20 % des diagnostics sont pédiatriques. A ce jour, aucun traitement n’a été approuvé, et il est urgent de développer de nouvelles solutions permettant de traiter et d’améliorer la qualité de vie des patients touchés par cette pathologie. Cela implique la nécessité de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques afin de découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la maladie. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet : composé d’une étape de caractérisation du modèle d’étude de la maladie (souris génétiquement modifiées), puis d'une phase de screening de molécules thérapeutiques, il permettra l’évaluation de plusieurs candidats-médicaments avant une éventuelle évaluation clinique chez l'humain. Ce projet a donc pour objectif l’évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour la PSC, dans le modèle génétique considéré aujourd'hui comme celui reproduisant au mieux les caractéristiques de la maladie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la PSC. Si le screening de molécules dans le modèle révèle des candidats médicaments prometteurs, ce projet débouchera sur l’étude de leur mécanisme d’action dans le contexte de la pathologie et permettra l’évaluation des meilleures molécules avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, cette étude supportera la recherche de nouveaux médicaments potentiels dont les effets seraient supérieurs aux traitements purement symptomatiques actuellement délivrés pour la PSC, et qui ralentiront ou stopperont l'évolution de la maladie.

Procédures

Afin d'évaluer de potentielles molécules thérapeutiques dans le modèle, puis de déterminer la dose, la fréquence et la voie d'administration permettant un effet optimal du composé, les animaux pourront recevoir un traitement administré une à sept fois par semaine, jusqu’à 2 fois par jour (en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration), pendant 7 semaines maximum. Le mode d’administration du composé dépendra de la nature de la molécule, de son mécanisme d’action et de la cible thérapeutique. En effet, notre approche étant exploratoire, nous devons envisager plusieurs voies d’administration afin d’optimiser l’efficacité du traitement. Nous n’attendons pas de nuisance liée à la nature des traitements (doses non toxiques selon les études de toxicologie préliminaires ou la littérature). L’administration des traitements par gavage entrainera un stress dû à la manipulation et une irritation liée à la sonde ; l’administration par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée entrainera un stress dû à la manipulation et une douleur liée à la piqûre. Des prélèvements de sang en cours de procédure pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse à raison d'un prélèvement toutes les deux semaines au maximum (soit 4 prélèvements par animal au maximum sur toute la durée de la procédure), d’un volume conforme aux recommandations éthiques. Le sang sera récupéré et l’animal sera remis dans sa cage pour son réveil.

Impact sur les animaux

Bien que les marqueurs sanguins et l'imagerie du foie révèlent l'apparition d'une altération du flux biliaire et d'une fibrose du foie dès 2 semaines, les animaux ne montrent pas de symptômes avant 8 à 12 semaines. Les symptômes documentés survenant dans cette période et leur impact sur le bien-être animal sont mineurs : petites altérations du comportement (léthargie/activité réduite), jaunisse transitoire. Cependant, l'état des animaux sera suivi 2 fois par semaine en observant la survenue de ces symptômes, en vérifiant la prise de nourriture, et en mesurant le poids des animaux. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques selon les études de toxicologie préliminaires ou la littérature) en dehors de celle induite par la piqûre. De plus, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront alors récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés afin de pratiquer différentes analyses qui nous permettront d'évaluer l'efficacité des candidats-médicaments dans ce modèle de PSC. De plus, l'euthanasie des animaux à 12 semaines maximum empêchera les animaux de subir des symptômes sévères liées à la modification génétique.

