Souris
Immunisation des souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Identifiées par puce électronique, les souris reçoivent des composés immunogènes ou pathogènes, subissent des prélèvements sanguins répétés, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant plusieurs jours voire plusieurs semaines, des prélèvements d'urine et de fèces obtenus par contention et massage du ventre, enfin un prélèvement terminal sous anesthésie. 1 500 souris, dont des souris humanisées porteuses de lymphocytes humains, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune approche statistique n'a servi à fixer cet effectif, calculé d'après les études des années précédentes et une croissance anticipée conforme au plan commercial de l'établissement. 1 400 souris seront tuées faute de recouvrer leur état de santé, et 100 partiront, sur décision vétérinaire, vers un projet de formation interne aux gestes techniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer et de caractériser différents modèles d’immunisation chez la souris, aussi bien immunocompétente qu’humanisée, afin d’évaluer la production d’anticorps spécifiques ainsi que les réponses immunitaires induites par divers types d’antigènes dans un contexte physiologique et humanisés, ainsi que tester les différents traitements à visée thérapeutique. De plus, en vaccinant des souris exprimant des lymphocytes T et B humains, et en exposant ces populations cellulaires à un agent pathogène ou chimique, nous modélisons, fidèlement, une réaction vaccinale chez l’homme. Ces immunisations pourront inclure : • Antigènes pathogènes inactivés (virus, bactéries, parasites) utilisés à des fins de vaccination expérimentale ou d’étude de la réponse immunitaire innée et adaptative. • Antigènes protéiques recombinants ou purifiés, associés ou non à des adjuvants, permettant de stimuler des réponses humorales et cellulaires. • Agents chimiques ou haptenes pour modéliser des réponses d’hypersensibilité immédiate (type I) ou retardée (type IV). • Particules ou formulations vaccinales innovantes dans le but de tester leur immunogénicité et d’étudier leur mécanisme d’action. Les différentes immunisations pourront être associées ou non à des adjuvants selon le protocole et le model à utiliser.
Bénéfices attendus
Ce projet présente plusieurs bénéfices scientifiques, méthodologiques et translationnels qui justifient son importance dans le domaine de l’immunologie préclinique. 1. Avancées scientifiques et médicales : L’étude des mécanismes d’immunisation chez des souris immunocompétentes et humanisées permettra de mieux comprendre les réponses immunitaires adaptatives et innées face à différents antigènes (pathogènes inactivés, antigènes recombinants, peptides ou agents chimiques). L’analyse des réponses humorales et cellulaires fournira des données essentielles sur la diversité et la spécificité des réponses immunitaires. Ces travaux contribueront à identifier de nouveaux biomarqueurs de réponse vaccinale et à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans l’allergie, l’auto-immunité, l’inflammation et la protection contre les agents infectieux. 2. Développement de modèles précliniques pertinents. L’utilisation de souris immunisées, y compris humanisées, permettra de développer des modèles innovants plus proches de la physiologie humaine. Ces modèles serviront à évaluer des candidats vaccins, adjuvants et immunothérapies avec une meilleure prédictivité des résultats cliniques. Ils permettront également d’explorer les risques d’effets indésirables tels que les réactions d’hypersensibilité immédiate (type I) ou retardée (type IV). 3. Impact translationnel et réduction des échecs cliniques. En intégrant des modèles humanisés, ce projet améliorera la transposabilité des résultats précliniques vers l’homme. Cela contribuera à limiter les échecs lors des essais cliniques et à optimiser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les données générées permettront de rationaliser les choix de molécules candidates et d’accélérer leur progression vers la clinique. 4. Valeur ajoutée en recherche et santé publique. Les connaissances issues de ce projet permettront de renforcer l’expertise dans le développement de modèles précliniques de vaccination et d’immunothérapie. À terme, ces avancées bénéficieront directement à la recherche biomédicale et au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour répondre à des enjeux majeurs de santé publique, tels que les maladies infectieuses émergentes, l’augmentation des pathologies inflammatoires chroniques et la recherche de traitements innovants en immuno-oncologie.
Procédures
Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des administrations de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques seront réalisés avec ou sans anesthésie. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Prise de température rectale : stress transitoire, inconfort ou légère douleur à l’insertion du thermomètre, risque minimal de blessure rectale. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prélèvement vaginaux : douleur et/ou lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Les nuisances attendues en lien avec les réactions immunitaires et le challenge par des agents pathogènes peuvent varier selon la nature du composé administré, de l’antigène ou de l’agent infectieux utilisé. Ces effets sont en général modérés et transitoires : réactions locales au site d’injection (rougeur, induration, gonflement, douleur transitoire, voire petit nodule ou abcès localisé), réactions systémiques liées à l’activation immunitaire : fièvre modérée, léthargie temporaire, diminution transitoire de l’activité ou de la prise alimentaire, piloérection, signes d’inflammation ou de réponse aiguë : perte de poids légère à modérée, altération passagère de l’état général, modification du comportement (moins d’exploration, regroupement), en cas de challenge infectieux (si applicable) : symptômes liés à la pathologie induite (ex. inflammation locale, troubles respiratoires légers, diarrhée, ou altération de l’état général selon la voie d’infection et le modèle), réactions immuno-allergiques rares : réactions exacerbées ou imprévisibles à certains antigènes ou adjuvants, généralement de faible intensité grâce aux doses et voies d’administration adaptées. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro une séroconversion et d’évaluer son impact protecteur sur un organisme vivant. La souris humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 5 à 10 individus par groupe (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire et administrés avant toute procédure potentiellement douloureuse (par exemple : intervention chirurgicale, implantation de certains dispositifs ou cathéters, manipulations invasives des tissus, injection répétées). Un relais per os dans l’eau de boisson à 1 mg/kg/jour pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis ou perte de poids dépassant le seuil défini.
Choix des espèces
La procédure expérimentale d’humanisation a été mise au point et est actuellement maîtrisée chez la souris. Les souches utilisées sont particulièrement réceptives à la greffe du système immunitaire ce qui va permettre à cette espèce d’exprimer des lignées lymphocytaires humaines. Cette particularité permet d’étudier les effets prophylactiques d’une vaccination en condition in vivo, et d’extrapoler, avec davantage de sécurité, les effets qu’auront les traitements chez l’utilisateur final : l’homme. D’autres souches de souris, en particulier non-humanisées, pourront être utilisées dans le cadre d’études préliminaires. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Contrôle du comportement alimentaire par la production de glucose dans un modèle de restriction alimentaire chronique, chez la souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une restriction alimentaire de trente à trente-cinq jours, commencée à cinq semaines d'âge, reproduit chez des souris adolescentes la dénutrition chronique de l'anorexie mentale. 1 232 souris vont être utilisées, 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 848 un niveau modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure. S'y ajoutent cinq injections sous-cutanées, quinze mesures de glycémie, quatre prélèvements à la veine caudale, la pose de microélectrodes sous anesthésie légère et, pour les lignées génétiquement modifiées, une biopsie de l'oreille entre le septième et le dixième jour de vie. Le porteur signale que la restriction peut provoquer hyperactivité, hypothermie, stress et compétition pour la nourriture, et annonce cinq tests comportementaux qu'il qualifie de non dommageables sans préciser lesquels.
Objectifs
L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires caractérisé par une restriction alimentaire sévère et une activité physique compulsive, conduisant à une dénutrition chronique et à des complications somatiques et psychiatriques graves. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM présente le taux de mortalité le plus élevé ainsi qu’un risque de rechute important. Malgré un déficit énergétique majeur, les patients atteints d’AM développent des adaptations métaboliques remarquables, notamment la capacité à maintenir une glycémie stable. Dans un contexte de restriction alimentaire prolongée associée à une augmentation de la dépense énergétique due à l'exercice physique, l’organisme met en place des mécanismes d’adaptation, en particulier au niveau de la production endogène de glucose. Cette production, essentielle à la survie en dehors des périodes de repas, est activée en réponse au jeûne. Chez ces patients, on observe également une préférence marquée pour les aliments connus pour réduire la sensation de faim en stimulant la production de glucose. Nous formulons l’hypothèse que chez les patients atteints d’AM, la production de glucose est influencée par deux facteurs majeurs : l’activité physique excessive et la consommation préférentielle de certains types d’aliments, permettant ainsi à l’organisme de mieux faire face au déficit énergétique. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et neurobiologiques impliqués dans cette adaptation métabolique en utilisant un modèle animal validé. Les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’amélioration des stratégies de prise en charge nutritionnelle des patients souffrant d’AM et à l’adaptation des recommandations concernant leur activité physique
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle de souris conçu pour s’approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l’AM peut aider à trouver des méthodes plus spécifiques de prise en charge. Il est également important de noter que le taux d'échec du traitement de l'anorexie est très élevé (environ 40% des patients). Ce projet permettra de faire de nouvelles découvertes sur les stratégies nutritionnelles et les adaptations métaboliques associées à la dénutrition, ainsi que l’adaptation des recommandations concernant l’activité physique, avec un impact économique et sociétal important.