Remplacement

Des expériences sur cellules pourront être réalisées en amont selon le mode d'action documenté ou envisagé des molécules testées. Cependant, l’étude de l’efficacité de molécules pouvant agir sur l’inflammation et/ou sur la fibrose est bien plus pertinente dans ce modèle dont l’ensemble des caractères anatomiques, physiologiques et immunitaires reproduit la majorité des aspects de la PSC humaine. Cette souche de souris est le modèle génétique de référence pour l'étude préclinique de la PSC, et modélise tout à la fois une altération du flux biliaire, une infiltration de cellules immunitaires en périphérie des canaux biliaires, une fibrose autour des canaux biliaires dite en "peau d'oignon" caractéristique de la PSC, ainsi qu'un déséquilibre des acides biliaires et de la flore intestinale. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur tous les facteurs précités, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous nous sommes appuyés sur les données de la littérature pour déterminer un nombre d’animaux nécessaire afin de garantir une puissance statistique adéquate pour l’analyse des résultats et d’inclure un nombre suffisant de contrôles internes permettant de conclure de manière robuste sur l’efficacité des traitements. L’analyse des données impliquera la comparaison de 8 groupes de 7 animaux pour chaque étude et bénéficiera d'une analyse statistique appropriée.

Raffinement

Pour minimiser l'impact sur les souris, une étude préliminaire sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études de screening ultérieures. L'implantation des puces d’identification et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane, un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal. L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. Les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré. Les animaux seront également suivis et pesés 2 fois par semaine afin d’anticiper tout signe de souffrance. Si les points limites sont atteints et que des signes de souffrance sont avérés chez l’animal, il sera sorti du protocole et euthanasié. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent exprimer leur comportement naturel. Une manipulation des animaux à l'aide d'un tunnel ou avec les mains en coupe sera privilégiée pour éviter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon leur poids et/ou selon un marqueur sanguin déterminé au cours de l'étude préliminaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux, la satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettant également d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

Ce modèle de souris génétiquement modifiées exprime un ensemble de caractères anatomiques, physiologiques et immunitaires très proche de la cholangite sclérosante primitive. Il s'agit du modèle génétique de référence dans la littérature ou les entreprises de recherche préclinique afin de tester l’efficacité de nouveaux traitements pour cette maladie. Dans le cadre de ce projet, nous nous intéresserons à la phase précoce (semaines 4 à 12 de la vie des animaux) de la maladie pendant laquelle se développent l'altération du flux biliaire, l'inflammation en périphérie des canaux biliaires et la fibrose du foie qui seront les principaux paramètres que nous chercherons à diminuer par l'administration de candidats-médicaments. Lors de cette phase, la pathologie est en cours de développement, ses caractéristiques sont encore modérées mais suffisamment développées pour permettre l'évaluation d'un candidat-médicament. Ne pas poursuivre l'étude sur les animaux au-delà de 12 semaines nous permettra d'obtenir des résultats suffisants pour démontrer l'efficacité de nos molécules tout en réduisant l'impact que la modification génétique pourrait avoir sur le bien-être des animaux.

840 femelles, 756 souris et 84 rates, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées dès la fin de l'opération sans attendre le réveil. Chaque animal reçoit deux injections en étant conscient, puis subit une ovariectomie de quarante-cinq minutes, laparotomie, dissection, ligature des vaisseaux, ablation des ovaires et sutures, avec un risque d'hémorragie si l'hémostase du stagiaire est insuffisante. Un animal par participant, quarante participants par session, quatre sessions par an pendant cinq ans : le compte est celui d'une obligation réglementaire de formation, pas d'une recherche. Le porteur indique que les stagiaires s'entraînent d'abord sur des substituts synthétiques, des pièces de boucherie et des cadavres de rongeurs, avant de conclure que la maîtrise du geste "nécessite" un animal vivant.

Objectifs

Les personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales sur des animaux dans le cadre des projets scientifiques, ont l’obligation réglementaire de suivre un enseignement théorique et pratique à la chirurgie expérimentale. Le projet concerne les travaux pratiques d’une formation aux bases de la chirurgie expérimentale à destination de ces personnes. Elle s’adresse à des personnes ayant validé préalablement une formation initiale à l’expérimentation animale (niveau applicateur ou concepteur). Chaque session de formation totale (formation théorique + formation pratique) dure 22h. Au cours de celle-ci, les participants sont préalablement sensibilisés à tous les aspects théoriques à l’occasion des cours et travaux dirigés. La formation pratique vise en particulier, sur un exemple pratique d’ovariectomie réalisée chez le rongeur, 1/ à leur dispenser les moyens de raffiner les procédures chirurgicales et à réduire le nombre d’animaux nécessaires, 2/ à acquérir les gestes nécessaires au bon déroulement d’une intervention chirurgicale réalisée dans le respect du bien-être animal. Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux). Elle enseigne ainsi dans le respect des 3R les différentes étapes d’une intervention chirurgicale incluant la préparation de l’animal, l’anesthésie, les soins péri- et post-opératoires, la bonne conduite de l’analgésie, la maitrise de la technique opératoire.

Bénéfices attendus

Chaque participant recevra ainsi une formation pratique pour mener à bien une intervention chirurgicale prenant en compte le respect du bien-être animal et la règle des 3R. La qualité de ces formations contribue ainsi à court terme à la maitrise des gestes chirurgicaux permettant d’obtenir à moyen terme des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles tout en réduisant au maximum le stress et la souffrance des animaux et leur nombre.

Procédures

Chaque animal recevra en vigile une injection sous-cutanée (analgésique) 15s, puis une injection intrapéritonéale (anesthésique)15s. Ces gestes induisent un stress/et ou douleur légère de courte durée (15s) chez les animaux. L'anesthésie peut également être réalisée par anesthésie gazeuse. Il subira ensuite une intervention chirurgicale (ovariectomie) réalisée sous anesthésie d'une durée totale de 45 minutes de douleur modérée consistant en une laparotomie, une dissection atraumatique, une ligature vasculaire, une exérèse d’organes et des sutures dans le plan musculaire et cutané. La mise à mort des rates sera réalisée par injection intrapéritonéale réalisée sous sédation (15s)

Impact sur les animaux

Chaque animal recevra en vigile une injection sous-cutanée (15s) puis une injection intrapéritonéale (15s). Ces gestes induisent un stress/et ou douleur légère de courte durée chez les animaux. L'anesthésie peut également être réalisée par anesthésie gazeuse à l'isofluorane ( 3-4% en induction 30 secones à 2 min pour les souris et 1 à 3 minutes pour les rates puis 1,5-2% ). Il subira ensuite une intervention chirurgicale (ovariectomie) réalisée sous anesthésie d'une durée totale de 45 minutes au maximun.. L’animal peut être victime d’une hémorragie en cas d’une hémostase insuffisante. La couverture analgésique proposée permet de réduire au maximum la douleur liée à l’intervention chirurgicale.

Devenir

42 animaux mis à mort par session de formation soit au total 840 animaux sur 5 ans Un seul animal par participant permettra la réalisation d’une chirurgie complète (rat ou souris). L’utilisation d’animaux supplémentaires sera de 2 animaux/session grâce à l’entrainement préalable que les participants recevront en amont, diminuant ainsi le risque d’échecs. Au maximum, 4 sessions de cette formation réglementaire seront réalisées par an dans cet établissement et le nombre de stagiaires par session de formation est limité à 40 participants. Le nombre d’animaux pour la durée du projet sera donc de (1 animal /participant X 40 participants/session X 4 sessions/an X 5 ans) + 2 animaux supplémentaires/session X 4 sessions/an X 5 ans) = 800+40 soit 840 animaux pour la durée du projet.

Remplacement

La formation est réalisée de telle façon que les participants peuvent s’entraîner et répéter, à leur rythme, les gestes chirurgicaux, sans avoir le stress de la surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal vivant en utilisant des substituts synthétiques inertes, des pièces de boucherie ou des cadavres de rongeurs euthanasiés indépendamment des besoins de la formation. Cela favorise la sérénité́ et la confiance dans l’apprentissage de la chirurgie expérimentale. La maitrise des gestes associés à une procédure chirurgicale nécessite cependant dans l’état actuel des connaissances un entrainement pratique sur modèle animal.