Procédures
- Les souris recevront des injections pendant 5 jours consécutifs à partir de l’âge de 5 semaines en sous-cutané (10 secondes, 5 fois). -Pendant une période maximale de 30-35 jours, les souris auront une restriction alimentaire. -Deux à trois fois par semaine, une mesure de la glycémie sera réalisée (5 secondes, 15 fois). -Une mise à jeun de 6h sera réalisée pour certains lots de notre projet -Un prélèvement de sang en cours de protocole sera réalisé au niveau de la veine caudale (4 prélèvements réalisés en 1 min chacun) -Certains animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique (10 secondes maximum) et puis 10 min plus tard, d’anesthésique en intrapéritonéal (10 secondes maximum) puis subiront une chirurgie terminale. - Des microélectrodes seront posées en sous-cutané pendant 10-15 min sous anesthésie légère, pour réaliser un électrocardiogramme. - Pour l’élevage des souris KO GHSR, une biopsie d'oreille est réalisée entre le 7eme et 10eme jour postnatal (durée 30 secondes, 1 fois). - Le niveau d'anxiété des souris sera évalué par cinq tests comportementaux non dommageables d'une durée de 5 à 30 min selon les tests en question.
Impact sur les animaux
La restriction alimentaire entraîne une perte de poids et peut provoquer une hyperactivité, une hypothermie et un stress. Une compétition pour la nourriture est susceptible d’apparaitre. Les prélèvements sanguins peuvent induire un stress et une douleur légers. Les souris invalidées pour le gène d'intérêt présentent une anxiété légère. Les tests comportementaux utilisés peuvent générer un stress léger. Les injections en sous-cutané de tamoxifène causent un stress et une douleur légère de courte durée. La pose des microélectrodes pour mesurer l'électrocardiogramme peut induire une légère douleur au réveil. La biopsie d'oreille pour le génotypage genère une douleur légère et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, l’anorexie mentale, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et un dialogue soutenu et complexe entre le système nerveux central et plusieurs organes périphériques. Notre étude nécessite ainsi une approche intégrée que nous ne pouvons obtenir que par l’utilisation de modèles animaux. Les autres approches disponibles ne prennent pas en compte les variations induites par les communications subtiles entre différents systèmes fortement interconnectés dans le cadre de cette maladie qui font de tous les organismes vivants de réels écosystèmes dont la complexité est difficilement réductible à l’utilisation de modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste à partir des résultats d’études précédentes menées par notre laboratoire et nos collaborateurs. Ce nombre a été établi sur différents paramètres statistiques ainsi que sur la variabilité inter-individus. Les années de pratique du laboratoire et du personnel qualifié nous ont permis de standardiser nos expérimentations le plus possible afin de diminuer les sources extérieures de variabilité inter-individus. Nos résultats seront analysés grâce à des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L’état général des animaux sera suivi quotidiennement (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis et précoces, sera communiqué au responsable du projet et les mesures pour remédier à la souffrance de l’animal seront mises en œuvre en cas de point limite atteint (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). De même, en cas de petites plaies causées par les souris, une crème aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée. Une habituation débutera dès l’arrivée des animaux. Les animaux seront hébergés par groupe de 2, pour limiter le stress et l’hypothermie induits par la restriction alimentaire, avec enrichissement, et seront manipulés régulièrement. Lors du nourrissage, une portion sera distribuée sous forme de 3 repas pour limiter le stress de la restriction alimentaire. Pour limiter l’apparition de dominance, 2 souris de poids similaire seront hébergées dans une même cage. Les changes des cages et la manipulation des animaux sont réalisés par la même personne pour limiter tout stress supplémentaire. Dans les conditions d’hébergement, aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris invalidées pour le gène d'intérêt.
Choix des espèces
Le modèle de souris de restriction alimentaire chronique utilisé dans ce projet est un modèle de choix pour explorer le comportement alimentaire, la régulation du glucose, les processus addictifs et le métabolisme énergétique de manière plus générale. Les processus biologiques mis en jeu sont particulièrement bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’humain. L’anorexie mentale (AM) est un trouble neuropsychiatrique qui touche des sujets jeunes adultes et des adolescents. La majorité des procédures sera donc débutée chez des souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de 5 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les protocoles que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines ; ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 14-15 semaines (souris adultes).
Maintien de modèles de xénogreffes de tumeurs humaines sur souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
Maintenir en croissance une collection commerciale de plus de 220 tumeurs humaines suppose de les regreffer en continu sur des souris. 22 104 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue et exclues de tout autre projet. Chacune reçoit un fragment tumoral ou des cellules tumorales sous la peau, une puce électronique ou un marquage aux oreilles, puis des administrations de molécules jusqu'à deux fois par jour. Le porteur range parmi les nuisances transitoires modérées les douleurs postopératoires, les infections, les diarrhées et la cachexie, et indique que l'effectif dépend de l'offre de sa collection et de la demande en tests de médicaments.
Objectifs
Le but de ce projet est de maintenir une collection de modèles tumoraux vivants, en croissance chez la souris, afin de garantir et d’optimiser leur accessibilité pour tester de nouveaux médicaments contre le cancer. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), sont des tumeurs humaines implantées chez la souris. Ils permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils soient testés chez l’Homme. Notre collection de plus de 220 modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Chaque modèle est soigneusement étudié afin de mieux comprendre ses particularités et de relier ces informations à la réponse observée aux différents traitements anticancéreux. Le développement de nouveaux médicaments contre le cancer nécessite des phases de test de leur efficacité antitumorale et de leurs mécanismes d’action qui sont réalisés sur ces modèles tumoraux, permettant d’obtenir des résultats fiables sur les traitements les plus prometteurs pour un type de tumeur ou mutation donnée. Elles peuvent également permettre d’étudier les mécanismes d’action des médicaments dans l’organisme. Elles sont nécessaires pour constituer un dossier de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) des médicaments. Ce projet prévoit le maintien de 120 modèles tumoraux parmi notre collection de PDX, sous forme de collection vivante sur souris, afin de garantir la disponibilité de ces modèles pour les tests réglementaires de nouveaux médicaments, et ce durant 5 ans. Ce maintien consiste en des étapes de décongélation et passages successifs.
Bénéfices attendus
Chaque année, dans le monde, près de 20 millions de personnes sont diagnostiquées atteintes d’un cancer (tous types confondus) dont plus de 400 000 en France, et on recense plus de 10 millions de décès (1/6) dont plus de 150 000 en France. Le nombre de personnes atteintes d’un cancer est en constante évolution, mais les progrès en terme de développement de traitements depuis 25 ans ont permis d’observer une diminution de la mortalité. La recherche de nouvelles solutions thérapeutiques est essentielle pour espérer diminuer le taux de mortalité dû au cancer, limiter les effets indésirables des traitements, et augmenter les taux de guérison. Dans ce contexte, ce projet vise à maintenir une collection vivante de tumeurs humaines implantées chez la souris (modèles de PDX) dans le but de réaliser des tests pour de nouveaux traitements contre différents types de cancers. Le maintien d’une partie de notre collection sous forme vivante garantie l’accessibilité des modèles pour les tests réglementaires et la découverte de nouvelles options thérapeutiques. Plusieurs paramètres sont régulièrement évalués durant ce maintien pour garantir la conservation des caractéristiques principales de chaque modèle tumoral et garantir des résultats qualitatifs.
Procédures
Greffe : implantation d’un fragment tumoral ou injection de cellules tumorales sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Identification : des puces électroniques sont implantées en sous cutané au moment de la chirurgie ou un marquage aux oreilles est réalisé. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement : biquotidienne ou moins. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute.
Impact sur les animaux
Stress dû à la préhension (suivi du poids et de la taille tumorale, administration de molécules): nuisance transitoire de classe légère ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire de classe modérée
Devenir
Les animaux seront euthanasiés compte tenu des nuisances occasionnées (greffe d’un fragment tumoral ou de cellules tumorales). Les animaux de ce projet ne seront pas utilisés dans un autre projet.
Remplacement
Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. La réalisation de ces tests est dépendante de la disponibilité de modèles tumoraux représentatifs de la diversité des cancers humains. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent le plus efficace. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, le développement puis, dans le cadre de ce projet, la disponibilité de modèles tumoraux sous forme vivante chez l’animal, sont essentiels à la réalisation de tests de nouveaux médicaments. Ces modèles tumoraux représentent la diversité des caractéristiques retrouvées dans les cancers humains. Leur maintien sous forme vivante chez l’animal est finement contrôlé pour garantir la conservation de leurs caractéristiques principales et l’obtention de résultats fiables.