Réduction

De notre expérience, 75 à 95% des animaux nécessaires à cette formation sont couverts par des animaux de surplus et donc destinés à être euthanasiés dans l’établissement utilisateur accueillant cette formation. Seuls 5 à 25% maximum des animaux nécessaires à cette formation nécessiteront une provenance d’un fournisseur. Ce qui contribue à la réduction. Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés, et grâce à l’entrainement préalable que les participants recevront en amont, un seul animal par participant permettra la réalisation d’une chirurgie complète (rat ou souris). En effet, le passage à la chirurgie pratique ne sera pas réalisé tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé, diminuant ainsi le risque d’échecs et l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement à part et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment afin de réduire au maximum le stress des animaux. Les gestes réalisés sur animaux vigiles (sous cutanée, intrapéritonéale) sont normalement maitrisés par les participants qui ont validé au préalable une formation initiale à l’expérimentation animale niveau applicateur ou concepteur, limitant ainsi le stress et la douleur liés à la réalisation de ces gestes techniques. Les encadrants ayant sensibilisé les participants aux différentes phases de l’anesthésie, s’assurent que chaque participant réalise l’intervention chirurgicale sous anesthésie générale conformément aux bonnes pratiques de narcose, myorelaxation et analgésie. Un analgésique est administré 30 min avant le début de la procédure chirurgicale en quantité suffisante pour limiter toute douleur per-opératoire, sa durée d’action couvrant la totalité de la procédure chirurgicale. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie sans attendre le réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect des bonnes pratiques, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques chirurgicales. Cette procédure chirurgicale sera réalisée dans un ratio encadrant/ participant (1/4) permettant de détecter précocement tout signe de souffrance des animaux ou une couverture anesthésique insuffisante et de prendre les mesures correctives adéquates (prolongation de l’anesthésie ou mise à mort précoce).

Choix des espèces

Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche, ces travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est fait en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation, et des besoins pédagogiques exprimés par les participants. Pour les travaux pratiques de chirurgie, la procédure chirurgicale enseignée étant une ovariectomie, des femelles sont utilisées.

Dix jours d'hébergement à 4 °C, ou deux mois à 30 °C, jusqu'à sept injections et cinq prélèvements sanguins : 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines ont 24 mois, un âge auquel le porteur prévoit des décès liés à la vieillesse et gonfle ses groupes en conséquence. La méthode mise au point est présentée comme une imagerie "non invasive" du tissu adipeux brun, et le porteur affirme que visualiser ce tissu dans un "organisme entier" rend le recours à l'animal "indispensable". Toutes les souris sont tuées à l'issue pour récupérer leur sang et leurs organes.