Réduction
Ce projet utilise le nombre d’animaux nécessaire pour garantir la disponibilité et la fiabilité des modèles tumoraux maintenus sous forme vivante chez l’animal. Le nombre de modèles tumoraux maintenus sur souris est conditionné par l’offre proposée au sein de notre collection et par la demande en terme de tests de médicaments. Notre collection de modèles de PDX s’étoffe en permanence pour répondre à la demande grandissante en terme de diversité de types de cancers (mutation d’intérêt, réponse au traitement) représentant la population de patients. Les besoins en modèles tumoraux sont actualisés en temps réels en fonction des besoins des industries pharmaceutiques, afin d’évaluer et d’actualiser les modèles conservés sous forme vivante sur animaux. Le nombre d’animaux utilisés est calculé en fonction des différentes étapes du projet (décongélation, maintien ou préparation d’une phase de test de nouveaux médicaments), des paramètres de croissance de chaque modèle tumoral et des besoins pour les phases de tests pharmacologiques ultérieurs, tout en garantissant la disponibilité et la qualité des modèles. Sur notre collection de plus de 220 modèles tumoraux de PDX, seulement les 120 les plus demandés sont maintenus sous forme vivante chez l’animal. Les modèles tumoraux à croissance rapide sont facilement accessibles, et ne sont donc pas maintenus sur souris s’ils ne sont pas demandés. Les modèles les plus rarement demandés, dû à leur type tumoral ou leurs caractéristiques moléculaires, ne sont pas maintenus sur souris pour limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical les animaux recevront une anesthésiés générale. Si une perte de poids est observée, un supplément nutritionnel sera proposé à l’animal. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utilisons des souches murines immunodéficientes qui sont classiquement utilisées pour des greffes de cellules ou de fragments tumoraux (Patient Derived Xenograft – PDX) et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines pour augmenter nos chances de succès.
Étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation : Gestion des souffrances d’un phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées dès qu'un point limite est atteint, ou dirigées vers d'autres protocoles et vers le renouvellement des trios reproducteurs, les souris de cet élevage ne quittent pas le circuit expérimental. 27 588 souris appartenant à vingt-six lignées immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré se réduit à une biopsie de l'oreille au poinçon de 2 mm, pratiquée avant le vingt-et-unième jour de vie sur 7 260 d'entre elles. Le porteur affirme que ces lignées sont "indispensables" à l'étude du rejet de greffe, que les organoïdes ne modélisent qu'imparfaitement le réseau immunitaire, et que l'immunodéficience reste sans conséquence tant que les animaux vivent en conditions stériles.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est d’étudier les réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes. La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Les patients soient maintenus sous immunosuppresseurs (médicaments permettant de calmer le système immunitaire) pour réduire le risque de rejet. Cependant, malgré les traitements, le risque de rejet reste encore un point critique majeur pour les patients transplantés. Pour mieux comprendre les mécanismes de rejet et trouver de nouvelles voies thérapeutiques pour améliorer la survie des greffons et la qualité de vie des patients transplantés, il est nécessaire d’utiliser des lignées de souris présentant différents types d’immunodéficiences (26 lignées au total). Ce projet concerne que la gestion des souffrances liées au phénotype dommageable de différentes lignées de souris, l’ensemble des projets expérimentaux menés sur ces animaux sont validés en parallèle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de générer les animaux qui rentreront ensuite dans différents projets de recherche ayant pour objectifs de mieux comprendre les réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes, et ceci en réduisant les nuisances du phénotype dommageable en élevage (conditions d'élevage stériles comme décrit précédemment), et en optimisant l’élevage. A moyen terme, cela pourrait déboucher sur de nouveaux traitements pour les patients transplantés.
Procédures
Un prélèvement de tissu par biopsie de l'oreille pour génotypage avant le 21ème jour de vie pour 7260 animaux.
Impact sur les animaux
Les souris ont un phénotype dommageable (immunodéficience) mais qui ne se déclarera pas dans les conditions d'hébergement et de reproduction décrites. Pour les lignées de souris qui nécessitent d’être géntoypées, le prélèvement de tissus nécessite de contentionner l’animal, ce qui peut induire un stress transitoire de courte durée chez les animaux. Ces gestes, réalisés une seule fois peuvent causer de la douleur légère et de l’inconfort chez l’animal.
Devenir
Tout animal ayant atteint un point limite sera automatiquement mis à mort. Les autres animaux produits seront utilisés encontinu pour le renouvellement des trios reproducteurs, dans les protocoles validés par le ministère sur ces lignées ou hors-projet (prélèvement d'organes post-mortem pour études in vitro ou mise au point de protocoles).
Remplacement
L’utilisation des lignées de souris immunodéficientes est indispensable pour l’étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes. Des études in vitro ont été préalablement réalisées. Cepedant, le réseau complexe de cellules immunitaires impliquées dans la régulation des réponses immunitaires étudiées dans ce projet ne peut être reproduit in vitro et n’est qu’impartialement modellisé par les techniques actuelles telles que la production d'organoïdes. En effet, dans ce cas, la composante temps et développement reste imparfaite. D'autre part, l'interaction entre plusieurs organes étant nécessaire à l'apparition des phénotypes que nous étudions, des modèles in vitro ou in silico ne permettent pas d'accumuler des données suffisamment prédictives ou représentatives de la situation pathologique. Cette étude nécessite donc la réalisation d’expériences à l’échelle de l’animal. Les objectifs des projets scientifiques justifient donc l’existence de ces lignées.
Réduction
Des calculs d'effectifs ont permis d'établir le nombre minimal d'animaux par lignée nécessaire en reproduction pour permettre de réaliser les différents projets de cette thématique. Nous nous sommes basés sur un nombre moyen théorique d'animaux par portées (6) et le nombre moyen théorique de portées par femelle et par semestre (3). Nous avons calculé au plus juste le nombre de cages de reproduction nécessaires avec ces chiffres et compte-tenu du nombre d'animaux nécessaires pour les expérimentations en aval. Lorsqu’un génotypage est réalisé, le nombre de cage de reproduction est augmenté pour tenir compte des animaux de génotype non-désiré. Si certains animaux ne peuvent être utilisés pour nos protocoles expérimentaux, ils seront utilisés hors protocole pour des prélèvements post-mortem permettant la mise au point et l'optimisation des expériences (par exemple, mise au point des immuno-marquages multiparamétriques sur des suspensions cellulaires de rate). Enfin, les trios reproducteurs sont changés tous les 6 mois pour ne pas garder de trios peu productifs, ce qui impliquerait d'augmenter leur nombre pour garder une production constante. La dimension de l'élevage sera dynamiquement évaluée pour prendre en compte l'objectif de réduction et s'adapter aux besoins des projets (notamment une réduction de l'élevage dans les phases de diminution des besoins des projets).
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cagées à portoirs ventilés et manipulés par un personel expérimenté en conditions stériles. Le phénotype dommageable (immunodéficience) ne se déclare pas lorsque les souris sont élevées dans ces conditions. Certaines de ces lignées de souris sont hébergées dans notre animalerie depuis plus de 5 ans avec une observation quotidienne, nous avons donc le recul nécessaire pour affirmer que le phénotype d'immunodéficience n'est pas dommageable en condition d'élevage SPF mais requiert des conditions d'infections controlées pour s'exprimer expérimentalement. Une biopsie d'oreille est parfois requise à des fins de génotypage. Cette biopsie sera effecuée à l’aide d’une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs. La biopsie sera réalisée avant le 21ème jour de vie à l'aide d'un poinçon de 2mm (régulièrement nettoyé et stérilisé par autoclavage) spécifique pour réaliser ce genre de prélèvement. Cet limite d’age a été choisie en fonction du développement des nouveaux-nés pour réaliser une biopsie indolore, ne nécessitant pas d’administration d’antalgique. La biopsie pourra être réalisée en même temps que le tatouage, afin d’éviter la préhension de l’animal plusieurs fois à quelques jours d’intervalle. Le lendemain de la biopsie, une attention particulière sera portée aux oreilles des animaux. En cas de lésions infectées, un lavage au sérum physiologique sera réalisé suivi d'une application de pommade antiseptique et cicatrisante sur conseil vétérinaire. Si l'infection auriculaire s'aggrave dans les 48h, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l'homme en termes de génétique, d'anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l'étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation. La sélection de la souris permet également de bénéficier d’un nombre important de modèles génétiquement modifiés pertinents développés précédemment (comme c'est le cas ici) et facilite donc le raffinement du plan expérimental. Des souris âgées de plus de 6 semaines et de moins de 12 mois seront utilisées pour la reproduction du fait de leur maturité sexuelle et avant la décroissance de la fertilité.
Etude de la biologie des lymphocytes T chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour faire disparaître une population de lymphocytes T régulateurs chez des souriceaux âgés de un à sept jours, puis chez des souris de quatre semaines, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois injections sous la peau, sur animal vigile, sont pratiquées en une semaine, avant la mise à mort de l'ensemble des animaux pour prélever leurs organes. Le porteur affirme que la mise en place du système immunitaire périnatal résulte d'interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro, ce qui l'oblige à recourir à un modèle in vivo. Le suivi annoncé est hebdomadaire, et les points limites dont l'atteinte déclencherait une mise à mort anticipée ne sont pas décrits.
Objectifs
Les lymphocytes T régulateurs sont une population de cellules du système immunitaire cruciales dans la prévention de l’auto-immunité mais délétère dans les réponses anti-cancéreuse du fait de leur puissant effet immunosuppresseur. Il a récemment été montré que les lymphocytes T régulateurs produits au cours de la période néo-natale présentaient des propriétés particulières et protégeaient l’organisme tout au long de la vie. Il a été observé, chez la souris qu’une déficience pour une protéine spécifique altérait drastiquement la survie de cette population cellulaire. Nous souhaitons évaluer les conséquences de la disparition de ces cellules durant la période néonatale mais également chez la souris de 4 semaines via l’administration de molécules spécifiques ciblant ces cellules. Nous souhaitons également restaurer la survie des lymphocytes T régulateurs néonataux chez la souris déficiente pour la protéine identifiée, grâce à un traitement ciblé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mieux comprendre les mécanismes contrôlant la mise en place des lymphocytes T régulateurs chez le nouveau-né et les conséquences à long terme d’une perturbation de ces mécanismes. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques visant à moduler l’influence de ces cellules, bénéfique dans la prévention de l’auto-immunité mais délétère dans la mise en place d’une immunité anti-tumorale efficace.
Procédures
3 injections sous la peau seront réalisées sur animal vigile (30s/souris/injection) sur une durée d’une semaine
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau peuvent induire un stress léger et des douleurs légères de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort dans le but de prélever les organes pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.
Remplacement
Des données bio-informatiques nous ont permis d’identifier des molécules importantes dans la survie des cellules T régulatrices. Des tests in vitro soutiennent également notre hypothèse. Cependant le système immunitaire est composé de nombreuses cellules qui interagissent entre elles. La mise en place de celui-ci lors de la période périnatale est le résultat d’interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro nous obligeant ainsi à utiliser un modèle in vivo.
Réduction
Les effectifs ont été calculé en utilisant une étude statistique garantissant la validité des données obtenues et l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un suivi hebdomadaire de la part de l’équipe scientifique sera mis en place. De plus des points limites ont été définis, s’ils sont atteints, une mise à mort anticipée des animaux sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l’étude du système immunitaire. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. L’étude du système immunitaire et de ses modulations entre le stade néonatal et adulte nécessite l’utilisation de souriceaux âgées de 1 à 7 jours et de jeunes souris âgées d’au moins 4 semaines.
Étude des transmissions glutamatergique et cholinergique sur les réponses comportementales émotionnelles, compulsives et mnésiques
- Enseignement supérieur
Trois à quatre injections intrapéritonéales, puis des tests de champ ouvert, de boîte noire et illuminée, d'enfouissement de billes et de reconnaissance d'objet, de dix minutes chacun : le protocole tient dans une séance de travaux pratiques de quatre heures. 400 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces séances initient des étudiants aux analyses comportementales en neurosciences, hors de toute production de connaissances. Le porteur présente ces travaux pratiques comme un apprentissage précoce de la règle des 3R, et prévoit de mutualiser les souris entre les séances du matin et de l'après-midi, puis de récupérer leurs corps pour des travaux pratiques de dissection.
Objectifs
Une personne sur quatre souffre de troubles mentaux. Les troubles mentaux regroupent un vaste ensemble de problèmes, dont les origines diffèrent. L’étiologie des troubles mentaux comporte des facteurs individuels (ex : génétique) et environnementaux. Les mécanismes biologiques sous tendant ces troubles sont loin d’être élucidés et ils sont au cœur de plusieurs programmes de recherche. Une majorité de ces recherches, par de leur nature même, impliquent l’étude du comportement et ont donc recours à l’expérimentation animale. Une formation précoce des étudiants à ces thématiques est fondamentale afin de les initier aux pratiques expérimentales auxquelles ils seront confrontés dans la suite de leur parcours d’étude et professionnelle. Les procédures incluses dans ce projet sont destinées à la formation d’apprenants dans le cadre des Travaux Pratiques (TP) axés sur le domaine des neurosciences. Ces procédures se déclinent sous forme de séances de travaux pratiques (TP) d’une durée de 4 h chacune et seront encadrées par des personnes possédant les habilitations réglementaires nécessaires à concevoir et réaliser des procédures expérimentales.. Les objectifs de ces TP sont doubles : - Sensibiliser les étudiants à l’utilisation d’animaux de laboratoire en s’appuyant sur la règle des 3R et leur présenter le cadre légal pour une telle approche (notion d'éthique et à la réglementation en vigueur). - Les initier à la complexité des analyses comportementales (exploration d'un champ ouvert pendant 10 minutes pour évaluer le comportement moteur, test de la boite noire/illuminée pendant 10 minutes pour évaluer les niveaux d’anxiété, test d’enfouissement des billes pendant 10 minutes pour évaluer le comportement compulsif et reconaissance d’objet (deux séances de 10 minutes pour évaluer la mémoire) et à l’interprétation des données nécessaires à la recherche s’intéressant aux troubles mentaux.
Bénéfices attendus
APPRENTISSAGE PRECOCE DE LA REGLE DES 3RS. Le bien-être des animaux de laboratoire passe aussi et surtout par une correcte formation du personnel, impliquant à la fois la maitrise des aspects pratiques des procédures expérimentales utilisant les animaux et la prise de conscience des enjeux éthiques et réglementaires qui les accompagnent. Bien que ces sujets soient largement traités au cours des formations réglementaires, une initiation précoce des étudiants à ces thématiques, aussi à travers une approche pratique, reste fondamentale afin de susciter leur intérêt, transmettre plus efficacement les notions théoriques et leur permettre de prendre des décisions plus éclairées pour la suite de leur parcours d’étude et/ou professionnel (choix du master, stages, insertion dans le monde du travail).
Procédures
Injection (trois ou quatre selon si animaux utilisés dans deux séances de travaux pratiques ou pas). Durèe estimée < 1 minutes. Test de mésure de la motricité (durée 10 minutes), test de mésure de l'anxieté (durée 10 minutes), test de mésure du comportement compulsif (durée 10 minutes), test de mémoire (deux sessions de 10 minutes chacune).
Impact sur les animaux
L’injection des deux produits sera réalisée à des doses largement étudiées en littérature et qui ne génèrent pas d’effets indésirables au-delà des altérations comportementales attendues (hyperactivité, réduction du comportement compulsif pour la procédure 1, amnésie pour la procédure 2).
Devenir
A la fin des procédures les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir les mutualiser avec d’autres travaux pratiques (notamment de dissection) réalisé dans le département.
Remplacement
Notre projet repose principalement sur des approches comportementales. Actuellement, il n’y a pas de méthodes substitutives qui pourraient remplacer le recours à l’animal dans nos travaux. Il n’est pas non plus envisageable d’utiliser des modèles animaux moins sensibles. En effet, la souris est un modèle animal de choix de par les approches pharmacologiques qui permettent une manipulation ciblée des voies de transmission étudiées.
Réduction
Concernant le nombre d’animaux utilisés, il faut remarquer que les dates des travaux pratiques seront coordonnées dans la mesure du possible afin de mutualiser les souris avec d’autres travaux pratiques nécessitant l’utilisation de tissues animaux. Plus précisément, sur la base de l’expérience des années précédentes, les carcasses des animaux pourront être récupérées pour des travaux pratiques de dissection. En plus, en partant de l’observation que les effets des deux produits disparaissent après environ 120 minutes, afin de réduire le nombre de souris utilisées, on mutualisera les animaux utilisés dans les TPs du matin et de l’après-midi.
Raffinement
Des comportements agressifs ont été observés les années précédentes. Ces comportements se déclarent dès la réception des animaux et ne sont pas liés à la procédure. Dans les dernières années on a donc préféré l’utilisation de souris femelles. Le fait d’avoir des souris femelles n’a pas modifié les résultats de l’expérience et a considérablement réduit la survenue de comportements agressifs. Dans le but du raffinement, on propose donc d’utiliser seulement des souris femelles. Concernant les procédures expérimentales, les souris seront manipulées 2 ou 3 jours avant les injections intrapéritonéales avec de légères contentions afin de les familiariser avec l’expérimentateur et les habituer à la manipulation nécessaire à l’injection i.p.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal de choix de par les approches pharmacologiques qui permettent une manipulation ciblée des voies de transmission étudiées. Utiliser des souris adultes maximise la validité interne, la reproductibilité et la robustesse pédagogique tout en respectant les 3R. On évite les confusions liées au développement, on diminue la variance et on applique des protocoles largement étalonnés pour l’âge adulte, ce qui est idéal pour un TP court et standardisé.
Détournement de vésicules extracellulaires pour la délivrance d’acides nucléiques contre le cancer grâce à des nanosystèmes dendrimériques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 242 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de complexes ARN et dix-huit injections directement dans la tumeur. L'implantation tumorale se fait sous la peau du flanc au trocart de 3 mm, suivie de séances d'imagerie par fluorescence de quinze à trente minutes sous anesthésie gazeuse et d'un prélèvement de sang à la veine mandibulaire sur animal vigile. Le porteur décrit des ulcérations cutanées possibles, des pertes de poids, de la prostration et un risque accru d'hypothermie lié aux anesthésies répétées, les souris nude étant par ailleurs plus vulnérables aux infections. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever tumeurs et organes, quand le bénéfice annoncé se limite à l'hypothèse que la stratégie, si elle fonctionne, pourrait ensuite être testée sur d'autres cancers.