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les tissus adipeux blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les tissus adipeux bruns (et beiges) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Il est clairement admis que la quantité et l'activité du tissu adipeux brun déclinent avec l'âge. Il est aussi aujourd'hui bien démontré que les tissus adipeux bruns sont associés de manière positive à la santé cardiométabolique chez l'homme. Il est donc important de pouvoir visualiser de manière non invasive le tissu adipeux brun pour définir des trajectoires de santé à l'échelle des individus. Plusieurs méthodes d'imagerie du tissu adipeux brun existent à l'heure actuelle. Elles sont pour la plupart basée sur la détection de sondes marquées et des techniques d'imagerie adaptées. Cependant, les sondes utilisées sont souvent des métabolites comme par exemple le glucose. L'intensité du marquage peut fluctuer en fonction de l'activité du tissu (et de l'état de santé métabolique de l'individu comme en cas d'insulinoresistance) et peut générer des faux positifs par l'activité métabolique d'autres tissus. Dans ce projet, nous proposons une nouvelle méthode d'imagerie pour détecter de manière non invasive des protéines membranaires exprimées par le tissu adipeux brun, in vivo chez la souris. Ceci reposera sur l'injection d'anticorps bioconjugués et de sondes marquées avec des fluorochromes pour une détection du tissu adipeux brun par imagerie en fluorescence in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre au point une nouvelle méthode de visualisation du tissu adipeux brun in vivo de manière non invasive. Etant donné que ce tissu décline avec l'âge et dans des contextes de désordres métaboliques, mesurer sa quantité chez un individu pourrait permettre de définir des trajectoires de santé. La méthode utilisée dans ce projet pourrait aussi être élargie à d'autres tissus et d'autres pathologies. En effet, la basigine est surexprimée par de nombreux types de cellules cancéreuses et la méthode proposée dans ce projet pourrait tout à fait être utilisée pour évaluer le développement de certains types de tumeur. Enfin, la méthode développée dans ce projet pourrait être adaptée pour détecter d'autres cibles protéiques, élargissant ainsi l'intêret et les bénéfices liés à ce projet.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements : soit 1 prélèvement sanguin (juste avant la mise à mort) soit 5 prélèvements sanguins (soit sur 2 jours (5 min, 3 heures, 6 heures, 24 heures et 48 heures) soit sur 7 jours (1, 2, 3, 4 et 7 jours)). Les animaux subiront des injections : soit 1 injection, soit 2 injections (1 injection et 1 injection au minimum 24 heures après) soit 3 injections (1 injection, 1 injection au minimum 24 heures après, et 1 injection 1 heure après), soit 7 injections (1 injection quotidienne pendant 5 jours consecutifs, 1 injection 7 jours après et 1 injection 1 heure après). Certains animaux seront soumis à des modifications dans leurs conditions d’hébergement (température d’hébergement de 4°C pendant 10 jours ou de 30°C pendant 2 mois).

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections, - les stress liés à l’injection des molécules - et le stress lié aux prélèvements sanguins. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.

Devenir

Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Notre objectif est de visualiser le tissu adipeux brun dans un organisme entier, de manière non invasive. Le recours à l'animal est donc indispensable. Cependant, des tests préalables pour valider l'anticorps et sa reconnaissance par les tétrazines auront été réalisés in vitro.

Réduction

Au regard de la bibliographie concernant des études similaires et de tests statistiques, des groupes de 6 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Dans les expériences effectuées sur des animaux de 24 mois, un nombre initial de 10 animaux sera prévu pour pallier aux décès potentiels liés à l’âge. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Nous proposons une stratégie de suivi longitudinal de marquage sur les mêmes animaux qui permettrait d’éviter l'euthanasie des animaux à différents temps donnés et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tissus et organes prélevés suite à l'euthanasie seront utilisés pour un grand nombre d’expériences différentes. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus qui nous permettrons, à partir du même échantillon, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels ainsi que surveillées une à plusieurs fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Une grille de score comprenant différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra la valeur seuil, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie du tissu adipeux brun a été particulièrement bien étudiée. Par ailleurs, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). En plus de souris sauvages (contrôles), nous utiliserons une souche de souris génétiquement modifiée. Nous utiliserons des souris sauvages âgées de 2 mois (certaines auront 4 mois en fin de protocole). Les souris âgées de 2 mois, sont matures sexuellement, et présentent un tissu adipeux brun bien développé. L'hébergement à 30°C sera réalisé chez des souris âgées de 2 mois pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver le tissu adipeux brun comme montré par les travaux précédents de l'équipe). L'exposition au froid sera réalisée chez des souris âgées de 3 mois et 20 jours, pendant 10 jours. Des travaux précédents de l'équipe ont montré qu'à 24 mois, les animaux présentent des défauts métaboliques importants dans le tissu adipeux brun, c'est la raison pour laquelle nous avons choisi cet âge pour les souris "âgées". Les souris génétiquement modifiées et leurs contrôles seront utilisées à l'âge de 4 mois, ce qui nous permettra de comparer les résultats avec les souris hebergées aux différentes températures.