Objectifs
Le cancer demeure une pathologie complexe et difficile à traiter. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amenés à développer des traitements personnalisés à base d’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents et de petits ARN d'activation pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précis et efficace. Dans ce projet, nous allons étudier des traitements anticancéreux utilisant ces ARN, qui sont transportés par des nanoparticules appelées dendrimères, via des petites vésicules naturelles produites par les cellules tumorales in situ, afin d’améliorer la pénétration dans la tumeur. Objectifs spécifiques : 1.Évaluer la toxicité des ARN/nanoparticules complexes 2.Observer comment ces complexes se déplacent dans le corps et s’accumulent dans les tumeurs 3.Tester l’efficacité de ces traitements chez des souris ayant une tumeur principale 4.Tester leur efficacité chez des souris avec des tumeurs métastatiques 5.Étudier comment ces traitements se déplacent entre les tumeurs principales et secondaires dans le corps via les vesicules transporteurs. La réalisation de ces objectifs nous permettra de développer et de valider la thérapie anticancéreuse basée sur des acides nucléiques, délivrés par des nanoparticules exploitant les vésicules-transporteurs générées in situ.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est l'évaluation et la validation d'un nouveau traitement pour le cancer, une maladie très complexe et difficile à traiter. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ces modèles tumoraux, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d'autres cancers résistants à la thérapie actuelle, ou sur d'autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.
Procédures
-Surveillance des souris et mesure des tumeurs (durée : 5 à 10 minutes par séance). - Prélèvement sanguin par ponction de la veine mandibulaire, une seule fois par animal en état vigile, dédié à l’évaluation spécifique de la toxicité des complexes ARN/nanoparticules (durée : 5 à 10 minutes). -Injections sous- cutanées ou intraveineuses, sous anesthésie gazeuse, des complexes ARN/dendrimère pour le traitement des tumeurs (2 fois par semaine, pendant 2 à 6 semaines selon le protocole, durée : environ 2 minutes par injection). - Injections intra-tumorales de l’inhibiteur de vésicules extracellulaires (3 fois par semaine, pendant 2 à 6 semaines selon le protocole, durée : environ 2 minutes par injection). -Contention et injection intrapéritonéale d’agent utilisé pour visualiser la tumeur (2 injections par souris, dédiées aux procédures spécifiques nécessitant cet agent, durée : environ 5 minutes par injection). -Intervention chirurgicale pour l’établissement du modèle de xénogreffe tumorale sous-cutanée (durée : 30 à 60 minutes, sous anesthésie). -Imagerie par fluorescence des tumeurs, réalisée chez les souris sous anesthésie gazeuse, avec une durée d’environ 15 à 30 minutes par séance. -Euthanasie des animaux par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse en fin d’étude, procédure terminale (durée : 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux comprennent les implantations de tumeurs effectuées en sous-cutané au niveau du flanc, sous anesthésie, à l’aide d’un trocart de 3 mm de diamètre. Le développement de tumeurs sous-cutanées peut générer un certain inconfort ou être la source d’ulcérations cutanées. Les injections de cellules cancéreuses en IV pour générer un modèle de cancer métastatique, ainsi que les injections de molécules en IP ou en IV et la prise de sang, peuvent générer une douleur. Ces traitements peuvent provoquer différentes manifestations du phénotype dommageable, telles que : diminution du poids, prostration, altération de l’état général ou troubles de la mobilité. La contention de l’animal vigile nécessaire pour les diverses injections, les mesures des volumes tumoraux ou la prise de poids corporel, ainsi que les anesthésies répétées, peuvent être des facteurs de stress supplémentaires, avec un risque accru d’hypothermie ou de dépression respiratoire. De même, les injections intra-tumorales de l’inhibiteur sont susceptibles de provoquer une nuisance locale transitoire. Il est également pris en compte que les souris NUDE, en raison de leur immunodéficience, présentent une vulnérabilité accrue aux infections et au stress expérimental, ce qui contribue à leur phénotype intrinsèquement sensible et justifie une surveillance rapprochée tout au long des procédures expérimentales.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de permettre la récupération d’organes, ainsi que des tumeurs, en vue d’analyses biochimiques et histopathologiques nécessaires à l’évaluation des effets des traitements étudiés.
Remplacement
Bien que nous ayons déjà utilisé des modèles cellulaires 2D et 3D, l’utilisation de la souris reste essentielle pour comprendre les mécanismes d’action dans un organisme entier, y compris des éléments comme l’environnement autour de la tumeur et la manière dont le traitement se répartit dans le corps, qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au strict minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, les tumeurs et organes des souris seront conservés afin de permettre des analyses complémentaires.
Raffinement
À leur arrivée, les souris bénéficieront de 10 jours d’acclimatation avec familiarisation à la manipulation afin de réduire le stress et favoriser l’adaptation à leur nouvel environnement. Elles seront hébergées en groupes sociaux avec un environnement enrichi (papier, dôme de cellulose, coton), litière changée chaque semaine, eau et nourriture ad libitum, afin de préserver leur bien-être et limiter les effets négatifs liés à l’isolement ou au stress. Toutes les procédures expérimentales (implantation tumorale, traitements, imagerie, prélèvements sanguins) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse pour minimiser douleur et stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’au réveil pour prévenir toute hypothermie. Si nécessaire, une analgésie appropriée sera administrée par voie sous-cutanée et complétée, si besoin, par une prise continue via l’eau d’abreuvement, afin d’assurer un confort durable des animaux. Un suivi quotidien sera assuré, avec un examen clinique approfondi deux fois par semaine (ou plus si nécessaire), permettant de repérer précocement toute manifestation du phénotype dommageable (diminution du poids, prostration, altération de l’état général, troubles de la mobilité ou inconfort local). Une grille de score permettra d’évaluer la souffrance, de repérer les points limites et de définir la conduite à tenir, garantissant ainsi que tout effet indésirable soit pris en charge rapidement et efficacement.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère facilement manipulable, avec une durée de vie courte qui permet le développement rapide de tumeurs. Ce projet, utilisant des cellules cancéreuses humaines, nécessite des souris immunodéficientes pour éviter le rejet lors des xénogreffes. Ces souris qui sont des modèles bien établies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent la prise des xénogreffes de tumeurs, le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité et l’efficacité des molécules Les animaux auront 5 semaines à leur réception (>20 g), afin d’obtenir des souris adultes, en bonne santé, et jeunes pour éviter le rejet de greffe. Un délai d’acclimatation de 10 jours est prévu pour l’adaptation. À l’issue, les souris auront entre 6 et 7 semaines.
Impact des invasions biologiques et du changement climatique sur la transmission des maladies parasitaires
- Protection de l’environnement
Génétiquement identiques par construction, des souris consanguines sont infectées par la grande douve du foie, le porteur cherchant à mesurer la virulence du parasite selon l'espèce d'escargot qui l'a hébergé. 260 souris vont être utilisées, 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 240 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Un gavage unique sous contention vigile leur inocule les parasites, puis des pesées hebdomadaires de trente secondes suivent leur état jusqu'à quatre semaines, terme fixé pour devancer l'installation de la maladie chronique. L'infection peut provoquer un inconfort abdominal modéré puis des lésions hépatiques aux nuisances sévères, et la mise à mort sert à prélever le liquide péritonéal et le foie.
Objectifs
La grande douve du foie est un parasite qui provoque une maladie du foie chez l’homme, le bétail et les animaux sauvages. Elle est transmise par de petits escargots d’eau douce. Après avoir infecté un escargot, le parasite se développe puis sort pour former de petits kystes sur les plantes aquatiques ou dans l’eau. L’homme et les animaux attrapent la maladie en mangeant des plantes ou des aliments contaminés. Cette maladie réapparaît de plus en plus dans le monde : environ 50 millions de personnes sont infectées et 180 millions sont exposées au risque. Des facteurs comme le changement climatique et l’introduction de nouvelles espèces favorisent cette progression. En Europe, surtout en France, la maladie touche surtout le bétail : plus de 86 % des fermes ont des animaux en contact avec ce parasite. Une seule espèce d’escargot d’eau douce est responsable de sa transmission en Europe. Chez l’humain, la maladie peut devenir chronique et provoquer des dommages au foie et à la vésicule biliaire. Les cas humains sont souvent liés à la consommation de plantes aquatiques crues comme le cresson ou la mâche. Ils apparaissent généralement de manière isolée, mais de petites épidémies peuvent aussi survenir.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à : i) Caractériser précisément la transmission de la maladie en lien avec l’invasion de nouvelles espèces d’escargots d’eau douce impliquées dans le cycle de transmission du parasite. ii) Mieux prédire quelles espèces d’escargots seront les plus impliquées dans la transmission du parasite dans les années à venir, en particulier dans les régions fortement affectées par le réchauffement climatique. iii) Explorer l’impact de la cohabitation de plusieurs espèces d’escargots dans la transmission du parasite, en combinaison avec les effets du réchauffement climatique. Cette approche vise à adopter le point de vue du parasite pour mieux comprendre comment ces conditions influencent ses interactions avec les escargots vecteurs et les hôtes mammifères. iv) Caractériser la virulence du parasite en relation avec l’infection chez la souris, afin d’identifier des pistes fonctionnelles sur l’évolution de la capacité du parasite à provoquer la maladie selon l’espèce d’escargot. Ces résultats pourraient également permettre d’identifier des cibles biologiques pertinentes pour la recherche de vaccins ou de traitements. v) Développer une modélisation de la transmission basée sur les données fonctionnelles issues du projet, à moyen terme. Cette modélisation permettra de répondre à des questions clés telles que : Quelle espèce d’escargot jouera un rôle central dans la transmission ? Quels seront les schémas saisonniers de transmission, ainsi que les niveaux de virulence et de pathogénicité du parasite chez les hôtes mammifères ? Quels facteurs environnementaux augmentent les risques de transmission ? Les résultats attendus, les hypothèses explorées et la méthodologie utilisée fourniront des outils précieux pour les chercheurs, les épidémiologistes et les décideurs engagés dans la gestion des maladies à transmission vectorielle. Ce projet apportera également des bénéfices dépassant le seul champ de la parasitologie fondamentale
Procédures
Une administration orale unique de moins d'une minutedes des parasites sera réalisée sur les animaux maintenus en contention vigile. Par la suite, seuls des pesages de 30 secondes hebdomadaires seront effectués tout au long de l’expérimentation. Un unique prélèvement post-mortem sera réalisé à la fin de l’étude, lors de l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Nous réaliserons l’administration orale des parasites par un gavage unique, effectué sous contention vigile. Cette procédure peut occasionner de légers désagréments pour les rongeurs, en raison de la contention et du mode d'administration. La migration des parasites juvéniles de l’intestin vers le foie peut également engendrer un inconfort abdominal modéré, bien que nous utilisions une dose parasitaire calibrée pour garantir l’infection tout en limitant les effets indésirables chez les souris. L’établissement des parasites dans le foie peut entraîner des lésions pouvant évoluer vers un état chronique, avec l’apparition de nuisances sévères. Afin de prévenir ces souffrances, nous avons fixé la fin de l’expérimentation avant l’établissement de la chronicité. Cette stratégie permet de limiter au maximum la souffrance animale, tout en répondant aux objectifs scientifiques du projet. Ainsi, les animaux seront étudiés avant que le parasite n’induise des atteintes majeures à leur bien-être.
Devenir
Necéssité d'analyser le liquide péritonéal, le foie et autres post-mortem pour les besoins de l'expérience. Les souris seront donc toutes euthanasiées à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Fasciola hepatica est un parasite qui a un cycle de vie complexe, avec des étapes de reproduction qui nécessitent différents hôtes pour arriver à maturité. Pour étudier les substances responsables de sa capacité à provoquer des maladies, on utilisera : Des parasites adultes récupérés dans le foie de souris infectées depuis 28 jours. Des formes très jeunes du parasite obtenues en laboratoire, en recréant les conditions de l’intestin d’un mammifère. Ces jeunes parasites ne survivent que 24 à 36 heures en dehors de leur hôte, mais ce temps suffit pour analyser leurs caractéristiques. Cette méthode permet d’éviter d’utiliser des souris pour obtenir ces formes jeunes.
Réduction
Au regard des études antérieures sur l'infection par la Grande douve du foie dans le modèle murin et après avoir effectué un test de puissance statistique pour déterminer le nombre de souris approprié, le choix de 12 souris par groupe expérimental a été retenu comme le nombre minimal suffisant. L'immuno-pathologie associée à l'infection sera étudiée à un seul point temporel, à la fin de l’expérimentation, afin de réduire le nombre de groupes expérimentaux. Par ailleurs, dans le cadre de l’approche d’évolution expérimentale des escargots, les infections seront réalisées uniquement avec des parasites provenant de la dernière génération de l’expérimentation.
Raffinement
Nous utiliserons la voie orale pour induire l'infection chez les souris, ce qui ne provoque que des nuisances légères, principalement liées à la contention. Les infections seront réalisées en une seule dose, avec un nombre optimal de parasites permettant de concilier l'infection, le bien-être des animaux et la survie de l'hôte. Une surveillance quotidienne sera assurée par le personnel pour veiller à l’état de santé des animaux. Des pesées hebdomadaires sont prévues jusqu’à la fin de l’expérimentation, afin de surveiller leurs états. Les animaux bénéficieront d’enrichissements de milieu tels que des tunnels en plastique ou en carton, ainsi que des petits morceaux de bois à ronger, offrant ainsi des opportunités d’activités ludiques et sociales. Tout rongeur présentant des signes de souffrance, définis par un score de 3 ou plus selon les points limites, sera immédiatement euthanasié. Le point d’arrêt expérimental a été fixé à 4 semaines post-infection afin d’éviter le développement de l’infection chronique et l’altération significative du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’infecter les souris consanguines. Les souches consanguines permettent d’obtenir des souris génétiquement identiques qui présentent une variété moindre d’un point de vue génétique et immunologique. Cela permet d’obtenir une base uniforme pour comparer les variations dues à l’impact environnemental chez le mollusque vecteur sur le parasite. De plus, la diversité étant moindre, les résultats sont statistiquement plus homogènes et cela permet de minimiser le nombre de souris utilisées conformément à la règle des 3R. Les animaux utilisés pour l’étude seront des adultes infestés entre 6 et 7 semaines. À cet âge, leur système immunitaire est entièrement mature et fonctionnel, contrairement à celui des animaux très jeunes ou plus âgés. Cela permet d’étudier de manière optimale la réponse immunitaire face au parasite
Récepteur purinergique P2X4R, autophagie, stéatose et fibrose hépatiques. [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant quatre mois avec un régime gras, une partie des souris entre ensuite dans des protocoles qui provoquent une cirrhose du foie, dont l'un passe par une chirurgie de dix à quinze minutes sous anesthésie. 1 370 souris vont être utilisées, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 570 un niveau sévère. Le porteur écrit pourtant que ces régimes "n'entraînent aucune douleur ou autre nuisance" et que la nuisance essentielle des protocoles de cirrhose se limite à une perte de poids surveillée deux fois par semaine. Toutes sont tuées pour prélever les organes, l'objectif déclaré étant de tester un récepteur comme cible de traitement des maladies du foie.
Objectifs
Il s’agit de déterminer le rôle d'un récepteur (protéine spécifique) dans les maladies du foie au cours desquelles il existe une surcharge en graisse et une fibrose. Nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux permettant de mimer ces maladies chez la souris, ainsi que des molécules pouvant être administrées aux animaux afin de tester l'implication de ce récepteur. L'objectif est de mettre à jour de nouvelles pistes de traitement des maladies du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer le rôle d'un récepteur (protéine spécifique) dans les maladies du foie, en analysant son impact sur la stéatose et la fibrose. La perspective médicale est de définir une ou des pistes de traitement liées à cette protéine. En effet à ce jour aucun traitement spécifique de ces pathologies du foie n'est efficace.
Procédures
Dans ce projet les animaux sont nourris avec des régimes spéciaux pouvant induire un foie gras associé à un surpoids (régime gras pendant 4 mois, autres régimes durant 2 à 7 semaines), qui n'entraînent aucune douleur ou autre nuisance. D'autres souris entreront dans des protocoles expérimentaux entrainant le développement progressif d'une cirrhose du foie, dont la nuisance essentielle est la perte de poids corporel qui sera surveillée 2 fois par semaine. Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (10 à 15 minutes par intervention), pratiqué sous anesthésie générale par un opérateur entrainé, encadré par des traitements antalgiques prévenant toute douleur post-opératoire. Les prélèvements se font sur les souris après leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Dans ce projet les animaux sont nourris avec des régimes spéciaux pouvant induire un foie gras associé à un un surpoids (régime gras), qui n'entraîne aucune douleur ou autre nuisance. D'autres souris entreront dans des protocoles expérimentaux entrainant le développement progressif d'une cirrhose du foie, dont la nuisance essentielle est la perte de poids corporel qui sera surveillée 2 fois par semaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélèvement des organes nous permettant d'évaluer l'efficacité des traitements utilisés sur les maladies du foie mimées chez ces souris.
Remplacement
Nos projets visent à étudier des mécanismes intégrés au sein de l'organisme et du tissu hépatique conduisant à la surcharge du foie en graisses et à la fibrose. Nos protocoles utilisent à la fois des méthodes in vitro (cultures cellulaires) et in vivo (souris), de façon complémentaire. Les approches in vivo chez la souris restent indispensables dans la perspective médicale de tester un récepteur spécifique comme cible thérapeutique des maladies hépatiques stéato-fibrosantes.
Réduction
Une bonne programmation des expériences, avec réflexion anticipée et approfondie concernant les tissus à prélever, les conditions de prélèvement, ainsi que le nombre minimal de souris à inclure dans chaque groupe expérimental, permettent d’éviter la répétition inutile des expériences. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables
Raffinement
Toutes les souris sont hébergées en cages de 4 à 5, l'environnement est systématiquement enrichi (tubes PVC et petites maisons). La consistance du régime riche en graisses étant assez pâteuse, un morceau de bois est placé dans la cage des souris soumises à ce régime afin de s’assurer que les souris puissent continuer de ronger. Durant les 4 mois de régime, ou au cours des autres protocoles expérimentaux, les souris sont surveillées de près de façon à dépister tout signe de souffrance. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie, avec analgésie avant et après l'intervention. Une grille d’évaluation quotidienne de la douleur a été mise en place pour la surveillance des animaux en cours de procédure afin de s'assurer du bien-être animal.
Choix des espèces
La souris est le rongeur de choix pour l’étude de la surcharge lipidique et de la fibrose du foie, du fait de l’existence de modèles expérimentaux au point dans le laboratoire et de la possibilité de disposer de souris génétiquement modifiées. De plus, les mécanismes impliqués dans ces pathologies chez la souris sont proches de ceux observés chez l’Homme. Nous utilisons des souris prédisposées avec l’âge à une prise de poids et au développement d’une intolérance au glucose. Ces souris sous régime permettent donc d’étudier les complications hépatiques de la surcharge pondérale, responsable d'une partie de plus en plus importante des maladies du foie. Les souris entrent dans les protocoles expérimentaux entre 8 et 16 semaines d'âge en fonction des types de traitements.
Acquisition et maintien de compétences techniques sur le rongeur MODIFICATION
- Formation professionnelle
Rats : 420
Hamsters dorés : 240
Autres rongeurs : 470
1 930 rongeurs, 800 souris, 420 rats, 240 hamsters dorés et 470 rongeurs d'autres espèces, vont être utilisés pour entraîner des apprenants aux gestes de base de l'expérimentation animale. 930 d'entre eux sont anesthésiés puis tués sans réveil, les 1 000 autres subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont annoncés comme réutilisables si aucun dommage n'est observé. Ils sont saisis et immobilisés cinq à dix minutes, reçoivent une injection, subissent un ou deux prélèvements sanguins, un frottis vaginal pour les femelles, et pour certains une injection terminale sous anesthésie. Le projet répond à une obligation réglementaire de formation, et le porteur affirme que ces gestes ne peuvent être réalisés que sur un animal "vivant entier", tout en indiquant qu'aucune validation des gestes n'est prévue pour l'initiation.
Objectifs
Le projet vise à répondre à la réglementation française sur l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques ou éducatives qui par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs qu'il soit personnel de recherche ou étudiant soient formés aux gestes et déclaré compétent pour les gestes qu'il aura à réaliser ultérieurement dans le cadre de ses activités scientifiques. L'objectif est donc de former aux gestes de bases employés en expérimentation animale sur rongeurs comme la préhension, la contention de l'animal mais également l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigile. Une partie de cette formation consistera à délivrer la partie pratique de la formation intiale niveau concepteur aux étudiants en première année de thèse : préhension, contention, injections élémentairtes et la formation dans son ensemble s'adressera aux personnels de laboratoires ou personnels zootechniques dans le cadre de leur formation lors de leur recrutement ou du maintien des compétrences tout au long de leur carrière. MODIFICATION: Pour suivre l'évolution de la demande en formation en lien avec les projets de recherche mis en oeuvre au sein de l'EU, le projet est modifié pour intégrer de nouveaux gestes techniques terminaux d'injection et de prélèvements. Le nombre d'animaux n'est pas modifié.
Bénéfices attendus
La phase pratique des séances de formations en expérimentation animale permet aux personnes d'appréhender les grands principes de manipulation et d'avoir un premier enseignement des bonnes pratiques zootechniques lors de l'utilisation d'animaux. Selon les besoins en rapport avec les projets de recherche développés ensuite dans les laboratoires, l'apprentissage des gestes réalisés avec un tuteur technique puis validé par un membre de la cellule du bien-être animal permettra de garantir la compétence acquise et au personnel ou étudiant formé de devenir autonome dans ces pratiques expérimentales. Concernant la formation continue des personnels déjà en poste le bénéfice sera de garantir le niveau des compétences requises en lien avec leurs missions zootechniques ou expérimentales. La formation continue permettra également de créer une dynamique en contribuant à faire évoluer les pratiques en expérimentation animale en tenant des évolutions éthiques notamment en terme de raffinement et donc d'inclure les méthodes alternatives développées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5-10 minutes le temps de réaliser les injections (durée 1 minute). Ils seront également soumis à 1 ou deux prélèvement sanguins sur animal vigile ou anesthésié qui ne dureront pas plus de 15 minutes, à un frottis vaginal (animaux femelles uniquement) sur animal vigile d'une durée de 2 minutes . Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection et deux prélèvements sanguins au cours de chaque session de formation. Les animaux seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes. AJOUT: certains animaux seront soumis à un prélèvement sanguin d'une durée de quelques minutes ou une injection terminale avec ou sans produit de contraste d'une durée de 15-20minutes, réalisés sous anesthésie.
Impact sur les animaux
La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les injections pourraient provoquer un saignement, un hématome, une inflammation. L'administration par voie orale (gavage) pourrait provoquer une fausse route. Le prélèvement sanguin à la queue (coupe ou incision) pourrait conduire à une inflammation . Les prélèvements sanguins pouraient entrainer une douleur aigue , un hématome. AJOUT: le prélèvement sanguin ajouté pourrait induire un saignement, une douleur légère de courte durée, un hématome qui pourrait dans de rares cas induire une diminution de la prise alimentaire avec perte de masse (5 à 10% attendu en moyenne). L'injection terminale réalisée sous anesthésie ne créera pas de nuisance à l'animal.
Devenir
A l'issu des procédures les animaux seront soit réutilisés si aucun dommage n'a été observé, soit mis à mort si les points limites ont été atteints.
Remplacement
La formation intègre des gestes techniques en lien avec l'expérimentation animale qui ne peuvent être réalisés que sur animal vivant entier car ces gestes nécessitent un organisme dans sa globalité (système cardio-vasculaire fonctionnel et intègre, cerveau...).
Réduction
Aucune analyse statistique ne sera réalisée car il s'agit de formation. Le nombre d'animaux/procédure a été estimé en fonction du niveau des apprenants et des attendus des tuteurs. Pour les formations spécifiques réglementaires, il s'agit d'une initiation aux gestes et donc il n'y a donc aucune validation des gestes. Un seul animal/apprenant suffit donc à cette initiation aux gestes. Pour l’acquisition de nouvelles compétences techniques ou la formation initiale et continue des personnels de laboratoire ou zootechniques, les gestes enseignés pourront faire l'objet d'une validation de la part des tuteurs. Nous avons alors évalué le nombre d'animaux/apprenant à N=2. Il s’agira autant que possible d’animaux de réforme. Un maximum de trois gestes seront réalisés sur un même animal réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés ou à l'espèce manipulée, les animaux seront anesthésiés pour limiter le stress, la souffrance ou l'inconfort. Tous les animaux utilisés seront au préalable habitués à la préhension et contention avant chaque session de formation afin de limiter le stress lorsque ces gestes seront réalisés par les apprenants. En alternative à la préhension par la queue ou le corps , pour la souris ou le rat, la méthode du tunnel qui consiste à apprendre à l'animal à entrer de façon volontaire dans le tunnel intégré en tant qu'enrichissment dans la cage sera proposée ce qui permet de sortir les animaux de leur cage sans les manipuler au risque de les stresser. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages enrichies avec le matériel dédié à chaque espèce leur permettant ainsi d'exprimer des comportements naturels comme ronger et nidifier. Pour limiter la souffrance animal des points limites prédictifs ont été définis pour chaque procédure du projet.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront les espèces animales prinicpalement utilisées dans le cadre de la formation pratique incluse dans la formation des étdudiants puisque ces deux espèces sont les plus manipulées et utilisées dasn les projets de recherche scientifiques. D'autres espèces de rongeurs plus spécifiques des domaines de recherche ciblés par les apprenants seront également utilisées afin de former les étudiants et personnels impliqués dans les projets de recherche. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte à partir de 3 mois. Selon les gestes enseignés, nous pourrions être amenés à affiner notre choix en prenant également en considérant le poids et le sexe de l'animal.
Impact de l’anesthésie associée à des inhibiteurs antitumoraux sur l’efficacité de la résection chirurgicale dans le glioblastome et sur les caractéristiques des rechutes sur la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 192
Des cellules de glioblastome sont implantées dans le cerveau de chaque animal, puis la tumeur est en partie retirée par une seconde chirurgie, avant cinq jours de radiothérapie et quatre à cinq semaines de chimiothérapie. 384 souris et 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la tumeur peut s'accompagner de nécrose, de cachexie et de perte de poids, et que les molécules testées, nouvelles par définition, peuvent produire des effets délétères inconnus. L'objet réel est de comparer les anesthésiques employés pendant la chirurgie du glioblastome, et le résumé annonce un suivi des signes cliniques et des points limites liés à la croissance tumorale et à la radiothérapie sans en donner un seul seuil.
Objectifs
Le glioblastome (GB) est une tumeur cérébrale primaire de très mauvais pronostic. Le traitement standard comprend une résection chirurgicale suivie d’une combinaison de radiothérapie et chimiothérapie et enfin de plusieurs cycles de chimiothérapie. Malgré ce traitement agressif, la rechute est quasi systématique, conduisant à une survie médiane des patients de l’ordre de 18 mois post-diagnostique. La procédure chirurgicale implique une anesthésie générale qui est classiquement réalisée avec le propofol. Il existe actuellement une forte interrogation sur les effets de l’anesthésie sur l’évolution de la pathologie cancéreuse et, par conséquent, le choix du protocole d’anesthésie à utiliser dans ce contexte. Les études cliniques sont peu nombreuses et souvent rétrospectives. En revanche, les études précliniques qui sont de plus en plus nombreuses semblent souligner un effet antitumoral du propofol. Le domaine de l’onco-anesthésie a débuté par des études cliniques rétrospectives critiquables méthodologiquement et des études in vitro qui ont mis en évidence de propriétés antitumorales du propofol dans différents types de tumeurs). Dans cette étude, nous souhaitons associer cet anesthésique à nos inhibiteurs afin de voir le gain de survie sur des animaux ayant subit la même prise en charge que les patients.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour, une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais, mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. A ce jour les traitements pour les patients souffrants (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ). L’utilisation du propofol et d’un inhibiteur passant la barrière hématoencéphalique et potentialisant la combinaison radio- et chimiothérapie et ceux en diminuant les doses de TMZ ont pour objectif d’améliorer la survie, mais aussi le confort de vie des patients.
Procédures
Lors de l'implantation tumorale nous réalisons une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation intracérébrale de cellules tumorales (10 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Lors de la résection tumorale, nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) et à l’injection dans la veine caudale (2 secondes), puis nous réalisons la chirurgie afin de réduire la tumeur (15 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Pour les traitements, les animaux subissent de la radiothérapie pendant 5 jours (2 minutes par irradiation) de la chimiothérapie en intrapéritonéale toutes les semaines hors week end pendant 4 à 5semaines (2 secondes) des injections intrapéritonéales d’inhibiteurs antimoraux toutes les semaines pendant 4 à 5 semaines (2 secondes)
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation (ex: isoflurane) lors des administrations/imageries. Le développement de tumeurs chez la souris et le rat pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associée ou non à de la nécrose, cachexie, perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (i.p=intrapéritonéale / s.c=sous cutanée/ iv =intra-veineux) (douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'implantation de cellules et les procédures chirurgicales d'exérèse induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation.
Devenir
En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs, ce projet est réalisé chez la souris et le rat, car il n’existe pas de méthode de substitution (in-vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les cancers. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 12 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé. Afin de mener à bien notre projet, nous souhaitons tester 4 inhibiteurs différents sur ces trois modèles d'animaux avec 7 groupes de 12 animaux par groupe soit un nombre total de 192 souris immunodéprimées, 192 immunocompétentes et 192 rats.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • des conditions d'hébergement garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, notamment liés à la croissance tumorale, liés à la radiothérapie (diarrhée) et/ou liés à l'utilisation de traitements de références et novateurs. • Un protocole d'anesthésie adapté à la chirurgie. • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie (exérèse tumorale) et la période post-opératoire et un suivi postopératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Dans cette étude nous allons tester de nouvelles molécules, afin d'améliorer la survie et le confort des animaux tout en combinant radiochimiothérapie. L’utilisation des modèles souris, déjà en place dans le laboratoire sera complétée par celle de rat, avec pour but des approches confirmatoires (modèles différents) mais aussi l’utilisation d’animaux modifiés. Nous utiliserons des souris et des rats de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines dans un modèle immunocompétent ou immunodéprimé, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
Etude exploratoire de l’activité de traitements antitumoraux sur des xénogreffes de tumeurs humaines implantées chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Les 200 études prévues consistent à tester, sur des tumeurs humaines greffées, des molécules présélectionnées en amont, à un stade précoce du développement des médicaments. 12 000 souris immunodéprimées vont y être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment tumoral est implanté sous leur peau, une puce électronique posée ou les oreilles marquées, puis viennent les administrations jusqu'à deux fois par jour et jusqu'à seize prélèvements sanguins par animal. Le porteur qualifie ces 12 000 souris de nombre "strictement nécessaire", et précise que celles chez qui la tumeur ne prend pas sont tuées elles aussi, "compte tenu des nuisances occasionnées".
Objectifs
Le but de ce projet est de tester l’efficacité de nouveaux traitements contre le cancer sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez la souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils ne soient testés chez l’Homme. Notre collection de modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Chaque modèle est soigneusement étudié afin de mieux comprendre ses particularités et de relier ces informations à la réponse observée aux différents traitements anticancéreux. Les 200 études prévues dans ce projet sont réalisées à un stade précoce du développement des médicaments. Elles impliquent un nombre d’animaux strictement nécessaire et visent à identifier rapidement les traitements les plus prometteurs pour un type de tumeur ou une mutation donnée. Les molécules les plus efficaces seront ensuite testées plus largement pour confirmer et approfondir les résultats obtenus.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier de nouveaux traitements efficaces contre différents types de cancers, à partir de modèles de tumeurs humaines implantées chez la souris (modèles de PDX). En testant des médicaments présélectionnés lors d’analyses préalables (modélisations informatiques, in vitro), nous pourrons repérer rapidement ceux qui montrent les effets les plus prometteurs. Ces candidats seront ensuite étudiés plus en détail pour définir les doses et les associations thérapeutiques les plus adaptées. Grâce à la diversité et à la caractérisation approfondie de notre collection de modèles PDX, nous pourrons également mieux comprendre pourquoi certains traitements fonctionnent mieux sur certaines tumeurs ou chez certains patients. À terme, ces travaux devraient contribuer à proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients pour lesquels les traitements actuels sont inefficaces ou inexistants, améliorer l’efficacité des traitements disponibles et réduire les effets secondaires associés aux thérapies anticancéreuses actuelles.
Procédures
Greffe : implantation d’un fragment tumoral sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Identification : des puces électroniques sont implantées en sous cutané au moment de la chirurgie ou un marquage aux oreilles est réalisé. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement : biquotidienne ou moins. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute. Prélèvement de sang : préhension des animaux à une fréquence dépendant des besoins en prélèvements, 16 prélèvements seront effectués maximum par animal. La durée de préhension n’excèdera pas 2 minutes.
Impact sur les animaux
Stress dû à la préhension (suivi du poids et de la taille tumorale, administration de molécules): nuisance transitoire de classe légère ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire de classe modérée
Devenir
Les animaux pour lesquels les tumeurs se seront développées seront euthanasiés pour réaliser les analyses associées (biologiques, histologiques). Les animaux n’ayant pas développé de tumeur malgré la greffe d’un fragment tumoral seront euthanasiés compte tenu des nuisances occasionnées. Les animaux de ce projet ne seront pas utilisés dans un autre projet.
Remplacement
Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent le plus efficace. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, une fois les tests préliminaires terminés, et les molécules les plus prometteuses identifiées, il est nécessaire de poursuivre leur évaluation chez l’animal. Ces études sont réalisées sur un nombre strictement nécessaire d’animaux, uniquement lorsque les alternatives ne permettent plus d’obtenir les informations nécessaires à l’avancée du projet.
Réduction
Ce projet utilise le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables lors des premières étapes d’évaluation des traitements. Les expériences sont réalisées sur de petits groupes de souris afin de déterminer rapidement si un traitement est efficace ou non. La croissance des tumeurs est mesurée de manière standardisée pour savoir si le traitement fonctionne : s’il stabilise ou diminue le volume de la tumeur. Seules les molécules les plus prometteuses sont ensuite étudiées plus en détail sur un nombre plus important d’animaux pour confirmer les résultats avant des essais chez l’Homme. De plus, les animaux dont les tumeurs ne se développent pas sont utilisés pour la formation en vue de l’acquisition, de l’entretien et de l’amélioration des compétences professionnelles du personnel, ce qui permet de limiter encore l’usage d’animaux supplémentaires. La phase de formation est intégrée dans ce projet.
Raffinement
Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical et lors de prélèvements invasifs, les animaux recevront une anesthésiés générale. Un point de compression sera réalisé sur le site de prélèvement pour éviter l’hémorragie. Si une perte de poids est observée, un supplément nutritionnel sera proposé à l’animal. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de fragments tumoraux issus de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines afin d'homogénéiser les conditions de croissance entre les différentes études.